Informe 2

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDA D NACIONAL NACIO NAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“DETERMINACIÓN DE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DEL ALMIDÓN” GRUPO: LOS QUÍMICOS CURSO: ALIMENTACIÓN Y NUTRICIÓN HUMANA

ESTUDIANTES: ●   Galván ●   Maita

Quispe, Sol Angie

20190498

Noel, Javier Palermo

20160451

●   Ore Aymachoque, ●   Simón

Joselin Gloria

20141363

Paniagua, Kristel Dayane

20190517

LIMA – PERÚ 2022

 

I.

INTRODUCCIÓN

La alimentación humana depende en gran parte de los carbohidratos contenidos en los alimentos, siendo su principal función, proporcionar glucosa al cuerpo para convertirla en energía para la realización de funciones vitales y actividades físicas. En este caso, la calidad de los carbohidratos de la dieta tiene una mayor importancia que la cantidad en la que se consumen (Mozaffarian et al., 2011). El índice glucémico es una medida in vitro basada en el efecto de los alimentos que contienen carbohidratos en el nivel de glucosa de la sangre. La capacidad de clasificar los alimentos que contienen carbohidratos permite elaborar y seguir dietas adecuadas según los requerimientos de salud (Otemuyiwa  et al .,., 2017). Puesto que una dieta variada de alimentos de bajo ííndice ndice glucémico es especialmente apropiada para evitar complicaciones complicaciones a lar largo go pla plazo zo.. Mie Mientr ntras as que par paraa pac pacien ientes tes con un unaa capaci capacidad dad de ab absor sorció ciónn reduci reducida da  pueden beneficiarse beneficiarse de alime alimentos ntos con un índice índice glucémico más alto (Jenkins (Jenkins et al., 1981). La importancia de las pruebas de digestibilidad del almidón in vitro reside principalmente en su utilidad para la predicción del índice glucémico (IG) de los productos alimenticios (Bello  et al .,., 2006). Y los métodos in vitro representan una alternativa de trabajo por su ra rapi pide dezz y acce accesi sibi bili lida dadd po porr lo qu quee para para logr lograr ar un unaa bu buen enaa co conf nfia iabi bilid lidad ad ba basa sann la lass características del proceso de digestión muy similar a una situación in vivo (Otemuyiwa  et  al.,

2017 2017). ). Esta meto metodolog dología ía emplea α-amilas α-amilasaa para hidrolizar hidrolizar el almidón presente presente en matric mat rices es alimen alimentar tarias ias,, med median iante te es esta ta rea reacc cción ión bioquí bioquímic micaa se ob obtie tienen nen molécu moléculas las de

maltosa, las cuales, al reaccionar con el ácido dinitrosalicílico, producen un cambio de color que puede se cuantificado espectrofotometricamente espectrofotometricamente a 550 nm (Bello et al., 2006). El objetivo de la práctica fue conocer el método estándar para la hidrólisis del almidón con α-amilasa y su aplicación en productos alimenticios con el fin de conocer su grado de digestibilidad in vitro y determinar el grado de digestibilidad del almidón de muestras sometidas a cocción por diferentes tiempos.

 

II.

REVISIÓN D DE E LI LITERATURA

2.1. Almidón Estructuralmente el almidón es un poliglicano, com compuesto puesto por una mezc mezcla la de polisacáridos confor con formad madaa por ami amilos losaa 20 por cient ciento, o, ami amilop lopect ectina ina 80 por ciento, ciento, y una fracción fracción minoritaria de 1 a 2 por ciento de conformación no glucosídica como lípidos y minerales, aunque esto depende de su origen botánico. (León  et al , 2020). Los gránulos de almidón son estructuras altamente organizadas cuyas dimensiones y características varían entre especies. Se encuentra en los cereales, los tubérculos y en algunas frutas como polisacárido de reserva energética. Su concentración varía según el estado de madurez de la fuente; a medida que la fruta madura, el polisacárido se hidroliza por la acción de las amilasas, y mediante median te otr otros os sis sistem temas as enz enzimá imátic ticos os se sin sintet tetiza izann la sacaro sacarosa sa y la fructo fructosa sa que se encuentran cuando llega a la plena maduración. (Badui, 2006)

2.2 Amilasa Las amilasas son enzimas intra o extracelulares que promueven la hidrólisis de enlaces glucosídicos presentes en el almidón, glucógeno y otros polisacáridos. (Ferrer  et  et al , 2015) Esta enzima se produce en el páncreas y en las glándulas salivales. La α-amilasa (EC 3.2.1.1) es una endohidrolasa que actúa de manera aleatoria sobre los enlaces internos a-(1-4) de la amilosa y de la amilopectina. Es capaz de romper las uniones glucosídicas adyacentes a ambos lados del enlace a-(1-6) de la amilopectina. Por otra parte, la β-amilasa (EC 3.2.1.2) hidroliza los enlaces a-(1-4) a partir de los extremos no reductores de la amilosa y de la amilopectina. (Badui, 2006)

2.3 Tampón fosfato Es un sistema muy eficaz para amortiguar ácidos, con capacidad de tamponar debido a su composición por el dihidrógeno fosfato H2PO4- y el hidrógeno fosfato HPO4-2. El tampón fosfato posee un valor de p K a de 6,8. Así pues, para el tampón fosfato:

pH = 6.8 + log [H2PO4-2/ H2PO4-]

 

A pH fisiológico de 7,4, la concentración de H 2PO4-2 a un 80 por ciento es 4 veces superior  a la de H2PO4- a un 20 por ciento. De esa manera, el buffer fosfato tiene una concentración concentración  baja en la sangre, siendo esta de 2 mEq/L. A nivel intracelular, intracelular, las concentracion concentraciones es de fosfato son elevadas lo que le convierte en un tampón eficiente. Las grandes cantidades de fosfato dentro de las células corporales y en el hueso hacen que el fosfato sea un depósito grande y eficaz para amortiguar el pH. (Cadile et al , 2007)

2.4 Ácido dinitrosalicílico (DNS) El reactivo se utiliza para la determinación de azúcares reductores, está compuesto por  ácido dinitrosalicílico, sal de Rochelle, fenol, bisulfito de sodio e hidróxido de sodio. Se introduce sal para evitar que el reactivo disuelva el oxígeno; fenol, para aumentar la cantidad de color producido y equilibrar el efecto del fenol que se encuentra en la orina; y  bisulfito, para estabilizar el color obtenido en presencia del fenol. El álcali es necesario  para la acción reduc reductora tora de la gluco glucosa sa sobre el áácido cido dinitrosalicílico. E Ell DNS se emplea en la dete determ rmin inac ació iónn de azúc azúcar ares es redu reduct ctor ores es con con lo loss qu quee re reac acci cion ona, a, form forman ando do ác ácid idoo 3-amino-5-nitrosalicílico, el cual tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 540 nm. En la reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico, la disolución pasa de un color  amarillento a un color anaranjado-rojizo. (Miller, 1959)

Figura 1. DNS reaccionando con un azúcar reductor formando ácido 3-amino-5-nitrosalicílico Fuente: Bradford, 1976.

 

III. METODO METODOLOGÍA LOGÍA 3.1.

LUGAR D DE EE EJJECUCIÓN El análisis experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímico Fisicoquímico de Alimentos de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM).

3.2.

MATERIALES Y EQUIPOS

3.2. 3.2.1. 1. Ma Mate teri riaa pr prim imaa -

Alm Almidó idónn de pap papaa (Ch (Chuño uño))

3.2. 3.2.2. 2. Ma Mate teri rial ales es -

Tu Tubos bos de ens ensayo ayo

-

Material de vidrio: erlenmeyer erlenmeyer,, pipetas, tubos de ensayo, etc.

-

Mic Microp ropipe ipeta ta de 2020-200 200 µl

-

Micro Micropipet pipetaa de 100-1 100-1000 000 µl

-

Mar Marca cador dor per perman manent entee

3.2. 3.2.3. 3. Re Reac acti tivo voss -

α-amilasa SIGMA TIPO IA 1200 U/mg (27 mg/ml). Se diluyó 5566 l de enzima enzima con con 16 ml de tampón fosfato (se preparó dentro de los 30 minutos previos al comienzo

-

de la hidrólisis). Tampón fosfato. Se disolvió aproximadame aproximadamente nte 700 ml de agua destilada 3.03 g de KH2PO4, 3.96 g de Na2HPO4.2H2O Na2HPO4.2H2O y 0.40 g de NaCl. Llevar a pH 6.9 y aforar a 1000 ml.

-

Solución de DNS DNS.. Disolve Disolverr 1111 g de Na NaOH, OH, 10 g de ácido dinitrosalicílico (DNS), 2 g de fenol y 0.5 g de bisulfito de sodio en agua destilada; se enrasó en una fiola de 1000 ml.

-

Sal de Rochelle. Se pre preparó paró un unaa solu solución ción al 40% (p/v (p/v)) de tartrato de sodio y potasio potasio en agua destilada.

-

Malto Maltosa sa anhi anhidra dra (solu (solución ción están estándar dar de 2 m mg/ml) g/ml)..

 

3.2. .2.4. Eq Equ uip ipoos -

Bal Balan anza za an analí alític ticaa Marca: SYNERGY LAB; Modelo: AS R2 Plus

-

Bañ Bañoo mar maría ía con agi agitac tación ión

-

Cocina

-

Agi Agitad tador or Vortex ortex Marca: ISOLAB; Modelo: 0-2500

-

Esp Espec ectro trofot fotóme ómetro tro Marca: Thermo Scientific; Modelo: Genesys 20

3.3 MÉTODOS 3.3. 3.3.1. 1. Mé Méto todo doss de aaná náli lisi siss El método DNS es un método espectrofotométrico utilizado para la estimación de azucares reductores, el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por  la glucosa u otro azúcar reductor, al ácido 3-amino-5- nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540 – 570 nm (Huanca, Espinal & Mollinedo, 2015).

3.3.2. 3.3 .2. Met Metodo odolog logía ía exp exper erime imenta ntall a. Prep Prepara aració ción nd dee la mue muestr straa Se pesaron 500 mg de almidón o su equivalente en un erlenmeyer de 150 ml, luego se le añadió 55 ml de tampón fosfato con un máximo 30 minutos antes de iniciar la hidrólisis.

b. Prep Prepara aració ción n de bat baterí eríaa de trabaj trabajoo Se rotularon cada uno de los tubos de ensayo con 0, 5, 15, 30, 30, 40 minutos y blanco tampón, luego se les procedió a añadir reactivos, muestra, agua des destilada tilada y solución estándar.

 

c. Pro Proced edim imie ien nto En primer lugar, se pesó 500 mg de almidón de papa (Chuño) en un matraz Erlenmeyer de 150 ml. Se añadió 55 ml de tampón fosfato (una hora antes de iniciar la hidrólisis). Se colocó el Erlenmeyer en un baño de agua a 37°C con agitación constante y se dejó estabilizar la temperatura. Este último proceso es considerado como preincubación y toma un tiempo de cin cinco co minutos. Luego de los cinco minutos y antes de adicionar los 1250μL de enzima, se tomó una alícuota de 200μL de muestra y se marcó dicho tubo de ensayo como tiempo cero (0 minutos). Posterior a ello, se añadió 1.25 ml de enzima al Erlenmeyer y luego se incubó a 37°C durante 40 minutos con agitación continua. Dentro del periodo de incubación se toma tomaro ronn mu mues estra trass de alíc alícuo uota tass de 20 200μ 0μL L a lo loss 5, 15 15,, 30 y 40 minuto minutos, s, orga organi niza zand ndoo los los tubo tuboss de ensa ensayo yo en un unaa ga gale lerí ríaa y si sien endo do es esto toss co codi dific ficad ados os respectivamente. Luego, se le añadió 3 ml DNS   +   800   μL agua. Se hirvieron los tubos de ensayos debidamente codificados durante 5 minutos seguido a cada tubo se le agregó 1 ml de Sal de Rochelle más 10 ml de agua destilada. Finalmente, se leyó leyó a una una abso absorb rban anci ciaa de 550 550 nm aj ajus usta tand ndoo el ce cero ro de absor absorba banc ncia ia en el espectrofotómetross con el blanco tampón. espectrofotómetro

 

IV.. IV

RES RESULT ULTADOS Y DIS DISC CUS USIÓ IÓN N

4.1. Grá 4.1. Gráfic ficaa Por Porcen centaj tajee de de hidr hidróli ólisis sis en Fun Funció ción nd del el tie tiempo mpo En el figura 2 se muestra la relación del porcentaje de hidrólisis de la muestra de almidón de papa, resultado de la digestibilidad in vitro  del mismo, con respecto a los tiempos de 0, 5, 15, 30 y 55 minutos, dicho porcentaje se obtuvo hallando previamente una curva estándar con datos de absorbancias medidos a 550 nm (Anexo 1).

Figura 2. Comportamiento del porcentaje de Hidrólisis con el tiempo de incubación De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede observar que el valor de porcentaje de hidrólisis para 0 minutos es 11.15, mientras que para 5, 15, 30 y 55 minutos, los  porcentajes de hidrólisis fueron 25.52, 29.96, 43.55 y 59.09 respectivamente respectivamente.. Se puede observar,, un notable incremento de dichos porcentajes observar porcentajes a medida que transcurre transcurre el tiempo y confirmar lo que plantearon Zamudio  et al . (2015), quienes mencionan que la hidrólisis de la muestra de almidón de papa demostró un incremento a medida medida que aumentaba aumentaba el tiempo de digestión, al evaluar la digestibilidad in vitro de harinas y almidones de tres variedades  Avena sativa). Como resultados no se observaron diferencias significativas; sin de avena ( Avena

embargo, reportaron que la digestibilidad fue mayor en los almidones. De esa manera, se

 

determinó que tanto la presencia de otros compuestos, como la fibra dietaria total, puede influir en la disminución de digestibilidad en las harinas. Baños, Bañ os, B. (20 (2007 07)) men mencio ciona na que la pre prese senci nciaa de cie cierto rtoss com compue puesto stoss tal tales es co como mo los β-glucanos, lípidos y proteínas presentes en la fibra soluble en la avena pueden interferir y disminuir la velocidad y el porcentaje de hidrólisis de harinas. Asimismo, Escobar (2012) reportó que se trata de la cantidad de β-glucanos presentes en la avena los cuales demues dem uestra trann un com compo porta rtamie miento nto reo reológ lógico ico car caract acteri eriza zado do por la for formac mación ión de red redes es intermoleculares que favorecen la gelación, razón por por la humedad contenida en en las galletas  puede verse modificada y por lo tanto también su textura. No obstante, al tratar como muestra la harina de la papa sin presencia de β-glucanos, la velocidad de hidrólisis se vio afectada debido a la gran cantidad de agua absorbida, lo cual a su vez genera una disminución en la movilidad de las enzimas. Chung  et al.,  (2008) argumentaron que la enzima a la cual se somete a hidrolizar, accede con mayor rapidez cuando el almidón esta hinchado debido a la absorción de agua, comportamiento correlacionado principalmente con el contenido de amilopectina; mientras  por otro lado, la amilosa actúa como un inhibidor del poder de hinchamiento como lo demuestra Zamudio   et al.  (2015), en muestras de almidones aislados de 19 diferentes cultivares de arroz. En dicha situación, los almidones presentaron una mayor capacidad de hidratación al tener una mayor cantidad de agua disponible disponible en comparación con las harinas trabajadas. Por último Farber & Gallant, citado por Holm  et al.  (1985) la presencia de la matriz  proteica en la muestra protege al al almidón de ataques ataques amilolíticos inhibiendo inhibiendo la acción acción de la α-amil α-a milasa asa,, por lo que mue muestr stras as co conn mat matric rices es pro protei teica cass cas casii int intact actas as pre presen sentan tan una digest dig estibi ibilid lidad ad cas casii nul nulaa en com compar paraci ación ón a mue muestr stras as que pre presen sentan tan mat matric rices es pro protei teicas cas reticuladas y fragmentada como el trigo cocido o el trigo descascarillado, descascarillado, los cuales cuales logran mayores grados grados de hidrólisis por por acción de la α-amilasa.

 

V.

5.1.

CONCLUSIONES

Se logró con conocer ocer el grad gradoo de dige digestibil stibilidad idad in vitro vitro del del almidó almidónn de papa trabajado trabajado  por el método estándar con α-amilasa generando una curva de hidrólisis en relación relación al tiempo.

5.2.   Se logró obte obtener ner el gra grado do de dig digest estibi ibilid lidad ad de la muestr muestraa de almidón almidón de de papa papa sometida a cocción por diferentes tiempos, siendo mayor el grado con respecto al aumento de los tiempos de 0, 5, 15, 30 hasta 55 minutos.

 

VI.

BIBLIOGRAFÍA

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VII. CUESTIONARIO

7.1.

¿Qué factores afectan la digestibilidad de los almidones? Según Parada & Rozowski (2008), mencionan que un factor a considerar es el estado físico del almidón puesto que la dimensión del grano original, muestra un arreglo complejo semicristalino muy ordenado, con lo cual podemos saber de qué forma y qué fracción del total es digerida. De igual manera Martínez (2006) menciona las estructuras del gránulo del almidón como un factor debido a que este fa fact ctor or la estr estruc uctu tura ra cris crista tali lina na qu quee ti tien enee de dete term rmin inaa en mayo mayorr medi medida da la susceptibilidad a las enzimas hidrolíticas. También tenemos el tamaño del gránulo como un factor intrínseco, según ello presentan mayor o menor cristalinidad y por  ende ende son son má máss su susc scep eptib tible less de se serr frac fracci cion onad ados os po porr moltu moltura raci ción ón o meno menorr, respectivamente. Otros factores serían de procesos tecnológicos, de gelatinización, retrogradación o modificaciones químicas.

7.2.. ¿Qu 7.2 ¿Quéé rel relac ación ión existe existe ent entre re la dige digesti stibil bilida idadd in vitro vitro del almidón almidón y porcen porcentaj tajee de gelatinización? Según Badui (2006), durante la cocción de los alimentos, el almidón contenido en ellos ellos se gel gelati atiniz niza, a, per peroo al enf enfria riarse rse co comie mienza nza el proces procesoo de recris recristal taliza izació ción, n, denominado retrogradación. De igual manera, Castillo (2016), menciona que “la digestión del almidón en un estado de gelatinización es significativamente mayor  que en el mismo alimento en un estado avanzado de retrogradación”. Esto guarda re rela laci ción ón con con la cons consta tant ntee de velo veloci cida dadd (k (k)) la cu cual al es mayo mayorr en el al alim imen ento to gelatinizado que en el retrogradado. Lo que podría sugerir que la acción de la hidrólisis del almidón por parte de las enzimas amilolíticas se ve disminuida por la recristalización.

 

VIII. ANEXOS Anexo 1. Datos de concentración de maltosa medidos a una absorbancia de 550 nm y los respectivos porcentajes de hidrólisis.