INFORME 3 RECUENTOI

RECUENTO BACTERIANO PRACTICA N°3

GRUPO: MAYUJAKE MARIA CAMILA ASSIA ORTIZ YUCELYS CONTRERAS SINCELEJO JAVIER RUIZ CONTRERAS KEVIN ALMANZA HERNANDEZ DAVID GUEVARA BENITEZ

CARLOS GARCIA MOGOLLON INGENIERO DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE INGENIERIA PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL SINCELEJO-SUCRE 2015 Laboratorio de Microbiología Industrial, Universidad de Sucre

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RESUMEN La práctica de laboratorio consiste en aplicar la técnica de recuento bacteriano, empleando el método de conteo directo al microscopio en cámara de Neubauer o hemocitometro. Para ello se tomó como cultivo madre la levadura comercial diluida en agua destilada estéril. Luego se realizó el conteo de dos diluciones seriadas en cámara de Neubauer observadas en microscopio. El conteo se realiza teniendo en cuenta el cuadro central dentro del cual se encuentra 5 cuadros indicados para realizar el recuento. Palabras claves: levadura, recuento, cultivo, Neubauer, disoluciones.

1. INTRODUCCIÓN El crecimiento microbiano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares, conduce a un aumento del número de individuos en la población. El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un contador electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células) y actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana). Para determinar el número total de células, el método utilizado es el recuento microscópico directo. Se utilizaron las células de levadura, se contabilizaron mediante el empleo de la cámara de Neubauer o hematocitometro sin pinzas, para la cual es necesaria una ampliación de 100X o 400X. Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de volumen de un líquido. Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias, esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio. Las cámaras de recuento BLAUBRAND® son instrumentos de precisión para medición. La placa base en vidrio óptico especial tiene el tamaño de un portaobjetos. Las ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas exteriores y 3 campos pequeños interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se utilizan para rotulación, los campos interiores están esmerilados y pulidos. En el campo central (fondo cámara) están grabadas dos cuadrículas de recuento separadas una de otra por una ranura. El fondo de la cámara del campo central es usualmente 0,1 mm más bajo (profundidad cámara) que ambos campos Laboratorio de Microbiología Industrial, Universidad de Sucre

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adyacentes. Entre campo central y cubreobjetos ya colocado existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La limitación lateral del volumen a contar se forma mediante las superficies imaginadas por la proyección vertical sobre las líneas exteriores de la cuadrícula de recuento. Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras. No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas al microscopio; y no distingue células vivas de muertas.

2. OBJETIVO General 

Desarrollar la destreza en el conteo de células en cámara de Neubauer o hemocitómetro.

Específicos  

Reconocer la técnica de conteo en Cámara Neubauer. Aplicar y desarrollar el recuento bacteriano con la técnica de la cámara de Neubauer.

3. PROCEDIMIENTO 

Diagrama de flujo

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RECUENTO BACTERIANO

Se preparó un cultivo madre a partir de 0.5 gr de levadura seca y 10 mL agua destilada

Se preparó dos soluciones problemas

Se tomó 0.1 mL de disolucion 10-2 y se depositó una alicuota en la superficie de la cámara de Neubauer

Se colocó en la platina de un microscopio y se enfocó con objetivos (4x y 40x)

Se midió la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de Neubauer

Se realizó el conteo teniendo en cuenta el cuadro central de la cámara

En 2 tubos se realizaron las diluciones 10-1 (1 mL cultivo madre + 9 mL de H 2O destilada) y 10-2

Se anotaron los resultados

(1 mL solucion 10-1 + 9 mL de H2O destilada)

4. RESULTADOS En la preparación del cultivo madre se obtuvo una mezcla homogénea blancuzca, lo que representa la concentración de levadura en el agua destilada (fig1). Se indicaron los cuadros para el recuento (fig.2) y se anotaron los resultados del conteo para las diluciones 10-1 y10-2 (tabla 1).

Figura 1: cultivo madre

figura 2: cultivo enfocado en 4x. Se observa el cuadro central para el recuento

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FACTOR [ ] g/ml Cuadro Cuadro Cuadro Cuadro Cuadro Total DILUCIÓ 1 2 3 4 5 N 10-1 0.05 52 56 58 71 60 297 10-2 0.005 28 25 18 11 15 97 Tabla 1: recuento de las células en cámara de Neubauer en los 5 cuadros indicados, para cada dilución.

Luego se calculó el número de células por mililitro de muestra para cada tubo y se anotaron los resultados (tabla 2). Volumen de la cámara de Neubauer con respecto a las dimensiones de los cuadros de conteo. 1 mm3 x 0.1 mm = 0.1 mm3 1.1 mm3 x 25 = 2.5 mm3

Se empleó la fórmula: [1] 1 dilución Número de cuadros x Volumen

Celulas contadas por dilución x N ° celulas /ml=

Con factor de dilución 10-1 1 −1 10 N ° celulas /ml= 5 x 2.5 mm3 297 x

= 237.6

Con factor de dilución 10-2 1 −2 10 N ° celulas /ml= 5 x 2.5 mm3 97 x

= 776

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FACTOR DILUCIÓN [ ] g/ml N° Células/ml -1 10 0.05 237.6 10-2 0.005 776 Tabla 2: número de levaduras por mililitro de muestra en cada tubo

5. ANALISIS DE RESULTADOS El recuento de las levaduras se realizó con las diluciones, ya que el cultivo madre tiene mayor concentración haciendo más difícil el conteo. Se puede apreciar en la tabla 1 los resultados del conteo bacteriano, pero cabe destacar que es un método poco preciso, puesto que la distribución de las células en cada cuadro varía, por lo que se saca un promedio de los datos, aun así no es muy exacto el resultado. De la tabla 2 se puede hacer un análisis de la concentración en las diluciones: en el tubo 1 hay mayor concentración y mayor número de células que en el tubo 2, esto debido a que son diluciones seriadas y a medida que se añade agua destilada disminuye la concentración de levaduras y por efecto disminuye el número de microorganismos.

6. CONCLUSIONES   

Se hizo un previo análisis de la cámara de Neubauer para después hacer una correcta manipulación de esta con las muestras. Se hizo el recuento de las células en cada una de las diluciones por conteo directo en cámara de Neubauer tomando como base el cuadro central. Se realizaron los respectivos cálculos para hallar la concentración y el número de levaduras para cada dilución.

7. CONSULTAS a) Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana. 1. Métodos directos de determinación de biomasa: Se basan en el número de células o en el peso celular, dentro de estos métodos podemos distinguir a los siguientes:

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Métodos gravimétricos (Peso Seco): La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica.

Métodos espectrofotométricos: Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal parámetro a partir de una sola medida de la turbidez Métodos microscópicos mediante epifluorescencia: La microscopía de epifluorescencia comenzó a emplearse a Principios de los 70 Y hoy en día se considera como uno de los mejores métodos para la estimación de la biomasa. La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adición de algún anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algún componente celular autofluorescente. El procedimiento consiste en la tinción de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopía óptica con iluminación de epifluorescencia. Métodos de siembra: El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas células viables de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los recuentos de placa por vertido, un volumen de 0,1- I ml de la suspensión microbiológica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensión sobre la superficie del medio de cultivo.

2. Métodos indirectos de determinación de lo biomasa: Estos métodos se basan fundamentalmente en la determinación de algún componente celular específico, en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos Laboratorio de Microbiología Industrial, Universidad de Sucre

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bioquímicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formación de algún producto (métodos cinéticos):

Métodos cinéticos: La base de estos métodos es la medida del consumo de sustrato o de la formación de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo más típico en microorganismos aerobios es la determinación de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolución a través del consumo de oxigeno dl medio Métodos bioquímicos: Las medidas de alguna actividad enzimática pueden considerarse como una alternativa a los métodos tradicionales. Los ensayos enzimáticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rápidamente. Además el equipamiento necesario no es ni costoso ni complejo. La mayoría de las medidas de actividad enzimática se realiza mediante la conversión de sustratos específicos a productos coloreados que son cuantificados fotométricamente. La principal desventaja de los métodos bioquímicos es la variación de las actividades enzimáticas celulares con los cambios fisiológicos y que una vez que los microrganismo mueren l las enzimas liberadas pueden seguir activas. [2] 3. ATP: La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin embargo existen dificultades para el cálculo exacto pues en algunos casos la concentración de ATP cambia según sus condiciones alteradas como las nutricionales y fisiológicas. La mejor medida sería la cantidad total de compuestos adenilados: A: ATP+ ADP + AMP Esto se calcula con el fin de calcular la carga energética. EC:

(ATP+ ½ ADP) ( ATP+ ADP + AMP)

Esta carga energética es una medida microorganismos presentes en la muestra. [3]

del

estado

fisiológico

de

los

b) Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas en el experimento

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Ventajas: Es rápido, las exigencias del equipo son mínimas y se pueden observar las diferencias morfológicas de los microorganismos Desventaja: El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las irregularidades en la distribución de la muestra. Además no se distinguen células vivas de muertas, analiza poca cantidad de muestra, provoca cansancio del operador y solo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL, hace más difícil distinguir los m.o de las partículas de la muestra. [4]

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS [1] Oscar Bastidas. Conteo Celular con Hematocitómetro. Technical Note Neubauer Chamber Cell Counting (consultado:5 octubre 2015). Disponible en: http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-CamaraNeubauer.pdf [2]. Carmen Arnáiz, Laura Isac y Julián Lebrato. Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Artículos Técnicos. N° 205 (200), p. 45 - 50. Disponible en: http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/tvolke/00_Determin-BM.pdf [3] Microbiólogos Industriales UDES [blog]. Métodos de Medición de Biomasa Microbiana. Viernes, 24 de agosto de 2007 [Consulta 21 septiembre 2015]. Disponible en: http://microbiologos.blogspot.com.co/2007/08/metodos-demedicion-de-biomasa.html [4] Evaluación del crecimiento microbiano. Curso Microbiología 2010. Facultad de Agronomía. Practico 6. [Consulta 21 septiembre 2015]. Disponible en: http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales %20teoricos/evaluacion%20del%20crecimiento.pdf Tortora, Gerard J (2004). Microbiology “An Introduction” (8va edición). Pearson Prentice Hal

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