Informe 1 - Crecimiento Celular - Cortés Plaza Fabiani

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD TECNOLÓGICA DEPARTAMENTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS INGENIERÍA DE ALIMENTOS LABORATORIO INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

INFORME Nº 01 CRECIMIENTO CELULAR Luis Cortés A., Lisette Plaza P., Loreto Fabiani M. Profesor: Sergio Aguilera Moya  Ayudante: Luis López Matus

Pauta de evaluación informes

ITEMS

PTJE MAXIMO PTJE ASIGNADO ASIGNADO

PORTADA INTRODUCCION OBJETIVOS

0,5 1 0,5

RESULTADOS

1

DISCUSIONES

2,5

CONCLUSIONES REFERENCIA

23 de Diciembre 2011

1 0,5

INTRODUCCIÓN En un sistema biológico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. (Pumarola, 1999) Sin embargo el crecimiento está normalmente limitado por el agotamiento de nutrientes o por la acumulación de productos del mismo metabolismo microbiano, que les son tóxicos a la población. La consecuencia es que el crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse. Por lo general se puede medir el crecimiento de las bacterias, calculando el aumento numérico y teniendo en cuenta, por lo tanto, la magnitud de sus poblaciones. Para ello existen distintos métodos los cuales se pueden clasificar en directos e indirectos. Los métodos directos permiten una estimación aproximada del número de bacterias mientras que los indirectos son empleados para determinaciones de masas celulares. (Pumarola, 1999) El crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo líquido es claramente exponencial, y la determinación de este crecimiento cuantitativo se puede representar mediante una curva en la que se distinguen distintas fases o períodos. En este caso se utilizó La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivinícola, así como por su capacidad de producir etanol. Este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es cultivado en medios líquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la fase logarítmica, el cambio diáuxico, la fase postdiáuxica y la fase estacionaria. (Folch-Mallol y col, 2004).

OBJETIVOS Objetivo general



Monitorear el crecimiento de un cultivo de levadura (Sccharomyces cerevisiae) en un medio de laboratorio por medio del uso de métodos

directos e indirectos. Objetivos específicos



Construir y caracterizar la curva de crecimiento de

Saccharomyces

cerevisiae EC-1118, utilizando los datos obtenidos en el recuento celular.



Determinar la viabilidad (%) del cultivo durante su crecimiento, mediante el recuento celular en cámara de Nuebahuer, determinado la cantidad de células vivas y muertas con uso de azul de metileno (tinción).



Relacionar el consumo de sustrato y absorbancia v/s tiempo con la curva de crecimiento del microorganismo obtenido del recuento celular en cámara de Neubahuer.



Determinar el rendimiento de Glucosa en el medio de cultivo con concentraciones iniciales y finales del microorganismo en la fase exponencial de la curva de crecimiento.

RESULTADOS Cámara de Neubahuer: 

Concentración celular, construcción y caracterización curva de crecimiento:

Tabla 1: Datos recuento celular cámara de Neubahuer y promedio células.

Muestra 1 3 5 6 7 9

Tiempo (h) 0 4 8 12 16 24

Factor de Células Dilución azules (FD) (muertas) 2 2 2 3 10 25 10 13 10 18 10 23

Células blancas (vivas) 16 29 209 167 270 348

Células totales

Promedio células

18 32 234 180 288 371

2 3,56 26 20 32 41,2



* Tener en consideración que se contaron 9 cuadrículas de la cámara, por lo que el promedio será: x= [cel totales/9]. Fuente: Elaboración propia, 2011.

Para cálculo Concentración celular (Células/mL), se utilizará la siguiente ecuación, con resultados en tabla 2, y con obtención gráfico 1:

       Ecuación 1 Donde: C: Concentración celular (células/mL). (X): Promedio de células contadas en la cámara Neubahuer. FD: Factor de dilución utilizado. Tabla 2: Resultados concentración celular obtenida desde la cámara de Neubahuer a diferentes tiempos.

Muestra 1 3 5 6 7 9

Tiempo (hr)

Promedio células

Factor de Dilución (FD)

Concentración celular (cél/mL)

0 4 8 12 16 24

2 3,56 26 20 32 41,2

2 2 10 10 10 10

1,02E+06 1,81E+06 6,60E+07 5,08E+07 8,13E+07 1,05E+08



Grafico N°1: Relación Concentración celular/tiempo para un cultivo de Saccharomyces cerevisiae EC-1118 Fuente: Elaboración propia, 2011.

 Ahora para calcular u máx y t d debemos transformar los resultados de concentración celular a logaritmo natural (Ln), resultados tabulados en tabla 3, y obtención gráfico 2 (Crecimiento celular), pero primeramente debemos conocer la ecuación para un cultivo por lote (Batch), usando el modelo biológico.

              Ecuación 2

Tabla 3: Resultados Logaritmo natural concentración celular [Cél./mL].

Muestra 1 3 5 6 7 9

Tiempo (hr)

Promedio células

0 4 8 12 16 24

2 3,56 26 20 32 41,2



Factor de Dilución (FD) 2 2 10 10 10 10

Concentración Ln[Cél/mL] celular (cél/mL) 1,02E+06 13,84 1,81E+06 14,41 6,60E+07 18,01 5,08E+07 17,74 8,13E+07 18,21 1,05E+08 18,47

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Grafico N°2: Relación Ln[Concentración celular]/tiempo para un cultivo de Saccharomyces cerevisiae EC-1118 (Crecimiento celular) Fuente: Elaboración propia, 2011.

Para obtener parámetros más ajustables a la fase exponencial de la curva de crecimiento se tomaran los tiempos desde 4 hasta las 16 horas, eliminándose dentro del rango, el tiempo 8 [h]. Todo tabulado en tabla 4, y con ello, obtención de gráfico 3: Tabla 4: Resultados Logaritmo natural concentración celular [Cél./mL] zona exponencial

Muestra 3 6 7

Tiempo (hr)

Promedio células

4 12 16

3,56 20 32



Factor de Dilución (FD) 2 10 10

Concentración Ln[Cél/mL] celular (cél/mL) 1,81E+06 14,41 5,08E+07 17,74 8,13E+07 18,21

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Grafico N°3: Relación Ln[Concentración celular]/tiempo para un cultivo de Saccharomyces cerevisiae EC-1118  Al obtener la gráfica 3, se puedo obtener una ecuación lineal que representa a la zona exponencial, correspondiente a la siguiente ecuación, con un R 2 = 0,9525:

 Ecuación 3  Ahora usando ecuación 2 y 3, obtenemos lo siguiente:

          Donde: Ln [Xf] = y

Ln [Xo] = 13,257

 Δt = X

µ = 0,3309

Por lo tanto, nuestro µ correspondiente a nuestro organismo en este medio específicamente “Comportamiento” (representando en la zona exponencial: µ

máx., para un cultivo Batch) es igual a 0,3309 [h -1].  Ahora, si bien conocemos la velocidad de crecimiento del microorganismo en este medio de cultivo, podemos determinar el tiempo de duplicación, debido a que sabemos, que corresponde al tiempo en que el microorganismo se duplica, es decir, si inicialmente se tenía X, al tiempo de duplicación obtendremos 2X, con esto, obtenemos la ecuación 4, con uso de ecuación 2 (modelo biológico):

                                  Ecuación 4 Con ecuación 4, y resultado de obtención de velocidad del microorganismo en el medio, podemos finalmente calcular el tiempo de duplicación:

        

Viabilidad Celular:

Tabla 5: Datos recuento celular cámara de Neubahuer.

Muestra

Tiempo (hr)

1 3 5 6 7 9

0 4 8 12 16 24

Células azules (muertas) 2 3 25 13 18 23

Células blancas (vivas) 16 29 209 167 270 348

Células totales 18 32 234 180 288 371

Fuente: Elaboración propia, 2011.

El porcentaje de viabilidad de calcula con la siguiente ecuación, cuyos resultados se encuentran tabla 6:

          Ecuación 5

Taba 6: Porcentaje de viabilidad medio de cultivo a diferentes tiempos.

Muestra

Tiempo (hr) 0 4 8 12 16 24

1 3 5 6 7 9

% Viabilidad Celular 88,89 90,63 89,31 92,78 93,75 93,8

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Espectrofotometría: Dados los valores de absorbancia obtenidos en la experiencia (turbidez: biomasa formada), se establece una relación con el tiempo de desarrollo del medio de cultivo, descrito por tabla 7. Tabla 7: Valores de Absorbencia obtenida en diferentes tiempos del cultivo a una longitud de onda de 600 nm.

Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (hora) 0 2 4 6 8 12 16 20 24 28

Absorbancia 0,064 0,047 0,120 0,301 0,428 0,289 0,320 1,020 1,000 0,919

Factor de Dilución -----2 2 3 3

Absorbancia corregida 0,064 0,047 0,120 0,301 0,428 0,578 0,640 3,060 3,000 3,676

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Con los datos obtenidos en tabla 7, podemos observar curva de crecimiento absorbancia v/s tiempo, como se muestra en Gráfico 4:

Grafico N°4: Relación absorbancia/tiempo para un cultivo de Saccharomyces cerevisiae EC-1118 Fuente: Elaboración propia, 2011.

Consumo de glucosa: Para determinar la concentración de glucosa consumida primero debemos obtener la glucosa residual que se obtiene al transcurso del tiempo, tabulado en tabla 8: Tabla 8: Datos Obtenidos Absorbancia a diferentes tiempos de Concentración Residual de Glucosa

Tiempo [h] 0 6 16 28

Absorbancia [nm] 0,075 0,013 0,100 0,060 Fuente: Elaboración propia, 2011.

Con los datos de la tabla 8 y la ecuación 7, se obtiene la concentración de glucosa residual, tabulados en tabla 9 y gráfico 5:

                 Ecuación 7

Tabla 9: Datos de la concentración de Glucosa residual a diferentes tiempos.

Tiempo [h]

Concentración [mg/L]

0 6 16 28

0,017730 0,003073 0,02364 0,01418

Factor de Dilución [FD] 1000 1000 100 100

Concentración [g/L] 17,730 3,073 2,364 1,418

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Con los datos de la tabla 9 se obtiene el Gráfico N°5:

Gráfico 5: Curva consumo Glucosa Residual a diferentes tiempos. Fuente: Elaboración propia, 2011.

Finalmente para cálculo, consumo de Glucosa, se utilizó datos de tabla 9, y ecuación 8, cuyos resultados están tabulados en tabla 10 y gráfico 6:

          Ecuación 8

Tabla 10: Datos de la concentración de Glucosa consumida a diferentes tiempos.

Tiempo [h] 0 6 16 28

Concentración Glucosa inicial y residual [g/L] 17,730 3,073 2,364 1,418

Concentración Glucosa consumida [g/L] 0 14,66 15,37 16,312

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Gráfico 6: Curva consumo Glucosa consumida a diferentes tiempos. Fuente: Elaboración propia, 2011. 

Rendimiento Glucosa:

Podemos determinar el rendimiento de Glucosa en el medio, sabiendo que este parámetro es calculado desde el tiempo 4 a las 16 horas (correspondiente a la fase exponencial de la curva de crecimiento), correspondiente a la concentración inicial y final en el proceso (zona exponencial) de Glucosa, para ello usaremos datos de tabla 12 y ecuación 10 (Correspondiente al rendimiento). Pero como no conocemos la concentración de glucosa residual a las 4 horas, debemos obtenerlo de datos de tabla 11 (datos tabla 9: 3 datos y linealización con logaritmo natural para mejor correlación), y con ello obtención gráfico 7:

Tabla 11: Datos de la concentración de Glucosa residual necesarias para cálculo concentración residual a las 4 horas.

Tiempo [h] 0 16 28

Concentración Glucosa residual [g/L] 17,730 2,364 1,418

Ln Concentración Glucosa consumida [g/L] 2,88 0,86 0,35

Fuente: Elaboración propia, 2011.

Gráfico 7: Relación concentración Glucosa residual v/s tiempo Fuente: Elaboración propia.

De Gráfico 7, obtenemos ecuación necesaria (R2: 0,9394) para calcular concentración residual al tiempo 4 horas en la curva de crecimiento (inicio zona exponencial)

 Ecuación 9

  7 Donde “y” calculado corresponde a Ln (Concentración Glucosa) a tiempo 4 horas, para obtención concentración extraer logaritmo natural.

   /*e 10,43 [g/L] Finalmente, con el dato anterior obtenido, correspondiente a la glucosa residual en proceso a las 4 (horas) zona exponencial determinamos rendimiento: Tabla 12: Datos de glucosa y concentración celular (inicial y final: fase exponencial)

Tiempo [h] 4 16

Concentración Glucosa [g/L] 10,43 2,364

Concentración celular [cel/mL] 1,81x10 8,13x10

Fuente: Elaboración propia, 2011. Y  x

 s



 X  f     X i  S  f   

S 0

Ecuación 10 Donde 

: Rendimiento

 X  f   : Células finales (células/L)

 X o : Células iniciales (células/L) S  f   : Sustrato final (mg/L)

S 0 : Sustrato inicial (mg/L) Y  x

 s

Y  x

 s





81300cel  /  L  1810celL  

2,364 g  /  L  10,43[ g  /  L]

9854,95Células /  g  de Glu cos a

Concentración celular [cel/L] 1810 81300

DISCUSIONES Comparación gráficos: concentración celular vs tiempo , absorbancia vs tiempo y Concentración de glucosa v/s tiempo: En estos gráficos (1 y 4) se puede observar

que las curvas presentan un comportamiento similar, sin embargo existe una diferencia en cuanto al tiempo, ya que en el caso de la concentración celular comienza a aumentar desde las 4 horas y en el caso de la absorbancia, ésta comenzó a aumentar a las 16 horas, esto pudo deberse a que ocurrieron una serie de errores durante el procedimiento de medición de absorbancia por la mala introducción de la cubeta en espectrofotómetro, mala manipulación del blanco y además se debe considerar que son diferentes métodos. También, para el caso de absorbancia v/s tiempo, como se trató de un método basado en la turbidez del medio pudo afectar errores en la absorbancia el medio (YPD), ya que pudo presentar características de longitud de onda similares al del microorganismo interfiriendo con los resultados y/o posible error en cálculos en los factores de dilución (mayor dilución real, que la registrada), provocando un cálculo de turbidez menor habiendo una mayor concentración y con ello, una menor absorbancia. Y al observar, gráficos 1,4 y 5, se pudo notar un aumento en la concentración celular y  Absorbancia, y una disminución de sustrato. Esto, debido a que como el microorganismo consumió “Glucosa” para aumentar de tamaño y Nitrógeno para su división, la concentración inicial de glucosa disminuye. Además, se observa, una disminución marcada en la concentración de glucosa al inicio, puesto que el organismo no se divide inicialmente, pero si aumenta de tamaño, ocupando y sintetizando la glucosa para la formación de proteínas, específicamente enzimas y formación de ARNm para su posterior división, y una vez comenzada la fase exponencial, el microorganismo se divide, disminuyendo con eso, el consumo de Glucosa, lo que se ve reflejado en el Gráfico 6. Caracterización curva de crecimiento celular:  Al realizar una comparación con un

estudio realizado con cultivos en medios diferentes pero con esta misma levadura se pudo observar que el rango de velocidad de crecimiento va desde aproximadamente 0,3  –  0,6 [h-1] (Rubio y col, 2010) y el valor obtenido

experimentalmente fue de 0,3309 [h-1] el cual se encuentra dentro del rango, sin embargo, se debe tener en cuenta que esta velocidad depende de una serie de factores tales como: medio de cultivo, tipo de sustrato y del microorganismo, entre otros. Otro estudio similar se realizó con cultivos en medio YPD de dos cepas diferentes de esta misma levadura obteniéndose a tiempo de incubación de 10 horas un µ= 0,3 [h-1] (Valdivieso, 2006). Además, se obtuvo el tiempo de duplicación (2,09 [h]) del microorganismos en este medio de cultivo, el cual nos proporciona información relevante y vital al momento de uso industrial, ya que gracias a ello, se puede determinar el tiempo necesario para producir una cantidad específica de biomasa, y que es característico de cada microorganismo y estará en función de las propiedades iniciales de inoculo (adaptación, edad, entre otros) y las cualidades del medio (sustrato, contaminación, agitación, aeración, entre otros). Viabilidad: Se puede observar que la viabilidad para cada una de las muestras fue

aumentando, siendo ésta bastante alta, debido posiblemente a que el cultivo de levaduras utilizadas era fresco, además se le proporcionó un medio rico (YPD), lo que permitió que dichas levaduras pudieran desarrollarse de manera eficiente. Rendimiento: El rendimiento obtenido fue de 9854,95 [cel/mg glucosa]. De

acuerdo al gráfico 5, se observa que el consumo de glucosa fue rápido en primera instancia y luego se mantuvo constante, esto debido a que el microorganismo se encontraba adaptado al medio lo que explica que fuese tan rápido, haciendo notar que el cultivo de levaduras era fresco y viable. En estas condiciones el microorganismo requiere de nutrientes para su desarrollo, tales como carbono utilizado por el microorganismo para crecer y nitrógeno utilizado para la división celular. Por lo tanto se produce la síntesis de ARNm y la consecuente generación de biomasa.

CONCLUSIONES

  Se confeccionó curva de crecimiento celular para Saccharomyces



cerevisiae EC-1118 con datos de cámara de Neubahuer.



Se determinó fase exponencial de la curva de crecimiento y con ello, la velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicación.



Se cálculo la viabilidad de los microorganismo en forma porcentual con uso de cámara de Nuebahuer y azul de metileno.



Se determinó el comportamiento del consumo de sustrato (Glucosa) durante el tiempo de desarrollo del medio de cultivo. Además, de proporcionar información del rendimiento de Glucosa en el cultivo.



Se confeccionó curva Absorbancia v/s tiempo y su comparación, tanto con la curva de crecimiento celular como el consumo de sustrato en el tiempo.

BIBLIOGRAFIA 

Abril N., Bárcena J., Fernández E., Galván A., Jorrín J., Peinado J., Toribio F., Túnez I., “Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas”, Departamento de Bioquímica y Biología

Molecular, Facultad de Medicina, Campus Universitario de Rabanales, Córdoba.   Ana Rubio, María Hernández. “Identificación prel iminar in vitro de



propiedades probióticas en cepas de S. cere visiae”. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Lab. de Biotecnología Aplicada. Bogotá, Colombia. Aceptado: Enero 10 de 2008



 Agustin Pumarola., “Microbiología y parasitología médica” (1999). Masson

S.A. pág. 62-63.



Fernández E., Galván A., Túne I., “Determinaciones colorimétricas

específicas de compuestos: determinación de glucosa (método glucosaoxidas). Determinación de nitrito (método de la sulfanilamida: N- NEDA)”.   Giraldo G., Loango N., Mejia C., (2010): “Laboratorio de bioquímica: una



visión práctica, Facultad de Ciencias Básicas y Tecnologías, Facultad de Ciencias Agroindustriales, Universidad de Quindio. 

Jorge Luis Folch-Mallol, Adriana Garay-Arroyo, Fernando Lledías, Alejandra  A. Covarrubias Robles. “Respuesta a estrés en la levadura Saccharomyces cerevisiae”. Revista Latinoamericana de Microbiología,

Vol. 46, No. 1 -2.

Enero - Marzo (2004)



Magdalena Valdivieso Ugarte. “Obtención y caracterización de cepas S. cerevisiae superproductoras de glutatión”   (2006). Dpto de biología,

Universidad de Granada. Pag 123.



Pierce “Genetica: Un Enfoque Conceptual” (2010). Editorial Médica

Panamericana. Pág. 201-202.



Quesada Mora S., (2007). “Manu al de experimentos de laboratorio para

Bioquímica, Universidad Estatal a Distancia, San José, Costa Rica.

ANEXO Definir medio rico, medio mínimo, medio complejo Un medio rico es aquel medio con todos los tipos de requerimientos nutritivos (fuente de carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, sales minerales y factores de crecimiento) que permiten el crecimiento de la mayoría de microorganismos heterótrofos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente. Se trata de un medio que sólo contiene compuestos inorgánicos con la adición de una fuente de carbono orgánica. Un medio complejo es aquél del cual no se conoce su composición exacta. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos (Pierce, 2010).

Coeficiente extinción Glucosa El coeficiente de extinción molar, es una constante para cada sustancia (Quesada Mora S., 2010). Considerando el coeficiente de extinción se puede realizar la determinación de la glucosa (inicial y final) usando la ley de Lambert y Beer. Sus unidades están determinadas por las unidades de concentración con que se trabaje y las unidades de espesor de la disolución en la cubeta o celda. Se expresa en cm (Giraldo G., Loango N., Mejia C., 2010). La ley de Lambert y Beer, expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución. Además, de que el coeficiente

de extinción es una constante y que es específica de cada cromóforo. La representación de Lambert-Beer, A = ε·c·l, nos permitirá calcular el valor del coeficiente de extinción molar, que corresponde a la pendiente de la recta (Concentración molar cromóforo v/s Absorbancia) (Abril N., Bárcena J., Fernández E., Galván A., Jorrín J., Peinado J., Toribio F., Túnez I.). La determinación de glucosa (método glucosa - oxidasa) está basado en: La glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando ácido glucónico y H 2O2. El peróxido de hidrógeno liberado reacciona con un cromógeno (fenol/4-aminoantipirina) por la reacción de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente proporcional a la concentración de glucosa (Fernández E., Galván A., Túne I.). Por lo que podemos inferir, que según revisión bibliográfica, el coeficiente de extinción depende de la longitud de o nda del equipo, de la cubeta (espesor: recorrido) y de la concentración del cromóforo, que en este caso es una quinona, y que es especifico para esta sustancia en esta condiciones. Además de ser proporcional a la glucosa, y poder ser obtenida de la gráfica Concentración cromóforo v/s absorbancia. Por lo que es único, dependiendo de método, las sustancias a utilizar y las cond iciones de trabajo.