Informe 1 Catalasa Peroxidasa-1

 

Universidad de las Fuerzas Armadas  –  ESPE  ESPE Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura Ingeniería en Biotecnología Laboratorio de Enzimología Práctica No 1 Autores:

       

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Castillo Fabricio  Jessica Villafuerte  Tamia Villacrés, Luis Leiva 

NRC: 4324  I. 

II. 

Tema: Identificación cualitativa de la actividad enzimática de la catalasa catalas a del hígado de res ( Bos  Bos taurus)) y peroxidasa del tomatillo ( Physalis philadelphica) taurus philadelphica) Objetivos  Objetivos  General Identificar cualitativamente la actividad enzimática de la catalasa del hígado de res y

 peroxidasa del tomatillo.  Específicos 1.  Obtener un extracto enzimático de hígado de res y tomatillo, tomatill o, respectivamente. 2.  Observar la actividad enzimática de la catalasa presente en el hígado de res ( Bos taurus)) mediante la reacción de coloración. taurus 3.  Demostrar la actividad de la enzima peroxidasa presente en tomatillo ( Physalis  Physalis  philadelphica)) mediante la reacción de coloración.  philadelphica III. 

Introducción Introducción   Tampón fosfato

Es HPO una disolución reguladora intracelular congado) un pk’=7.2, pk’ =7.2, yconformada el sistema K  conju (Tejón, otros, otros, 2006). 2006por ). Importante 2 4 (base débil) y KH2PO4 (ácido conjugado)  para mantener el pH en los fluidos intra y extracelulares debido a que este factor influye en la actividad biológica de las proteínas, enzimas, hormonas, la distribución de iones a través de membranas, etc (Túñez, Galván, & Fernández, s.f.).

En el caso de la extracción de enzimas intracelulares se recomienda mantener el  pH  entre 6 y 7, un rango cercano al  pH  natural de tejido del hígado, el cual puede ser ajustado adicionando un reactante ácido o alcalino dependiendo del  pH inicial (Hans & Wauwatousa, Wauwatous a, 1961).  Catalasa En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad

mayor en el hígado, riñón y eritrocitos (Universidad del Zulia, s.f.). Particularmente en los peroxisomas donde cumple la función de detoxificación o antioxidante al

 

descomponer el peróxido de hidrogeno, presentando una actividad enzimática de tipo oxido-reductasa (Cancho, García, Molano, Morejo, & Alfonso, 2012). Su masa molecular es de 225.000 kDa, contiene cuatro grupos hemo por molécula y su contenido de hierro es 0.9% (Universidad del Zulia, s.f.). Para su extracción se requiere que el tejido muestra, esté congelado para evitar la autolisis y rápida descomposición del tejido, que causa que las enzimas se inactiven (Currea & Martínez, 2014) (Hans & Wauwatousa, 1961). Su actividad enzimática regularmente se produce bajo el rango de pH fisiológico, fisi ológico, sin embargo, se ha demostrado que su actividad es estable en un amplio rango de pH entre 5 y 10.5 y a temperaturas de 10 a 30°C (Cheng, y otros, 2014). Peroxidasa

Las peroxidasas, constituyen un grupo de glicoproteínas muy extendido en la escala filogenética, cataliza reacciones bisustrato de carácter redox de diferentes sustratos fenólicos y sustancias orgánicas e inorgánicas (Guarachi Condori, Paz Garcia, Terrazas Siles , & Giménez Turba, 2008). Las peroxidasas vegetales, frecuentemente se las conoce como: peroxidasas clase III, son enzimas monoméricas que intervienen en una amplia gama de procesos fisiológicos, tales como: la lignificación, la suberización, el metabolismo de las auxinas, el ensamblado de las proteínas de la pared celular, la tolerancia a sales, el estrés hídrico y la defensa contra el ataque de patógenos (Matus Trujillo, Díaz Solares, & Samaniego , 2017). La variación de la enzima depende del crecimiento en los que se encuentra la célula; existe una relación inversa entre la peroxidasa y el crecimiento celular (Guarachi Condori, Paz Garcia, Terrazas Siles , & Giménez Turba, 2008). Las peroxidasas  participan en el balance de especies activas de oxígeno (Mazorra & Nuñez, 2003). IV. 

Metodología Materiales y equipos  

Se usó 2 tubos de ensayo, un mortero, tres pipetas, gradilla, pipetas Pasteur, una balanza electrónica, una centrífuga, hígado de res, tomatillos. tomatil los.

  Reactivos

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Se empleó una solución de fosfato 0.1M pH 7.0, una solución de peróxido de hidrogeno al 3%, guayacol al 0.5% y agua destilada.

  Identificación de cualitativa de catalasa.

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En la identificación de la enzima, se homogenizó 15g de hígado de res fresco con 35mL de una solución de buffer de fosfato 0,1M a pH 7.0 por al menos 2 min. Se centrifugó por 5min a la mezcla y se recuperó el sobrenadante. Para el ensayo se realizó: en un de tubo se extrajo del sobrenadante y adicionó de solución de peróxido hidrógeno al 3mL 3%. Para tener un control se tomó 2mL 3mL

 

de buffer fosfato 0,1M a pH 7.0 en un tubo de ensayo y se adicionó 2mL de solución de peróxido de hidrógeno al 3%. Y se identificó la presencia de la catalasa.

  Identificación cualitativa de peroxidasa. 

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En la identificación enzimática se homogenizó 25g de tomatillo fresco con 25mL de una solución buffer de fosfato 0.1M pH 7.0 durante 2min. Se centrifugó por 5min la mezcla y se recuperó el sobrenadante. Para el ensayo se toma en un tubo de ensayo 4mL del sobrenadante, adicionamos 1mL de solución de guayacol al 0.5% y finalmente 1mL de peróxido de hidrógeno al 3%. En otro otr o tubo de ensayo se coloca 4mL de buffer fosfato 0.1M pH 7.0 como control y se realiza el mismo mi smo  procedimiento que con el sobrenadante.

V. 

Cálculos Ecuación de Henderson-Hasselbalch

   PM=174,17 g/mol

    PM=136,08 g/mol  =  + 

[∆− ][]

[∆ ][á] [∆− ] + [∆ ] = 0.1 

 

[∆− ] = 0.361[ 0.361[∆ ∆]]  0.361[∆ ] + [∆ ] = 0.1  0.1 6.13110 − [∆ ∆]] =  =   1.631  3.86910−

−

  [∆ ]  = 0.361[ 0.361[∆] ∆ ] =   KH    →  [∆ ] =  =  ∗  = 136.08 136.08 ∗ 6.131 6.13110 10− = 8.59   

  [∆ 174.17 ∗ 3.860 3.86010 10− = 6.72     →  → [ ∆− ] =  =  ∗  = 174.17    1000mL 250mL

8.59g X=2.148g

    6.74g

1000mL

Y=1.685g

250mL

 

VI. 

  Resultados   Resultados Tabla 1.- resultados cualitativos de la presencia de enzimas peroxidasa y cata lasa  lasa  

Blanco

PEROXIDASA Acción de peroxidasa Observaciones

Se obtiene una reaccion positiva a la presencia de  peroxidasa, debido al cambio de coloracion, coloracion, a un color marron ladrillo.

Solución de buffer, guayacol, peróxido de hidrogeno.

Solución de buffer, y  peróxido de hidrógeno

Solución de buffer, guayacol, peroxidasa y  peróxido de hidrogeno CATALASA Se puede observar en la reacción la presencia de  burbujas al colocar el peróxido de hidrógeno hidrógeno con lo cual vemos una reacción positiva de la catalasa,  por su reacción efervescente, en contraste contraste con el otro tubo de blanco. Otro tipo de característica que se apreció fue la  presencia de calor de la reacción reacción lo cual indica que estamos ante la presencia de una reacción exotérmica.

Solución de buffer, extracto de hígado y  peróxido de hidrógeno

 

VII. 

Discusión

  La catalasa y la peroxidasa (células eucariotas) se encuentran en vesículas denominadas

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 peroxisomas, en el citoplasma celular, por lo tanto, el extracto enzimático enzimáti co se obtuvo a  partir del sobrenadante que resultó de la centrifugación del homogenado de cada muestra (Cancho, García, Molano, Morejo, & Alfonso, 2012) (Universidad de Vigo, 2018). A razón de ser un estudio cualitativo el tampón fosfato (pH 7.0) cumplió la función de solvente y regulador de pH; en consecuencia, no se purificó el extracto con otros solventes (Hans & Wauwatousa, 1961).   Las peroxidasas son enzimas que se encuentran en células vegetales, en el citoplasma y es una enzima que cataliza catal iza la oxidación de compuestos dadores de oxígeno, por medio del peróxido de hidrogeno, Castro (2006) indica que el principal substrato oxidable más usado es el guayacol, usado en el extracto enzimático proveniente del rábano para detectar la peroxidasa debido a que la enzima oxida el reactivo orignando la coloración rojo ladrillo coincidiendo con los resultados obtenidos del extracto enzimático de tomatillo ( Physalis  Physalis philadelphica), philadelphica), indicando positivo a la presencia de peroxidasa en esta especie.   La catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los organismos aerobios. Cataliza la dismutación del peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno. La mayoría de estas enzimas son homotetrámeros con un grupo hemo en cada subunidad. Se ha determinado la estructura cristalográfica de nueve catalasas. Algunas catalasas tienen subunidades pequeñas (masa molecular ≈ 60 kDa) y otras grandes (masa molecular > 80 kDa). Entre estos dos tipos de catalasas existen diferencias estructurales importantes. Las catalasas pequeñas son menos resistentes a la desnaturalización, unen  NADPH, tienen hemo b y se inhiben i nhiben e inactivan por sust sustrato. rato. En cambio, las catalasas grandes tienen un dominio extra en el C-terminal que es semejante a la flavodoxina, son muy resistentes a la desnaturalización, tienen hemo d, presentan enlaces covalentes inusuales cercanos al sitio activo y son resistentes a concentraciones molares de H2O2. Aquí revisamos los aspectos estructurales de las catalasas y sus posibles implicaciones funcionales. (Días, 2003)

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VIII. 

Conclusiones  Conclusiones  1.  Se obtuvo un extracto enzimático no purificado (catalasa) de la muestra de hígado de res y otro extracto no purificado (peroxidasa) de la muestra de tomatillo, mediante el uso de tampón fosfato, para reproducir las condiciones de pH biológicas normales. 2.  Se observó una reacción exotérmica al colocar el peróxido en la muestra que contenía solución de buffer y extracto de catalasa, en comparación con el reactivo  blanco. También También apreciamos la reacción inmediata al apreciar la efervescencia de la muestra lo que comprueba la presencia de la enzima catalasa en la muestra de hígado ( Bos  Bos taurus) taurus)

3.  Se demostró la presencia de la enzima peroxidasa en muestras vegetales de tomatillo t omatillo ( Physalis  Physalis philadelphica), philadelphica), mediante un cambio de coloración del reactivo de guayacol a color marrón ladrillo que demuestra la oxidación de sustrato. s ustrato.

 

 

IX. 

Bibliografía   Bibliografía

Cancho, L., García, C., Molano, N., Morejo, J., & Alfonso, F. (2012). Acción y reconocimiento de la catalasa. Revista IES San Pedro de Alcántara, Alcántara, 3-5.  Cheng, Q., Cheng, M., Wang, Y., Yao, M., Chen, Y., Gao, Y., & Ding, W. (2014). A simple method of catalase purification for the undergraduate experimental course. Molecular Medicine Reports,, 1340-1343. Reports Currea, C., & Martínez, S. (2014). La enzima caatlasa y su acción en tejidos animales y vegetales.  vegetales.  Villavicencia, Colombia: Universidad de los Llanos. Días, A. (11 de Marzo de 2003). Estructuras de las catalasas. Obtenido catalasas. Obtenido de Departamento de Bioquímica, Instituto de Fisiología Celular: http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/2003-2_LA%20ESTRUC_.pdf Guarachi Condori, M., Paz Garcia, M., Terrazas Siles , E., & Giménez Turba, A. (2008). ÓRGANO OFICIAL DEL COLEGIO DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA DE BOLIVIA. BOLIVIA . Obtenido de http://www.revistasbolivianas.org.bo/pdf/rbfb/v16n1/v16n1a08.pdf Hans, E., & Wauwatousa, W. (1961). Method of extracting catalase from liver. MIlwaukee: liver.  MIlwaukee: United States Patent Office. Matus Trujillo, M., Díaz Solares, M., & Samaniego , L. (septiembre de 2017). Expresión de la enzima  peroxidasa en plantas de Saccharum Saccharum sp. híbrido inoculadas co con n Xanthomonas albilineans  Ashby (Dowson). (Dowson). Obtenido de http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S086403942017000300004 Mazorra, L. M., & Nuñez, M. (2003). INFLUENCIA DE ANÁLOGOS DE BRASINOESTEROIDESEN LA RESPUESTA DE PLANTAS DE TOMATE A DIFERENTESESTRÉS AMBIENTALES. Cultivos Tropicales,, 35-40. Tropicales Tejón, J. M., Garrido, A., Blanco, D., Villaverde, C., Mendoza, C., Rampirez, & Jesús. (2006). Fundamentos de Bioquímica estructural. Madrid: estructural. Madrid: Tébar. Túñez, I., Galván, A., & Fernández, E. (s.f.). pH (s.f.). pH y amortiguadores: Tampones fisiológicos fisiológicos . Rabanales, . Rabanales, España: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-Universidad de Córdoba. Universidad de Vigo. (2018). Hatlas de histología animal y vegetal . Obtenido de La célulaPerixosomas: https://mmegias.webs.uvigo.es/5-celulas/6-peroxisomas.php https://mmegias.webs.uvigo.es/5-celulas/6-peroxisomas.php Universidad del Zulia. (s.f.). Facultad de Ciencias Veterinarias. Veterinarias. Obtenido de Prácticas de BioquímicaActividad enimática de la catalasa sanguínea: http://www.fcv.luz.edu.ve/images/stories/catedras/bioquimica/03_actividad_enzimatica_de  _la_catalasa_sanguinea.pdf