Imunologia-SEBENTA

IMUNOLOGIA 2009/2010

Licenciatura em Bioquímica

Joana Maria Soares Pereira

3º Ano

FCUP/ICBAS

2009/2010

Imunologia

INTRODUÇÃO AO SISTEMA IMUNITÁRIO VISÃO GERAL DA RESPOSTA IMUNE

Imunidade A Imunidade refere-se à protecção da doença, mais especificamente, da doença infecciosas. As células e as moléculas responsáveis pela imunidade constituem o sistema imunitário, e a sua resposta colectiva e coordenada à introdução de substâncias estranhas é referida como resposta imune. Assim, as funções do sistema imunitário são:     

Defender o organismo de micróbios e de substâncias estranhas não infecciosas; Defesa contra infecções; Defesa contra certos tumores; Impede a transplantação; Causador de algumas doenças.

Em adição, mecanismos que normalmente protegem individuos da infecção e eliminam substâncias estranhas são capazes de causar dano tecidular e doença em alguns casos. Portanto, podemos definir em melhor extensão: 

Resposta imune – acção contra componentes dos micróbios, a macromoléculas, como proteinas e polissacarideos, e a pequenos químicos que são reconhecidos como estranhos, descuidando a consequência fisiológica ou patológica de tal reacção.

A resposta imune usa mecanismos protectores para controlar e eliminar os micróbios infecciosos. Todos esses mecanismos se baseiam na detecção de características estruturais do agente patogénico que os distinguem das células do hospedeiro. Tal discriminação entre o agente infeccioso e o hospedeiro é essencial para permitir ao hospedeiro eliminar o microorganismo patogénico sem ocorrer dano excessivo dos tecidos do hospedeiro. A imunologia é o estudo da resposta imune no seu sentido lato e dos eventos celulares e moleculares que ocorrem após um organimo entrar em contacto com um micróbio e outras macromoléculas estranhas.

Perspectiva Histórica A imunologia cresceu da observação de que individuos que recuperavam de certas doenças infecciosas estavam protegidos contra a doença: Immunis  isento Imunidade  estado de protecção contra uma doença infecciosa Joana Maria Soares Pereira

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Na história da imunologia encontram-se vários nomes: 

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Thucydides, ao descrever uma praga em Atenas, escreveu em 430 a.C. que apenas aqueles que recuperaram da praga conseguiam podiam cuidar a doença pois não eram capazes de contrair a doença uma segunda vez; Edward Jenner, um médico inglês, reparou que vacas que tinham recuperado da varíola bovina nunca contraiam a varíola mais séria. Na base da sua observação, ele injectou material de uma pústula (pequena borbulha característica da varíola) de varíola bovina no braço de um rapaz de 8 anos de idade. Quando este rapaz foi mais tarde inoculado intencionalmente com varíola, a doença não se desenvolveu. O seu trabalho quanto à vacinação (vaccinus  vaca) foi publicado em 1798. Este método permitiu que a varíola fosse a primeira doença erradicada por todo o mundo; Louis Pasteur cresceu bactérias que pensava provocarem cólera aviária em cultura e mostrou que galinhas injectadas com as bactérias desenvolviam cólera. Após regressar de umas férias, ele injectou algumas galinhas com uma cultura antiga e estas ficaram doentes mas, para surpresa de Pasteur, elas recuperaram. Pasteur cresceu então uma nova cultura de bactérias com a intenção de as injectar noutras galinhas, mas o suprimento em galinhas era baixo e, portanto, ele usou as galinhas já anteriormente inoculadas. De novo para sua surpresa, as galinhas estavam protegidas da doença. Assim, ele mostrou que a idade enfraqueceu a virulência do patogénio e que tal estirpe atenuada pode ser usada para proteger da doença. À estirpe atenuada ele deu o nome de vacina, em honra ao trabalho de Jenner. Pasteur extendeu as suas descobertas a outras doenças, demonstrando que era possivel atenuar, ou enfraquecer, um patogénio e administrar a estirpe atenuada como uma vacina. Em 1885, Pasteur administrou pela primeira vez a sua vacina num humano, um pequeno rapaz que tinha sido mordido repetidamente por um cão com raiva. O rapaz Joseph Meister, foi inoculado com uma séria de preparações de virus da raiva atenuadas e sobreviveu.

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No entanto, a vacinação com estirpes atenuadas apresenta desvantagens:  

Pessoas imunodeficientes são susceptiveis a ataque pela estirpe atenuada; Os microorganismos podem não permanecer atenuados.

Podemos ainda definir dois tipos de vacinas:  

Terapeuticas, que são usadas após a inoculação com o agente patogénico e que permitem lutar contra este; Preventivas, que são usadas antes da inoculação e que previnem a resposta imune.

Imunidade Inata e Adaptativa A defesa contra micróbios é mediada pelas primeiras reacções da imunidade inata e pelas respostas mais tardias da imunidade adaptativa:

Estes dois tipos de imunidade diferem pelas suas caracteristicas e componentes: Caracteristicas Especificidade Diversidade Memória Auto-tolerância Componentes Barreiras celulares e químicas Proteínas sanguineas Células

Imunidade Inata

Imunidade Adaptativa

Para estruturas partilhadas por grupos de microorganismos relacionados Limitada; codificada pela linhagem germinativa Não Sim

Para antigénios dos microorganismos e para antigénios não microbianos Elevada; receptores são produzidos por recombinação somática de segmentos de genes Sim Sim

Pele, epitélio mucoso; químicos antimicrobianos Sistema complemento, outras Fagócitos (macrófagos, neutrófilos), células naturalmente assassinas (NK cells)

Linfócitos no epitélio; anticorpos secretados nas superficies epiteliais Anticorpos Linfócitos, células dendriticas

A imunidade inata e a adaptativa constituem componentes de sistemas integrados de defesa do hospedeiro nos quais numerosas células e moléculas funcionam cooperativamente:

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Os mecanismos da imunidade inata fornecem uma defesa inicial potente contra as infecções; No entanto, vários micróbios patogénicos evoluiram de modo a resistir à imunidade inata, e a sua eliminação requer os mecanismos mais poderosos da imunidade adaptativa; A resposta imunitária inata aos micróbios também estimula a resposta adaptativa e influência a sua natureza; A imunidade inata é filogeneticamente o sistema de defesa do hospedeiro mais antigo.

Imunidade Inata A Imunidade Inata, também chamada de imunidade nativa, fornece a primeira linha de defesa contra os micróbios. Consiste nos mecanismos bioquímicos e celulares de defesa que estão em vigor mesmo antes da infecção e estão bem posicionados para responder rapidamente à infecção: 

Estes mecanismos reagem apenas contra micróbios e produtos de células danificadas, e respondem essencialmente do mesmo modo para repetidas infecções.

Os principais componentes da imunidade inata são: Tipo de Componente Barreiras anatómicas Pele Membranas mucosas

Barreiras fisiológicas Temperatura Baixo pH Mediadores químicos

Barreiras fagociticas/endociticas Barreiras inflamatórias

Mecanismo Barreira mecânica que retarda a entrada de micróbios; Ambiente acidico (pH 3-5) retarda o crescimento de micróbios; Flora normal compete como micróbios para locais de ligação e nutrientes; Muco impede a entrada de microorganismos; Cilios levam os microorganismos para fora do corpo Temperatura corporal normal inibe o crescimento de alguns patogénios; Febre inibe o crescimento de alguns patogénios Acidez do estômago mata a maior parte dos microorganismos ingeridos Lisozimas quebram a parede celular; Interferon induz um estado antiviral em células não infectadas; Sistema complemento lisa microorganismos ou facilita a fagocitose; Receptores toll-like reconhecem moleculas microbianas, sinal celular para a secreção de citocinas imunostimulatórias; Colectinas rompem a parede celular do patogénio Várias células internalizam (endocitose) e quebram macromoléculas estranhas; Células especializadas (monócitos, neutrófilos, macrofagos) internalizam (fagocitose), matam e digerem microorganismos inteiros Dano tecidular e infecção induzem células fagocitárias para a área afectada

Os mecanismos da imunidade inata são especificos para estruturas que são comuns para grupos de microorganismos relacionados e não distinguem diferenças ligeiras entre substâncias estranhas: 



PAMPS – o sistema imunitário inato reconhece estruturas que são compartilhadas por várias classes de micróbios e não estão presentes nas células do hospedeiro, as pathogen associated molecular patterns. Existem na superficie dos patogénios e avisam a entrada destes, podendo ser reconhecidos por receptores; DAMPS – o sistema imunitário inato reconhece estruturas encontradas nas células do hospedeiro em stress ou mortas, as danger associated molecular patterns.

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Imunidade Adaptativa Em contraste com a imunidade inata, a imunidade adaptativa é estimulada pela exposição a agentes infecciosos e aumenta em magnitude e capacidades defensivas com cada exposição sucessiva a um micróbio particular. Assim, esta forma de imunidade desenvolve-se como uma resposta à infeccção e adapta-se à infecção:   

Têm grande especificidade para moléculas distintas e habilidade para relembrar e responder mais vigorosamente a esposições repetidas ao mesmo micróbio; É capaz de reconhecer e reagir contra um grande numero de substâncias microbianas e não microbianas; Tem uma extraordinária capacidade de distinguir entre diferentes micróbios e moléculas, mesmo que intamamente relacionadas, o que a torna muito especifica;

Os principais componentes da imunidade adaptativa são linfócitos e seus produtos secretórios, como os anticorpos. Substâncias estranhas que induzem respostas imunitárias especificas ou são os alvos de tais respostas são designados antigénios.

Tipos de respostas imunitárias adaptativas Existem dois tipos de respostas imunitárias adaptativas que são mediadas por diferentes componentes do sistema imunitário e funcionam para eliminar diferentes tipos de micróbios:

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Imunidade humoral – mediada por moléculas no sangue e nas secreções da mucosa, designados anticorpos, que são produzidos por células designadas linfócitos B. Os anticorpos reconhecem antigénios microbianos, neutralizam a infectividade dos micróbios e marcam micróbios para eliminação por variados mecanismos efectores. Este é o principal mecanismo de defesa contra micróbios extracelulares e as suas toxinas porque os anticorpos secretados podem ligar-se a esses micróbios e toxinas e assistir a sua eliminação. Os anticorpos são especializados: diferentes tipos de anticorpos promovem a fagocitose de micróbios por células do hospedeiro e outros ligam-se e provocam a libertação de mediadores inflamatórios das células;



Imunidade mediada por células – é mediada por linfócitos T. Microbios intracelulares, como os virus e algumas bactérias, sobrevivem e proliferam dentro do fagócito e de outras células hospedeiras, onde estão inacessiveis para os anticorpos circulantes. Defesa contra tais infecções é função deste tipo de imunidade, que promove a destruição de micróbios que residem em fagócitos ou a morte das células infectadas, para elimnar os reservatórios de infecção.

A imunidade protectora contra um micróbio pode ser induzida por resposta do hospedeiro ao micróbio ou pela transferência de anticorpos ou linfócitos especificos para o micróbio:



Imunidade activa – forma de imunidade que é induzida pela exposição a um antigénio estranho. Assim, o individuo imunizado tem um papel activo na resposta ao antigénio. Individuos e linfócitos que não encontraram um antigénio particular são designados de naive, implicando que sejam imunologicamente inactivos. Individuos que responderam a um antigénio microbiano e estão protegidos de subsequentes exposições ao micróbios são designados de imunes;



Imunidade passiva – forma de imunidade que é conferida a um individuo por transferência de soro ou linfócitos de um individuo especificamente imunizado. O recebedor de tal transferência torna-se imune a um antigénio particular sem nunca ser exposto ou ter respondido a esse antigénio. É um método util para conferir imunidade rapidamente. Um exemplo é a transferência de anticorpos maternais para o feto, que permite aos recém-nascidos combater infecções antes de desenvolverem a habilidade de produzirem anticorpos.

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Principais Características da Resposta Imunitária Adaptativa Ambas as respostas imunitárias mediadas por células ou humorais a antigénios estranhos têm um numero de propriedades fundamentais que reflectem as propriedades dos linfócitos que medeiam essas respostas:



Especificidade e diversidade – as respostas imunes são especificas para antigénios distintos e para diferentes porções de um único complexo proteico, polissacarideo ou outras moléculas. As partes de tais antigénios que são especificamente reconhecidas por linfócitos individuais são desigandos epitopos. Esta fina especificidade existe porque linfócitos individuais expressam receptores de membrana que são capazes de distinguir diferenças subtis na estrutura de diferentes antigénios. Clones de linfócitos com diferentes especificidades estão presentes em individuos não-imunizados e são capazes de reconhecer e responder a antigénios estranhos. O numero total de especificidades de antigénios dos linfócitos de um individuo é extremamente elevado. esta diversidade é o resultado da variabilidade em estruturas dos locais de ligação a antigénios dos receptores nos linfócitos;



Memória – exposição do sistema imunitário a antigénios estranhos aumenta a sua habilidade para responder de novo a esse antigénio. As respostas a exposições seguintes ao mesmo antigénio são normalmente mais rápidas, maiores e qualitativamente diferente da primeira. A memória imunológica ocorre parcialmente porque cada exposição ao antigénio expande a clonagem de linfócitos para antigénios especificos. Em adição, estimulação de linfócitos naive por antigénios gera células de memória de longa vida. Estas células de memória apresentam caracteristicas especiais que as torna mais eficientes na resposta e eliminação do antigénio do que os linfócitos naive. Os linfócitos B de memória produzem anticorpos que se ligam a antigénios com maior afinidades que os anticorpos produzidos nas respostas imunitárias primárias, e os linfócitos T de memória reagem muito mais rapida e vigorosamente ao antigénio do que os linfócitos T naive;



Expansão clonal – os linfócitos sofrem proliferação considerável a seguir à exposição ao antigénio. Este termo refere-se ao aumento do número de células que expressam receptores idênticos para o antigénio. Este aumento no numero de células especificas para um antigénio permite que a resposta imunitária adaptativa ocorra rapidamente;

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Especialização – o sistema imunitário responde por vias distintas e especiais a diferentes micróbios, maximizando a eficiência dos mecanismos de defesa antimicrobianos. Assim, a imunidade humoral e a mediada por células são elicitadas por diferentes classes de micróbios ou pelo mesmo micróbio em diferentes estágios da infecção (extracelular e intracelular), e cada tipo de resposta imunitária protege o hospedeiro contra essa classe de micróbio. Mesmo dentro das respostas humorais ou mediadas por células, a natureza dos anticorpos ou dos linfócitos T que são gerados pode variar entre classes de micróbios;



Contracção e homeostasia – todas as respostas imunes normais desvanescem com o tempo após a estimulação pelo antigénio, sendo que o sistema imunitário retorna ao seu estado basal, o que se designa de homeostasia. A contracção da resposta imune ocorre largamente porque respostas que são provocadas por antigénios funcionam para eliminar os antigénios, sendo assim a eliminação o estimulo essencial para a sobrevivência e activação dos linfócitos;



Auto-tolerância – uma das propriedades mais importantes do sistema imunitário de todos os individuos normais é a sua habilidade para reconhecer, responder, e eliminar antigénios estranhos enquanto não reage com as substâncias antigénicas desse individuo. A ausência de resposta imunológica é chamado de tolerância. A tolerância a antigénios do próprio, ou autotolerância, é mantida por vários mecanismos, que incluem a eliminação de linfócitos que expressam receptores especifico para alguns antigénios do próprio e permitindo que linfócitos encontrem outros antigénios do próprio de modo a que leve à inactivação funcional ou à morte de linfócitos auto-reactivos. Anormalidades nestes sistemas levam a respostas auto-imunes.

Estas caracteristicas da imunidade adaptativa são necessários caso o sistema imunitário esteja a desempenhar as suas funções normais de defesa do hospedeiro: Caracteristica Especificidade Diversidade Memória Expansão clonal Especialização Contracção e homeostasia Auto-tolerância

Significado Funcional Assegura que antigénios distinctos provoquem respostas especificas Permite que o sistema imunitário responda a uma garnde variedade de antigénios Leva ao aumento da resposta a exposições repetidas ao mesmo antigénio Aumenta o numero de linfócitos especificos para um antigénio Gera respostas que são óptimas para a defesa contra diferentes tipos de micróbios Permite que o sistema imunitário responda e novos antigénios Previne o dano do hospedeiro durante a resposta a antigénios estranhos

Componentes Celulares do Sistema Imunitário Adaptativo As principais células do sistema imunitário são os linfócitos, as células apresentadoras de antigénios e as células efectoras. Os linfócitos são as células que reconhecem e respondem especificamente a antigénios estranhos e são, assim, mediadores da imunidade humoral e mediada por células. Existem distintas subpopulações de linfócitos que diferem na sua função: 

Linfócitos B – são as únicas células capazes de produzir anticorpos. Reconhecem antigénios extracelulares (incluindo da superficie celular) e diferenciam-se entre plasmócitos que secretam anticorpos, funcionando como mediadores da imunidade humoral;

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Linfócitos T – as células da imunidade mediada por células. Reconhecem antigénios de micróbios intracelulares e destroem esses micróbios ou as células infectadas. Os linfócitos T não produzem anticorpos. Os seus receptores de antigénios são moléculas de membrana distintas mas estruturalmente relacionadas com anticorpos. Estas células apresentam uma especificidade restrita para os antigénios, reconhecem apenas antigénios péptidicos ligados a proteinas do hospedeiro codificadas por genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e que são expressas na superficie de outras células. Como resultado, estas células T reconhecem e respondem a células associadas pela superficie mas não a antigénios soluveis; Células naturalmente assassinas (NK) - envolvidas na imunidade inata contra virus e outros micróbios intracelulares.

Os linfócitos T consistem em populações funcionalmente distintas de células: 

 

Linfócitos T helper (TH cells) – em resposta a estimulação antigénica, secretam proteinas denominadas citocinas, cujas funções são estimular a proliferação e diferenciação de linfócitos T e activar outras células, incluindo linfócitos B, macrófagos e outros leucócitos. Apresentam à sua superficie CD4; Linfócitos T citotóxicos (TC cell) – matam células que produzem antigénios estranhos, como células infectadas por virus e outros micróbios intracelulares. Apresentam à sua superficie CD8; Linfócitos T reguladores – alguns linfócitos T e funcionam principalmente de modo a inibir a resposta imunitária.

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Diferentes classes de linfócitos podem ser distinguidas pela expressão de proteinas de superficie que são chamadas “moléculas CD” e numeradas:

A iniciação e desenvolvimento da resposta imunitária adaptativa requer que os antigénios sejam capturados e disponibilizados a linfócitos especificos. As células que têm este papel são as células apresentadoras de antigénio (APCs): 



Células dendriticas – as células apresentadoras de antigénios mais especializadas e capturam antigénio microbianos que entram apartir do ambiente externo, os transportam para os orgãos linfoides e apresentam os antigénios ao linfócitos T naive para iniciar respostas imunitárias; Outros tipos de células funcionam como ACPs em diferentes estágios das respostas imunes humoral ou mediada por células.

A activação dos linfócitos pelo antigénio leva à geração de numerosos mecanismos que funcionam para eliminar o antigénio. Esta eliminação normalmente requer a participação de células que são designadas de células efectoras porque elas ela medeiam o efeito final da resposta imunitária, que é eliminar o micróbio: 

Linfócitos T activados, fagocitos mononucleares e outros leucócitos funcionam como células efectoras em diferentes respostas imunitárias.

Os linfócitos e as APCs estão concentradas em orgãos linfáticos anatomicamente discretos, onde interagem com um outro para iniciar respostas imunitárias. Os linfócitos estão também presentes no sangue, e daqui podem recircular para tecidos linfáticos e para locais periféricos onde houve exposição ao antigénio para o eliminar.

Disfunção Imunitária e suas Consequências Embora a resposta imunitária inata e adaptativa tenham mecanismos de acção diferentes, o sinergismo entre elas é essencial para uma resposta imune eficaz. No entanto, é importante regular as vias de resposta imune:  

Evitar a activação excessiva de linfócitos e o dano de tecidos durante o desenvolvimento de uma resposta protectora normal contra os micróbios; Prevenir reacções inapropriadas contra auto-antigénios.

Por vezes, o sistema imunitário falha na protecção adequada do hospedeiro ou então desvia as suas actividades causando desconforto, doença debilitante ou mesmo morte. Existem várias manifestações comuns de disfunção imune:  

Alergia e asma; Rejeição de tecidos transplantados ou do próprio hospedeiro;

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Doença auto-imune; Imunodeficiência.

Alergia e asma A alergia e a asma resultam de respostas imunitárias inapropriadas, normalmente a antigénios comuns como o pólen, alimento ou pêlos de animais. Reacções alérgicas constituem respostas baseadas principalmente na classe de imunoglobulinas IgE. A exposição do antigénio (ou alergénio) provoca uma estimulação pela IgE da libertação imediata de moléculas que causam sintomas que vão desde espirros e dermatites a inflamação dos pulmões num ataque asmático: 



Quando o anticorpo produzido após o contacto com o alergénio é do tipo IgE, esta classe de anticorpo reage via a sua região constante com mastócitos; A reacção subsequente do local de ligação do anticorpo com o alergénio provoca a secreção de moléculas que causam sintomas alergénicos pelos mastócitos a que a IgE está ligada.

O desconforto de alergias comuns, como a pólen de plantas, consiste numa ou duas semanas de espirros e coriza (inflamação da mucosa nasal, acompanhada de secreção e obstrução nasal), que parece trivial quando comparado com problemas como câncro, paragem cardíaca ou infecções de tratamento continuo. A asma constitui uma resposta alérgica mais séria, uma doença crónica dos pulmões na qual a inflamação, mediada por antigénios ambientais ou infecções, causa dificuldade severa na respiração. Resposta a transplantes Quando o sistema imunitário encontra células ou tecidos estranhos, ele responde fortemente para proteger o hospedeiro de invasores. No entanto, em alguns casos, a transplantação de células ou de um órgão de outro individuo, apesar de ser visto pelo sistema imunitário como uma invasão, poderá ser o único tratamento possivel para uma doença:  

Como o sistema imunitário irá atacar e rejeitar qualquer orgão transplantado que não reconhece como próprio, é uma barreira a este potencial tratamento vital; Um risco adicional ao transplante está no facto de que qualquer células transplantada com actividade imunológica irá reconhecer o hospedeiro como estranho e reagir contra este, o que pode ser uma resposta fatal.

Estas reacções de rejeição podem ser suprimidas por drogas, mas este tipo de tratamento suprime toda a função imunitária, pelo que o hospedeiro deixa de estar protegido pelo seu sistema imunitário e torna-se susceptivel a doenças infecciosas.

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Doença auto-imune Em certos individuos, o sistema imunitário funciona de modo errado por perda da sua auto-tolerância, o que permite um ataque imunitário contra o hospediro. Esta condição, auto-imunidade, pode levar a várias doenças crónicas debilitantes e os sintomas diferem dependendo dos tecidos e orgãos que estão a ser sujeitos a ataque:   

Esclerose múltipla – devido a ataque auto-imune do cérebro e do sistema nervoso central; Doença de Crohn – devido a ataque dos tecidos do intestino; Artrite reumatóide – devido a ataque nas articulações dos braços e pernas.

Estas respostas podem ser provocadas e sustentadas por factores genéticos e ambientais. Imunodeficiência Se qualquer um dos componentes da imunidade inata ou adaptativa estiver deficiente devido a anormalidades genéticas, ou se qualquer função imunitária é perdida devido a dano por agentes quimicos, fisicos ou biológicos, ocorre imunodeficiência. Nestes casos, diz-se que o hospedeiro sofre de imunodeficiência e a sua severidade depende do numero de componentes afectados:  

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Imunodeficiência selectiva – quando apenas um tipo de imunoglobulina, IgA, está em falta; Imunodeficiência combinada severa (SCID) – afecta tanto os linfócitos T e B e, se não tratada, resulta em morte por infecção na idade jovem. Normalmente, são os doentes que têm de viver dentro de “bolhas” para sobreviver; Sindrome da imunodeficiência adequirida (SIDA) – é a forma mais comum de imunodeficiência e resulta da infecção com o retrovirus da imunodeficiência humana (HIV). Aqui os linfócitos T são infectados e e destruidos pelo HIV, causando o colapso do sistema imunitário.

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IMUNIDADE INATA

Imunidade Inata A imunidade inata constitui a primeira linha de defesa contra infecções. Os mecanismos da imunidade inata existentes antes do encontro com microorganismos são rapidamente activados pelos microorganismos antes do desenvolvimento das respostas imunes adaptativas: 

A imunidade inata é, filogeneticamente, o mecanismos de defesa contra microorganismos mais antigo e co-evolui com os microorganismos para proteger todos os organismos multicelulares, incluindo plantas e insectos.

A imunidade inata tem duas importantes funções: 

Resposta inicial ao microorganismos – previne, controla ou elimina infecções do hospedeiro. A inibição ou eliminação qualquer um dos mecanismos da imunidade inata aumenta marcadamente a susceptibilidade a infecções, mesmo quando o sistema inume adaptativo está intacto e funcional. Muitos microorganismos patogénicos evoluiram estratégias para resistir à imunidade inata e essas estratégias são cruciais para a sua virulência. Na infecção por tais microorganismos, as defesas da imunidade inata devem manter a infecção controlada até que as respostas imunes adaptativas sejam activadas. As respostas imunes adaptativas, sendo mais potentes e especializadas, são capazes de eliminar microorganismos que resistem aos mecanismos de defesa inatos;



Estimula as respostas imunes adaptativas e influencia a sua natureza – assim, optimiza as respostas imunes adaptativas contra diferentes tipos de microorganismos. A imunidade inata não serve só como um mecanismo de defesa antes da infecção, mas também fornece o “aviso” de que uma infecção está presente contra a qual uma resposta imune adaptativa será subsequentemente montada. Ainda, diferentes componentes da resposta imune inata normalmente reagem de modos distintos a diferentes microorganismos e, portanto, influencia o tipo de resposta adaptativa que se desenvolve.

Alguns componentes da imunidade inata funcionam continuadamente, a todo o momento, mesmo antes da infecção. Estes componentes incluem barreiras à entrada microbiana fornecidas pelas superficies epiteliais, como a pele e os epitelios dos tractos gastrointestinal e respiratório. Outros componentes são normalmente inactivos mas estão prontos a responder rapidamente na presença de microorganismos, como os fagocitos e o sistema complemento.

Caracteristicas do Reconhecimento Imune Inato A especificidade do sistema imunitário inato para produtos microbianos difere da especificidade do sistema imune adaptativo em vários aspectos: 1. Os componentes da imunidade inata reconhecem estruturas que são carateristicas de patogénios microbianos que não estão presentes nas células do hospedeiro – o sistema imune inato reconhece apenas um numero limitado de produtos microbianos, enquanto o sistema imune adaptativo é capaz de reconhecer uma gama mais ampla de substâncias estranhas mesmo que sejam ou não produtos microbianos: Joana Maria Soares Pereira

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As substâncias microbianas que estimulam a imunidade inata são desiganados padrões moleculares associados a patogénios (PAMPs), e os receptores que ligam essas estruturas conservadas são designados receptores de reconhecimento de padrões; Diferentes classes de microorganismos expressam diferentes PAMPs. Essas estruturas incluem ácidos nucleicos que são únicos dos microorganismos (RNA de cadeia dupla encontrado em virus), caracteristicas de proteinas encontradas em microorganismos (iniciação por N-formilmetionina, tipico de proteinas bacterianas) e lipidos e carboidratos complexos que são sintetizados por microorganismos e não pelas células do hospedeiro (lipopolissacarideos em bactérias gram-positivo e oligossacarideos ricos em manose encontrados nos microorganismos e não nos mamiferos); Devido a esta especificidade por esturutras microbianas, o sistema imune inato é capaz de distinguir células do hospedeiro de células estranhas não pertencentes ao hospedeiro.

2. O sistema inume inato reconhece produtos microbianos que são normalmente essenciais para a sobrevivência dos microorganismos - esta adaptação do hospedeiro é importante porque assegura que os alvos da imunidade inata não possam ser descartados pelos microorganimos num esforço para escapar ao reconhecimento pelo hospedeiro. Em contraste, os microorganismos podem mutar ou perder alguns dos antigénios que são reconhecidos pelo sistema imune adaptativo, permitindo assim que os microorganismos escapem à defesa pelo hospedeiro sem compremeterem a sua sobrevivência; 3. As moleculas de reconhecimento de padrões da imunidade inata incluem receptores de reconhecimento de padrões expressos na superficie ou no interior da célula, e proteinas soluveis no sangue e no fluido extracelular – os receptores associados à célula podem ter duas funções principais, traduzindo sinais que activam funções antimicrobianas e pro-inflamatorias na célula em que são expressos e podem facilitar o uptake de microorganimos pela célula. Receptores soluveis são responsáveis por facilitar a eliminação de microorganismos do sangue, estimulando o seu uptake pelas células ou activando mecanismos extracelulares de morte dos microorganismos; 4. Os receptores de reconhecimento de padrões do sistema imune inato são codificados no DNA de germline – em contraste, linfócitos T e B, os principais componentes da imunidade inata, mudam o rearranjo de genes somático para gerar os seus receptores de antigénios. Como apenas poucos receptores podem ser codificados na germline, o sistema imune inato apresenta um reportório limitado de especificidades. Ainda, enquanto o sistema imune adaptativo consegue distinguir entre antigénio de um microorganismo, a imunidade inata consegue destinguir apenas classes de microorganismos; 5. O sistema imune inato também consegue reconhecer células do hospedeiro danificadas ou sob stress – células stressadas ou danificadas normalmente expressam moléculas não encontradas em abundância em células saudáveis, sendo assim facilmente reconhecidas pelo sistema imune inato. Células que são directamente infectadas ou que estão na vizinhança de outras células infectadas podem aumentar a expressão de moléculas deste tipo. Deste modo, a imunidade inata pode contribui para a eliminação de células que albergam microorganismos, mesmo se produtos microbianos não forem expostos na superificie da célula. Joana Maria Soares Pereira

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Receptores de Reconhecimento de Padrões Receptores toll-like

Lectinas tipo C

Receptores scavenger NLRs Receptores N-formil Met-LeuPhe Moleculas de Reconhecimento Soluveis Pentraxinas

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Localização Membrana plasmática e membranas endossomais de células dendriticas, fagocitos, endoteliais e muitos outros tipos de células Membrana plasmática dos fagócitos

Membrana plasmática dos fagócitos Citoplasma dos fagócitos e de outras células Mambrana plamsática dos fagócitos Localização Plasma

Colectinas

Plasma;

Ficolinas

Alvéolos Plasma

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Exemplos Especificos e os seus Ligandos PAMP TLRs 1-9: várias moléculas virais e microbianas

Receptor de manose: carboidratos na superficie microbiana com terminais de manose e frutose; Dectina: glicanos presentes nas paredes celulares dos fungos CD36: diacilglicerideos microbianos Nod1, Nod2 e NALP3: peptidoglicanos microbianos FPR e FRKL1: peptidos contendo residuos Nformilmetionil Exemplos Especificos e os seus Ligandos PAMP Proteinasreactivas C (CRP): fosforilcolina e fosfatidiletanolamina microbianas Lectina de ligação à manose (MBL): carboidratos com terminação em manose e frutose; Proteinas surfactantes SP-A e SP-D: várias estrutras microbianas Ficolina: componentes N-acetilglucosamina e ácido lipoteicoico das paredes celulares das bactérias gram-positivo 15

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Receptores de Reconhecimento de Padrões Uma grande variedade de tipos de células expressa receptores de reconhecimento de padrões e, portanto, participam na resposta imune inata. Mesmo assim, outras células também os expressam, mesmo não pertencendo à resposta imune inata. As células que os expressam são:       

Neutrófilos; Macrofagos; Célula dendriticas; Células endoteliais; Células epiteliais; Linfócitos; Etc…

Estes receptores de reconhecimento de padrões associados a células estão presentes na superficie da célula, em vesiculas endossomais e no citoplasma prontos a reconhecer microorganismos em qualquer uma dessas localizações: 

Receptores de reconhecimento de padrões estão ligados a vias de trasdução do sinal intracelulares que activam várias respostas celulares, incluindo a produção de moléculas que promovem a inflamação e a defesa contra o microorganismo.

Receptores toll-like (TLRs) Os TLRs são uma familia evolucionalmente conservada de receptors de reconhecimento de padrões expressa em vários tipos de células que exercem papeis essenciais nas respostas imunes inatas aos microorganismos: 

 

Toll foi originalmente identificada como um gene de Drosophila envolvido no estabelecimento do eixo dorso-ventral durante a embriogénese da mosca, mas subsequentemente foi também descoberto que as proteinas Toll também medeiam respostas antimicrobianas; Existem onze TLRs humanos diferentes, desigandos de TLR1 a 11; Todos estes receptores contêm um dominio homólogo a receptor Toll/IL-1 (TIR) na sua região citoplasmática, que é essencial na sinalização.

Os principais tipos de células que expressam TLRs incluem:     

Macrófagos; Células dendriticas; Neutrófilos; Células epiteliais da mucosa; Células endoteliais.

Os TLRs dos mamiferos estão envolvidos na resposta a vários tipos divergentes de moléculas que são normalmente expressas por células microbianas mas não dos mamíferos:

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 

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TLRs são encontradas na superficie celular e nas membranas intracelulares, e são assim capazes de reconhecer microorganismos em diferentes localizações celulares; Alguns dos produtos microbianos que estimulam a sinalização via TLR incluem LPS bacterianos gram-negativo, peptidoglicanos bacterianos gram-positivo, lipoproteinas bacterianas, ácido lipoteicoico, lipoarabinomannan, zymosan, a proteina microbiana flagelar fladelina, proteina de fusão do virus respiratório syncytial, motivos CpG não metilados, RNA de cadeia dupla, RNA de cadeia simples; TLRs 3, 7, 8 e 9 são maioritariamentente expressos dentro das células no reticulo endoplasmático (ER) e nas membranas endossomais, onde detectam ácidos nucleicos microbianos.

Apesar dos ligandos ácidos nucleicos reconhecidos pelos TLRs não serem todos produzidos unicamente por microorganismos, os ácidos nucleicos produzidos pelas células dos hospedeiros não se encontram normalmente nos endossomas, ou seja, os TLRs 3, 7, 8 e 9 destinguem substâncias próprias de estranhas baseado na localização celular dos ligandos a que se ligam. Várias vias de sinalização ligam o reconhecimento por TLR de ligandos microbianos com a activação de factors de transcrição, resultando na expressão de genes importantes para a resposta imune inata: 

Essas vias de sinalização são iniciadas pela ligação do ligando ao TLR na superficie da célula, ou no reticulo endoplasmático ou nos endossomas, levando à dimerização das proteinas do TLR;

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A dimerização do TLR é acompanhada pelo recrutamento de proteinas adaptadoras contendo um dominio TIR, que facilitam o recrutamento e a activação de várias proteinas cinases, levando à activação de diferentes factores de transcrição.

Os principais factores de transcrição que são activados pelas vias de sinalização dos TLRs são: 



Factor nuclear KB(NF-KB) e/ou AP-I – estimulam a expressão de genes que codificam várias moléculas da resposta imune inata, incluindo citocinas inflamatórias (p. e. TNF e IL-1), quimiocinas (p. e. CCL2) e moléculas de adesão endotelial (p. e. E-selectina); IRF-3 e IRF-7 – promovem a expressão de genes do interferão, importante para a resposta imune inata aos virus.

O uso de diferentes proteinas adaptadoras por diferentes TLRs fornece alguma variabilidade no tipo de resposta celular que é estimulada por produtos microbianos distintos.

Componentes do Sistema Imune Inato O sistema imune inato consiste em:  

Barreiras epiteliais; Células dos tecidos e circulantes;

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Proteinas plasmáticas.

As principais células efectoras do sistema imune inato são:   

Neutrófilos; Fagócitos mononucleares; Células naturalmente assassinas (NK).

Estas células atacam microorganismos que ultrapassaram as barreiras epiteliais e entraram nos tecidos ou na circulação. Cada um destes tipos de células tem um papel importante na resposta aos microorganismos. Algumas das células da imunidade inata, principalmente macrófagos e células naturalmente assassinas, secretam citocinas que activam fagócitos e estimulam a reacção celular da respsota imune, designada inflamação: 



A inflamação consiste no recrutamento de leucócitos e extravasão de várias proteinas plasmáticas para o local de infeccção, e activação dos leucócitos e de proteinas para a eliminação do agente infeccioso; A inflamação também é capaz de danificar tecidos normais.

Se os microorganismos entrarem na circulação, são combatidos por várias proteinas plasmáticas. As principais proteinas plasmáticas da imunidade inata são:  

Proteinas do sistema complemento; Outras proteinas plasmáticas que reconhecem estruturas microbianas, como a lectina que liga manose.

Barreiras Epiteliais As superficies epiteliais intactas formam barreiras intactas entre os microorganismos no ambiente externo e os tecidos do hospedeiro. 



As três principais interfaces entre o ambiente e o hospedeiro são a pele e as superificies mucosas dos tractos gastrointestinal e respiratório; Todas as três estão protegidas pelo epitélio continuo que previnem a entrada de micoorganismos, e a perda da sua integridade comummente leva a infecção.

O epitélio, tal como os leucócitos, produz péptidos que apresentam propriedades anti-microbianas. Existem duas familias estruturalmente distintas de peptidos anti-microbianos: 1. Defensinas – pequenos péptidos catiónicos, com cerca de 29 a 34 aminoácidos de comprimento, que contêm três ligações dissulfito intracadeia. Três familias de defensinas, designadas α, β e φ, são distinguidas pela localização dessa ligações. As defensinas são produzidas pelas células epiteliais das superficies mucosas e pelos leucócitos granulócitos, incluindo neutrófilos, células NK e linfócitos T citotóxicos. O conjunto das moléculas de defensinas produzidas difere entre diferentes tipos de células. As principais produtoras de defensinas são as células de Paneth nas criptas do intestino grosso. As defensinas destas células servem para limitar a quantidade de microorganismos no lumen. As defensinas são também Joana Maria Soares Pereira

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produzidas noutros locais no intestino, nas células da mucosa respiratória e na pele. Algumas defensinas são constitutivamente produzidas por alguns tipos de células, mas a sua secreção é aumentada por citocinas ou produtos microbianos. As acções protectoras das defensinas incluem:  Toxicidade directa aos microorganismos, incluindo bactérias e fungos;  Activação de células envolvidas na resposta inflamatória aos microorganismos. 2. Catelicidinas – são expressas pelos neutrófilos e por várias barreiras epiteliais,incluindo a pele, as células mucosas gastrointestinais e respiratórias. Uma proteina precursora da catelicidina de 18 kD é transcrita e proteoliticamente clivada em dois péptidos, cada um com funções protectoras. Tanto a sintese do percursor como a clivagem proteolitica são estimuladas pelas citocinas inflamatórias e por produtos microbianos. O fragmento N-terminal tem actividade antimicrobianas. E o C-terminal apresenta multiplas funções que servem para protecção contra a infecção, que incluem:  Toxicidade directa a uma gama larga de microorganismos;  Activação de várias respostas nos leucócitos e noutros tipos de células que promovem a erradicação de microorganismos;  Apresenta um dominio (LL-37) que se liga e neutraliza LPS, que é um componente tóxico da parede celular externa das bactérias gram-negativo. As barreiras epiteliais e as cavidades serosas contêm certos tipos de linfócitos, incluindo linfócitos T e B1 (um subgrupo de células B) intra-epiteliais, que reconhecem e respondem a microorganismos que encontram nesses locais. Uma terceira população de células presente nos epitélios e nas cavidades serosas são os mastócitos, que respondem directamente a produtos microbianos secretando citocinas e mediadores lipidos que promovem a inflamação. Fagócitos e Resposta Inflamatória As células efectoras mais numerosas do sistema immune inato são células derivadas da medula óssea que circulam no sangue e migram para os tecidos. Estas incluem:

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 

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Células da linhagem mielóide – incluindo os neutrófilos, fagócitos mononucleares e células dendriticas; Células da linhagem linfoide – incluindo as células naturalmente assassinas, as células dendriticas e os linfócitos T e B.

Os fagócitos, incluindo os neutrófilos e os macrófagos, são células cuja a função primária consiste na identificação, ingestão e destruição dos microorganismos. As suas respostas funcionais na defesa do hospedeiro consiste numa sequência de passos:     

Recrutamento activo de células para o local de infecção; Reconhecimento de microorganismos; Ingestão de microorganismos pelo processo de fagocitose; Destruição dos microorganismos ingeridos; Produzem citocinas, que apresentam várias funções nas respostas imunes inata e adaptativa e na reparação de tecidos.

Estas funções efectoras dos fagócitos são importantes não apenas na imunidade inata, mas também nas fases efectoras das respostas imunes adaptativas:  

Na imunidade mediada por células T, os linfócitos T estimulados por antigénios conseguem activar macrófagos para que estes se tornem mais eficientes na fagocitose; Na imunidade humoral, o revestimento por anticorpos, ou opsonização, dos micróbios promove a fagocitose destes pelos macrófagos, pois estes ultimos apresentam receptores de superficie para os anticorpos.

Granulócitos Os granulócitos são classificados em neutrófilos, eosinófilos ou basófilos com base na morfologia celular e nas caracteristicas da coloração citoplasmática: 





Os neutrófilos apresentam um núcleo multilobado e um citoplasma granulado que colora tanto com colorações acidicas como básicas; Os eosinófilos apresentam um núcleo bilobado e um citoplasma granulado que colora com a eosina (vermelho), uma coloração acidica; Os basófilos, apresentam um núcleo lobado e um citoplasma ricamente granulado que colora de azul devido à coloração básica azul de metileno.

Tanto os neutrófilos como os eosinófilos são fagócitos, enquanto os basófilos não o são. Os neutrófilos, que constituem 50%-70% dos leucócitos circulantes, são muito mais numerosas que os eosinófilos (1%3%) ou os basófilos (-1%).

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Neutrófilo

Eosinófilo

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Basófilo

Os neutrófilos, também designados leucócitos polinucleares, são a população de leucócitos circulantes mais abundante e medeiam as primeiras fases das respostas inflamatórias:  

Circulam como células esféricas com cerca de 12 a 15/lm de diâmetro com numerosas projecção da membrana; O seu núcleo é segmentado em três a cinco lóbulos ligado, daí a designação de leucócito polimorfonuclear.

O citoplasma dos neutrófilos apresenta grânulos de dois tipos: 1. Grânulos especificos – cheios de enzimas, como lisozimas, colagenase e elastase. Não coloram fortemente tanto como colorações acidicas ou básicas (eosina e hematoxilina, respectivamente), que distingue os grânulos dos neutrófilos dos dos eosinófilos e basófilos, respectivamente; 2. Grânulos azurófilos – lisossomas que contêm enzimas e outras substâncias microbicidas, incluindo defensinas e catelicidinas. Os neutrófilos são produzidos na medula óssea e surgem de uma linhagem comum com os fagócitos mononucleares, a linhagem mielóide:  

A produção de neutrófilos é estimulada pelo granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF); Um humano adulto produz mais de 1 x 1011 neutrófilos por dia, sendo que cada um circula no sangue por apenas cerca de 6 horas.

Os neutrófilos migram para os locais de infecção poucas horas depois da entrada dos microorganismos. Mas se um neutrófilo não for recrutado para o local de infecção nesse periodo, ele sofre apoptose e é normalmente fagocitado por macrófagos residentes no fígado ou no baço. Mesmo depois de entrarem nos tecidos, os neutrófilos funcionam durante poucas horas e depois morrem. Os eosinófilos, como os neutrófilos, são células fagociticas móveis que podem migrar do sangue para os espaços entre os tecidos. O seu papel fagocitico é menos importante que o dos neutrófilos, e parecem apresentar papel importante na defesa contra organismos parasitas: 

A secreção dos conteudos dos grânulos eosinófilos danificam a membrana do parasita.

Os basófilos são granulócitos não fagocitários que funcionam pela libertação de substâncias farmacologivamente activas dos seus granulos citoplasmáticos: 

Estas substâncias têm papel importante em certas respostas alérgicas.

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Fagócitos Mononucleares O sistema dos fagócitos mononucleares consiste em células que apresentam uma linhagem comum com a dos granulócitos, linhagem mielóide, e a sua função primária é a fagocitose, apresentando um papel importante na imunidade inata e adaptativa. As células do sitema fagocitário mononuclear originam-se na medula óssea, circulam no sangue e maturam-se, tornando-se activas em vários tecidos:





Monócito – é o primeiro tipo de célula que entra no sangue periférico depois de deixar a medula, estando diferenciada de modo incompleto. Apresenta 10 a 15/lm de diâmetro e apresenta um núcleo em forma de ferredura e um citoplasma fracamente granular contendo lisossomas, vacuolos fagociticos e filamentos do citoesqueleto; Macrófago – monócito maduro que se forma quando este entra nos tecidos. Os macrófagos podem assumir diferentes formas morfológicas depois da activação por vários estimulos externos, como os microorganismos. Alguns desenvolvem um citoplasma abundante e são designados células epitelioides devido à sua semelhança com as células epiteliais da pele. Macrófagos activados podem fundir-se formando células gigantes multinucleadas.

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A diferenciação dos monócitos em macrófagos tecidulares ocorre cerca de 8h após a libertação dos monócitos na circulação quando estes entram nos tecidos e envolve um número de alterações:   

A célula de tamanho 5 a 10 vezes; Os organelos intracelulares aumentam em número e complexidade; Aumenta a habilidade fagocitica, produzindo maiores niveis de enzimas hidroliticas e secretando uma varieade de factores soluveis.

Os macrófagos estão dispersos por todo o corpo. Alguns tomam residência num tecido particular, desigando-se macrófagos residentes, enquanto outros se mantêm moveis e são designados de macrófagos livres e viajam através dos tecidos por movimentos amebóide. Células do tipo macrófago apresentam diferentes funções me diferentes tecidos e são designadas de acordo com o tecido onde se localizam:      

Macrófagos alveolares no pulmão; Histiócitos nos tecidos conjuntivos; Células de Kupffer no fígado; Células mesangiais no rim; Células da microglia no cérebro; Osteoclastos no osso.

Apesar de normalmente se encontrarem num estado de repouso, os macrófagos são activados por uma variedade de estimulos activadores no decurso da resposta imune:  



A fagocitose de um antigénio particular funciona como o estimulo activante inicial; A actividade do macrófago pode também ser ainda aumentada por citocinas secretadas por linfócitos TH activados, por mediadores da resposta inflamatória e por componentes da parede bacteriana; Um dos activadores de macrófagos mais potentes é o interferão gama (IFN-γ) secretado pelos linfócito TH activados.

Os macrófagos activados são mais eficientes que os que se encontram em repouso na eliminação de potenciais patogénios, o que se deve ao facto de exibirem:       

Maior actividade fagocitica; Maior habilidade para matar microorganismos ingeridos; Maior secreção de mediadores inflamatórios; Maior habilidade para activar linfócitos T; Secretam várias proteinas citotóxicas que ajudam a eliminar uma gama alargada de patogénios, incluindo células infectadas com virús, células de tumores e bactérias intracelulares; Expressam elevados niveis de moléculas do MHC classe II, permitindo que funcionem mais efectivamente como células apresentadoras de antigénios; Macrófagos e linfócitos TH facilitam mutuamente a activação de ambos durante a resposta imune.

Devido ao facto de normalmente serem residentes num tecido, os macrófagos são as células do sistema imunitário com maior tempo de vida, mantendo-se normalmente inactivos, enquanto os neutrófilos vivem cerca de 6 horas e estão prontos a actuar. Joana Maria Soares Pereira

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Células Dendriticas As células dendriticas apresentam um papel importante nas respostas inatas a infecções e na ligação entre as respostas imunes inata e adaptativa:   

Apresentam longas projecções membranares e capacidade fagociticas, e são amplamente distribuidas pelos tecidos linfóides, epitélio mucoso e parenquima dos orgãos; São derivadas de precursores da medula óssea e as mais relacionadas em linhagem com os fagócitos mononucleares; Expressam receptores de reconhecimento de padrões e respondem aos microorganismos pela secreção de citocinas.

Existem vários tipos de células dendriticas, apesar da maior parte das células dendriticas maduras apresentarem a mesma função principal, a apresentação de antigénios aos linfócitos TH. são conhecidos quatro tipos de células dendrtiticas:    

Células de Langerhans; Células dendriticas intersticiais; Células dendriticas mielóides; Células dendriticas linfóides.

Cada um dos tipos de células dendriticas origina-se de células estaminais hematopoiéticas por diferentes vias e em diferentes localizações, podendo descender tanto da linhagem mielóide como linfóide. Apesar das sua diferenças, todas elas constitutivamente expressam elevados niveis de moléculas do MHC classe II e membros da familia co-estimulante B7. Assim, são células apresentadoras de antigénios mais potentes que os macrófagos e as células B, pois estes ultimos precisam de ser activados antes de funcionarem deste modo:   

Formas imaturas de cada um destes tipos de células dendriticas adquirem antigénior por fagocitose ou endocitose; O antigénio é processado e as células dendrtiticas maduras apresentam-no a linfócitos TH; Após a invasão microbiana ou durante a inflamação, formas maduras ou imaturas de células de Langerhans e celulas dendriticas intersticiais migram para nodos linfáticos de drenagem onde apresentam os antigénios a células TH, processo essencial para a iniciação da resposta por estas células chave.

Outro tipo de células dendrtiticas, as células dendriticas foliculares, não se originam nas medula óssea e apresentam uma função diferente das células dendriticas com origem na mdeula:  

Não expressam coléculas de MHC classe II, não funcionando como células apresentadoras de antigénios para a activação das células TH; Localizadas exclusivamente em estruturas organizadas dos nodos linfáticos designados foliculos linfáticos, que são ricos em células B;

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Expressam altos niveis de receptores de membranas para anticorpos, o que permite a ligação de complexos anticorpo-antigénio, assim, a interacção de células B com este antigénio ligado pode ter efeitos importantes na resposta dos linfócitos B.

Recrutamento de Leucócitos para o Local de Infecção Os neutrófilos e os monócitos são recrutados do sangue para os tecidos pela ligação a moléculas de adesão nas células endoteliais e por quimiotaxia em resposta a quimio-atraidores produzidos em resposta à infecção:  

Na ausência de infecção, estes leucócitos circulam no sangue e não migram para os tecidos; O seu recrutamento para locais de infecção é um processo com multiplos passos envolvendo a adesão de leucócitos circulantes à superficie luminal das células endoteliais nas vénulas póscapilares e migração através da parede do vaso.

Cada passo é orquestrado por diferentes tipos de moléculas: 1. Rolagem mediada por selectinas – em resposta aos microorganismos e a citocinas produzidas pelas células que encontram os microorganismos (e. g. macrófagos), as células endoteliais que revestem as vénulas pós-capilaresno local de infecção rapidamente aumentam a expressão de proteinas designadas selectinas à sua superficie. As citocinas mais importantes na activação do endotélio são o tumor necrosis factor (TNF) e a interleucina-I (IL-I). Os dois tipos de selectinas expressas pelas células endoteliais são a P-selectina, que é armazenada em grânulos citoplasmáticos e rapidamente redistribuida pela superficie em resposta a produtos microbianos e citocinas, e a E-selectina, que é sintetizada em resposta a IL-I e TNF como a produtos microbianos, e é expressa na superficie celular em 1 a 2 horas. Um terceira selectina, desiganada L-selectina (CD62L), é expressa nos linfócitos e outros leucócitos e funciona como receptor para linfócitos T naive e células dendriticas nos nodos linfáticos, mediando a sua ligação ao endotélio das vénulas. Nos neutrófilos, funciona para a ligação destas células a células endoteliais que foram activadas por citocinas (TNF, IL-I e IFN-γ) encontradas nos locais de infecção. Os leucócitos expressam L-selectina e os ligandos carboidratos para as P- e E-selectinas Joana Maria Soares Pereira

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nas pontas das sua microvilosidades, facilitando interacções com moléculas na superficie das células endoteliais. As interacções selectina-ligando são de baixa afinidade e facilmente quebradas pela força do sangue que flui. Como resultado, os leucócitos repetitivamente deligam-se e ligam-se à superficie endotelial. Este abrandamento dos leucócitos no endotélio permite o próximo passo de estimulos; 2. Activação das integrinas mediada por quimiocinas – quimiocinas são pequenas citocinas péptidicas produzidas por macrófagos tecidulares, células endoteliais e outros tipos de células em resposta a produtos microbianos e IL-I e TNF, citocinas associadas a infecções. A principal função das quimiocinas é estimular a quimotaxia das células. As quimiocinas produzidas num local de infecção são transportadas para a superficie luminal das células endoteliais das vénulas pós-capilares, onde se ligam da glicosaminoglicanos, e são apresentadas em em altas concentrações. Neste local, as quimiocinas ligam-se a receptores especificos de quimiocinas nas superficie do leucócito em rolagem. Os leucócitos expressão uma familia de moléculas de adesão designadas integrinas, que estão num estado de baixa afinidade nas células inactivas e não efectivos na mediação de interacções de adesão. Duas consequências da sinalização pelo receptor de quimiocinas são o aumento da afinidade das integrinas dos leucócitos e agrupamento membranar de integrinas, resultando num aumento da força da ligação mediada por integrinas dos leucócitos à superfici endotelial; 3. Adesão estável dos leucócitos ao endotélio mediada por integrinas – em paraleo com a activação das integrinas e a sua conversão ao estado de alta afinidade, as citocinas (TNF e IL-I) também aumentam a expressão endotelial de ligandos de integrina, principalmente vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1, o ligando da integrina VLA-4) e intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, o ligando para as integrinas LFA-1 e Mac-1). O resultado final destas alterações é a ligação firme do leucócito ao endotélio, sendo que o seu citoesqueleto se reorganiza e a célula se espalha pela superficie endotelial; 4. Migração dos leucócitos pelo endotélio (diapedése) – as quimiocinas actuam depois nos leucócitos aderentes e estimulam as células a migrar através dos espaços inter-endoteliais ao longo de um gradiente quimico de concentração das quimiocinas (i. e., para o local de infecção). Outras proteinas expressas nos leucócitos e células endoteliais, principalmente CD31, têm um papel importante nesta migração através do endotélio. Os leucócitos produzem enzimas que permite a sua passagem através das paredes dos vasos, e acumulam-se nos tecidos extravasculares à volta dos microorganismos infecciosos. A acumulação dos leucócitos nos tecidos é o principal componente da inflamação:  

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É tipicamente ilicitada pelos microorganismos, mas também pode ser observada na resposta a uma variedade de estimulos não infecciosos; Existe alguma especificidade no processo de migração de leucócitos baseado na expressão de combinações distinctas de moléculas de adesão e receptores de quimiocinas em neutrófilos e monócitos; Padrões temporariamente distintos de expressão de moléculas de adesão e quimiocinas nos locais de infecção tipicamente resulta no recrutamento inicial de neutrófilos (horas a dias) seguida do recrutamento mais tardio de monócitos (dias a semanas);

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Outras combinações de moléculas de adesão e de quimiocinas controlam a ligração de linfócitos para os tecidos linfóides ou não linfóides.

Fagocitose de Microorganismos Os neutrófilos e os macrófagos ingerem microorganismos em vesiculas pelo processo de fagocitose:  

Processo activo, dependente de energia de englobamento de particulas de grandes dimensões (> 0,5 µm de diâmetro); A morte dos microorganismos ocorre em vesiculas formadas pela fagocitose, estando assim o mecanismos de eliminação, que potencialmente poderia danificar o fagócito, estão isolados do resto da célula.

O primeiro passo é o reconhecimento do microorganismo pelo fagócito:  

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Os neutrófilos e os macrófagos são constantemente expostos a células normais, que ignoram, mas ingerem especificamente vários microorganismos e particulas; Esta especificidade deve-se ao facto de neutrófilos e macrófagos expressarem receptores que reconhecem especificamente microorganismos, e que estão funcionalmente ligados ao mecanismo de fagocitose; Alguns destes receptores são receptores de reconhecimento de padrões, incluindo lectinas do tipo-C e receptores scavenger. Receptores de reconhecimento de padrões podem contribuir para a fagocitose de apenas microorganismos que expressão padrões moleculares particulares, como a manose; Outro grupo de receptores nos fagócitos reconhecem certas proteinas do hospedero que revestem os microorganismos. Estas proteinas são designadas opsoninas, e incluem anticorpos, proteinas do complemento e lectinas, e cobrem o microorganismo alvo para fagocitose no processo designado de opsonização.

Os fagócitos apresentam receptores que se ligam especialmente a anticorpos, moléculas do complemento e lectinas com alta afinidade. Estes receptores são criticos para a fagocitose da maior parte dos microorganismos pelo processo de opsonização: Joana Maria Soares Pereira

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Um dos processo mais eficientes de opsonização de microorganismos é o seu revestimento com anticorpos. Os anticorpos apresentam locais de ligação ao antigénio numa extremidade e na outra extremidade, desiganada região Fc, o anticorpo interage com células efectoras e moléculas do sistema imune inato; Os fagócitos expressam receptores Fc de alta afinidade (FcyRI) especificos para um único tipo de anticorpo, o IgG. Assim, se um individuo responder a uma infecção com a produção de IgG contra agentes microbianos, a molécula de IgG liga-se a esse antigénio, a extremidade Fc interage com FcyRI nos fagócitos e o resultado final é a fagocitose eficiente dos microorganismos; Como diferentes anticorpos podem ser produzidos pela ligação de diferentes produtos microbianos, a opsonização mediada por anticorpos contribui para a fagocitose de uma larga gama de microorganismos em comparação com o reconhecimento de padrões; Apesar dos anticorpos IgG serem essenciais para uma fagocitose eficiente de vários organismos, eles são de facto um produto do sistema imune adaptativo (linfócitos B) que se envolve com as células efectoras do sistema imune inato (fagócitos) para que estas desempenham as sua funções; Vários receptores de reconhecimento de padrões soluveis e moléculas efectoras do sistema imune inato, incluindo complemento e lectinas, são opsoninas importantes, sendo que estão presentes no sangue e se ligam a microorganismos facilitando a fagocitose pelos fagocitos que expressam receptores para elas.

A opsonização aumenta bastante o grau de ligação da particula a fagocitar ao fagócito, sendo que o reconhecimento de anticorpos leva a um menor aumento relativamente ao do complemento. No entanto, a combinação de ambos leva a um elevado aumento da ligação, logo da actividade fagocitica.

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Quanto aos receptores de anticorpos ou do complemento, estes diferem:  

Receptores Fc – dependentes de cinase de tirosina, activam cdc42 e rac, e a inflamação envolve radicais de oxigénio, TNFα, IL-1 e IL-6; Receptores do complemento – independentes de cinases de tirosina, activam rho mas não cdc42 ou rac, e não provocam inflamação.

Receptores Fc

Receptores do Complemento

Assim que um microorganismo ou particula se liga ao receptor no fagócito, a membrana plasmática na região do receptor começa a redistribuir-se e extende projecções em volta do microorganismo ou particula:    

Quando a membrana saliente se extende para além do diâmetro da particula, o topo das saliências fecha-se e forma-se uma vesicula intracelular – fagossoma; Esta vesicula contém a particula estranha ingerida e distancia-se da membrana plasmática; Os receptores na superficie da membrana também transmitem sinais activadores que estimulam as actividade microbicidas dos fagócitos; Os micoorganismos fagocitados são destruidos e, ao mesmo tempo, são produzidos péptidos a partir de proteinas microbicidas e apresentados aos linfócitos T para que estes iniciem respostas imunes adaptativas.

Destruição de Microorganismos Fagocitados Os neutrófilo e macrófagos activados matam microorganismos fagocitados pela acção de moléculas microbicidas nos fagolisossomas: 

Vários receptores que reconhecem microorganismos, incluindo TLRs, receptores acoplados a proteinas-G, receptores de Fc dos anticorpos e C3 do complemento e receptores para citocinas,

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principalmentes de IFN-γ, funcionam de modo cooperativo para activar a destruição de microorganismos fagocitados pelos fagócitos; A fusão dos fagossomas com lisossomas resulta na formação de fagolisossomas, onde a maior parte dos mecanismos microbicidas estão concentrados.

Os mecanismos de destruição de microorganismos fagocitados são: 1. Enzimas proteoliticas – produzidas por neutrófilos e macrófagos nos fagolisossomas e que destroem os microorganismos. Uma das enzimas importantes nos neutrófilos é a elastase, uma serina protease de larga escala necessária para matar vários tipos de bactérias. Outra enzima importante é a catepsina G sendo essencial na eliminação de microorganismos fagocitados; 2. Espécies reactivas de oxigénio (ROS) – formadas quando macrófagos e neutrófilos activados convertem oxigénio molécular. São agentes oxidantes altamente reactivos que destroem microorganismos (e outras células). O sistema de produção de redicais livres primário é o sistema fagócito oxidase:

  

Enzima com multiplas subunidades que se forma no fagócitos activados principalmente na membrana fagolizossomal; É induzida e activada por vários estimulos, incluindo IFN-γ e sinais de TLRs; A sua função é reduzir oxigénio molecular em ROS como radicais superóxido, com o NADPH actuando como cofacto;

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

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O superóxido é enzimaticamente dismutado em peróxido de hidrogénio, que é usado pela enzima mieloperoxidase para converter iões halogenetos não reactivos em ácidos halogenados que são tóxicos para as bactérias; O processo pelo qual os ROS são produzidos é designado explosão respiratória; Apesar da geração de ROS tóxicos ser comummente visat como a principal função da fagocito oxidase, outra função da enzima é produzirs condições nos vacuolos fagociticos que são necessárias para a actividade de enzimas proteoliticas; A oxidase actua como uma bomba de electrões, gerando um gradiente electroquimico através da membrana do vacuolo, que é compensado pelo movimento de iões para o vacúolo. O resultado é uma diminuição de pH e da osmolaridade dentro do vacuolo, o que é necessário para a actividade da elastase e da catepsina G; Uma doença designada doença granulomatosa crónica é causada por uma deficiência num dos componentes da fagócito oxidase, compremento a capaciade dos neutrófilos matarem certas espécies de bactérias gram-positivo.

3. Intermediários reactivos de azoto – produzidas em adição aos ROS pelos macrófagos, sendo o mais comum o óxido nitrico (NO), pela activação de uma enzima designada oxido nitrico sintase indusivel (iNOS):  iNOS é uma enzima citosólica que está ausente nos macrófagos em repouso mas pode ser induzida em resposta a produtos microbianos que activam TLRs, especialmente na combinação com IFN-γ, anoxia, baixos niveis de ferro, etc…;  Cataliza a conversão de arginina em citrulina, sendo o gás óxido nitrico libertado já que é livremente difundivel:





Nos fagolisossomas, o óxido nitrico combina-se com peróxido de hidrogénio, gerado pela fagócito oxidase, para produzir radicais peroxinitrito altamente reactivos que matam microorganismos; A função cooperativa e redundante dos ROS e do óxido nitrico é demonstrada pelo facto de perda de iNOS e fagocito oxidase leva a um aumento da susceptibilidade a infecções microbianas, relativamente à perda de apenas um destes componentes.

Quando os neutrófilos e os macrófagos são fortemente activados, podem danificar tecidos normais do hospedeiro pela libertação de enzimas lisossomais, ROS e NO:  

Os produtos microbicidas destas células não distinguem entre tecidos do hospedeiro e microorganismos; Como resultado, se os produtos entram no ambiente extracelular, são capazes de danificar os tecidos.

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Outras Funções dos Macrófagos Activados Em adição à eliminação de microorganismos fagocitado, os macrófagos servem muitas outras funções na defesa do organismo:





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Muitas destas funções são mediadas por citocinas. TNF, IL-1 e quimiocinas induzem as reacções inflamatórias, mas, em adição, os macrófagos produzem IL-12 que estimula as células NK e as células T a produzirem IFN-γ; Altas concentrações de LPS induz uma doença sistémica caracterizada por coagulação dosseminada, colapso vascular e anormalidades vasculares, todas constituindo efeitos patogénicos de altos niveis de citocinas secretadas por macrófagos activados por LPS; Os macrófagos activados também produzem factores de crescimento de fibroblastos e células endoteliais, que participam na remodelação de tecidos depois da infecção e da danificação.

Assim, podemos resumir alguns dos factores secretados por macrófagos activados do seguinte modo: Factor Interleucina 1 (IL-1) Interleucina 6 (IL-6) TNFα Proteinas do complemento Enzimas hidroliticas Interferão alfa (IFN-α) Tumor necrosis factor (TNF-α) GM-CSF G-CSF M-CSF

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Função Promove respostas inflamatória e a febre Promovem a imunidade inata e a eliminação de patogénios Promovem a resposta inflamatória e a eliminação de patogénios Promovem a resposta inflamatória Activa genes elulares, resultando na produção de proteinas que conferem um estado antiviral na célula Mata células de tumores Promovem a hematopoiese indusivel

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Células Naturalmente Assassinas (NK cells) As células naturalmente assassinas são uma linhagem de células relacionadas com os linfócitos tha reconhecem células infectadas e/ou stressadas e respondem directamente matando essas células e secretando citocinas inflamatórias:   

Constituem 5% a 20% das célula mononucleares no sangue e no baço e são raras noutros órgãos linfóides; O termo naturalmente assassinas deriva do facto de se estas células estiverem isoladas do sangue ou do baço, elas matam várias células alvo sem qualquer necessidade de activação; São também as principais fontes de IFN-γ, que activa macrofagos de modo a que estes matem micróbios ingeridos;

Estas células derivam de percursores na medula óssea e aparecem como grandes linfócitos com numerosos grânulos citoplasmáticos, o que por vezes leva a uma designação de linfócitos granulares. Estas células não são nem linfócitos B nem T e não expressam receptores somaticamente rearranjados, como imunoglobulinas ou receptores T. Reconhecimento de Células Infectadas e Stressadas A activação das células naturalmente assassinas é regulada pelo balanço entre sinais que são gerados por receptores activadores e receptores inibitórios: 





A maior parte destes receptores são complexos de subunidades de ligação ao ligando, que reconhecem moléculas na superficies de outras células, e subunidades sinalizadoras, que traduzem sinais activadores ou inibitórios para a célula; Quando uma célula naturalmente assassina interage com outra célula, o resultado é determinado pela a integração de sinais gerados por um arranjo de receptores inibitórios e activadores são simultaneamente expressos pela célula naturalmente assassina e simultaneamente interagem com ligandos na outra célula; Em geral, os sinais activadores devem ser bloquedos pelos sinais inibitórios de modo a prevenir a activação de células naturalmente assassinas e o ataque de células normais;

A maior parte destes receptores nas células naturalmente assassinas reconhece moléculas MHC classe I ou proteinas que são estruturalmente semelhantes a moléculas MHC classe I: 

No entanto, é importante perceber que estas células usam tipos de receptores fundamentalmente diferentes dos receptores usados pelas células T para reconhecer MHC tipo I ou II.

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Os receptores activadores nas células naturalmente assassinas reconhecem um grupo heterogeneo de ligandos que são expressos nas células que sofreram stress, nas que foram infectadas com micróbios intracelulares ou células que foram malignamente transformadas: 

Cascatas de sinalização dependentes de cinases são iniciadas quando os receptores activadores nas células naturalmente assassinas ligam os seus ligandos, rapidamente levando a uma actividade citotóxica contra as células alvo e produzindo citocinas.

Os receptores inibitórios nas células naturalmente assassinas ligam-se a moléculas MHC classe I, que são normalmente expressas na maior parte das células saudáveis não infectadas: 

 

A ligação destes receptores inibitórios aos seus ligandos desencadeia casacatas de sinalização dependentes de fosfatases, que contra-actuam os efeitos das cinases nas casacatas de sinalização iniciadas pelos receptores activadores; Devido à especificidade dos receptores inibitórios para moléculas MHC classe I do próprio, células do hospedeiro normais estão protegidas das células naturalmente assassinas; Esta especificidade não usual dos receptores inibitórios para as moleculas MHC classe I normais permite ao sistema imune inato atacar célula viralmente infectadas que seriam invisiveis ás células T, que requerem a expressão de MHC para o reconhecimento.

A infecção de células do hespedeiro, especialmente por alguns virus, normalmente leava a uma expressão reduzida de moléculas MHC classe I e, assim, os ligandos para os receptores inibitórios são perdidos. Como resultado, as células naturalmente assassinas são libertadas do seu estado normal de inibição. Ao mesmo tempo, ligandos para os receptores activadores são expressos e, assim, as células infectadas são mortas.

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Por outro lado, a expansão e a actividade das células naturalmente assassinas são também estimuladas por citocinas, principalmente IL-15 e IL-12:  

  

A citocina IL-12 derivada dos macrófagos é um potente indutor da produção de IFN-γ e da actividade citotóxica, sendo esta actividade aumentada pelo IL-18; IL-12 e IL-18 também estimulam a produção de IFN-γ pelas células T e são assim particiantes centrais na produção de IFN-γ e subsequente activaão de macrofagos mediada por IFN-γ tanto na imunidade inata com adaptativa; Os IFNs tipo I, IFN-α e IFN-β, também activam o potencial cititóxico das células naturalmente assassinas, talvez pelo aumento da expressão de receptores de IL-12 e assim a resposta a estes; IL-IS, IL-12 e IFNs tipo I são produzidos por macrofagos em resposta à infecção e assim as trÊs citocinas activam as células naturalmente assassina na imunidade inata; Altas concentrações de IL-2 também estimulam as actividades das células naturalmente assassinas, e cultura em IL-2 é por vezes usada para aumentar a sua actividade.

Funções Efectoras das Células Naturalmente Assassinas As funções efectoras das células naturalmente assassinas são:



Efeito citotóxico – o mecanismos de citotoxicidade mediada por células naturalmente assassinas é essencialmente o mesmo dos linfócitos T citotóxicos. Estas células apresentam grânulos que contêm proteinas que medeiam a morte das células alvo. Quando as células naturalmente assassinas são activadas, a exocitose de grânulos liberta estas proteinas para as células alvo. Uma proteina granular das células naturalmente assassinas, designada perforina, facilita a entrada de outra proteinas granulares, designadas granzimas, para o citoplasma das células alvo levando à apoptose da célula alvo. Por matar células infectadas com virus e bactérias intracelulares, as células naturalmente assassina eliminam reservatórios de infecção. Isto também pode ocorrer contra algumas células tumorais;



Defesa contra micróbios intracelulares – matam células viralmente infectadas antes dos linfócitos citotóxicos antigénio-especificos serem completamente activados, ou seja, durante os primeiro dias depois da infecção viral. Cedo no curso da infecção viral, as células naturalmente assassinas são expandidas e activadas por citocinas da imunidade inata, como IL-12 e IL-IS, e matam células infectadas, especialmente aqeulas que apresentam niveis reduzidos de moléculas MHC classe I. Em adição, os IFN-γ secretado por células naturalmente assassinas activa macrofagos para destruirem microbios fagocitados. Esta activação por IFN-γ consegue controlar uma infecção por uma bactéria intracelular por vários dias ou semanas e assim

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fornece tempo para o desenvolvimento da imunidade mediada por células T e a eliminação da infecção por estas. A ausência de células naturalmente assassinas leva a um aumento da susceptibilidade a infecções por alguns virus e bactérias intracelulares. Em ratos sem células T, a resposta das células naturalmente assassinas deve ser adequada para manter a infecção controlando tais micróbios por algum tempo, mas os animais normalmente sucumbem na ausência de imunidade mediada por células T. as células naturalmente assassinas também matam células infectadas que tentam escapar ao ataque imune mediado por células T citotóxicas pela reduzida expressão de moléculas MHC classe I.

Papel da Imunidade Adaptativa

Inata

na

Estimulação

da

Resposta

Imune

A resposta imune inata fornece sinais que funcionam de modo concertado com antigénios para estimular a proliferação e a diferenciação de linfócitos T e B especificos para determinados antigénios. Enquanto a reposta imune inata fornece uma defesa inicial, também prepara a resposta imune adaptativa. A activação de linfócitos requere dois sinais, o primeiro sendo o antigénio e o segundo componentes da resposta imune inata a micróbios ou células danificadas. Esta ideia é designada de two-signal hypothesis para a activação de linfócitos:  

Sinal 1 - a necessidade do antigénio assegura que a resposta adaptativa é especifica; Sinal 2 - a necessidade de um estimulo adicional provocado por micróbios ou reacções da imunidade inata a micróbios assegura que as respostas imunes adaptativas são induzidas quando existe um perigo de infecção e não quando os linfócitos reconhecem antigénios inofensivos, incluindo antigénios do próprio.

As moléculas produzidas durante as reacções da imunidade inata que funcionam como sinais secundários para a estimulaçãom de linfócitos incluem:   

Co-estimuladores, para as células T; Citocinas, tanto para as células T e B; Produtos da destruição de complemento, apenas para as células B

No entanto, os sinais secundários gerados durante as respostas imunes inatas a diferentes micróbios não aumentam apenas a magnitude da subsequente resposta imune adaptativa como também influenciam a natureza da resposta imune adaptativa: 1. A principal função da imunidade mediada por células T é activar macrófagos de modo a que estes destruam micróbios intracelulares:  Agentes infecciosos que se ligam a TLRs tendem a estimular as respostas imunes mediadas por células T, pois a sinalização por TLR aumenta a habilidade de células apresentadoras de antigénios induzirem a diferenciação de células T em células efectoras designadas células TH1; Joana Maria Soares Pereira

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Células TH1 produzem a citocina IFN-γ, que consegue activar macrofagos de modo a estes matarem micróbios que de outro modo poderiam sobrevivers nas vesiculas fagociticas;

2. Em contraste, vários micróbios extracelulares que entram no sangue activam a via alternativa do complemento, que por sua vez aumenta a produção de anticorpos por linfócitos B. esta imunidade humoral serve para eliminar micróbios extracelulares. O papel da imunidade inata na estimulação das respostas imunes inatas é a base da acção de adjuvantes, que são substâncias que necessitam de ser administradas em conjunto com antigénios proteicos para provocar respostas imunes inatas dependentes de células T máximas:  

Adjuvantes são uteins em imunologia experimental e vacinas clinicas; Vários adjuvantes usados experimentalmente constituem proutos microbianos, como micobactérias mortas e LPS, que se ligam a TLRs e provocam respostas imunes inatas fortes no local de entrada do antigénio.

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RECONHECIMENTO DE ANTIGÉNIOS O COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE

O Complexo Principal de Histocompatibilidade Todos os mamiferos estudados até agora possuem um grupo de genes fortemente ligados, o complexo principal de histocompatibilidade (MHC), cujos produtos têm papeis importantes no reconhecimento intercelular e na descriminação entre o próprio e o estranho:  

O MHC participa no desenvolvimento de respostas imunes humorais e mediadas por células; Enquanto os anticorpos reagem com antigénios sozinhos, a maior parte das células T reconhecem antigénios apenas quando estes estão associados com uma molécula MHC.

As principais funções dos linfócitos T são defesa contra micróbios intracelulares e activação de outras células, como macrófagos e linfócitos B. Todas estas funções requerem que os linfócitos T interajam como outras células, que serão células do hospedeiro infectadas, células dendriticas, macrófagos e linfócitos B. No entanto, os receptores de antigénio das células T conseguem apenas reconhecer antigénios que são apresentados por outras células. A tarefa de apresentar antigénios associados a células para reconhecimento pelas células T é realizada por proteinas especializadas codificadas pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Como as moléculas MHC actuam como estruturas apresentadoras de antigénios, o grupo particular de moléculas MHC expressas por um individuo influencia o reportório de antigénios a que as células T H e Tc desse individuo reagem. Por esta razão, o MHC determina parcialmente a resposta a um antigénio individual de organismos infecciosos e está, assim, implicado na susceptibilidade a uma doença e no desenvolvimento da autoimunidade. Assim, o conhecimento da estrutura e da biossintese de moléculas MHC e a associação de péptidos antigénios com moléculas MHC é fundamental para a compreensão de como as células T reconhecem antigénios. A recente compreensão que as células naturalmente assassinas expressam receptores para antigénio MHC classe I e o facto da interacção receptor-MHC poder levar a inactivação ou activação, expande o papel conhecido desta familia de genes. Joana Maria Soares Pereira

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Descoberta do MHC O conceito de que a rejeição de tecidos estranhos é o resultado de uma resposta imune a moléculas na superficie das células, agora designados antigénios de histocompatibilidade, tem origem no trabalho de Peter Gorer nos meados dos anos 1930:  



Gorer estava a usar estirpes puras de ratinhos para identificar grupos antigénios do sangue e, no curso destes estudos, ele identificou quatro grupos de genes, designados de I a IV; Trabalhos levados a cabo nos anos 1940s e 1950s por Gorer e George Snell estabeleceram que os antigénios codificados pelos genes no grupo designado II participava na rejeição de tumores transplantados e outros tecidos; Snel designou estes genes como “genes de histocompatibilidade”, e a sua designação corrente como genes de histocompatibilidade-2 (H-2) refere-se ao grupo II dos genes de antigénios de Gorer.

Assim, o MHC foi descoberto como: 

Locus genético cujos produtos eram responsáveis pela rejeição rápida de enxertos de tecidos trocados entre linhagens puras de ratos.

Nos anos 1940s, George Snell e os seus colegas usaram técnicas genéticas para analisar a rejeição de tumores transplantados e outros enxertos de tecidos entre estirpes de ratos de laboratório. Primeiro, foi necessário produzir estirpes de ratinhos isogênicos por cruzamento repetitivo de irmãos:  

Após 20 gerações, cada membro de cada estirpe apresentava sequências de ácidos nucleicos idênticas em todas as localizações de todos os cromossomas; No caso dos genes polimórficos, cada estirpe pura, já que é homozigótica, expressa um único alelo, e diferentes estirpes expressam diferentes alelos;

Quando um tecido ou orgão, como um enxerto de pele, é transferido de um animal para outro existem dois resultados possiveis: 1. Em alguns casos, a pele enxertada sobrevive e funciona como pele normal; 2. Em outros casos, o sistema imune destroi o enxerto, um processo designado de rejeição. Estas experiências de transferência de pele mostraram que enxertos torcados entre animais de uma estirpe pura são aceites enquanto enxertos torcados entre diferentes estirpes são rejeitadas: 



Os genes responsáveis por tornarem o tecido enxertado reconhecido como similar ou diferente dos tecidos do próprio são desigandos genes de histocompatibilidade; As diferenças entre próprio e estranho foram atribuidas a polimorfismos entre diferentes alelos de genes de histocompatibilidade;

Técnica genéticas foram de seguida aplicadas para identificar os genes relevantes: Joana Maria Soares Pereira

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A estratégia critica neste esforço foi a criação de linhagens congénica de ratinhos. Em dua estirpes congénicas, os ratinhos são idênticos em todos os loci excepto naquele em que foram seleccionados para serem diferentes; Análises de ratinhos congénicos que foram seleccionados pela sua habilidade de rejeitar enxertos indicaram que uma única região genética era responsavel pela rejeição rápida de enxertos e foi designada de locus princiapl de histocompatibilidade; O locus particular que foi identificado pelo grupo de Snell estava ligado a um gene no cromossoma 17 codificante de um grupo de antigénios sanguineos designado antigénio-II, e assim essa região foi designada de histocompatibilidade-2, ou simplesmente H-2.

Inicialmente, pensava-se que este locus continha um único gene que controlava a compatibilidade de tecidos. Contudo, ocorreram eventos de recombinação ocasionais no locus H-2 durante o cruzamento de diferentes estirpes, indicando que ele contem vários genes diferentes mas fortemente ligados, cada um envolvido na reeição de enxertos. Assim, a região genética que controlava a rejeição de enxertos foi designada de complexo principal de histocompatibilidade. Genes que determinam o destino de tecidos enxertados estão presentes em todas as espécies de mamiferos, são homologos das genes H-2 primeiro identificados em ratinho e são todos designados genes MHC. Durante cerca de 20 anos após a descoberta do MHC, o seu único papel documentado era a rejeição de enxertos. No entanto, a transplantação não é um fenómeno normal e não parecia existir qualquer razão óbvia para o facto de um grupo de genes ter sido preservado durante a evolução quando a sua única função era controlar a rejeição de enxertos de tecidos estranhos. Nos anos 1960s e 1970s foi descoberto que os genes MHC são de importância fundamental para todas as respostas imunes a proteinas antigénios: 



Baruj Benacerraf, Hugh McDevitt e os seus colegas descubriram que estirpes puras de ratinhos e porquinhos diferiam na sua habilidade para produzir anticorpos contra polipéptidos sintéticos simples; Os genes relevantes foram designados genes de resposta imune (Ir), e foram todos encontrados da região do MHC.

Sabemos agora que os genes Ir são, de facto, genes MHC que codificam moléculas MHC que diferem na sua habilidade a ligar e apresentar proteinas antigénios: 

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Estirpes que respondem - herdam alelos MHC cujos produtos ligam tais péptidos, formando complexos péptido-MHC que são depois reconhecidos por células T helper. Estas células T ajudam então células B a produzir anticorpos; Estirpes que não respondem – expressam moléculas MHC que não são capazes de ligar a peptidos derivados de um antigénio polipeptidico e, assim, estas estirpes não geram células T helper ou anticorpos especificos para o antigénio.

Organização Geral e Herança do MHC O complexo principal de histocompatibilidade é uma colecção de genes organizados num alogamento continuo e longo de DNA:  

HLA – MHC do humano e encontra-se no cromossoma 6; H-2 – MHC do ratinho e encontra-se no cromossoma 7.

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Apesar do arranjo de genes ser de certo modo diferente, nos dois casos os genes MHC estão organizados em regiões que codificam três classes de moléculas MHC: 

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Genes MHC classe I – codificam glicoproteinas expressas na superficie da maior parte das células nucleadas. A prinicpal função dos seus produtos é a apresentação de péptidos antigénicos a células TC (CTL); Genes MHC classe II – codificam glicoproteinas expressam principalmente em células apresentadoras de antigénios (macrófagos, células dendrtiticas e linfócitos B), onde apresentam péptidos antigénicos a células TH; Genes MHC classe III – codificam, em conjunto com outros produtos, várias proteinas secretadas que apresentam funções imunes, incluindo componentes do sistema complemento e moléculas envolvidas na inflamação.

Podemos dividir as moléculas MHC classe I em dois tipos: 



Moléculas classe I clássicas – são as codificadas pelas regiões K e D no ratinho e pelos loci A, B e C no humano. Foram as primeiras a serem descobertas e são expressas numa ampla gama de tipos de células; Moléculas classe I não-clássicas – são genes ou grupos de genes adicionais dentro dos complexos H-2 ou HLA que também codificam moléculas classe I. A sua expressão é limitada a certos tipos de células especificos e apesar das suas funções não serem todas conhecidas, alguns produtos podem ter papeis altamente especializados na imunidade.

As duas cadeias das moléculas MHC classe II são codificadas pelas regiões IA e IE em ratinho e pelas regiões DP, DQ e DR em humanos: 



A terminologia pode ser de algum modo confusa visto que a região D em ratinho codifica oléculas classe I enquanto a região D (DR, DQ, DP) em humanos refere-se a genes codificantes de moléculas MHC classe II; Como nos loci classe I, moléculas classe II adicionalmente codificadas nesta região apresentam funções especializadas nos processos imunes.

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As moléculas MHC classe I e classe II apresentam caracteristicas estruturais comuns e ambas apresentam papeis no processamento de antigénios. Em contraste, a região MHC classe III, que se encontra entre as regiões classe I e classe II, codifica moléculas que são criticas para a função imune mas que têm pouco em comum com as mol´culas classe I e classe II. Os produtos classe III incluem:  

Componentes do complemento (C4, C2, BF); Citocinas inflamatórias, incluindo tumor necrosis factor (TNF) e heat-shock proteins.

Formas alélicas do MHC Os loci constituintes do MHC são altamente polimórficos, isto é, existem várias formas alternativas dos genes em cada locus entre a população, o que se designa de alelos. Os genes dos loci MHC encontramse todos juntos e a frequência de recombinação, isto é, a frequência de eventos de crossover cromossomal durante a mitose, indicativo da distância entre determinados segmentos de genes, é baixa:   

Assim, a maior parte dos individuos herda os alelo codificados por estes loci tão juntos como dois grupos, um de cada progenitor; Cada grupo de alelos é referido com haplótipo. um individuo herda um haplótipo da mãe e outro do pai; Em populações hibridas, os recem-nascidos são geralmente heterozigóticos em vários loci e expressarão ambos os alelos MHC da mãe e os do pai. Estes alelos são codominantemente expressos, isto é, ambos os produtos maternais como paternais são expressos nas mesma células.

Se os ratinhos forem puros, isto é, apresentarem alelos idênticos em cada loci, cada locus H-2 será homozigótico porque os haplótipos materno e paterno são idênticos, e todos os recém-nascidos expressarão haplótipos idênticos. Certas estirpes de ratos puras foram designadas como estirpes protótipo e o haplótipo MHC expresso por essas estirpes é designado por um sobrescripto itálico arbitrário (e.g. H-2a, H-2b). Estas designações referem-se ao conjunto inteiro de H-2 alelos herdados numa estirpe sem ser necessário listar cada alelo individualmente. No entanto, diferentes estirpes podem ter o mesmo haplótipo MHC, diferindo apenas noutros genes fora do MHC. Estirpe protótipo CBA CBA/2 C57BL/10(B10) A A.SW A.TL DBA/1

Outras estirpes com o mesmo haplótipo AKR, C3H, B10.BR, C57BR BALB/c, NZB, SEA, YBR C57BL/6, C57L, C3H.SW, LP, 129 A/He, A/Sn, A/Wy, B10.A B10.S, SJL STOLI, B10.Q, BDP

Haplótipo k d b a s t1 q

Alelos H-2 K k d b a s s q

IA k d b a s k q

IE k d b a s k q

S k d b a s k q

D k d b a s d q

Se dois ratos de estirpes puras contendo diferentes haplótipos MHC forem cruzados, a geração F1 herda haplótipos de ambos os progenitores e, assim, expressam os alelos de locus MHC de ambos. Como tais F1 expressam as proteinas MHC de ambas as estirpes parentais em todas as células, eles são histocompativeis com ambas as estirpes e capazes de aceitar enxertos de ambas as estirpes progenitoras. Contudo, nenhuma das estirpes parentais puras são capazes de aceitar um enxerto de uma ratinho F1 porque metade das moléculas MHC serão estranhas para o progenitor. Joana Maria Soares Pereira

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Numa população não pura, cada individuo é geralmente heterozigótico em cada locus. O complexo HLA humano é altamente polimórfico e existem multiplos alelos de cada gene classe I e classe II. Contudo, tal como com os ratinhos, os loci MHC humanos estão juntos e são herdados como um haplótipo. Quando o pai e a mãe apresentam diferentes haplótipos, existe uma probabilidade de 1 para 4 do filhote herdar os mesmos haplótipos do pai e da mãe e, assim, serem histocompativeis com cada um.

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Apesar da taxa de recombinação por crossover ser baixa dentro do HLA, esta contribui significativamente para a diversidade dos loci nas populações humanas. A recombinação genética gera novas combinações alélicas e o elevado numero de gerações intervenientes desde o aparecimento dos humanos como espécie permitiu uma recombinação extensiva, de modo que é raro dois individuos não relacionados apresentarem grupos de genes HLA idênticos. Assim, várias caracteristicas importantes dos genes MHC e dos seus produtos foram deduzidas de análises genéticas e bioquimica clássicas feitas em ratinhos e humanos: 1. Os dois tipos de genes MHC polimórficos, os genes MHC classe I e os genes MHC classe II, codificam dois grupos de proteinas estruturalmente distintas mas homólogas. Moléculas MHC classe I apresentam péptidos a células T CD8+, e moléculas MHC classe II apresentam péptidos a células T CD4+; 2. Os genes MHC são os genes mais polimórficos presentes no genoma. Sequenciação molecular mostrou que um único alelo HLA pode consistir em multiplas variantes que diferem ligeiramente; 3. Os genes MHC são concomitantemente expressos em cada individuo. Isto é, para um determinado gene MHC, cada individuo expressa os alelos que são herdados de ambos os pais. Para o individuo, isto maximiza o numero de moléculas MHC disponivel para ligar peptidos para apresentação a células T.

Moléculas MHC As moléculas MHC classe I e classe II são glicoproteinas membranares intimanente relacionadas estrutura e funcionalmente: 



Ambas as moléculas MHC classe I e classe II foram isoladas e purificadas e as estruturas tridimensionais dos seus dominios extracelulares foram determinadas por cristalografia de raios-X; Ambos os tipos de glicoproteinas membranares funcionam como moléculas apresentadoras de péptidos antigénicos altamente especializadas que formam complexos estáveis com péptidos antigénicos, apresentando-os na superficie da célula para reconhecimento por células T.

Em contraste, as moléculas MHC classe III são um grupo de proteinas não relacionadas que não partilham de semelhança estrutural e função comum com as moléculas da classe I e da classe II. As principais caracteristicas das moléculas MHC apresentadoras de antigénios são, resumidamente: Caracteristica Cadeias polipetidicas Localização dos residuos polimórficos Local de ligação ao co-receptor das células T Tamanho da fenda de ligação ao péptido Nomenclatura Humano Ratinho Joana Maria Soares Pereira

MHC classe I

MHC classe II

α (44-47 kD) β2-microglobulina (12 kD)

α (32-34 kD) β (29-32 kD)

Dominios α1 e α2

Dominios α1 e β1

Região α3 liga-se a CD8

Região β2 liga-se a CD4

Acomoda péptidos com cerca de 8-11 residuos

Acomoda péptidos com cerca de 10-30 residuos ou mais

HLA-A, HLA-B, HLA-C H-2K. H-2D, H-2L

HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP I-A, I-E 45

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Todas as moléculas MHC partilham certas caracteristicas estruturais que são criticas para o seu papel de apresentação de péptidos e reconhecimento de antigénios pelos linfócitos: 1. Cada molécula MHC consiste numa fissura de ligação ao péptidos extracelular, ou groove, seguida de dominios imunoglobulin (Ig)-like e dominos transmembranares e citoplasmáticos. As moléculas classe I são compostas por uma cadeia polipeptidica codificada no MHC e uma segunda cadeia não codificada pelo MHC, enquanto as moléculas classe II são constituidas por duas cadeias codificadas pelo MHC. Apesar desta diferença, as estruturas tridimensionais das moléculas MHC classe I e classe Iisão semelhantes; 2. Os residuos de aminoácidos polimórficos das moléculas MHC estão localizados na e adjecentes à fissura de ligação do péptido. Esta fissura é formada pelo enrolamento do Ntermini das proteinas codificadas pelo MHC e é composta por α-hélices paralelas sobre oito folhas-β. Os residuos polimórficos, que são aminoácidos que variam entre diferentes alelos, estão localizados dentro e à volta da fissura. Esta porção das moléculas MHC liga-se a péptidos para os apresentar a células T, e os receptores de antigénios nas células T interagem com este péptido e com as α-hélices das moléculas MHC. Devido à variabilidade de aminoácidos nesta região, diferentes moléculas MHC ligam-se a e apresentam diferentes péptidos e são reconhecidas especificamente pelos receptores de antigénios de diferentes células T; 3. Os domínios Ig-like não polimórficos das moléculas MHC contêm locais de ligação para as moléculas CD8 e CD4 das células T. CD4 e CD8 são expressas em sub-populações distintas de linfócitos T maduros e participam, em conjunto com os receptores de antigénios, no reconhecimento do antigénio, isto é, são “co-receptores”:  CD4 liga-se selectivamente a moléculas MHC classe II e é por isso que as células T CD4+ reconhecem apenas péptidos apresentados por moléculas MHC classe II, funcinando depois como linfócitos TH;  CD8 liga-se selectivamente a moléculas MHC classe I e é por isso que as células T CD8 + reconhecem apenas péptidos apresentados por moléculas MHC classe I, funcionando depois como linfócitos Tc. Estrutura das Moléculas MHC classe I As moléculas MHC classe I contêm uma cadeia-αde 45 kDa associada não-covalentemente com uma molécula β2-microglobulina de 12 kDa: 

Cadeia-α – é uma glicoproteina transmembranar codificada por genes polimórficos nas regiões A, B e C do complexo HLA humano e nas regiões K e D/L do complexo H-2 do ratinho;



β2-microglobulina – proteina codificada por um gene altamente conservado localizado num cromossoma diferente.

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A associação da cadeia-α com a β2-microglobulina é necessária para a expressão das moléculas MHC classe I nas membranas celulares. A cadeia-α é ancorada na membrana plasmática pelo seu segmento transmembranar hidrofóbico e cauda citoplasmática hidrofilica. Análises estruturais revelaram que a cadeia-α das moléculas MHC classe I estão organizadas em:   

Três dominios externos (α1, α2 e α3), cada contendo aproximadamente 90 aminoácidos; Um dominio transmembranar com cerca de 25 aminoécidos hidrofóbicos seguidos de um pequeno alongamento de aminoácidos carregados (hidrofilicos); Um segmento citoplasmático de 30 aminoácidos.

A β2-microglobulina é semelhante em tamanho e organização ao dominio α3, mas não contem uma região transmembranar e não é covalentemente ligada à glicoproteina classe I. Esta região e a α3 revelam homologia e também com os dominios das regiões constantes das imunoglobulinas. A enzima papaina cliva a cadeia-α 13 residuos acima do dominio transmembranar, libertando a porção extracelular da molécula, consistindo nos α1, α2, α3 e na β2-microglobulina. A purificação e cristalização da porção extracelular revelou dois pares de dominios a interagirem: 



Um par distante da membrana dos dominios α1 e α2, formando uma plataforma de folhas-β antiparalelas rodeadas por duas longas regiões de α-hélices. A estrutura forma uma fenda profunda com as longas α-hélices como paredes e as folhas-β antiparalelas como o fundo. Os residuos polimórficos das moléculas classe I estão confinados aos dominos α1 e α2, onde contribuem para variações entre diferentes alelos classe I na ligação a péptidos e reconhecimento por células T; Um par próximo da membrana dos dominios α3 e β2-microglobulina, formando uma estrutura essencial para o reconhecimento do MHC pela célula T. Estes estão organizados em duas folhasβ praguedas, cada formada por cadeias-β antiparalelas de aminoácidos. Esta estrutura é caracteristica de dominios imunoglobulina e, assim, as moléculas MHC e a β2-microglobulina são classificadas como membros da superfamilia de imunoglobulinas.

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A fenda de ligação ao péptido está localizada na superficie superior da molécula MHC classe I e é suficientemente grande para ligar um peptido de cerca de 8-10 aminoácidos. Estes péptidos são, de facto, antigénios processados e péptidos do próprio. O dominio α3 parece ser altamente conservados entre moléculas MHC classe I e contem uma sequência que interage com a molécula membranar CD8 presente nas células Tc. A β2-microglobulina interage extensivamente com o dominio α3 e também com aminácidos dos dominios α1 e α2. A interacção com a β2-microglobulina e a com um péptido pela cadeia-α classe I é essencial paraa molécula classe I alcançar a conformação completamente montada. Na ausência de β2-microglobulina, a cadeia-α MHC classe I não é expressa na membrana celular. Estrutura das Moléculas MHC Classe II As moléculas MHC classe II contêm duas cadeias polipéptidicas diferentes, uma cadeia-α de 33 kDa e uma cadeia-β de 28 kDa, associadas por interacções não covalentes: 





 

Como as cadeias-α classe I, as moléculas MHC classe II são glicoproteinas membranares que contêm dominios externos, um segmento transmembranar e um segmento citoplasmático; Cada cadeia numa molécula classe II contem dois dominios externos: os dominio α1 e α2 numa cadeia e os dominios β1 e β2 na outra cadeia. Os dominios α2 e β2 próximos da membrana, como os dominos α3 e β2-microglobulina das moléculas MHC classe I, apresenta semelhança sequencial com a estrutura das imunoglobulinas, sendo tambémclassificadas como membros da superfamilia de imunoglobulinas; A porção das moléculas classe II distante da membrana é composta pelos dominios α1 e β1 e forma uma fenda de ligação ao antigénio; Ao contrário das moléculas MHC classe II, os genes que codificam ambas as cadeias das moléculas classe II pertencem ao MHC e são polimórficos.

Os segmentos N-terminal α1 e β1 das cadeia classe II interagem para formar a fissura de ligação ao péptido, que é estruturalmente semelhante à fissura das moléculas classe I:  



Quatro folhas β das fissura e das paredes constituidas por α-hélices são formadas pelo segmento α1 e as outras quatro folhas β e a segunda parede são formadas pelo segmento β1; Os residuos polimórficos estão localizados nos segmentos α1 e β1, dentro e à volta da fissura, como nas moléculas MHC classe I. Nas moléculas classe II humanas, a maior parte dos residuos polimórficos está na cadeia β; Nas moléculas classe II, as terminações da fissura de ligação ao péptido estão abertas, de modo que péptidos de 30 ou mais residuos conseguem encaixar.

Os segmentos α2 e β2 das moléculas MHC classe II, como as α3 e β2-microglobulina da classe I, estão enroladas em dominios Ig e são não-polimórficas entre vários alelos de um gene particular da classe II:

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  



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O segmento β2 das moléculas classe II contêm locais de ligação para CD4, de modo semelhante ao local de ligação a CD8 no segmento α3 da cadeia pesada da classe I; Em geral, cadeias α de um locus do MHC classe II (e.g., DR) normalmente emparelha com cadeias β do mesmo locus e menos commumente com cadeias β de outros loci (e.g., DQ, DP); As terminações C-terminal dos segmentos α2 e β2 continuam em pequenas regiões de ligação seguidas de um alongamento de aproximadamente 25 residuos transmembranares e hidrofóbicos; Nas duas cadeias, as regiões transmembranares terminam com grupos de residuos de aminoácidos, seguidos de pequenas caudas citoplasmáticas hidrofilicas.

A molécula classe II completamente montada é um heterodimero constituido por uma cadeia α, uma cadeia β e um péptido antigénico ligado. Para além disso, a expressão estável de moléculas classe II na superficie da célula requeres a presença de todos os três componetes do heterodimero. Como nas moléculas classe II, isto assegura que as moléculas MHC que acabam na superficie da célula são as moléculas que estão a actuar normalemnte na sua função de apresentação de péptidos antigénicos. Relação Exão/Estrutura dos Genes e Proteinas MHC Exões separados codificam cada região de proteinas classe I e classe II. Cada um dos genes classe I do humano e do ratinho apresenta um exão 5’ que codifica um pequeno péptido sinal seguido de cinco ou seis exões que codificam a cadeia α das moléculas classe I: 

 

O péptido sinal serve para facilitar a inserção da cadeia α no reticulo endoplasmático e é removido por enzimas proteoliticas no reticulo endoplasmático depois da translacção estar completa; Os três exões seguintes codificam os dominios extracelulares α1, α2 e α3 e os seguintes exões codificam a região transmembranar (Tm); Um ou dois codões 3’-terminal codificam os dominios citoplasmáticos (C).

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Como os genes MHC classe I, os genes classe II estão organizados numa série de exões e intrões reflectindo a estrutura dos dominios das cadeias α e β: 

Ambos os genes α e β que codificam moléculas MHC classe II de ratinho e humanas apresentam um exão lider, um exão α1 ou β1, um exão α2 ou β2 e um mais exões citoplasmático.

Ligação de Péptidos a Moléculas MHC As moléculas MHC apresentam uma ampla especificidade para a ligação a péptidos, em contraste com a grande especificidade de reconhecimento de antigénios pelo receptor de antigénios dos linfócitos T e existem várias caracteristicas importantes da interacção das moléculas MHC com os péptidos antigénicos:    

Cada molécula MHC classe I e classe II apresentam uma única fenda de ligação a um péptido péptido, mas cada moléculas MHC pode ligar-se a diferentes péptidos; Os péptidos que se ligam a moléculas MHC partilham caracteristicas estruturais que promovem esta interacção; A associação de péptidos com moléculas MHC é um processo saturável e muito lento; As moléculas MHC de um individuo não são capazes de discriminar entre péptidos estranhos e péptidos derivados de proteinas desse individuo.

A habilidade das moléculas MHC ligarem diferentes péptidos foi estabelecida por diferentes evidências experimentais:

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1. Se uma célula T especifica para um péptido for estimulada por células apresentadoras de antigénios que apresentam esse mesmo péptido, a resposta é inibida pela adição de excesso de um outro péptido com semelhança estrutural. Nestas experiências, a molécula MHC liga diferentes péptidos mas a célula T reconhece apenas um desses péptidos; 2. Estudos de ligação directa com moléculas MHC purificadas em solução estabeleceram que uma única molécula MHC consegue ligar diferentes péptidos (um de cada vez) e que multiplos péptidos competem entre si para a ligação a uma única molécula MHC; 3. As análises de péptidos eluidos de moléculas MHc purificadas de células apresentadoras de antigénios mostraram que diferentes péptidos podem ser eluidos de qualquer tipo de molécula MHC. A determinação da estrutura cristalina das moléculas MHC classe I e classe II confirmou a presença de uma unica fenda de ligação a péptidos nestas moléculas. Não é supreendente que uma única molécula MHC seja capaz de ligar multiplos péptidos porque cada individuo contem apenas algumas moléculas MHC diferentes (6 moléculas classe I e cerca de 10-20 moléculas classe II num individuo heterozigótico), e essas devem ser capazes de apresentar péptidos de um numero enorme de proteinas antigénicas.

Os péptidos que ligam moléculas MHC partilham caracteristicas estruturais que promovem a interacção destes com as moléculas MHC: 1. Moléculas classe I conseguem acomodar péptidos com um comprimento de cerca de 8-11 residuos e moléculas classe II ligam péptidos que podem ter cerca de 10-30 residuos ou mais, sendo o tamanho óptimo 12-16 residuos; 2. Péptidos que se ligam a uma forma alélica particular de uma molécula MHC comtêm residuos de aminoácidos que permitem interacções de complementariedade entre o péptido e essa molécula MHC; 3. Os residuos que um péptido que ligam à molécula MHC são distintos dos reconhecidos pelas células T.

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Numa célula, várias chaperones e enzimas facilitam a ligação do péptido a moléculas MHC. Quando formado, a maior parte dos complexos péptido-MHC são estáveis, e as constantes cinéticas de dissociação são indicativas de tempos de semi-vida longos, que variam entre várias horas a dias: 



Esta taxa de dissociação tão baixa permite que os complexo péptido-MHC persistam tempo suficiente na superificie da célula apresentadora de antigénios para que estes sejam reconhecidos pelas células T; Esta caracteristica da apresentação de antigénios permite que as poucas células T que são especificas para o antigénio localizem-no enquanto as células circulam pelos tecidos e, assim, gerar respostas imune eficientes contra o antigénio.

Com as moléculas MHC não são capazes de distinguir entre péptidos estranhos e péptidos do próprio, apresentam tanto péptidos do próprio como péptidos estranhos e as células T examinam esses péptidos para a presença de péptidos estranhos. Este processo é central para a função de vigilância das células T. No entanto, a incapacidade das moléculas MHC discriminarem entre antigénios próprios e estranho levanta duas questões: 1. Como as moléculas MHC são continuadamente expressas expostas a, e presumivelmente ocupadas por, péptidos do próprio abundantes, como é que as suas fendas de ligação a péptidos estão sempre disponiveis para ligar e apresentar péptidos estranhos, que são raros? 2. Se os péptidos propríos estão continuadamente a ser apresentados, porque é que o individuo não desenvolve reacções autoimunes? As respostas a estas questões encontra-se na biologia celular da biossintese e montagem das moléculas MHC, na especificidade das células T e na sensividade requintada destas células a pequenas quantidade de complexos MHC-péptido. Base Estrutural da Ligação de Péptidos a Moléculas MHC A ligação de péptidos a moléculas MHC é uma interacção não covalente mediada por residuos dos péptidos e das fendas das moléculas MHC:

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 

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Proteinas antigénicas são proteoliticamente clivadas nas células apresentadoras de antigénios para gerar os péptidos que se ligarão e serão apresnetados pelas moléculas MHC; Esses péptidos ligam-se ás fendas das moléculas MHC numa conformação extendida e, quando ligados, os péptidos a as moléculas de água associadas preenchem as fendas, fazendo contactos extensivos com residuos de aminoácidos que formam o pavimento de folhas-β e as paredes de α-hélices.

Na maior parte das moléculas MHC, as cadeias-β do pavimento da fenda contêm “bolsas”. Os residuos de aminoácidos do péptido podem conter cadeias laterais que encaixam nessas bolsas e ligam-se por a aminoácidos complementares na molécula MHC, normalmente por interacções hidrofóbicas. Tais residuo do péptido são designados residuos de ancoragem porque contribuem para a maior parte das interacções favoráveis à ligação:   

Ancoram o péptido na fenda da molécula MHC; Estão localizados no meio ou nas terminações do péptido; Cada péptido de ligação ao MHC normalmente contem apenas um ou dois residuos de ancoragem e isto permite uma grande variabilidade nos outros residuos do péptido, que são residuos que são reconhecidos por células T especificas.

No entanto, nem todos os péptidos usam residuos de ancoragem para ligar a moléculas MHC, especialmente a moléculas MHC classe II:  

Interacções especificas do peptido com as α-hélice laterais da fenda MHC também contribuem para a ligação do péptido por formação de pontes de hidrogénios ou ponte salinas com este; Para além disso, péptidos de ligação a moléculas classe I normalmente contêm aminoácidos básicos ou hidrofóbicos na sua terminação carboxi que também contribuem para a interacção.

Assim, como vários residuos dentro e nas redondezas da fenda de ligação ao péptido das moléculas MHC são polimórficas (e.g., diferem entre vários alelos MHC), diferentes alelos favorecem a ligação de diferentes péptidos. Esta é a base estrutural da função dos genes MHC como “genes da resposta imune”: 

Apenas animais que expressam alelos MHC que ligam um péptido particular e o apresentam a células T são capazes de responder a esse péptido.

Os receptores de antigénios das células T reconhecem tanto os péptidos antigénicos como as moléculas MHC, sendo o péptido responsável pela requintada especificidade do reconhecimento do antigénio e os residuos MHC contribuindo para a restrição de MHC das células T:

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Uma porção do péptido é exposta na superficie da fenda da molécula MHC e as cadeias laterais de aminoácidos desta porção do péptido são reconhecidos pelos receptores de antigénios de células T especificas; O mesmo receptor da célula T também interage com residuos polimórficos das α-hélices da moléculas MHC em si.

Portanto, variações no péptido ou na fenda de ligação ao péptido da molécula MHC alterará a apresentação desse péptido ou o reconhecimento pelas células T.

Diversidade de Moléculas MHC entre A nimais Uma enorme diversidade é exibida pelas moléculas MHC dentro de uma espécie e entre individuos. Esta variabilidade assemelha-se à diversidade de anticorpos e receptores de células T, mas a fonte de diversidade de moléculas MHC não é a mesma: 



Anticorpos e receptores de células T são gerados por vários processos somáticos, incluindo rearranjo de genes e mutações somáticas de genes rearranjados. Assim, a geração de receptores de células T e B é dinâmica, alterando durante o tempo num individuo; Em contraste, as moléculas MHC expressas por um individuo são fixas nos genes e não alteram ao longo do tempo. A diversidade do MHC dentro de uma espécie tem origem no polimorfismo, a presença de multiplos alelos num determinado locus genético dentro da espécie.

A diversidade de moléculas MHC num individuo resulta não apenas deste apresentar multiplos alelos para cada gene mas também da presença de genes duplicados com funções semelhnates ou sobrepostas, ao contrário dos isotipos das imunoglobulinas. Como inclui genes com semelhantes mas não idênticas funções e estruturas (por exemplo, HLA-A, -B e –C), o diz-se que o MHC é poligénico. O MHC possui um número extraordinariamente grande de alelos diferentes em cada locus e é um dos complexos genéticos mais polimórficos conhecidos nos vertebrados superiores. Esses alelos diferem nas suas sequências de DNA entre individuos em cerca de 5-10% e o número de diferenças de aminoácidos entre alelos MHC pode ser significante, com cerca de 20 aminoácidos a contribuir para a natureza estrutural única de cada alelo:  

Análises de genes classe I do HLA humano revelaram aproximadamente 240 alelos A, 470 alelos B e 110 alelos C. Em ratinhos o polimorfismo é igualmente elevado; Os genes humanos classe II são de igual modo altamente polimórficos e, em alguns casos, existem numeros diferentes de genes em individuos diferentes. O numero de genes HLA-DR da cadeia-β pode variar entre 2 e 9 em haplótipos diferentes, e conhecem-se 350 alelos de genes DRB. No entanto, a cadeia DRA é altamente conservada, com apenas 2 alelos diferentes conhecidos.

Este polimorfismo tão elevado resulta numa diversidade tremenda de moléculas MHC dentro de uma espécie. Usando os números de formas alélicas dos HLA-A, -B e –C, é possivel calcular o numero teórico de combinações que podem existir (240x470x110=12.408.000) para os haplótipos classe I. Considerando também os haplótipos classe II, obtemos uma diversidade elevadissima de alelos MHC.

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Desiquilibrio de Ligação O cálculo da diversidade teórica assume uma combinação completamente aleatória dos alelos. No entanto, a diversidade actual é inferior, pois certas combinações alélicas ocorrem mais frequentemente em alguns haplótipos HLA do que o previsto pela combinação aleatória, um estado referido com desiquilibrio de ligação:  

O desiquilibrio de ligação é a diferença entre a frequência observada para uma combinação particular e a esperada para as frequências de alelos individuais; A frequência esperada para a combinação deve ser calculada pela multiplicação da frequência de dois alelos. HLA-A1 ocorre em 16% dos individuos numa população (frequência de 0,16) HLA-B8 ocorre em 9% dos individuos dessa população (frequência de 0,09) Será esperado que a combinação de HLA-A1 com HLA-B8 ocorra em 1,4% dos individuos. No entanto, esta combinação é observada em 8,8% dos individuos!

Foram já avançadas várias explicações para o desiquilibrio de ligação: 1. A mais simples é que ainda não decorreram gerações suficientes para se atingir o numero de crossovers necessários para atingir o equilibrio entre os alelos presentes em fundadores da população. Os haplótipos que estão representados em maior percentagem na população hoje refletem as combinações de alelos presentes nos fundadores; 2. Alternativamente, efeitos selectivos poderão ter levado a uma maior frequência de certa combinações alélicas. Por exemplo, certas combinações de alelos podem produzir resistência a certas doenças, levando a que sejam seleccionados, ou podem gerar efeitos malignos, como susceptibilidade a desordens autoimunes, e sofrer selecção negativa; 3. Os crossovers podem ser mais frquentes em certas regiões da sequência de DNA, e a presença ou ausência de regiões propensas a sofrer crossover entre alelos pode dictar a frquência de associação de alelos. De facto, comprova-se a existência de alguns locais deste género dentro do MHC. Apesar do desiquilibrio de ligação, existe aida um enorme polimorfismo no MHC humano e continua a ser muito dificil emparelhar tipos de MHC do dador e do aceitador para transplantes de órgãos com sucesso. Relevância Funcional do Polimorfismo A divergência sequencial entre alelos do MHC de uma espécie é bastante elevada, tanto com a divergência observada para os genes codificantes para algumas enzimas entre espécies. No entanto, a variação sequencial entre moléculas MHC não está aleatoriamente distribuida ao longo da cadeia polipéptidica, está agrupada em pequenos segmentos, maioritariamente nos dominios α1 e α2 das moléculas classe I e no dominio α1 das moléculas classe II.

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Dos aminoácidos que mostram polimorfismo significante, a maior parte encontra-se na fenda de ligação ao péptido destas moléculas. Assim, a importância do polimorfismo será: 

As diferenças alélicas contribuem para as diferenças observadas na habilidade das moléculas MHC interagirem com um determinado péptido antigénico.

Organização Genómica do MHC O MHC ocupa cerca de 2000 kb do DNA do ratinho e cerca de 4000 kb do DNA humano. Nos humanos, o MHC está localizado no braço curto do cromossoma 6 e a β2-microglobulina é codificada por um gene no cromossoma 15:  

O locus MHC extende-se cerca de 4 centrimorgans, significando que ocorrem crossovers no MHC numa frequência de cerca de 4% em cada meiose; A recentemente completa sequência do genoma humano mostra que esta região é bastante densa, sendo que a maior parte dos genes apresentam funções conhecidas.

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Em humanos, a região MHC classe I tem cerca de 2000 kb de comprimento e contem aproximadamente 20 genes. No entanto, em ratinho, o MHC classe I consiste em duas regiões separadas pelas regiões classe II e III. Incluidos na região classe I estão os genes que codificam as moléculas MHC classe I clássicas bem caracterizadas, designadas HLA-A, HLA-B e HLA-C em humanos e H-2K, H-2D e H-2L em ratinhos. No entanto, vários genes classe I não-clássicos, identificados por mapeamento molecular, estão também presentes no MHC humano e do ratinho:  

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

Em ratinhos, os genes classe I não-clássicos estão localizados em três regiões (H-2Q, T e M) a jusante do complexo H-2; Em humanos, os genes classe I não-clássicos incluem os loci HLA-E, HLA-F, HLA-G, HFE, HLA-J e HLA-X em cojunto com a familia recentemente descoberta de genes MIC, que inclui desde MICA a MICE; Alguns dos genes MHC classe I não-clássicos são pseudogenes e não codificam um produto proteico, mas outros, como HLA-G e HFE, codificam produtos classe I-like com funções altamente especializadas; A familia MIC de genes classe I apresenta apenas 15%-30% de identidade sequencial para com os genes clássicos, e os membros designados como MICA são altamente polimórficos. Os produtos de genes MIC são expressos em niveis baixos nas células epiteliais e são induzidos pelo calor ou outros estimulos que influenciam as heat shock proteins.

As funções dos genes MHC classe I não-clássicos são amplamente desconhecidas, apesar de alguns estudos sugerirem que algumas destas moléculas, como as moléculas MHC classe I clássicas, podem apresentar péptidos ás células T: 



Uma molécula codificada pelo locus H-2M em retinho é capaz de ligar um péptido self derivado de uma subunidade da NADH desidrogenase, uma enzima codificada pelo genoma mitocondrial. Este péptido self contem uma metionina N-terminal formilada. Curiosamente, péptidos derivados de organismos procarióticos também apresentam metioninas formiladas; Estas moléculas H-2M podem assim apresentar péptidos de organismos procarióticos que são capazes de viver intracelularmente, como de Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Brucella abortus e Salmonella typhimurium.

A região MHC classe II contem genes que codificam as cadeias α e β das moléculas MHC classe II clássicas desiganadas HLA-DR, DP e DQ em humanos e H-2IA e –IE em ratinho. O mapeamento molécular do MHC classe II revelou multiplos genes para cadeias-β em algumas regiões tanto para humanos como para ratinhos, tal como multiplos genes para cadeias-α em humanos:  



Na região DR humana, por exemplo, existem três ou quatro genes de cadeia-β funcionais; Todos os produtos destes genes de cadeia-β podem ser expressos em conjunto com o produto do gene de cadeia-α numa determinada célula, aumentanto deste modo o numero de moléculas apresentadoras de antigénios diferentes na célula; Apesar da região DR humana conter apenas um gene de cadeia-α, cada uma das regiões DP e DQ apresentam dois.

Foram também identificados genes MHC classe II não-clássicos tanto em ratinho como em humanos:

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Em ratinhos, vários genes classe II (Oα, Oβ, Mα e Mβ) codificam moléculas MHC não-clássicas que exibem polimorfismo limitado e um padrão de expressão diferente das moléculas classe II clássicas IA e IE; Na região classe II humana, genes não-clássicos denominados DM e DO foram identificados; Os genes DM codificam uma molécula classe II-like (HLA-DM) que facilita o carregamento de péptidos antigénicos para as moléculas MHC classe II; As moléculas DO classe II, que são expressas apenas no timo e nas células B aduras, funcionam como reguladores do processamento de antigénios classe II.

A região MHC classe III em humanos e ratinhos contem uma colecção heterogénea de genes:  

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Estes genes codificam vários componentes do complemento, duas esteróide 21-hidrolases, duas heat-shock proteins e duas citocinas (TNF-α e TNF-β); Alguns destes produtos MHC classe III têm papel importante em algumas doenças. Por exemplo, mutações em genes codificantes para 21-hidrolases estão relacionadas com congenital adrenal hyperplasia; A presença de um grupo de genes classe III é conservada em todas as espécies com MHC.

Expressão de Moléculas MHC Como as moléculas MHC são necessárias para a apresentação de antigénio aos linfócitos T, a expressão destas proteinas determina se antigénios estranhos (e.g., microbianos) nessas célula serão reconhecidos por células T. Assim, existem várias caracteristicas importantes da expressão de moléculas MHC: 

 

As moléculas classe I são constitutivamente expressas virtualmente em todas as células nucleadas, enquanto as moléculas classe II são normalmente expressas apenas em células dendriticas, linfócitos B, macrófagos e algumas outras células; A expressão de moléculas MHC é aumentada por citocinas produzidas durantes as respostas imunes inata e adaptativa; A taxa de transcrição é o principal determinate do nivel de sintese e expressão de moléculas MHC na superficie.

O padrão de expressão do MHC está relacionado com as funções das células restritas a classe I e restritas a classe II: 



A função efectora dos linfócitos Tc CD8+ restritas a classe I é matar células infectadas com micróbios intracelulares, como virus. Com os virus são capazes de infectar virtualmente todas as células nucleadas, os ligandos que as células T CD8+ reconhecem necessitam de ser apresentados por todas as células nucleadas. A expressão de moléculas MHC classe I em todas as células nucleadas tem precisamente este propósito, fornecendo um sistema de apresentação para antigénios virais; Os linfócito TH CD4+ restritos a classe II apresentam um grupo de funções que requerem o reconhecimento de antigénios apresentados por um número de células mais limitado. Em particular, células T CD4+ naive precisam de reconhecer antigénios que são apresentados por células dendrtiticas em órgãos linfácitos perféricos. Linfócitos TH CD4+ diferenciados têm como principal função activar macrófagos a eliminar micróbios extracelulares que foram fagocitados e activar os linfócitos B a produzir anticorpos que também eliminam micróbios extracelulares. As

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moléculas classe II são expressas principalmente nestes tipos de células e fornecem um sistema de apresentação de péptidos antigénicos derivados de micróbios e proteinas extracelulares. A regulação da expressão de genes MHC é feita por citocinas produzidas durante as respostas imunes inata e adaptativa: 1. Na maior parte dos tipos de células, os interferões IFN-α, IFN-β e IFN-γ aumentam o nivel de expressão de moléculas classe I, e TNF e LT podem ter o mesmo efeito. Os interferões são produzidos durante o inicio da resposta imune inata a vários virus, e TNF e LT são produzidos em resposta a várias infecções microbianas. Assim, as respostas imunes inatas a micróbios aumentam a expressão de moléculas MHC que apresentam antigénios microbianos a células T especificas para micróbios; 2. A expressão de moléculas MHC classe II é também regulada por citocinas e outros sinais em diferentes células. IFN-γ é a principal citocina envolvida na estimulação da expressão de de moléculas classe II pelas células apresentadoras de antigénios, como as células dendriticas e os macrófagos:  O IFN-γ é produzido pelas células naturalmente assassinas durante as reacções imunes inatas, e por células T activadas por antigénios durantes reacções imunes adaptativas;  A habilidade do IFN-γ aumentar a expressão de classe II em células apresentadoras de antigénios é um mecanismo amplificador na imunidade inata;  Nas células dendriticas, a expressão de moléculas classe II também aumenta a resposta a sinais de Toll-like receptors respondendo a componentes microbianos, promovendo assim a apresentação de antigénios microbianos;  Linfócitos B expressam constitutivamente moléculas classe II e aumentam a expressão em resposta ao reconhecimento de antigénios e a citocinas produzidas por células TH, melhorando assim a apresentação de antigénios pelas células TH;  Células endoteliais vasculares, como os macrófagos, aumentam a expressão de classe II em resposta ao IFN-γ. A significância deste fenómeno não é clara mas vários tipos de células não imunes expressão poucos, se não nenhumas, moléculas moléculas MHC a menos que sejam expostas a elevados niveis de IFN-γ mas não perecem apresentar antigénios a células CD4+;  Células T humanas, mas não de ratinho, expressam moléculas classe II depois da activação. Contudo, nenhuma citocina foi identificada nesta resposta. As citocinas aumentam a expressão de MHC por estimulação da taxa de transcrição de genes classe I e classe II numa larga variedade de tipos de células: 

Estes efeitos são mediados pela ligação de factores de transcrição activados por citocinas a sequências de DNA regulatórias nas regiões promotoras dos genes MHC;

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Vários factores de transcrição devem ser montados e ligar-se a uma proteina designada activador de transcrição classe II (CIITA), e o complexo inteiro liga-se ao promotor classe II e promove a trancrição eficiente; Por manter o complexo de factores de transcrição junto, a CIITA funciona como um regulador principal da expressão de genes classe II e é expressa em resposta ao IFN-γ; Mutações em alguns destes factores de transcrição foram identificadas como a causa de doenças humanas de imunodeficiência associadas com expressão deficiente de moléculas MHC.

A expressão da maior parte das proteinas envolvidas no processamento e apresentação de antigénios é coordenadamente regulada. Assim, o IFN-γ aumenta a transcrição de não só genes classe I e classe II como também de β2-microglobulina, dos genes que codificam duas das subunidades do proteossomas e dos genes que codificam as subunidade do heterodimero TAP.

PROCESSAMENTO DE ANTIGÉNIOS E SUA APRESENTAÇÃO AOS LINFÓCITOS T

Reconhecimento de Antigénios pelos Linfócitos T Os linfócitos T têm um papel importante nas respostas imunes adaptativas contra proteinas antigénicas:  

Na imunidade mediada por células, as células T CD4+ activam macrófagos para destruir micróbios fagocitados e as células T CD8+ matam células infectadas por micróbios intracelulares; Na imunidade humoral, as células TH CD4+ interagem com linfócito B e estimulam a proliferação e diferenciação dessas células B.

Tanto a fase de indução como a efectora das respostas das células T são desencadeadas pelo reconhecimento de um antigénio especifico. As células T reconhecem fragmentos peptidicos que são derivados de proteinas antigénicas e que estão ligados a moléculas na superficie celular codificadas por genes do MHC. As células que apresentam péptidos associados ao MHC são designadas células apresentadoras de antigénios (APCs): 

Certas APCs apresentam antigénios a células T naive durante a fase de reconhecimento das respostas imunes de modo a iniciar essas respostas;

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E algumas APCs apresentam antigénios a células T diferenciadas durante a fase efectora para desencadear os mecanismos que levam à eliminação do antigénio.

As formas fisico-quimicas dos antigénios que são reconhecidos pelas células T são diferentes das reconhecidas pelos linfócitos B e pelos anticorpos, e este facto levou à descoberta do papelo do MHC no reconhecimento de antigénios pelas células T: várias caracteristicas do reconhecimento de antigénios são unicas dos linfócitos T: 1. A maior parte das células T reconhece péptidos e não outras moléculas. Isto portque apenas péptidos se ligam a moléculas MHC. A maior parte dos linfócitos T reconhecem apenas péptidos enquanto as células B são capazes de reconhecer péptidos, proteinas, ácidos nucleicos, polissacarideos, lipidos e pequeno quimicos. Como resultados, as respostas imunes mediadas por células T são normalmente induzidas por antigénios péptidicos, a fonte natural de péptidos estranhos, enquanto as respostas imunes humorais são observadas com antigénio péptidicos e não péptidicos. Para além disso, algumas células T são especificam para pequenos haptenos quimicos, como dinitrofenol, uruchiol do veneno de hera, plactams de antibióticos pinicilina. Nestas situações, os haptenos devem ligar-se a proteinas do p´roprio e estes péptidos conjugados são reconhecidos por células T. 2. As células T são especificas por sequências de aminoácidos dos péptidos. Em contraste, as células B reconhecem determinantes conformacionais dos antigénios,mesmo proteinas, na sua configuração terciária nativa. Os receptores de antigénios das células T reconhecem poucos residuos num único péptido e diferentes células T são capazes de distinguir péptidos que diferem mesmo num único aminoácido; 3. As células T reconhecem e respondem a péptidos antigénicos estranhos apenas quando estes estão ligados à superficie das APCs, enquanto as células B e anticorpos secretados se ligam a antigénios soluveis nos fluidos corporais e a antigénios expostos na superficie das células estranhas. Isto ocorre porque as células T são capazes de reconhecer apenas péptidos ligados e apresentados pelas moléculas MHC, e estas são proteinas intgrais da membrana das APCs; 4. As células T de qualquer individuo reconhecem péptidos antigénicos estranhos apenas quando estes estão ligados e são apresentados pelas moléculas MHC desse individuo. Esta caracteristica é designada restrição MHC e pode ser demonstrada em situações experimentais nas quais os linfóctios T de um individuo são misturadas com APCS de outro individuo; 5. As células TH CD4+ reconhecem péptidos ligados a moléculas MHC classe II, enquanto as células Tc CD8+ reconhecem péptidos ligados a moléculas MHc classe I. Assim, as células T CD4+ são restritas a MHC classe II e as células T CD8+ são restritas a MHC classe I. A razão para esta segregação é que o CD4 se liga directamente a moléculas MHC classe II e o CD8 a moléculas MHC classe I; 6. As células T CD4+ restritas a classe II reconhecem péptidos derivados principalmente de proteinas extracelulares que são internalizadas em vesiculas pelas APCs enquanto as células T CD8+ reconhecem péptidos derivados do citosol, principalmente proteinas endogenamente sintetizadas. Isto ocorre porque proteinas vesiculares entram na via de processamento e apresentação de péptidos classe II e as proteinas citosólicas entram na via classe I. Joana Maria Soares Pereira

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A primeira demonstração da restrição MHC surgiu de estudos de Rolf Zinkernal e Peter Doherty, que examinavam o reconhecimento de células infectadas por virus por linfócitos T citotóxicos (CTLs) especificos para virus em ratinhos puros: 

  

Se um ratinho for infectado por um virus, as CTLs CD8+ especififcas para virus desenvolvem-se no animal. Essas CTLs reconhecem e matam células infectadas por virus apenas se essas células infectadas expressarem moléculas MHC de alelos que são expressos no animal no qual as CTLs foram geradas; Pelo o uso de estirpes de ratinhos MHC congénicos, mostrou-se que as CTLs e a célula alvo infectada devem ser derivadas de ratinhos que partinham um alelo MHC classe I; Assim, o reconhecimento de antigénios pelas CTLs CD8+ é restrito a alelos MHC classe I self; Experiências essencialmente semelhantes demonstraram também que as respostas dos linfócitos TH CD4+ a antigénios são restritos a MHC classe II.

A restrição MHC das células T é uma consequência dos processos de selecção durante a maturação de células T no timo: 

Durantes este processo de maturação, as células T que expressam receptores de antigénios especificos para péptidos ligados a MHC próprio são selecionados para sobreviver, e as células que não reconhecem MHC do próprio acabam por morrer;

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Este processo assegura que as células T que atingem a maturidade são as úteis porque serão capazes de reconhecer antigénios apresentados pelas moléculas MHC do individuo.

A descoberta da restrição MHC forneceu uma evidência definitiva que as células T não reconhecem apenas proteinas antigénicas mas também residuos polimórficos das moléculas MHC, que são residuos que distinguem MHC próprio do estranho. Assim, as moléculas MHC apresentam péptidos para reconhecimento por linfócitos T e são também componentes integrais dos ligandos que as células T reconhecem. No entanto, apesar das células T serem restritas a MHC do próprio, elas também reconhecm moléculas MHC etsranhas presentes em enxertos de tecidos e rejitam-nos. Em adição à apresentação de péptidos associada ao MHC, existe um outro sistema de apresentação de antigénios especializado para apresentar antigénios lipidicos:  



A molécula CD1 classe I não-polimórfica é expressa numa variedade de APCs e epitélios, e apresenta antigénios lipidicos a populações de células T não usuais que não são restritas a MHC; Uma variedade de células são capazes de reconhecer antigénios lipidicos apresentados pelas CD1, incluindo células T CD4+, CD8+ e CD4-CD8- que expressam recpetores de células T (TCR) αβ e também células T γδ; Existe um pequeno grupo de células T que expressam marcadores de células naturalmente assassinas, designadas NK-T cells, e reconhecem lipidos associados a CD1 e glicolipidos, incluindo alguns produzidos por bactérias.

Células Apresentadoras de Antigénios As respostas dos linfóctios T especificos para proteinas antigénicas requerem a participação de células apresentadoras de antigénios (APCs), que capturam e apresentam as células T. Esta conclusão é baseada em várias linhas de evidência experimental: 1. As células T presentes no sangue, baço ou nodos linfáticos de individuos imunizados com uma proteina antigénica podem ser activadas pela exposição a esse anitgénio numa cultura de tecido. Se células dendriticas, macrófagos e linfócitos B contaminates forem removidos da cultura, os linfócitos T purificados não respondem ao antigénio, e a resposta pode ser restaurada pela adição de qualquer uma dessas células. Isto permite determinar que tipo de célula é capaz de apresentar função apresentadora de antigénios; 2. Se um antigénio for recolhido por células dendriticas ou macrófagos in vitro e dpois injectado num ratinho, a quantidade de antigénio associado a células para induzir a resposta é 1000 vezes inferior à quantidade de mesmo antigénio necessária quando administrado por si só nums forma livre. Isto é, as proteinas associadas a células são muito mais imunogénicas que as proteinas soluveis. Isto é explicado pelo facto de a forma imunogénica do antigénio ser a forma associada a APCs e apenas uma pequena fracção de antigénio livre injectado é que acaba associado a APCs in vivo. Este conceito é agora explorado para imunizar pacientes com cancro contra os seus tumores pelo crescimento de APCs (especeialmente, células dendriticas) desses pacientes incubando-as com antigénios tumorais e injectando-as nos pacientes como uma vacina celular.

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As células apresentadoras de antigénios apresentam duas funções importântes na activação de células T:  

Processamento de antigénios – as APCs convertem proteinas antigénicas a péptidos, e apresentam complexos péptido-MHC para reconhecimento por células T; Co-estimulação – algumas APCs fornecem estimulos (co-estimuladores) às células T, para além dos iniciados pelo reconhecimento dos complexos péptido-MHC pelo receptor da célula T, que são necessários para as respostas completas das células T, especialmente as células CD4 + naive.

A função apresentadora de antigénios das APCs é aumentada pela exposição a produtos microbianos: 



As células dendriticas e os macrófagos expressam Toll-like receptors que respondem a micróbios pelo aumento da expressão de moléculas MHC e de co-estimuladores, melhorando a eficiência da apresentação de antigénios e antivando as APCs a produxir citocinas, que estimulam as respostas das células T; As células dendriticas e os macrófagos que são activados por micróbios expressam receptores de quimiocinas que estimulam a sua migração para locais de infecção, amplificando assim a apresentação de antigénios e a antivação de células T.

Para induzir a resposta das células T a uma proteina antigénica experimentalmente, o antigénio deve ser administrado com substâncias designadas adjuvantes, que podem ser produtos microbianos, como micobactérias mortas, ou mimitizam micróbios e estimulam as respostas das células T pelos mesmo mecanismos dos produtos microbianos:   

Não é possivel usar vários abjuvantes microbianos em humanos devido à inflamação aptológica que os produtos microbianos geram; Alguns adjuvantes que são usados em humanos, como alúmen, são especialmente bons na estimulação das respostas dos anticorpos mas são estimuladores de células T menos potentes; Antigénios proteicos administrados na forma aquosa sem adjuvantes tanto não induzem respostas das células T como induzem um estado de não-resposta, designado de tolerância.

Diferentes tipos de células funcionam como células apresentadoras de antigénios para activar células T naive e previamente efectoras diferenciadas: 

Células dendriticas – são as células apresentadoras de antigénios mais efectivas na activação de células T CD4+ e CD8+ naive e, assim, na iniciação das respostas das células T;

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Macrófagos – apresentam antigénios a c+elulas T CD4+ diferenciadas (efectoras) na fase efectora da imunidade mediada por células; Linfócitos B – apresentam antigénios a células TH durante as respostas imunes humorais.

As células dendriticas, macrófagos e linfócitos B expressam moléculas MHC classe II e co-estimuladores, e são, assim, capazes de activar linfócitos T CD4+. Por esta razão, estes três tipos de células foram designados células apresentadoras de antigénios profissionais. Contudo, este termo é por vezes usado para referir apenas as células dendrtiticas porque:  

Este é o unico tipo de células cuja função principal é capturar e apresentar antigénios; É o unico tipo de APCs capazes de iniciar respostas das células T.

Resumidamente, podemos organizar as principais caracteristicas das APCs do seguinte modo: Tipos de células

Células dendriticas

Macrófagos

Linfócitos B

Expressão de Co-estimuladores Constitutiva; aumenta com Constitutiva; aumenta a maturação; induzivel pelo com a maturação; IFN-γ, interacções CD40aumentada pelo IFN-γ CD40L Baixa ou negativa; Induzivel pelo LPS, IFN-γ, induzida pelo IFN-γ interacções CD40-CD40L Induzida pelas células T Constitutiva; aumentada (interacções CD40-CD40L), pela IL-4 cross-linking antigénio receptor MHC classe II

Células endoteliais vasculares

Unduzivel pelo IFN-γ; constitutiva em humanos

Constitutiva; induzivel em ratinhos

Várias células epiteliais e mesenquimais

Induzivel pelo IFN-γ

Probabelmente nenhuma

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Principal função Iniciação das respostas das células T a proteinas antigénicas Fase efectora das respostas mediadas por células Apresentação de antigénios a + células TH CD4 nas respostas imunes humorais (interacções célula T-célula B) Promove a activação de células T especificas para antigénios no local de exposição ao antigénio Função fisiológica desconhecida

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Papel das Células Dendriticas na Iniciação das Respostas das Células T As células dendrtiticas estão presentes nos órgãos linfáticos, no epitélio da pele e dos tractos respiratório e gastrointestinal e no intersticio da maior parte dos órgãos parenquimais:  





Estas células são morfologicamente identificadas pelas suas projecções membranosas; Existem grupos de células dendriticas que podem ser distinguidas pela expressão de vários marcadores membranares e podem ter diferentes papeis nas respostas imunes; Todas as células dendriticas têm origem em percursores da medula óssea e a maior parte, designadas células dendriticas mielóides, estão relacionadas em linhagem com os fagócitos mononucleares; As células dendriticas epiteliais são as células de Langerhans e ocupam cerca de 25% da área superficial da epiderme devido às suas grandes projecções.

Normalmente, as células dendriticas epiteliais e dos tecidos encontram-se num estado de descanso ou imaturo, necessitando de um processo de maturação:  



Estas células dendriticas capturam proteinas antigénicas microbianas e transportam os antigénios para nodos linfáticos; Em resposta aos componentes microbianos encontrados, as células dendriticas maturam-se enquanto migram para os nodos linfáticos e tornam-se extremamante eficientes na apresentação de antigénios e na estimulação de células T naive; As células dendriticas maduras residem nas zonas de células T nos nodos linfáticos e neste local apresentam antigénios a células T, e neste local são simplesmente designadas células dendriticas.

Assim, a iniciação das respostas das células T CD4+ dá-se nos órgãos linfoides periféricos, sendo necessário um transporte de antigénios para os órgãos linfóides depois de serem recolhidas na sua entrada portal: 



 

As vias comuns de entrada de antigénios estranhos, como micróbios, num hospedeiro são a pele e os epitélios dos sistemas respiratório e gastrointestinal. Em adição, antigénios microbianos podem ser produzidos em qualquer tecido que possa ter sido infectado; A pele, o epitélio mucoso e os órgãos parenquimais contêm numerosos capilares linfáticos que drenam linfa dessas locais para os nodos linfáticos regionais. A linfa contem uma amostra de todos os antigénios soluveis e associados a células presentes nestes tecidos; Os órgãos linfáticos que se encontram ao longo dos vasos linfáticos actuam como filtros da linfa em numerosos pontos antes desta alcançar o sangue; Antigénios que entram na corrente sanguinea são de modo semelhante testados no baço.

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O função das células dendriticas residentes nos epitélios e nos tecidos é capturar proteinas antigénicas e transportar os antigénios para drenagem nos nodos linfáticos: 









As células dendriticas imaturas, residentes nos epitélios e nos tecidos, expressam receptores membranares que se ligam aos micróbios, como receptores de manose. As células dendriticas usam esses receptores para capturar e endocitar antigénios microbianos, e iniciam o processamento de proteinas em péptidos capazes de se ligar a moléculas MHC. As células dendriticas também expressam Toll-like receptors que reconhecem moléculas microbianas e activam a célula para secreção de citocinas e iniciam o seu processo de maturação; As células dendriticas que são activadas por micróbios e por citocinas produzidas localmente, como tumor necrosis factor, perdem a sua adesão pelos epitélios e começam a expressar um receptor de quimiocinas designado CCR7 que é especifico para quimiocinas produzidas nas zonas de células T nos nodos linféticos. Assim, as quimiocinas atraem células dendriticas carregadoras de antigénios microbianos para as zonas de células T dos nodos linfáticos regionais; A maturação também converte as células dendriticas cuja função era capturar antigénios em células que são capazes de apresentar antigénios a células T naive e activar os linfócitos. As células dendriticas maduras expressam elevados niveis de moléculas MHC classe II com péptidos ligados tal como co-estimuladores necessários para a activação de células T; Quando estas células se tornam residentes no nodos linfáticos, elas estão completamente desenvolvidas em potentes APCs com a habilidade de activar linfócitos T. Células T naive que recirculam através dos nodos linfáticos encontram estas APCs, as células T que são especificas para a apresentação de complexos péptido-MHC são activadas e um resposta imune é iniciada.

Assim, podemos descrever várias propriedades das células dendriticas que as tornam as células apresentadoras de antigénios mais efectivas na iniciação de respostas primárias das células T: Joana Maria Soares Pereira

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1. As células dendriticas estão estrategicamente localizadas em locais comuns de entrada de micróbios e antigénios estranhos e em tecidos que podem ser colonizados por micróbios; 2. As células dendriticas expressam receptores que permitem que elas capturem micróbios e respondam a estes; 3. Estas células migram preferencialmente para zonas de células T nos nodos linfáticos, através dos quais linfócitos T naive circulam procurando por antigénios estranhos; 4. Células dendriticas maduras expressam elevados niveis de co-estimuladores, que são necessários para activar linfócitos T naive. Células dendriticas imaturas Principal função Expressão de receptores Fc, receptores de manose Expressão de moléculas envolvidas na activação de células T: B7, ICAM-1, IL-12 Moléculas MHC classe II Semi-vida Numero de moléculas de superficie

Captura de antigénios

Células dendriticas maduras Apresentação de antigénios a células T

++

-

- ou baixa

++

~ 10 hr 6 ~ 10

>100 hr 6 ~ 7 x 10

Os antigénios podem também ser transportados para os nodos linfáticos numa forma soluvel. Quando a linfa entra num nodo linfóide através de um vasos lifántico aferente é filtrada por todo o nodo: 





Aqui, os antigénios soluveis na linfa podem ser extraidos do fluido por células dendriticas residentes e macrófagos e as células B no nodo podem também reconhecer e internalizar antigénios soluveis; As células dendriticas, os macrófagos e as células B que reconheram proteinas antigénicas podem depois processá-las e apresentar esses antigénios a células T naive e a células T efectoras que foram anteriormente produzidas; Assim, as populações de APCs nos nodos linfáticos acumulam e concentram antigénios e apresentam-nos a linfócitos T CD4+ especificos.

As células dendriticas são também as melhores APCs na indução de respostas primárias de células T CD8+, mas isto coloca um problema especial porque os antigénios que estes linfócitos reconhecem têm de ser produzidos em qualquer tipo de célula, como uma célula infectada por virus ou tumoral:  



As células dendriticas apresentam a habilidade de ingerir células infectadas por virus ou tumorais e apresentar antigénios dessas células em moléculas MHC classe I; Esta via de apresentação de antigénios é contrária à regra geral de que antigénios ingeridos em vesicula são apresentadas em moléculas MHC classe II, enquanto péptidos associados a MHC classe I são derivados de proteinas citosólicas; Este processo é designado cross-presentation para indicar que um tipo de célula é capaz de apresentar antigénios de outra célula e activar células T especificas para esses antigénios.

Os linfócitos B reconhecem antigénios soluveis tal como antigénios apresnetados por células dendriticas. Um tipo de células especializadas designadas de células dendriticas foliculares, que são distintas das células dendriticas comuns, apresentam antigénios a linfócitos B previamente activados em centros germinais. Joana Maria Soares Pereira

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Apresentação de Antigénios a Linfócitos T Efectores Diferenciados Nas respostas imunes mediadas por células, os macrófagos apresentam os antigénios de micróbios fagocitados e células T efectoras, que activam os macrófagos a matar os micróbios. Este processo é a reacção central da imunidade mediada por células:  

Monócitos circulantes são capazes de migrar para qualquer local de infecção e inflamação, onde se diferenciam em macrófagos e fagocitam e destroem micróbios; As células T CD4+ aumentam as actividade microbicidas destes macrófagos. A maior parte dos macrófagos expressa baixos niveis de moléculas MHC classe II e co-estimuladores, e niveis mais elevados são induzidos pela citocina IFN-γ.

Por outro lados, nas respostas imunes humorais os linfócitos B internalizam proteinas antigénicas soluveis e apresentam péptidos derivados dessas proteinas a células TH. Esta função das células B é essencial para a produção de anticorpos dependentes de células TH, um processo que ocorre principalmente nos órgãos linfóides. Todas as células nucleadas são capazes de apresentar péptidos associados a moléculas MHC classe I, derivados de proteinas antigénicas citosólicas, a linfócitos T CD8+ citotóxicos porque todas as células nucleadas expressam moléculas MHC classe I: 



  

A maior parte das proteinas antigénicas estranhas que estão presentes no citosol são engenamente sintetizadas, como proteinas virais em células infectadas por virus e proteinas mutadas em células tumorais; Todas as células nucleadas são susceptiveis a infecções virais e a mutações causadoras de tumores. Assim, é importante que o sistema imune seja capaz de reconhecer antigénios citosólicos ancoradas em qualquer tipo de célula; CTLs CD8+ diferenciadas são capazes de reconhecer péptidos associados a classe I e matar qualquer célula que expresse antigénios; A expressão ubiqua de moléculas classe I permite que CTLs restritas a classe Ireconheçam e aliminam qualquer tipo de célula infectada por virus ou tumoral; Micróbios fagocitados podem tambem ser reconhecidos por CTLs CD8+ porque alguns destes micróbios ou os seus antigénios podem escapar das vesiculas fagociticas para o citosol.

No entanto, a apresentação de péptidos associados a moléculas MHC classe II ocorre apenas nas APCs, mas ainda outras células são capazes de expressar estas moléculas MHC classe II: 





As células endoteliais vasculares em humanos expressam moléculas MHC classe II e poderão apresentar antigénios a células T sanguineas que se tornaram aderentes à aprede do vaso. Isto contribui para o recrutamento e activação de células T nas reacções imunes mediadas por células; As células endoteliais em enxertos são também alvos de células T reagindo contra enxertos antigénicos. Várias células epiteliais e mesenquimais expressam moléculas MHC classe II em resposta a IFN-γ. O significado fisiológico da apresentação de antigénios por estas células ainda não é claro, e já que não expressam co-estimuladores não devem ter papel importante na apresentação de antigénios a células T; As células epiteliais timicas expressam constitutivamente moléculas MHC classe II e têm um papel critico na apresentação de complexos MHC-péptido a células T que sofrem maturação no

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timo como parte dos processos de selecção que moldam o reportório de especificidades das células T.

Processamento de Antigénios As vias de processamento de antigénios convertem proteinas antigénicas derivadas do espaço extracelular ou do citosol em péptidos e carregam esses péptidos nas moléculas MHC para apresentação aos linfócitos T: 

 



As vias de processamento e apresentação de antigénios usam organelos e enzimas subcelulares que apresentam funções generalizadas de degradação e reciclagem de proteinas que não são exclusivamente usadas para a apresentação de antigénios ao sistema imune; Assim, tanto a via de apresentação de antigénio pelo MHC classe I ou classe II evoluiram como adaptações de funções celulares básicas; Os mecanismos celulares de processamento de antigénios são designados para gerar péptidos que apresentam caracteristicas estruturais necessárias para a associação com moléculas MHC e para colocar esses péptidos na mesma localização celular das moléculas MHC apropriadas com fendas de ligação a péptidos disponiveis; A ligação de péptidos a moléculas MHC ocorre antes da expressão na superficie da célula e é um componente integral da biossintes e montagem das moléculas MHC, devido també ao facto de este passo ser necessário para uma montagem estável das moléculas MHC.

Os diferentes destinos dos antigénios vesiculares e citosólicos são devidos a vias de biossintese e montagem diferentes para moléculas classe I e classe II: 



Esta diferente fundamental entre antigénios vesiculares e citosólicos foram demonstrados experimentalmente pela análise da apresentação do mesmo antigénio produzido em APC por diferentes vias; Se uma proteina globular for adicionada na forma soluvel a APCs e endocitada para vesiculas destas células, ele é subsequentemente apresentada como péptidos associados a classe II e reconhecida por células T CD4+;

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Em contraste, se a mesma proteina antigénica for produzida no citoplasma de APCs com produto de um gene modificado de modo a entrar na via secretória, ou introduzida directamente no citoplasma de APCs por choque osmótico, ela é apresentada na forma de péptidos associados a classe I que são reconhecidos por células T CD8+.

As principais caracteristicas das vias MHC classe I e classe II são: Caracteristica

Via MHC classe II Cadeias α e β polimórficas, péptido

Composição do complexo péptido-MHC estável

Tipos de APCs Células T Fontes de proteinas antigénicas Enzimas responsáveis pela geração de péptidos Local de carregamento do MHC Molécula envolvidas no transporte de péptidos e carregamento de moléculas MHC

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Células dendriticas, fagócito mononucleares, linfócitos B, células endoteliais, epitélio timico + Células T CD4 proteinas endossomais/lisossomais (maioritariamente internalizadas do ambiente extracelular) Proteases endossomais e lisossomais (e.g., catepsinas) Compartimento vesicular especializado Chaperones no ER; cadeia invariante no RE, Golgi e MIIC/CIIV; DM

Via MHC classe I Cadeia αpolimórfica, β2micrglobulina, péptido

Todas as células nucleadas +

Células T CD8 Proteinas citosólicas (principalmente sintetizadas na célula, podem também entrar no citosol a partir dos fagossomas) Proteossoma citosólico Reticulo endoplasmático Chaperones, TAP no RE

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Via MHC Classe II A produção de péptidos associados a MHC classe II a partir de antigénios endocitados involve a degradação proteolitica de proteinas internalizadas em vesiculas endociticas e a ligação de péptidos a moléculas MHC classe II nestas vesiculas:

1. RECOLHA DE PROTEINAS EXTRACELULARES PARA COMPARTIMENTOS VESICULARES DAS APCS

Os passos iniciais na apresentação de proteinas antigénios extracelulares são a ligação do antigénio naive a uma APC e a internalização desse antigénio. Diferentes APCs são capazes de se ligar a proteinas antigénicas de vários modos e com eficiências e especificidades variáveis: 

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Células dendriticas e macrófagos expressam uma variedade de receptores de superficie que reconhecem estruturas partilhadas por vários micróbios. Assim, estas APCs ligam e internalizam micróbios eficientemente; Macrófagos também expressam receptores para as porções Fc dos anticorpos e receptores para a proteina do complemento C3b, que liga antigénios com anticorpos ligados ou proteinas do complemento e melhoram a sua internalização; Na superficie dos linfócitos B também existem receptores, as imunoglobulinas de superficie, que, devido às suas elevadas afinidade para antigénios, conseguem mediar a internalização de proteins presentes a concentrações muito baixas no fluido extracelular.

Depois da internalização, as proteinas antigénicas localizam-se em vesiculas intracelulares revestidas por uma membrana e os endossomas são vesiculas com pH acidico que contêm enzimas proteoliticas. A via endossomal de trâfego intracelular de proteinas comunica com lisossomas, que são vesiculas revestidas por uma membrana mais densas e com conteudo enzimático. Micróbios particulares são internalizados em vesiculas designadas fagossomas, produzindo vesiculas designadas fagolisossomas. A fusão dos lisossomas com as vesiculas de endocitose leva à degradação do conteúdo fagocitado.

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No entanto, alguns micróbios, como as micobactérias e a Leishmania, podem sobreviver e mesmo replicar nos fagossomas ou endossomas, fornecendo uma fonte persistente de antigénios nos compartimentos vesiculares. 2. PROCESSAMENTO DE PROTEINAS INTERNALIZADAS EM VESICULAS ENDOSSOMAIS E LISOSSOMAIS

Proteinas internalizadas são degradadas enzimaticamente em endossomas tardios e lisossomas para gerar péptidos que são capazes de se ligar às fendas de moléculas MHC classe II. A degradação de proteinas antigénicas em vesiculas é um processo activo mediado por proteases que apresentam um pH óptimo: 

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O processamento de proteinas soluveis por macrófagos (e outras APCs) é inibida mantendo as APCs metabolicamente inertes por fixação quimica ou aumentando o pH de vesiculas intracelulares acidicas com agentes como as cloroquinas; Vários tipos de proteases estão presentes em endossomas e lisossomas e inibidores especificos destas enzimas bloqueiam a apresentação de proteinas antigénicas pelas APCs; As formas processadas da maior parte das proteinas antigénicas que as células T reconhecem podem ser artificialmente geradas por proteólise. As APCs que são quimicamente fixadas ou tratadas com cloroquina antes de processarem proteinas antigénicas podem apresentar eficientmente péptidos antes digeridos desse antigénio mas não a proteina intacta a células T especificas.

Várias enzimas diferentes participam na degradação de proteinas antigénicas nos endossomas. As proteases mais abundantes nos endossomas são as catepsinas, que são proteases tiol e aspartil com largas especificidades de substratos e que apresentam um papel importante na produção de péptidos para a via classe II. Proteinas parcialmente degradadas ou clivadas ligam-se a fendas MHC classe II livres e são enzimaticamente aparadas para o seu tamanho final. A maior parte dos péptidos de ligação a MHC classe II são derivados de proteinas internalizadas do meio extracelular e proteinas de compartimentos secretórios que são normalmente degradadas em lisossomas. Menos frequentemente, as proteinas citoplasmáticas e membranares podem também entrar na via classe II. Joana Maria Soares Pereira

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Em alguns casos, isto pode resultar de digestão enzimática de conteudos citoplasmáticos, autofagia:   

Nesta via, proteinas citoplasmáticas são presas em vesiculas derivadas do reticulo endoplasmático designadas autofagossomas; Estas vesiculas fundem-se com lisossomas e as proteinas citoplasmáticas são proteoliticamente degradadas; Os péptidos gerados por esta via podem ser entregues às mesmas vesiculas classe II às quais os péptidos derivados de antigénios ingeridos são entregues.

Alguns péptidos que se associam com moléculas classe II derivam de proteinas membranares que podem ser recicladas pela mesma via endocitica que as proteinas extracelulares. Assim, mesmo virus, que replicam no citoplasma de células infectadas, produzem proteinas citoplasmáticas e membranares que são degradadas em péptidos que entram na via MHC classe II de apresentação de antigénios. Este pode ser um mecanismo para a activação de células TH CD4+ especificas para antigénios virais. 3. BIOSSINTESE E TRANSPORTE DE MOLÉCULAS MHC CLASSE II PARA OS ENDOSSOMAS

A biossintese de moléculas MHC classe II ocorre no RE e estão são transportadas para endossomas com uma proteina associada, designada cadeia invariante (Ij), que ocupa as fendas de ligação ao péptido de moléculas classe II recentemente sintetizadas:   

As cadeias α e β das moléculas MHc classe II são coordenadamente sintetizadas e associadas uma à outra no RE; Dimeros classe II nascentes são estruturalmente instáveis e a sua montagem é auxiliada por chaperones residentes no RE, como a calnexina; A Ij não polimórfica também se associa com heterodimeros αβ MHC classe II no RE.

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A proteina Ij é um trimero composto por três subunidades de cerca de 30 kDa, cada uma das quais se liga a um heterodimero αβ MHC classe II de tal modo que interfere com o carregamento da fenda formada pelas cadeias α e β:  

Assim, as moléculas MHC classe II não conseguem ligar e apresentar péptidos que encontram no RE, deixando tais péptidos para se associar a moléculas classe I; A Ij também promove a montagem de moléculas classe II e direcciona moléculas classe II recentemente formadas para endossomas tardios e lisossomas onde proteinas internalizadas foram proteoliticamente degradadas em péptidos.

Ao contrário das vesiculas contendo proteinas destinadas para secreção ou para a superficie da célula, as vesiculas contendo moléculas MHC classe II emergem do aparelho de Golgi e são enviadas para endossomas e lisossomas: 

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Durante a sua viagem até à superficie das células, as vesiculas exociticas transportadoras de moléculas MHC classe II encontram-se e fundem-se com vesiculas endociticas contendo antigénios internalizados e processados; Como resultado, as moléculas classe II entram nas vesiculas que também contêm péptidos gerados por proteólise de proteinas endocitadas.

Foi definida uma classe de endossomas ricos em classe II que apresentam papeis importantes na apresentação de antigénios. Em macrófagos e linfócitos B humanos, designa-se compartimento MHC classe II, ou MIIC:  

Apresenta uma aparência multilaminar por microscopia electrónica; Contem todos os compartimentos necessários para a associação péptido-classe II, incluido enzimas que degradam proteinas antigénicas, as moléculas classe II, as Ij e uma molécula designada human leukocyte antigen DM (HLA-DM).

APCs de ratinhos KO deficiente em Ij mostram apresentação deficiente de algumas proteinas antigénicas mas são ainda capazes de apresentar péptidos associados a classe II derivados de uma larga gama de proteinas. Assim, isto sugere que a importância da Ij pode variar de acordo com o antigénio e aser apresentado. 4. ASSOCIAÇÃO DE PÉPTIDOS PROCESSADOS COM MOLÉCULAS MHC CLASSE II EM VESICULAS

Nos MIIC, ocorre a associação de péptidos às moléculas MHC classe II. A Ij (cadeia invariante) dissociase das moléculas MHC classe II pela acção combinada de enzimas proteoliticas e da moléculas HLA-DM, e os péptidos antigénicos são então capazes de se ligar a fendas de ligação de péptido disponiveis nas moléculas MHC classe II: 

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Como as Ij bloqueiam o acesso à fenda de ligação ao péptido de moléculas MHC classe II, devem ser removidas antes de se poderem formar complexos de péptidos com moléculas MHC classe II; As mesma enzimas proteoliticas, como catepsina S, que geraram péptidos a partir de proteinas internalizadas também actuam sobre as Ij, degradando-as e deixando apenas um pequeno péptidos de 24 aminoácidos designado péptido classe II associado a cadeia invariante (CLIP); O CLIP localiza-se na fenda de ligação ao péptido de moléculas classe II. Assim, é necessária a remoção do CLIP antes da fenda se tornar acessivel para os péptidos produzidos a partir de proteinas extracelulares;

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Esta remoção é feita pela a acção de uma molécula chamada HLA-DM (ou H-2M no ratinho), que é codificada no MHC, tem uma estrutura semelhante a moléculas MHC classe II e co-localiza-se com as moléculas MHC classe II nos compartimentos MIIC; Assim que o CLIP é removido, os péptidos gerados por proteólise de proteinas antigénicas internalizadas são capazes de se ligar a moléculas MHC classe II. Assim, as moléculas HLA-DM aceleram a ligação de péptidos a moléculas classe II; Como as terminações das fendas de ligação em moléculas MHC classe II estão abertas, péptidos grandes e mesmo proteinas inteiras não enroladas podem ligar-se à fenda e são depois aparadas por enzimas proteoliticas para o tamanho adequado; Os péptidos apresentados na superficie das células classe II têm um tamanho de 10-30 residuos, sendo que normalmente são gerados por este processo de aparamento.

As moléculas HLA-DM diferem das moléculas classe II em vários aspectos:   

Não são polimórficas; Não se associam com as Ij; Não são expressas na superficie das células.

As moléculas HLA-DM actuam como trocadores de péptidos, facilitando a remoção do CLIP e a adição de outros péptidos a moléculas MHC classe II. O papel critico das HLA-DM foi demonstrado pela descoberta de que linhas celulares mutantes que não apresentam Dm, e ratinhos KO que não contêm a proteina homóloga H-2M, são deficientes na apresentação de péptidos derivados de proteinas extracelulares: 

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Quando moléculas MHC classe II são isoladas deste mutantes, encontram-se CLIPs quase exclusivamente a ocupar as suas fendas de ligação, facto consistente com o papel de remoção do CLIP pelo DM; Transfecção de genes codificantes de DM para estas linhas celulares mutantes restaura a apresentação de antigénios associados a classe II.

Linfócitos B, e talvez outras APCs, expressam outro heterodimero classe II-like não-polimórfico designado HLA-DO: 

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A maior parte das DO nas células é encontrada com as DM, sugerindo que as moléculas DO poderão regular a eficiência da apresentação de antigénios ou o tipo de péptidos que são gerados nas células B; Contudo, as DO não são necessárias para o processamento de antigénios, e as suas funções continuam pobremente definidas.

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5. EXPRESSÃO DE COMPLEXOS PÉPTIDOS-CLASSE II NA SUPERFICIE DAS APCS

As moléculas MHC classe II são estabilizadas pela ligação de péptidos e os complexos péptido-classe II estáveis são deixados na membrana das APCs, onde são apresentados para reconhecimento pelas células T CD4+: 

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A necessidade da ligação do péptido para a estabilização de moléculas MHC classe II assegura que apenas complexos péptido-MHC apropriadamente carregados são expressos na superficie das células; Assim, que são expressos na superficie das APCs, os complexos péptido-classe II são reconhecidos por células T CD4+ especificas, com o co-receptor CD4 a ter um papel essencial na ligação a regiões não-polimórficas das moléculas MHC classe II; A baixa taxe de dissociação e, assim, o longo tempo de semi-vida dos complexos péptido-MHC aumenta a probabilidade de uma célula T especifica para tal complexo faça contacto e seja activada; Enquanto moléculas classe II carregadas com péptidos viajam dos endossomas tardios para a superficie da célula, outras moléculas envolvidas na apresentação de antigénios, como DM, mantêm-se em vesiculas e não são expressas com proteinas membranares.

Como as APCs apresentam continuadamente péptidos derivados de todas as proteinas que encontram, apenas uma fracção muito pequena de complexos péptido-MHC na superficie celular apresentarão o mesmo péptido. Além disso, a maior parte dos péptidos ligados serão derivados de proteinas do próprio normais porque não existe nenhum mecanismo para destinguir proteinas self de non-self no processo que gera os complexos péptido-MHC. Isto gera duas questões: 1. Como é que as células T reconhecem e são activadas por qualquer antigénio estranho se normalmente todas as APCs apresentam principalmente complexos péptido-MHC self? As células T são notavelmente sensiveis e necessitam de reconhecer especificamente muito poucos complexos péptido-MHC para serem activadas. Estima-se que apenas cerca de 100 complexos de um péptido particular com uma molécula MHC classe II na superficie de uma APC são capazes de iniciar uma resposta especifica de uma célula T. Isto representa menos de 0,1% do número total de moléculas MHC classe II presentes na superficie de uma APC. Assim, antigénios recentemente introduzidos podem ser processados em péptidos que carregam suficientes moléculas MHC de APCs para activar células T especificas para esses antigénio, apesar de algumas moléculas MHC estarem ocupadas por péptidos self. A habilidade das APCs internalizarem, processarem e apresentarem uma mistura heterogénea de proteinas self e nonself assegura que o sistema imune seja capaz de reconhecer pequenas exposições a antigénios estranhos. O reconhecimento de antigénios pelas células T também desencadeia uma redestribuição de moléculas MHC sobre as APCs para a célula T, estabelecendo um feedback positivo que promove o reconhecimento de antigénios. 2. Se individuos processam as suas proteinas e as apresentam em associam com as próprias moléculas MHC classe II, porque é que não desenvolvemos normalmente respostas imune contra as nossas proteinas? Complexos péptido-MHC self são formados mas não induzem autoimunidade porque células T especificas para tais complexos são morta ou inactivadas. Assim, as células T não capazes de responder normalmente a antigénios self. Joana Maria Soares Pereira

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Via MHC Classe I A produção de péptidos associados a MHC classe I é feita por degradação proteolitica de proteinas citosólicas, transporte dos péptidos gerados para o RE e a sua ligação a moléculas MHC classe I recentemente sintetizadas:

1. FONTES DE ANTIGÉNIOS CITOSÓLICOS

Os péptidos que são apresentados ligados a moléculas MHC classe I derivam de proteinas citosólicas, sendo a maior parte sintetizadas endogenamente nas células nucleadas:   

Antigénios estranhos no citosol são produtos de virus ou outros micróbios intracelulares que infectaram tais células; Nas células tumorais, vários genes mutados ou expressos em excesso podem produzir proteinas antigénicas que são reconhecidas por CTLs restritas a classe I; Péptidos que são apresentados em associação com moléculas classe I podem também ser derivados de micróbios ou outros antigénios particulares que são internalizados nos fagossomas.

Alguns micróbios são capazes de danificar as membranas dos fagossomas e criar poros através dos quais os micróbios e os seus antigénios entram no citosol. Por exemplo, estirpes patogénicas de Listeria monocytogenes produzem uma proteinas, designada listeriolisina, que permite que a bactéria escape de vesiculas para o citosol. Assim que os antigénios de micróbios fagocitados estão no citosol, são processados como qualquer outro antigénio citosólico. 2. DEGRADAÇÃO PROTEOLITICA DE PROTEINAS CITOSÓLICAS

O principal mecanismo para a produção de péptidos a partir de proteinas antigénicas citosólicas é a proteólise pelo proteossoma: 

O proteossoma é uma grande enzima multimérica com uma larga actividade proteolitica que é encontrada no citoplasma da maior parte das células;

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Uma forma do proteossoma com 700 kDa aparece como um cilindo composto por dois aneis externos e dois internos, cada anel sendo composto por sete subunidades. Três das sete subunidades são os locais cataliticos para proteólise; Um proteossoma maior, 1500 kDa, é mais importante na produção de péptidos classe I e é composto pela estrutura de 700 kDa mais algumas subunidades adicionais que regulam a actividade proteolitica; Duas subuinidade cataliticas presentes nos proteossomas de 1500 kDa, designadas LMP-2 e LMP-7, são codificadas por genes no MHC, e são particularmente importantes para a produção de de péptidos classe I.

O proteossoma realiza uma função básica das células degradando várias proteinas danificadas ou mal montadas. Estas proteinas são alvo de degradação proteossomal por ligação covalente a várias cópias de pequenos péptidos designados ubiquitina. Proteinas ubiquinadas são reconhecidas pelas cápsulas dos proteossomas e são desenroladas, a ubiquitina é removida e as proteinas são puxadas para dentro do proteossoma.

O proteossoma apresenta uma ampla gama de especificidade de substratos e gera uma grande variedade de péptidos a partir de proteinas citosólicas, mas não as degrada em aminoácidos:  

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Em células tratadas com a citocina IFN-γ, existe um aumento da transcrição e sintese de LMP-2 e LMP7, e essas proteinas substituem duas das subunidades do proteossoma; Isto resulta numa alteração de especificadade para substratos de modo que os péptidos produzidos apresentam cerca de 6-30 residuos e contêm aminoácidos C-terminais básicos ou hidrofóbicos, caracetristicas tipicas de péptidos transportados por moléculas MHC classe I; Assim, os proteossomas são excelentes exemplos de organelos cujas funções celulares básicas foram adaptadas para o papel expecializados de apresentação de antigénios.

Várias linhas de evidência estabeleceram que a degradação proteossomal de proteinas citosólicas é necessa´ria para a entrada na via de processamento de antigénios classe I: 1. Inibidores especificos da função proteossomal bloqueiam a apresentação de uma proteina citoplasmática a células T restritas a MHC classe I. Contudo, se o péptido que é reconhecido pelas CTLs for sintetizados directamente no citoplasma de uma célula como produto de um minigene transfectado, o péptido é apresentado e a célula pode ser morta por CTLs. Nesta situação, a apresentação do péptido não é bloqueada por inibidores de enzimas proteossomais, indicando que assim que os antigénios são convertidos a péptidos citosólicos não necessitam de mais dagradação proteossomal; Joana Maria Soares Pereira

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2. Em algumas linhas celulares, a inibição da ubiquitinização também inibe a apresentação de ptoteinas citoplasmáticas a células T restritas para MHC classe I especificas. De modo reciproco, modificação de proteinas por ligação de uma sequência N-terminal que é reconhecida por enzimas de conjugação de ubiquitina leva ao aumento da ubiquitinização e a apresentação de antigénios associados a MHC classe I mais rapidamente; 3. Ratinhos nos quais genes codificantes de determinadas subunidades proteossomais (LMP-2 ou LMP-7) são eliminados mostram defeitos na produção de CTLs contra alguns virus, presumivelmente devido a deficiente apresentação de antigénios virais associados a MHC classe I. Assim, os mecanismos preoteoliticos que geram péptidos antigénicos que ligam moléculas MHC classe I são diferentes dos mecanismos descritos para as associações péptido-MHC classe II. Isto é também evidente a partir da observação que agentes que aumentam o pH endossomal e lisossomal, ou directamente inibem proteases endossomais, bloqueiam a apresentação de antigénios restrita a classe II mas não classe I, enquanto inibidores da ubiquitinização ou dos proteossomas fazem exactamente o inverso. No entanto, existem outros mecanismos de produção de péptidos para apresentação via classe I que não exigem ubiquinização e o proteossoma, podendo ocorrer degradação de proteinas no RE. 3. TRANSPORTE DE PÉPTIDOS DO CITOSOL PARA O RETICULO ENDOPLASMÁTICO

Como os péptidos antigénicos para a via classe I são produzidos no citosol mas as moléculas MHC classe I são sintetizadas no RE, tem de existir um mecanismo de transporte de péptidos para o RE. A proteina transportadora, designada TAP (transportador associado com o processamento de antigénios):  

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Heterodimero trans-membranar constituido por duas proteinas: TAP1 e TAP2; Em adição aos seus segmentos trans-membranares, as proteinas TAP1 e TAP2 apresentam um dominio projectado para o lumen do RE e um dominio de liagação a ATP que se projecta para o citoso; Ambas as proteinas TAP1 e TAP2 pertencem à familia de proteinas transportadoras de ligação a ATP encontradas na membrana de várias células, incluindo bactérias, e que medeiam o transporte de pequenas moléculas dependente de ATP.

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Péptidos gerados no citosol pelo proteossoma são translocados pela TAP para o RE por um processo que requer a hidrólise de ATP e a TAP tem caracteristicas importantes que beneficiam este transporte:   

A TAP apresenta o máximo de afinidade para péptidos com cerca de 8-10 aminoácidos, o que corresponde a um tamanho óptimo para ligação a moléculas MHC classe I; Em adição, a TAP favorece péptidos com residuos hicrofóbicos ou básicos C-terminais, os residuos preferidos para ancoragem a moléculas MHC classe I; A TAP é óptima para o transporte de péptidos que irão interagir com moléculas MHC classe I.

Os genes TAP1 e TAP2 localizam-se na região MHC classe II, adjacentes aos genes LMP2 e LMP7. Ambos os genes transportadores e LMP são polimórficos, o que significa que diferentes alelos são expressos numa população. Este polimorfismo pode contribuir para a variação observada entre individuos relativamente às suas respostas a diferentes antigénios endogenos. 4. MONTAGEM DE COMPLEXOS PÉPTIDO-MHC CLASSE I NO RETICULO ENDOPLASMÁTICO

A sintese e montagem de moléculas classe I envolve um processo de vários passos no qual a ligação do péptido é um ponto importante:    

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As cadeias α e β2-microglobulina classe I são sintetizadas no RE e o enrolamento adequado de cadeias α nascentes é assistida por várias chaperones do RE, como calnexina e calreticulina; No RE, os dimeros classe I formados vazios continuam ligados ao complexo TAP por tapasina; Depois da entrada no RE via TAP, os péptidos são normalmente aparados para o tamanho apropriado por uma aminopepidase residente no RE, ERAP; Os péptidos podem então ligar-se à fenda da molécula classe I adjacente, sendo depois o complexo péptido-classe I libertado da tapasina e capaz de sair do RE e ser transportado para a superficie da célula; Na ausência de péptido ligado, a maior parte dos dimeros MHC classe I formados são instáveis, não são transportados do RE eficientmente e são degradados neste local.

Péptidos transportados para o RE preferencialmente ligam-se a moléculas classe I mas não a classe por duas razões: 1. Moléculas classe I recentemente sintetizadas estão ligadas à parte luminal dos complexos TAP, prontas para receber péptidos; 2. No RE, as fendas de ligação a péptidos de moléculas MHC classe II recentemente sintetizadas estão bloqueadas pela Ij associada.

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5. EXPRESSÃO DE COMPLEXOS PÉPTIDO-MHC CLASSE I NA SUPERFICIE CELULAR

Moléculas MHC classe I com péptidos ligados são estruturalmente estáveis e são expressas na superficie celular:  

Complexos péptido-MHC classe I que foram produzidos no RE movem-se atravé do aparelho de Golgi e são transportados para a superficie da célula por vesiculas exociticas; Assim que são expressas na superficie da célula, os complexos péptido-classe I são reconhecidos por células T CD8+ especificas, com o co-receptor CD8 apresnetado um papel essencial ligandose a regiões não-polimórficas das moléculas MHc classe I.

Vários virus evoluiram mecanismos que interferem com a montagem e carregamento de moléculas MHC classe I, enfatizando a importância desta via na imunidade antiviral.

Significado Fisiológico da Apresentação de Antigénios via MHC As vias de apresentação de antigénio classe I ou classe II processam proteinas disponiveis para apresentação a células T, e a maior parte dessas proteinas são próprias do hospedeiro. Proteinas estranhas são relativamente raras, podendo derivar de micróbios infecciosos, outros antigénios estranhos introduzidos no corpo e tumores. As células T apresentam uma função de vigilância, analisando todos os péptidos apresentados para a presença de péptidos estranhos e respondendo a estes ultimos:

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Péptidos do próprio não estimulam respostas das células T, porque células T com receptores para estes péptidos foram eliminadas durante a maturação no timo ou porque as células podem sofrer inactivação por reconhecimento de antigénios do próprio; As moléculas MHC apresentam antigénios do espaço extracelular ou do citosol de todas as células nucleadas, e isto é importante porque micróbios podem residir nas duas localizações. Apesar de péptidos derivados de antigénios estranhos (e.g., microbianos) não serem abundantes, estes antigénios estranhos são reconhecidos pelo sistema imune devido à eslevada sensibilidade das células T; Micróbios infecciosos estimulam a expressão de co-estimuladores nas APCs que aumentam as respostas das células T, assegurando assim que as células T sejam activadas quando micróbios estão presentes.

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A apresentação de proteinas vesiculares versus citosólicas pelas vias MHC classe II ou classe I, respectivamente, determina quais os grupos de células T que responderão a antigénios encontrados nestas duas pools de proteinas: 

Antigénios extracelulares – normalmente terminam em vesiculas endossomais e activam células T CD4+ restritas a classe II porque proteinas vesiculares são processadas em péptidos que se ligam a classe II. As células T CD4+ funcionam como ajudantes para estimular mecanismos efectores, como anticorpos e a fagocitose, que servem para eliminar antigénios extracelulares;

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Antigénios citosólicos – antigénios sintetizados endogenamente estão presentes na pool citoplasmática de proteinas, onde estão inacessiveis aos anticorpos e à fagocitose. Estes antigénios citosólicos entram na via de processamento de moléculas classe I e activam CTLs CD8+ restritas a classe I, que matam as células que produzem os antigénios intracelulares. A expressão de moléculas classe I em todas as células nucleadas assegura que os péptidos de virtualmente qualquer proteina podem ser apresentados para reconhecimento por células T CD8+. Assim, antigénios de micróbios que residem em diferentes localizações celulares selectivamente estimulam as respostas das células T que são mais efectivos na eliminação desse tipo de micróbio.

Isto é especialmente importante porque os receptores de antigénios de células T H e CTLs não são capazes de distinguir entre micróbios extracelulares e intracelulares. Pela secreção de péptidos derivados de diferentes tipos de micróbios, as moléculas MHC guiam estes subgeupos de células T a responder a micróbios que cada grupo consegue combater. A especificidade única das células T para antigénios ligados à superficie de células é essencial para as funções dos linfócitos T, que são amplamente mediadas por interacções que requerem contacto célulaJoana Maria Soares Pereira

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célula directo e por citocinas que actuam a curtas distâncias. As APCs não apresentam apenas antigénios a linfócitos T mas também são alvos das funções efectoras das células T:  

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Macrófagos com micróbios fagocitados apresentam antigénios microbianos a células T CD4 + e as células T respondem pela activação da macrófago para a destruição dos micróbios; Linfócitos B que ligaram e endocitaram especificamente uma proteina apresentam péptidos derivados deste antigénios a células TH, e as células T estimulam depois os linfócitos B a produzir anticorpos contra a proteina; A apresentação de péptidos associados a classe I permite que CTLs CD8+ detectem e respondam a antigénios produzidos em todas as células nucleadas e destroem estas células.

As moléculas MHC determinam a imunogenicidade de proteinas antigénicas por duas vias relacionadas: 1. Os epitopos de proteinas complexas que elicitam as respostas das células T mais fortes são os péptidos que são gerados por proteólise em APCs e ligam mais avidamente a moléculas MHC. Se um individuo é imunizado com uma proteina antigénica multideterminante, em muitos casos a maioria das células T que respondem são especificas para uma ou poucas sequências de aminoácidos lineares do antigénio, designadas epitopos ou determinantes imunodominantes. As proteases envolvidas no processamento de antigénios produzem uma variedade de péptidos a partir de proteinas naturais, e apenas alguns desses péptidos possuem as caracteristicas que permitem que estes se liguem a moléculas MHC presentes em cada individuo;

2. A expressão de alelos MHC classe II particulares num individuo determina a habilidade desse individuo para responder a antigénios particulares. Sabemos que os genes de resposta imune (Ir) que controlam as respostas dos anticorpos são genes estruturais do MHC classe II. Estes influenciam a resposta imune porque várias moléculas MHC classe II alélicas diferem na sua habilidade de ligar a diferentes péptidos antigénicos e, assim, estimular as células TH especificas.

Apresentação de Lipidos Antigénicos por Moléculas CD1 Uma excepção à regra que as células T apenas reconhecem péptidos é o reconhecimento de lipidos e glicolipidos antigénicos por uma população de células T numericamente raras designadas células T naturalmente assassinas (NK-T cells). Estes linfócitos apresentam propriedades não usuais:  

Expressam marcadores que são caracteristicos de células T e de células naturalmente assassinas; Apresentam receptores com uma diversidade limitada.

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As células NK-T reconhecem lipidos e glicolipidos apresentados por moléculas MHC classe I-like não clássicas designadas CD1. Apesar das suas vias de trâfego intracelular diferirem de modos subtis, todas as moléculas CD1 ligam a apresentam lipidos por uma via unica:  

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Moléculas CD1 recentemente sintetizadas ligam lipidos celulares e carregam-nos até à superficie da célula; A partir daqui, os complexos CD1-lipido são endocitados para endossomas ou lisossomas, onde lipidos que foram ingeridos do ambiente externo são capturados e novos complexos CD1-lipido regressam à superficie da célua; Assim, as moléculas CD1 ligam lipidos endocitados durante a reciclagem e apresentam-nos sem processamento aparente.

As células NK-T que reconhecem os lipidos antigénicos parecem ter um papel na defesa contra micróbios, especialmente micobactérias (que são ricas em componentes lipidicos).

MHC e Susceptibilidade a Doença Alguns alelos HLA ocorrem com muito maior frequência nos individuos que sofrem certas doenças relativamente à população a que pertencem. As doenças associadas com alelos MHC particulares incluem:    

Doenças autoimunes; Certas doenças virais; Algumas doenças neurológicas; Várias alergias diferentes.

A associação entre alelos HLA e uma determinada doença deve ser quantificada pela determinação da frequência de alelos HLA espressos por individuos com essa doença, e comparando esses dados com a frequência do mesmo alelo na população geral. Esta comparação permite o calculo do risco relativo (RR): Doença Espondilite anquilosante Sindrome de Goodpasture Enteropatia sensivel ao gluten Hemacromatose hereditária Diabetes tipo I Esclerose multipla Miastenia grave Narcolepsia Artrite reactiva (Yersinia, Salmonella, Gonococcus) Sindrome de Reiter Artrite reumatóide Sindrome de Sjorgen Lupus eritematosa sistémica



Alelo HLA associado B27 DR2 DR3 A3 B14 A3/B14 DR4/DR3 DR2 DR3 DR2

Risco relativo 90 16 12 9,3 2,3 90 20 5 10 130

B27

18

B27 DR4 Dw3 DR3

37 10 6 5

Um risco relativo de 1 significa que o alelo HLA é expresso com a mesma frequência no paciente e na população geral, indicando que o alelo não confere risco de doença;

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

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Imunologia

Um risco relativo substancialmente superior a 1 indica uma associação entre o alelo HLA e a doença.

A existência de uma associação entre um alelo MHC e uma doença não pode ser interpretada como implicando que a expressão do alelo causa a doença, a relação entre alelos MHC e o desenvolvimento da doença é complexa. Por exemplo, 

No caso da espondilite anquilomatose, foi sugerido que devido à forte ligação entre os genes TNF-α e TNF-β com o locus HLA-B estas citocinas podem estar envolvidas na destruição da cartilagem, o que é caracteristico desta doença.

Quando as associações entre alelos MHC e doença são fracas, reflectidas por baixos valores de risco relativo, é provavel que multiplos genes influenciem a susceptibilidade, dos quais apenas um é do MHC. Gémeos são um bom modelo para mostrar que estas doenças não são herdadas por degregação Mendeliana simples já que ambos herdam o factor de risco mas não significa que ambos desenvolverão a doença. Isto sugere que que multiplos factores genéticos e ambientais apresentam papeis no desenvolvimento da doença, especialmente doença autoimunes, com o MHC a apresentar um papel importante mas não exclusivo. Uma dificuldade adicional na associação de um produto MHC particular com uma doença é o fenómeno genético de desiquilibrio de ligação. O facto de alguns alelos MHC classe I estarem em desiquilibrio de ligação com alelos MHC classe II faz com que a sua contribuição na susceptibilidade a doenças pareça mais pronunciada do que é na realidade. Por exemplo, 

Se DR4 contribui para risco de doença e se este ocorre frequentemente em combinação com A3 devido ao desiquilibrio de ligação, o A3 será incorrectamente associado com a doença.

Um numero de hipóteses foram sugeridas para explicar o papel do MHC na susceptibilidade a doenças: 

 

Diferenças alélicas podem levar a diferenças na resposta imune, que se devem a variações na habilidade de apresentar antigénios processados ou na habilidade das células T reconhecerem antigénios apresentados; Formas alélicas de genes MHC podem codificar moléculas que são reconhecidas como receptores por virus ou toxinas bacterianas; A anélise genética da doença deve considerar a possibilidade de genes em multiplos loci estarem envolvidos e que interacções complexas entre eles podem ser necessárias para desencadear a doença.

Por outro lado, algumas evidências sugerem que uma redução no polimorfismo do MHC numa espécie pode predispor essa espécie a doença infecciosas. Por exemplo, chitas e outros felinos são altamente susceptiveis a doenças virais e apresentam um polimorfismo de MHC muito limitado. Este aumento de suceptibilidade deverá resultar da redução no numero de moléculas MHC diferentes diponiveis na espécie como um todo e a uma limitação correspondente da gama de antigénios processados com os quais estas moléculas MHC interagem. Assim,  

Os altos niveis de polimorfismo do MHC observados em várias espécies tem como vantagem fornecer uma grande gama de moléculas MHC apresentadoras de antigénio; Apesar de alguns individuos numa espécie provavelmente não serem capazes de desenvolver um resposta imune a um determinado antigénio e assim serem susceptiveis à infecção por este,

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

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Imunologia

o polimorfismo extremo assegura que pelo menos alguns membros da espécie serão capazes de responder e serão resistentes; A diversidade de MHC parece proteger uma espécie de uma grande gama de doenças infecciosas.

É importante salientar também que as moléculas MHC estão também presentes na saliva e noutras secreções, funcionando como feromonas.

RECEPTORES DE ANTIGÉNIOS E MOLÉCULAS ACESSÓRIAS NAS CÉLULAS T

Recepção de Antigénios pelas Células T Os linfócitos T respondem a fragmentos péptidicos de proteinas antigénicas que são apresentados por células apresentadoras de antigénios (ACPs). A iniciação destas respostas requere:   

O reconhecimento especifico de antigénios pelas células T; Adesão das células T às APCs; Tradução do sinal a partir da superficie ao núcleo da célula T.

Cada um destes eventos é mediado por grupos distintos de moléculas na superficie das células T:  

Moléculas membranares envolvidas no reconhecimento do antigénio e na sinalização intracelular; Moléculas envolvidas na adesão das células T às APCs.

Os linfócitos T apresentam especificidade dupla:  

Reconhecem residuos polimórficos de MHC próprio, o que conta para a restrição de MHC; Reconhecem residuos de péptidos antigénicos apresentados por estas moléculas MHC, o que é responsável pela especificidade.

Moléculas MHC e péptidos formam complexos na superficie das APCs. O receptor que reconhece estes complexos péptido-MHC é designado T cell receptor (TCR). O TCR é um receptor clonalmente distribuido, o que significa que clones de células T com diferentes especificidades expressam diferentes TCRs. Os sinais bioquimicos que são desencadeados nas células T por reconhecimento de antigénios não são traduzidos pelo TCR em si mas sim por proteinas invariantes designadas CD3 e ξ, que estão nãocovalentemente ligadas ao TCR para formar o complexo TCR. Assim, nas células T, e também nas células B, o reconhecimento de antigénios e a sinalização são separadas por dois grupos de moléculas:  

Um receptor de antigénos altamente variável – o TCR nas células T e o TCB nas células B; Proteinas sinalizadoras invariantes – cadeias CD3 e ξ nas células T e Igα e Igβ nas células B.

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Os receptores de célula T não apresentam apenas função de activação de células T imaturas que encontram antigénios, mas este receptor e um receptor relacionado designado receptor pré-T desempenham papeis importantes durante o desenvolvimento de células T. As células T também expressam outros receptores membranares que não reconhecem antigénios mas participam em respostas as antigénios, sendo designados colctivamente moléculas acessórias:  

 

O papel fisiológico de algumas moléculas acessórias é facilitar a sinalização pelo complexo TCR, enquanto outras fornecem “sinais secundários” para a activação completa das células T; Outras moléculas acessórias funcionam como moléculas de adesão para estabilizar a ligação das células T às APCs, permitindo assim que o TCR se ligue ao antigénio o tempo suficiente para a tradução dos sinais necessários; Moléculas de adesão também regulam a migração de células T para os locais onde os antigénios se localizam e respondam a estes; A maior parte da moléculas de adesão também participam na formação de “sinapses imunologicas” entre células T e APCs.

TCR αβ para Péptidos Antigénicos Associados a MHC O receptor de antigénios de células TH CD4+ e de células TC CD8+ restritas a MHC é um heterodimero constituido por duas cadeias polipéptidicas transmembranares, designadas α e β, covalentemente ligadas por uma ponte dissulfito. Cada cadeia α e β é constituida por:

   

Um dominio Ig-like N-terminal variável (V); Um dominio Ig-like constante (C); Uma região transmembranar hidrofóbica; Uma pequena região citosólica.

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A porção extracelular do heterodimero αβ é estruturalmente semelhante ao fragmento de ligação ao antigénio (Fab) de uma molécula Ig, que é construida pelas regiões V e C da cadeia leve e pelas regiões V e C da cadeia pesada.

As regiões V das cadeias α e β do TCR contêm pequenos segmentos de aminoácidos onde a variabilidade entre diferentes TCrs está concentrada e estes formam as regiões hipervariáveis ou determinantes da complementaridade (CDRs):  

Três CDRs na cadeia α estão justapostas a três regiões similares na cadeia β para formar a parte do TCR que reconhece especificamente complexos péptido-MHC; Uma quarta CDR encontra-se no dominio V da cadeia β, e esta não parece participar no reconhecimento de anti´genios mas é o local de ligação para produtos microbianos designados superantigénios.

Cada cadeia TCR é codificada por multiplos segmentos génicos que sofrem rearranjo somético durante a maturação dos linfócitos T. Nas cadeias α e β, a terceira região hipevariável é composta por sequências codificantes por segmentos de genes V e J (joining), no caso da cadeia α, ou segmentos V, D (diversidade) e J, no caso da cadeia β. Estas regiões CDR3 também contêm sequencias juncionais que são codificadas por nucleótidos adicionados, designados assim nuclótidos de regiões N e P. Assim, a maior parte da variabilidade dos TCRs está concentrada nas regiões CDR3.

As regiões C das cadeias α e β continuam em pequenas regiões dobradiça, que contêm residuos de cisteina que contribuem para pontes de dissulfureto que ligam as duas cadeias: 



A dobradiça é seguida por porções transmenbranares hidrofóbicas e uma caracteristica não usual é a presença de residuos acidicos positivamente carregados, incluindo residuos de lisina (na cadeia α) ou um residuo de lisina e arginina (na cadeia β). Estes residuos interagem com residuos carregados negativamente presentes nas porções transmembranares de outros polipeptidos (CD3 e ξ) que fazem parte do complexo TCR; Ambas as cadeias α e β apresentam caudas citoplasmáticas C-terminal com cerca de 5-12 residuos de comprimento. Estas regiões citoplasmáticas são muito curtas para traduzirem sinais, e moléculas fisicamente associadas com o TCR permitem esta transmissão do sinal.

Os TCRs e as moléculas Ig são estruturalmente semelhantes, mas existem várias diferenças significantivas entre estes dois tipos de receptores de antigénios: 



O TCR não é produzido numa forma secretada, e não cumpre uma função efectora por si só. Por outro lado, ligando-se a complexos péptido-MHC, os complexos TCR iniciam sinais que activam as funções efectoras das células T; Para além disso, ao contrário dos anticorpos, as cadeias TCR nas sofrem alterações de expressão da região C ou maturação de afinidade durante a diferenciação das células T.

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Componentes Número de dominios Ig

2009/2010 Anticorpo (imunoglobulina – Ig)

Cadeias leve e pesada Cadeia pesada – um dominio V, três ou quatro dominio C Cadeia leve – um dominio V e um dominio C

Numero de CDRs

Três em cada cadeia

Moléculas sinalizadoras associadas Afinidade para o antigénio (Kd) Alterações depois da activação celular Produção da forma secretada Alteração de isotipo Mutações somáticas

Igα e Igβ -7 -11 10 -10 M (Ig secretada)

Formas de antigénios reconhecidos

Diversidade Reconhecimento de antigénios por Funções sinalizadoras mediadas por Funções efectoras mediadas por

Imunologia

Sim Sim Sim Macromoléculas (proteinas, polissacarideos, lipidos, ácidos nucleicos), pequenos péptidos; epitopos conformacionais e lineares Cada clone apresenta uma especificidade unica; potencial para 9 >10 especificidades distintas Regiões variáveis (V) das cadeias leve e pesada das Ig membranares Proteinas (Igα e Igβ) das Ig associadas à membrana Regiões constantes (C) de Ig secretadas

Receptor da célula T (TCR)

Cadeias α e β Um dominio V e um dominio C em cada cadeia Três em cada cadeia para ligação ao antigénio; quarta região hipervariável na cadeia β CD3 e ξ -5 -7 10 -10 M Não Não Não Péptidos apresentados por moléculas MHC nas APCs; epitopos lineares Cada clone apresenta uma especificidade unica; potencial para 11 >10 especificidades distintas Regiões variáveis (V) das cadeias α e β Proteinas (CD3 e ξ) associadas com TCR TCR não apresenta função efectora

Papel do TCR αβ no Reconhecimento de Péptidos Antigénicos Associados a MHC O local de ligação ao antigénio do TCR é formado pelos seis CDRs das cadeias α e β que estão espalhados para formar uma superficie de reconhecimento de complexos péptido-MHC. Esta estrutura é semelhante às superficies de ligação ao antigénio dos anticorpos, que são formadas por regiões V de cadeias leves e pesadas. Nas estruturas de TCR que foram analisadas em detalhe: 

o TCR contacta com o complexo péptido-MHC numa orientação diagonal, encaixando entre os pontos altos das α-hélices MHC;

Joana Maria Soares Pereira

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



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Em geral, o loop CDR1 das cadeias α e β do TCR estão posicionadas nas extermidades do péptido ligado, os loops CDR2 sobre as hélices da molécula MHC, e o loop CDR3 está posicionado sobre o centro do MHC associado; As cadeias laterias de apenas um ou dois residuos de aminoácidos do péptido ligado ao MHC é que fazem contacto com o TCR.

A afinidade do TCR para complexos péptido-MHC é baixa, muito menor que a da maior parte dos anticorpos:  

Nas poucas células T que foram analizadas em detalhe, a constante de dissociação (K d) das interacções do TCR com complexos péptido-MHC varia entre 10-5-10-7 M; Esta baixa afinidade para a ligação especifica de antigénios e provavelmente a razão para a necessidade de moléculas de adesão para estabilizar a ligação das células T às APCs, permitindo que as respostas biológicas se iniciem.

A sinalização via complexos TCR parece requerer ligações prolongadas ou repetitivas a complexos peptido-MHC, o que também é promovido pela adesão estável entre as células T e as APCs. O TCR e as moléculas acessórias nas membranas plasmática das células T movem-se coordenadamente com os seus ligandos na membrana da APC para formar estruturas supramoleculares transients que são designadas sinapses imunológicas. A formação desta sinapse regula a tradução de sinal mediada pelo TCR.

Proteinas CD3 e ξ dos Complexos TCR As proteinas CD3 e ξ estão não covalentemente associadas com o heterodimero αβ e, quando o TCR reconhece antigénios, estas proteinas associadas tranmitem os sinais que leva à activação das células T:  

Cada complexo TCR contem um dimero αβ associado com um heterodimero CD3 γε, um heterodimero δε e um heterodimero ξξ ligado por pontes dissulfito; As cadeias CD3 e ξ são idênticas em todas as células T independentemente da especificidade, o que é consistente com o papel de ambas na sinalização e não no reconhecimento de antigénios.

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As proteinas CD3 γ, δ e ε são homólogas entre si e são divididas em três regiões:  



As regiões N-terminal extracelulares das cadeias γ, δ e ε contêm um unico dominio Ig-like, e assim estas proteinas são membros da superfamilia Ig; Os segmentos transmembranres de todas as cadeias CD3 contêm um residuo de aspartato negativamente carregado, que se liga a residuos carregados positivamente nos dominios transmembranares das cadeias α e β do TCR; Os dominios citoplasmáticos das proteinas γ, δ e ε têm cerca de 44-81 residuos de comprimento e cada um desses dominios contem uma cópia de um motivo conservado importante para a sinalização que é designado immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM).

Os motivos ITAMs têm um papel importante na sinalização pelo complexo TCR. São encontrados nas caudas citoplasmáticas de várias proteinas membranares de outros linfócitos que estão envolvidas na trandução de sinais, incluindo:     

A cadeia ξ do complexo TCR; As proteinas Igα e Igβ associadas com moléculas Ig membranares nos linfócitos B; Componentes de vários receptores Fc; Componentes do receptor activador NKG2D nas células naturalmente assassinas; Etc...

A cadeia ξ apresenta uma curta região extracelular de nove aminoácidos, uma região transmembranar contendo um residuo de aspartato negativamente carregado e uma região citoplasmática longa (113 aminoácidos) que contem três ITAMs. É normalmente expressa com um heterodimero e está também associada com receptores de sinalização de outros linfócitos, como os receptores Fcγ (FcγRIII) nas células naturalmente assassinas. Joana Maria Soares Pereira

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A expressão do complexo TCR requer a sintese de todos os seus componentes:





Durante a maturação das células T no timo, as proteinas CD3 e ξ são sintetizadas antes dos genes α e β do TCR serem expressos, mas estas proteinas não viajam para a membrana plasmática e são degradadas; Chaperones, como as calnexinas, retêm membros individuais do complexo TCR no RE antes do complexo ser completamente montado e, em células T maduras, o complexo TCR inteiro é montado no RE e transportado para a superficie celular.

Funções das Proteinas CD3 e ξ As cadeias CD3 e ξ ligam o reconhecimento do antigénio pelo TCR aos eventos bioquimicos que levam à activação funcional das células T. Várias linhas de evidência suportam o papel critico destes componentes do complexo TCR na tradução de sinal nas células T: 

Anticorpos contra proteinas CD3 normalmente estimulam as respostas funcionais das células T que são idênticas a respostas induzidas por antigénios. Ao contrário dos antigénios, que estimulam células T especificas, anticorpos anti-CD3 ligam-se a e estimulam todas as células T, idependentemente da especificidade. Assim, os anticorpos anti-CD3 são activadores policlonais das células T;



A cauda citoplasmática das proteinas CD3 e ξ é suficiente para traduzir sinais necessários para a activação das células T na ausência de outros componentes do complexo TCR. Isto foi mostrado expressando, em certas linhas de células T, moléculas quiméricas obtidas por engenharia genética contendo a porção citoplasmática das cadeias CD3 e ξ fundida com os dominios de outros receptores superficiais para ligando soluveis, como o receptor para a interleucina-2 (IL2). A ligação do ligando (e.g., IL-2) a estes receptores quiméricos resulta na activação de respostas idênticas às induzidas pela estimulação através do complexo TCR normal nas mesmas células T.

Os primeiros eventos intracelulares que ocorrem nas células T depois do reconhecimento do antigénio é a fosforilação de residuos de tirosina das ITAMs nas caudas citoplasmáticas pas proteinas CD3 e ξ por cinases. Os residuos fosforilados nas ITAMs tornam-se locais de ancoragem para uma tirosina cinase, que é recrutada para a cadeia ξ e desencadeia vias de tradução de sinal que levam a alterações da espressão de genes nas células T. Joana Maria Soares Pereira

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Co-receptores e Receptores de Co-estimuladores nas Células T Outras categorias de proteinas para além do complexo TCR na superficie das células T contribuem de um modo principal na activação e diferenciação dos linfócitos T: 

Co-receptores – representam uma categoria de proteinas membranares que aumentam a sinalização do TCR. Os seus nomes referem-se ao facto de estes ligarem moléculas MHC e, assim, reconhecem uma parte dos mesmo ligandos (complexos péptido-MHC) como os receptores de antigénios;



Receptores de co-estimuladores – representam um grupo de proteinas que também apresentam sinais activadores a células T, mas estas proteinas, em contraste com os coreceptores, reconhecem moléculas nas APCs que não fazem parte dos complexos péptido-MHC. Os receptores de quimiocinas e citocinas são também de grande importância para as respostas das células T, por exemplo.

CD4 e CD8: Co-receptores Envolvidos na Activação das Células T Restritas a MHC As CD4 e CD8 são proteinas das células T que ligam regiões não polimórficas das moléculas MHC e facilitam a sinalização pelo complexo TCR durante a activação das células T:  

As células T αβ maduras expressam ou CD4 ou CD8, mas não ambos; As CD4 e as CD8 interagem com moléculas MHC classe II e classe I, respectivamente, quando os receptores de antigénios das células T reconhecem especificamente complexos péptido-MHC nas APCs.

A principal função das moléculas CD4 e CD8 encontra-se na tradução de sinal no momento de reconhecimento do antigénio. Para além disso, reforçam a ligação das células T às APCs. Como as CD4 e as CD8 participam em conjunto com os TCR no reconhecimento de moléculas MHC e na activação das células T, são designadas co-receptores.

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35% body T cells

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65% body T cells

As CD4 e CD8 são glicoproteinas transmembranares membros da superfamilia Ig, que medeiam funções semelhantes a estas: 



CD4 – expressa como um monómero na superficie de células T periféricas e timócitos e está presente nos fagócitos mononucleares e em algumas células dendriticas. Apresenta quatro dominios Ig-like extracelulares, uma região hidrofóbica transmembranar e uma cauda citoplasmática altamente básica com cerca de 38 aminoácidos. Os dois dominios N-terminal Iglike da proteina CD4 ligam ao dominio β2 não polimórfico das moléculas MHC classe II; CD8 – a maior parte existe como heterodimeros mantidos por pontes dissulfito compostos por duas cadeias relacionadas designadas CD8α e CD8β. Ambas as cadeias apresentam um unico dominio Ig-like extracelular, uma região hidrofóbica transmembranar e uma cauda citoplasmática altamente básica com cerca de 25 aminoácidos de comprimento. O dominio Ig da CD8 liga-se ao dominio α3 não polimórfico das moléculas MHC classe I. Algumas células T expressam homodimeros CD8αα, mas este parece funcionar de modo semelhante.

A ligação selectiva das CD4 às moléculas MHc classe II e das CD8 às moléculas MHC classe I assegura que as células T CD4+ respondem a péptidos antigénicos associados a classe I e que as células T CD8 + respondem a péptidos antigénicos associados a classe II. A separação das respostas das células T CD4 + e CD8+ a estes diferentes grupos de antigénios ocorre devido às especificidades dos CD4 e CD8 a diferentes classes de moléculas MHC: 





CD4 liga-se a moléculas MHC classe II e é expresso em células T cujos TCRs reconhecem complexos de péptidos e moléculas MHC classe II. A maior parte das células T CD4+ restritas a classe II são células TH produtoras de citocinas e funcionam na defesa do hospedeiro contra micróbios extracelulares que são ingeridos por macrófagos ou são reconhecidos por anticorpos de modo a serem eliminados; CD8 liga-se a moléculas MHC classe I e é expresso em células T cujos TCRs reconhecem complexos de péptidos com moléculas MHC classe I. A a maior parte das células T CD8+ restritas a classe I são CTLs, que servem para erradicar infecções por micróbios intracelulares que residem no citoplasma de células infectadas; Algumas células T CD4+, especialmente em humanos, funcionam como CTLs, mas mesmo estas são restritas a classe II.

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Os papeis essenciais das CD4 e CD8 nas respostas funcionais das células T foram demonstradas por vários tipos de experiências: 







Anticorpos especificos para CD4 selectivamente bloqueiam a estimulação de células T restritas a classe II pos antigénios e APCs, e anticorpos para CD8 selectivamente bloqueiam a morte de células alvo por CTLs restritas a MHC classe I; Se genes TCR α e β forem isolados de um clone de célula T CD4+ e transfectado para outra linha de células T que não expressam CD4, a linha transfectada não responderá a APCs que carregam o antigénio classe II relevante associado. A resposta é restaurada de o gene CD4 for cotransfectado com os genes TCR. O mesmo é observado relativamente à relação CD8/classe I; Uma APC que não apresenta moléculas MHC não é capaz de apresentar antigénios a ou activar células T. A habilidade de activar células T é restaurada pela transfecção da APC com moléculas MHC normais mas não pela transfecção de moléculas MHC nos quais os locais de ligação de CD4 ou CD8 não polimórficos estão mutados; Ratinhos KO que não apresnetam CD4 ou CD8 não contêm células T maduras restritas a classe II ou classe I, respectivamente, porque estes co-receptores têm um papel importante na maturação das células T no timo.

As CD4 e CD8 participam nos primeiros eventos da tradução de sinal que ocorre depois do reconhecimento pela célula T de complexos péptido-MHC nas APCs. Estas funções de tradução do sinal são mediadas por por tirosinas cinases especificas de células T que está não covalentemente mas fortemente associada com as caudas citoplasmáticas das CD4 e CD8. A associação destas cinases com estas moléculas é necessária para a maturação e activação das células T: 



Quando uma célula T reconhece complexos péptido-MHC via os seus receptores de antigénios, interacções simultânea de CD4 ou CD8 com as moléculas MHC leva o co-receptor e a sua cinase associada para próximo do complexo TCR; A cinase fosforila os residuos de tirosina dos ITAMs das cadeias CD3 e ξ, iniciando a cascata de activação das células T.

ANTICORPOS E ANTIGÉNIOS

Os Anticorpos Os anticorpos são as proteinas de ligação ao antigénio presentes nas membranas das células B e secretadas pelos plasmócitos: 



Anticorpos ligados à membrana conferem especificidade antigénica às celulas B, sendo a proliferação especifica para antigénios das células B causada pela interacção deste anticorpo com os antigénios; Anticorpos secretados circulam no sangue, onde servem como efectores para a imunidade humoral procurando e neutralizando antigénios ou marcando-os para eliminação.

Todos os anticorpos partilham caracteristicas estruturais, ligam-se ao atigénio e participam num numero limitados de funções efectoras. Aqueles que são produzidos em resposta a um antigénio particular são heterogéneos. Joana Maria Soares Pereira

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A maior parte dos antigénios são complexos e contêm diferentes determinantes antigénicos, e normalmente o sistema imune responde a estes pela produção de anticorpos para vários epitopos no antigénio. Esta resposta requer o recrutamento de vários clones de células B. As suas respostas são anticorpos monoclonais, sendo que cada um liga especificamente um unico determinante antgénico. Em conjunto, estes anticorpos monoclonais constituem a resposta por anticorpos séricos policlonal e heterogénea contra um antigénio imunizantes, no sangue.

Estrutura Básica dos Anticorpos O sangue pode ser separado numa centrifuga num fracção fluida e noutra celular: 



Plasma – é a fracção fluida e contem todas as pequenas moléculas e macromoléculas soluveis do sangue, incluindo fibrina e outras proteinas requeridas para a formação de coagulos. Se estas moléculas coagulantes forem excluidas, o fluido resultante é designado de soro; Fracção celular – contem os eritrócitos, leucócitos e plaquetas.

Sabe-se que os anticorpos residem no soro, e a primeira evidência que os anticorpos estavam contidos em fracções particulares de proteinas séricas surgiu de uma experiência clássica por A. Tiselius e E. A. Kabat, em 1939:    

Eles imunizaram coelhos com a proteina ovalbumina e dividiram o soro dos ratinhos imunizados em duas aliquotas; A electroforese de uma aliquota revelou quatro picos correspondentes a albumina e às globulinas alpha (α), beta (β) e gamma (γ); A outra aliquota sérica reagiu com albumina e o precipitado formado foi removido. As proteinas sérica que restaram, que não reagiram com o antigénio, foram separadas em electroforese; A comparação do perfis electroforéticos das duas aliquotas revelou uma queda abrupta do pico γ-globulina na aliquota que reagiu com o antigénio.

Assim a fracção γ-globulina foi identificada como contendo anticorpos séricos, que foram designados imunoglobulinas, para distingui-los de qualquer outras proteinas que podiam estar contidas na fracção γ-globulina. No entanto, sabe-se agora que, apesar das imunoglobulinas G (IgG), a principal classe de anticorpos, ser de facto encotrada principalmente na fracção γ-globulina, quantidades significantes desta e de outras classes importantes de anticorpos são encontradas nas fracções α e β de soro.

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As moléculas de anticorpos apresentam uma estrutura comum de quatro cadeias polipéptidicas, também designadas imunoglobulinas:   

 

Duas cadeias leves (L), polipéptidos com peso molecular de cerca de 25.000; Duas cadeias pesadas (H), polipéptidos maiores com peso molecular de cerca de 50.000; Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ponte dissulfito, e por ligações não covalentes como pontes salinas, pontes de hidrogénio e ligações hidrofóbicas, para formar o heterodimero (H-L); Interacções não covalentes semelhantes e pontes dissulfito ligam dois heterodimero (H-L) para formar uma estrutura básica de quatro cadeias (H-L)2, um dimero de dimeros; O numero exacto de as posições precisas destas pontes dissulfito diferem entre classes e subclasses de anticorpos.

Os primeiros 110 aminoácidos das regiões N-terminais das cadeias leve e pesada variam altamente entre anticorpos com diferentes especificidades. Estes segmentos com sequências altamente variáveis são designadas regiões V:   

VL nas cadeias leves e VH nas pesadas; Todas as diferenças de especificidade apresentadas por diferentes anticorpos podem ser relacionadas com diferenças nas sequências de aminoácidos nas regiões V; A maior parte das diferenças entre anticorpos caem em áreas das regiões V, designadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs – como visto para os TCRs) e são estes CDRs nas cadeias leves e pesadas que constituem o local de ligação aos antigénios na molécula de anticorpo.

Por outro lado, dentro da mesma classe de anticorpo, muito poucas diferenças são observadas quando comparamos sequências no resto da molécula. As regiões com sequências relativamente constantes abaixo das regiões variáveis foram designadas regiões C:  

CL nas cadeias leves e CH nas pesadas; Os anticorpos são glicoproteinas. Com pequenas excepções, os locais de ligação dos carboidratos são restritos a estas regiões.

O papel da glicolisação não é ainda bem entendido, mas provavelmente aumenta a solubilidade dos anticorpos. A glicolisação inapropriada, ou a sua ausência, afecta a taxa pela qual os anticorpos são retirados do soro, e diminui a eficiência da interacção entre o anticorpos e o sistema complemento e entre os anticorpos e os receptores Fc. Quando a fracção γ-globulina do soro é separada em fracções de baixo e elevado peso molécular, anticorpos com cerca de 150.000 MW, designados imunoglobulinas G (IgG) são encontradas na fracção de baixo peso molecular e experiências com esta molécula permitiram a modulação da estrutura de uma molécula de anticorpo: 1. A digestão breve das IgG com a enzima papaina produz três fragmentos, dois dos quais são idênticos:  Os dois fragmentos idênticos (cada um com peso molecular de 45.000) apresentam actividade de ligação ao antigénios e foram designados fragmentos Fab;  O outro fragmento (com peso molecular de 50.000) não apresenta actividade de ligação ao antigénio e foi designado fragmento Fc. Joana Maria Soares Pereira

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2. A digestão com pepsina, uma enzima proteolitica diferente, também demonstrou que as propriedades de ligação ao antigénio pelo anticorpo podem ser separadas do resto da molécula:  A digestão por pepsina gerou um unico fragmento com peso molécular de 100.000 composto por dois fragmentos Fab-like designado fragmento F(ab’)2, que se liga ao antigénio;  O fragmento Fc não foi recuperado porque foi digerido a vários fragmentos.

Anticorpos por si só foram usados para determinar como é que os produtos enzimáticos – Fab, F(ab’)2 e Fc – estão relacionados com produtos de redução das cadeias leves e pesadas, e isto foi feito pelo uso de soros de caprinos que foram imunizadas tanto com fragmentos Fab ou Fc de IgG de coelho:   

O anticorpos para o fragmento Fab reagiu tanto com as cadeias H e L, enquanto o anticorpo para o fragmento Fc reagiu apenas com a cadeia H; Isto leva à conlusão que o fragmento Fab consiste em porções de uma cadeia pesada e de outra leve e que o Fc contem apenas componentes das cadeias pesadas; A partir destes resultados a estrutura da IgG foi deduzida.

Estrutura Aprofundada das Imunoglobulinas A estrutura das moléculas imunoglobulinas é determinada pela organização primária, secundária, terciária e quaternária da proteina: 1. A estrutura primária, a sequência de aminoácidos, conta para as regiões constantes e variáveis das cadeias pesadas e leves; Joana Maria Soares Pereira

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2. A estrutura secundária é formada pelo enrolamento da cadeia polipéptidica numa folha-β pragueada antiparalela; 3. As cadeias são depois enroladas numa estrutura terciária de dominios globulares compactos, que são ligados aos dominios vizinhos da cadeia polipeptidica que se encontram fora das folhasβ; 4. Os dominios globulares de cadeias polipeptidicas pesadas e leves interagem numa estrutura quaternária, formando dominios funcionais que permitem que a molécula de ligue especificamente ao antigénio e, ao mesmo tempo, realizar um numero de funções biológicas efectoras.

Enrolamento Imunoglobulina Análise cuidadosas das sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas mostraram que ambas as cadeias contêm várias unidades homólogas com cerca de 110 residuos de aminoácidos. Dentro de cada unidade, denominadas dominios, uma ponte dissulfito intracadeia forma um loop com cerca de 60 aminoácidos:  

As cadeias leves contêm um dominio variável (VL) e um dominio constante (CL); As cadeias pesadas contêm um dominio variável (VH) e três ou quatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 e CH4), dependendo da classe do anticorpo.

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Análises de cristalografia revelaram que os dominios imunoglobulina são enrolados numa estrutura compacta caracteristica designada enrolamento imunoglobulina:  

Esta estrutura consiste numa “sandwich” de duas folhas-β pragueadas, cada uma contendo cadeias-β antiparalelas de aminoácidos, que são ligadas por loops de vários comprimentos; As duas folhas-β numa estrutura deste tipo são estabilizadas por interacções hidrofóbicas entre elas e pela ponte dissulfito.

Apesar de dominios variáveis e constantes apresentarem estrutura semelhante, existem diferenças subtis entre elas. O dominio V é ligeiramente mais longo que o dominio C e contem um par extra de cadeias-β na estrutura das folhas-β, tal como uma seuquênica loop extra que conecta este par de cadeias-β. A estrutura básica deste enrolamento imunoglobulina contribui para: 



A estrutura quaternária das imunoglobulinas facilitando interacções não-covalentes entre dominios atraves das faces das folhas-β. Interacções formam ligações entre dominios idênticos (e.g., CH2/CH2, CH3/CH3 e CH4/CH4) e entre dominios não idênticos (e.g., VL/VH e CH1/CL); Comprimentos e sequências de aminoácidos variáveis que formam loops ligando as cadeias-β. Algumas sequências de loops dos dominios VL e VH contêm aminoácidos variáveis e constituem o local de ligação ao antigénio desta molécula.

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Dominios da Região Variável e Ligação ao Antigénio Comparações detalhadas das sequências de aminoácidos de um grande numero de dominios VL e VH revelaram que a variação sequencial está concentrada em poucas regiões discretas desses dominios. O padrão desta variação é melhor resumido medindo quatitativamente a variabilidade em cada ponto da cadeia polipeptidica. a variabilidade é definida como:

A determinação quantitativa da variabilidade dos dominios VL e VH mostram que variações máximas são observadas em sequências que correspondem aos loops que ligam as cadeias-β. Essas regiões foram designadas originalmente regiões de hipervariabilidade em reconhecimento da sua elevada variabilidade. No entanto, estas regiões formam os locais de ligação ao antigénio e, por isso, são agora designadas regiões determinantes da complementariedade (CDRs). As regiões restantes dos dominios VL e VH exibem menor variação, sendo designados regiões framework (FRs):

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  

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A grande gama de especificidades exibida pelos anticorpos é devida a variações no comprimento e na sequência de aminoácodps das seis CDRs em cada fragmento Fab; A região framework actua como scaffold que suporta os seis loops; A estrutura tri-dimensional das regiões framework de virtualmente todos os anticorpos analizados pode ser sobreposta, no entanto, os loops hipervariáveis apresentam diferentes orientações em diferentes anticorpos.

Difracção de raios-X de vários complexos anticorpo-antigénio mostrou que vários CDRs fazem contacto com o antigénio, podendo até fazer os seis. Em geral, parece que mais residuos dos CDRs da cadeia pesada contactam com o antigénio, do que residuos dos CDRs da cadeia leve. Assim, o dominio V H normalmente contribui mais para a ligação ao antigénio do que o dominio VL. A forma do local de ligação ao antigénio formada por qualquer combinação de CDRs varia dramaticamente entre anticorpos. Isto deve-se a diferenças de tamanho dos antigénios, que levarão a diferentes tipos de interacções: 1. Contactos entre um grande numero de proteinas antigénicas globulares grandes e anticorpos ocorrem numa grande superficie, sendo que, na área de contacto, depressões ou saliências no antigénio complementam saliências ou depressões no anticorpo. Nesta área, cerca de 15-22 aminoácidos no anticorpo contactam o mesmo numero de residuos na proteina antigénica;

2. Anticorpos que ligam pequenos antigénios, como haptenos, fazem-no em bolsas mais pequenas, em que o antigénio é encaixado.

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As interacções não covalentes que formam a base da ligação antigénio-anticorpos incluem:    

Pontes de hidrogénio; Ligações iónicas; Interacções hidrofóbicas; Interacções de van der Waals.

Como estas interacções são individualmente fracas (comparado com uma ligação covalente), um grande numero delas é necessário para formar uma ligação antigénio-anticorpo forte. Ainda, como cada uma destas interacções não covalentes opera a distâncias muito curtas, geralmente cerca de 1x10-7 mm, uma interacção antigénio-anticorpo forte depende de uma aproximação e de um encaixe entre o anticorpo e o antigénio. Isto depende assim de uma elevada complementariedade entre antigénio e anticorpo, um requerimento que caracteriza as interacções antigénio-anticorpo. Com o avanço da resolução da estrutura dos fragmentos Fab, começou a tornar-se claro que em alguns casos a ligação do antigénio induz alterações conformacionais no antigénio, no anticorpo, ou em ambos, dependendo do anticorpo e do antigénio. Esta alteração de conformação resulta no encaixe fechado entre o epitopo e o local de ligação ao antigénio no anticorpo, necessário para as interacções. Assim, em adição à variabilidade no comprimento e na composição em aminoácidos dos loops CDR, a habilidade destes loops alterarem de conformação significativamente no local de ligação permite que os anitcorpos assumam uma forma mais complementar para os epitopos. No entanto, estas alterações não necessitam de ser limitadas ao anticorpo, o que também pode inactivar os antigénios (no caso de moléculas com actividade biológica). Dominios da Região Constante Os dominios da região constante das imunoglobulinas participam em vária funções biológicas que são determinadas pela sequência de aminoácidos de de cada dominio. Existem vérios dominios com diferentes funções, sendo de importância mais elevada:   

Dominios CH1 e CL; Região dobradiça; Dominios da região Fc.

Os dominios CH1 e CL existem em todos os tipos de cadeia pesadas e servem para: 



Extender os braços Fab da molécula de anticorpo, facilitando assim a interacção com o anticropo e aumentando a rotação máxima dos braços Fab; Ajudam a manter os dominios VH e VL juntos através de pontes dissulfito entre eles;

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α, γ e δ

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

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Contribuem para a diversidade de anticorpos permitindo uma maior associação aleatória entre dominios VH e VL do que aquela que ocorreria se esta associação fosse feita apenas pelas interacções VH/VL.

Estas considerações para estes dois dominios apresentam implicações importantes na montagem de diversos anticorpos pois rearranjos aleatórios de genes imunoglobulina geram sequência unicas VH e VL que depois geram locais de ligação ao antigénio unicos, e a presença destes dois dominios aumenta o numero de interacções VH/VL estáveis que são possiveis, contribuindo para a diversidade geral de moléculas de anticorpos que podem ser expressos num animal. As cadeias pesadas α, γ e δ contêm uma sequência péptidica extendida entre os dominios CH1 e CH2 que apresenta homologia com outros dominios. Esta região, é designada região dobradiça (hinge region):  



É rica em residuos de prolina e é flexivel, fornecendo flexibilidade às IgA, IgD e IgG; Como resultado, os dois braços Fab são capazes de assumir vários ângulos um com o outro quando o antigénio está ligado, podendo assim um anticorpo ligar um antigénio cujos epitopos estejam mais ou menos separados; Varia em comprimento (10-60 residuos) entre diferentes isotipos de imunoglobulinas, sendo que as maiores diferenças entre as subclasses IgG estão concentradas nesta região.

Os aminoácidos mais comuns nas regiões dobradiça são: 



Prolina – fornecem a esta região uma conformação polipeptidica extendida, tornando-a particularmente vulnerável à clivagem por enzima proteoliticas. É aqui que o anticorpo é clivado pela papaina ou pepsina; Cisteina – formam ponte dissufito inter-cadeias que mantêm as duas cadeias pesadas juntas. O numero de pontes dissulfito na região dobradiça varia consideravelmente entre diferentes classes de anticorpos e entre espécies. μeε

Por outro lado, as cadeias pesadas das imunoglobulinas do tipo μ e ε não apresentam uma região hinge, mas contêm um dominio adicional de 110 aminoácidos (CH2/CH2) que apresenta caracteristicas semelhantes à região dobradiça.

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Como visto anteriormente, as cadeias pesadas nas IgA, IgD e IgG contêm três dominios na região constante e uma região dobradiça enquanto as cadeias pesada na IgE e IgM contêm quatro regiões constantes e nenhuma região dobradiça. Os dominios correspondentes dos dois grupos são: IgA, IgD, IgG CH1/CH1 Região dobradiça CH2/CH2 CH3/CH3

IgE, IgM CH1/CH1 CH2/CH2 CH3/CH3 CH4/CH4

Cristalografia raios-X revelou que dos dois dominios CH2 das IgA, IgD e IgG, e os dominios CH3 das IgE e IgM, são separados por cadeias laterais oligossacrideo, sendo estes os dois dominios globulares mais acessiveis que os outros em meio aquoso. Isto contribui para a actividade biológica destes dominios na activação de components do complemento pelas IgG e IgM. O dominio C-terminal é designado CH3/CH3 nas IgA, IgD e IgG e CH4/CH4 nas IgE e IgM, e este está relacionado com a possibilidade de podermos dividir a imunoglobulinas em dois tipos, sendo diferentes em ambos os tipos: 1. Imunoglobulinas secretadas (sIg) – apresentam uma sequência de aminoácidos hidrofilica de vários comprimentos nas suas terminações carboxilicas; 2. Imunoglobulinas membranares (mIg) – o dominio C-terminal contem três regiões (uma sequência extracelular hidrofilica de 26 residuos, uma sequência transmembranar hirdofóbica e uma cauda citoplasmática) sendo a região transmembranar constante entre isotipos de imunoglobulinas, enquanto os comprimentos das sequências extracelular e citoplasmática variáveis.

As células B expressam diferentes classes de mIg em diferentes estágios de desenvolvimento:  

Células B imaturas, ou células pré-B, expressam apenas mIgM; Mais tarde na maturação, mIgD é co-expresso com IgM na superficie das células B maduras antes de estas serem activadas por um antigénio;

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

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Uma célula B de memória é capaz de expressar mIgM, mIgG, mIgA ou mIgE.

Mesmo quando diferentes classes são expressas sequencialmente numa unica célula, a especificidade antigénica de todas a moléculas de anticorpos membranares expressas por uma unica célula é idêntica, se modo que cada anticorpo liga o mesmo epitopo.

Funções Efectoras Mediadas por Anticorpos Em adição a ligar antigénios, os anticorpos participam numa grande gama de outras actividades biológicas. Quando consideramos o papel dos anticorpos na defesa contra uma doença, é importante ter em conta que os anticorpos não matam ou removem patogénios apenas por se ligarem a eles. Para serem efectivos contra estes patogénios, os anticorpos não devem apenas reconhece-los mas também evocar respostas que resultarão na remoção do antigénio e na morte do patogénio:  





Opsonização (visto já no capitulo da fagocitose); Activação do complemento - IgM e, em humanos, a maior parte das subclasses de IgG são capazes de activar uma classe de glicoproteinas séricas designadas sistema complemento. O principal produto desta activação é um fragmento péptidico designado C3b que se liga a complexos de opsonização e que é reconhecido pelos eritrócitos e pelos macrófagos. Isto facilita a fagocitose pelos macrófagos e também permite que os eritrócitos transportem estes complexos para o figado ou baço onde macrófagos residentes eliminam os antigénios e matam os patogénios sem danificar o eritrócito; Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos - A ligação de um anticorpo ligado a células alvo (células do hospedeiro infectadas com virus) a receptores Fc de um numero de tipos de células, particularmente células naturalmente assassinas, é capaz de dirigir actividades citotóxicas efectoras contra a célula alvo; Transcitose – Define a entrega de anticorpos nas superficies mucosas dos tractos respiratório, gastrointestinal e urogenital, tal como o seu exporte para o leite materno, que requer o movimento de imunoglobulinas atraves das camadas epiteliais.

Enquanto as regiões variáveis dos anticorpos são quem liga os antigénios, a região constante das cadeias pesadas (CH) é responsável por esta variedade de interacções colaborativas com outras proteinas, células e tecidos, que resultam nas funções efectoras da resposta humoral. Como estas funções efectoras resultam de interacções entre a região constante das cadeias pesadas e outras proteinas séricas ou receptores membranares, nem todas as classes de imunoglobulinas apresentam as mesmas propriedades funcionais. A capacidade das imunoglobulinas serem transportadas por transcitose depende das propriedades da região constante:  

Em humanos e ratinhos, a IgA é a principal espécie de anticorpo que sofre tal transporte, apesar das IgM também poderem ser transportadas para as superficies das mucosas; Algumas espécies de mamiferos, como os humanos e os ratinhos, também transferem grandes quantidades de IgG da mãe para o feto. Visto que os sistemas circulatorios da mãe e do feto são separados, os anticorpos devem ser transportados através do tecido da placenta. Isto fornece uma inicial protecção do feto, o que é uma forma de imunização passiva.

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Classes e Actividades Biológicas dos Anticorpos As várias classes e isotipos de imunoglobulinas são distinguidas por sequências de aminoácidos unicas na região constante das cadeias pesadas, que conferem propriedades funcionais e estruturais especificas da classe. A estrutura das principais classes na forma secretada é a seguinte:

As propriedades moleculares e biológicas das diferentes classes podem ser sumariadas na seguinte tabela:

Κ ou λ

Concentração sérica (mg/mL) 3,5

Semi-vida sérica (dias) 6

δ

Κ ou λ

Traços

3

Nenhum

ε

Κ ou λ

0,05

2

IgG

IgG1-4

γ (1, 2, 3 ou 4)

Κ ou λ

13,5

23

IgM

Nenhum

μ

Κ ou λ

1,5

5

Isotipo

Subtipos

Cadeia H

IgA

IgA1,2

Α (1 ou 2)

IgD

Nenhum

IgE

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Cadeia L

Funções Imunidade das mucosas Receptor de antigénios nas células B naive Defesa contra parasitas helmintos, hipersensibilidade imediata Opsonização, activação do complemento, citotoxicidade mediada por células, imunidade neo-natal, inibição por feedbcak das células B Receptor de antigénios nas células B, activação do complemento

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Imunoglobulina G (IgG) A classe de imunoglobulinas G, a mais abundante no soro, constitui cerca de 80% do total de imunoglobulinas no soro. A molécula de IgG consiste em duas cadeias pesadas γ e duas cadeias leve κ ou λ. Existem quatro subclasses de IgG humana, distinguidas por diferenças na sequência da cadeia γ e numeradas de acordo com a diminuição das suas concentrações no soro:

 

As sequências de aminoácidos que distinguem as quatros subclasses IgG são codificados por diferentes genes CH, cujas sequências de DNA são 90%-95% homólogas; As caracteristicas estruturais que distinguem estas subcalsses são o tamanho da região dobradiça e o numero e posição das pontes dissulfito entre as cadeias pesadas.

As diferenças subtis de aminoácidos entre subclasses de IgG afectam a actividade biológica das moléculas:   

IgG1, IgG3 e IgG4 atravessam a placenta e têm um papel importante na protecção do feto em desenvolvimento; IgG3 é o activador do complemento mais efectivo seguido por IgG1. IgG2 é menos eficiente e IgG4 não é capaz de activar o complemento; IgG1 e IgG3 ligam receptores de Fc com elevada afinidade nas células fagociticas e, assim, medeiam a opsonização. IgG4 apresenta uma afinidade intermédia para receptores Fc e IgG2 apresenta uma afinidade extremamente baixa.

Imunoglobulina M (IgM) As imunoglobulinas M correspondem a cerca de 5%-10% do total de imunoglobulinas séricas, com uma concentração sérica média de 1,5 mg/mL. Podemos ter duas formas de IgM:  

IgM monomérica, com um peso moleculas de 180.000, é expressa com um anticorpo membranar nas células B; IgM pentamérica é a forma secretada, na qual cinco unidades monoméricas são mantidas em conjunto por pontes dissulfito que ligam os dominios C-terminal das cadeias pesadas (CH4/CH4) e os seus dominios CH3/CH3.

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IgM membranar

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IgM secretada

Na IgM pentamérica, as cinco subunidades monoméricas estão arranjadas com as suas regiões Fc no centro de um pentâmero e os dez locais de ligação ao antigénio na periferia da molécula. Cada pentâmero contem um polipéptido adicional designado cadeia J (joining), que se encontra ligado por pontes dissulfito a residuos de cisteina de duas das dez cadeias μ. Esta cadeia parece ser necessária para a polimerização do monómero para formar a IgM pentamérica, e é adicionada mesmo antes da secreção do pentâmero. A IgM é a primeira classe de imunoglobulinas a ser secretada numa primeira resposta ao antigénio, e é também a primeira imunoglobulina a ser sintetizada nos recém-nascidos. Devido à sua estrutura pentamérica com 10 locais de ligação ao antigénio, a IgM sérica apresenta uma maior valência relativamente aos outros isotipos, tendo uma actividade biológica mais rápida: 





Uma IgM é capaz de ligar 10 pequenas moleculas de haptenos, contudo, devido ao impedimento estéreo, apenas cerca de 5 moléculas de antigénios maiores se conseguem ligar simultaneamente; Devido à elevada valência , a IgM pentamérica é mais eficiente do que outros isotipos na ligação a antigénios com vários epitopos repetidos, como particulas virais e eritrócitos, formando aglutinados e inactivando particulas virais mais rapidamente do que qualquer outro isotipo; IgM é mais eficiente que IgG na activação do complemento, que requer duas regiões Fc em grande aproximação.

Devido ao seu elevado tamanho, a IgM não se difunde bem e, assim, é encontrada em concentrações muito baixas nos fluidos intercelulares. A presença da cadeia J pemite que as IgM se liguem a receptores nas células secretórias, que a transportam através de revestimentos epiteliais de modo a entrarem nas secreções externas que banham as superficies mucosas. Imunoglobulina A (IgA) Apesar das imunoglobulinas A constituirem cerca de 10%-15% das imunoglobulinas totais no soro, elas são a classe de imunoglobulinas predominantes nas secreções externas como o leite materno, a saliva, as lágrimas e o muco dos tractos broncal, genitourinário e digestivo. Assim, podemos ter dois tipos de IgA: Joana Maria Soares Pereira

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 

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IgA sérica – existem principalmente como um monómero, mas formas poliméricas (dimeros, trimeros e alguns tetrameros) são por vezes observadas, todas contendo uma cadeia J; IgA secretória – é a das secreções externas e consiste num dimero ou tetramero, uma cadeia J e uma cadeia polpeptidica designada componente secretório.

IgA sérica

IgA scertória

O componente secretório é derivado a partir do receptor que é responsável pelo transporte da IgA polimérica através da membrana celular, e a cadeia J é idêntica com aquela encontrada na IgM pentamérica, servindo para funções semelhantes facilitando a polimerização dos dois tipos de IgA: 



O componente secretório é um polipéptido de 70.000 MW produzido pelas células epiteliais das membranas mucosas e consiste em cinco dominios Ig-like que se ligam a dominios da região Fc do dimero IgA; Esta interacção é estabilizada por uma ponte dissulfito entre o quinto dominio do componente secretório e uma das cadeias da IgA dimérica.

A produção diária de IgA secretória é maior que a de qualquer outra classe de imunoglobulina. Os plasmócitos secretores de IgA estão concentrados ao longo da superficie das membranas mucosas e, todos os dias, um humano secreta 5g a 15g de IgA secretória nas secreções mucosas:

1. Estas células preferencialmente migram para tecidos subepiteliais, onde a IgA secretada se liga fortemente a receptores para moleculas imunoglobulinas poliméricas, que são expressos nas mucosas epiteliais e no epitélio glandular nas glândula mamárias, salivares e lacrimais;

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2. Depois da IgA polimérica se ligar a estes receptores, o complexo IgA-receptor é transportado através da barreira epitelial para o lumen; 3. O transporte deste complexo envolve endocitose mediada por receptores e transporte directo das vesiculas através da célula epitelial para a membrana luminal, onde a vesicula se funde com a membrana plasmática; 4. O receptor é então clivado enzimaticamente da membrana e torna-se o componente secretório, que se encontra ligado e é libertado em conjunto com a IgA polimérica nas secreções mucosas. Os componente secretório mascara locais susceptiveis a clivagem por proteases na região dobradiça das IgA secretórias, permitindo que a molécula polimérica exista durante mais tempo no ambiente rico em proteases do muco que de outro modo não seria possivel. Este mecanismo de transporte é também usado pelas IgM pentaméricas, mas estas ultimas existem numa percentagem muito menor nas secreções mucosas. As principais actividades biológicas das IgA são:    



Função efectora importante nas superficies membranares das mucosas, que são os principais locais de entrada de organismos patogénicos; Como são poliméricas, as IgA secretórias são capazes de ligar de modo cruzado antigénios com multiplos epitopos; A ligação de IgA secretória a antigénios superficiais de virus e bactérias previne a ligação destes às células mucosas, inibindo a infecção virica e a colonização bacteriana; Complexos de IgA secretória e antigénios são facilmente presos no muco e depois eliminados pelas células epiteliais ciliada do tracto respiratório ou pelos movimentos peristálticos do sistema digestivo; O leite materno contem IgA secretória e muitas outras moléculas que ajudam a proteger o recem-nsacido contra a infecção durante o primeiro mês de vida. Como o sistema imune dos bebés não está completamente funcional, a amamentação tem um papel importante na manutenção da saude dos recém-nascidos.

Imunoglobulina E (IgE) A potente actividade biológica das imunoglobulinas E permitiu que estas fossem identificadas no soro apesar da concentração sérica extremamente baixa (0,3 μg/mL). Estes anticorpos medeaim as reacções de hipersensibilidade imediata que são responsáveis pelos sintomas da febre do feno, asma, urticária e choque anafilático:  



IgE liga-se a receptores Fc na membrana dos basófilos no sangue e dos mastócitos nos tecidos; A ligação cruzados dos antigénios a moléculas IgE ligadas aos recepotres induz os basófilos e os mastócitos a translocarem os seus grânulos para a membrana plasmática e a libertarem o seu conteudo para o ambiente extracelular; Como resultado, uma variedade de mediadores farmacologicamente activos são libertados e dão origem às manifestações alérgicas.

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No entanto, a desgranulação dos mastócitos localizada induzida pelas IgE podem também libertar mediadores que facilitam a montagem de células necessárias para a defesa antiparasitica. Imunoglobulinas D (IgD) A classe de imunoglobulinas D apresenta uma concentração sérica de 30 μg/mL e constitui cerca de 0,2% das imunoglobulinas séricas totais. Em conjunto com as IgM, as IgD são as principais imunoglobulinas membranares expressas pelas células B maduras, e o seu papel na fisiologia das células B ainda está sob investigação. Assim, podemos resumir as principais propriedades dos diferentes subtipos de imunoglobulinas na seguinte tabela: Propriedade/Actividade Peso molecular

IgG1

IgG2

IgG3

IgG4

150.000

150.000

150.000

150.000

γ1

γ2

γ3

9

3

23

Componente da cadeia pesada Nivel sérico normal (mg/mL) Semi-vida sérica (dias) Activa a via do complemento clássica Atravessa a placenta Presente na membrana cas células B maduras Liga a receptores Fc nos fagócitos Transporte para as mucosas Induz desgranulação dos mastócitos

IgA1 150.000600.000

IgA2 150.000600.000

IgM

IgE

IgD

900.000

900.000

150.000

γ4

α1

α2

μ

ε

δ

1

0,5

3,0

0,5

1,5

0,0003

0,03

23

8

23

6

6

5

2,5

3

+

+/-

++

-

-

-

+++

-

-

+

+/-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

++

+/-

++

+

-

-

?

-

-

-

-

-

-

++

++

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

Determinantes Antigénicos nas Imunoglobulinas Como os anticorpos são glicoproteinas, eles podem funcionar como potentes imunogénios para induzir uma resposta por anticorpos. Tais anticorpos anti-Ig são ferramentas poderosas para o estudo do desenvolvimento das células B e das respostas imunes humorais. Os determinantes antigénicos, ou epitopos, nas imunoglobulinas caem em três principais categorias, que estão localizadas em porções caracteristicas da molécula: 1. Determinantes isotipicos – regiões constantes que colectivamente definem cada classe e subclasse de cadeia pesada e cada tipo e subtipo de cadeia leve numa espécie. Cada isotipo é codificado por um gene de região constante separado, e todos os membros de uma espécie carrega o mesmo gene de região constante, que apresenta multiplos alelos. Assim, diferentes espécies expressam diferentes isotipos; 2. Determinantes alotipicos – apesar de todos os membros de uma espécie herdarem o mesmo grupo de genes isotipo, multiplos alelos existem para alguns dos genes. Estes alelos codificam

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diferenças de aminoácido subtis, designados determinantes alotipicos, que ocorrem em alguns, mas não todos os membros de uma espécie; 3. Determinantes idiotipicos – a sequência de aminoácidos unica dos dominios VH e VL de um determinado anticorpo funciona não apenas como local de ligação ao antigénio mas também como determinantes antigénicos. Estes determinantes idiotipicos surgem das regiões variáveis da cadeias pesadas e leves. Em alguns casos, um idiotipo pode ser mesmo o local de ligação ao antigénio e noutros casos podem incluir regiões variáveis fora do local de ligação.

Receptor da Célula B (BCR) Os receptores da célula B (BCRs) são imunoglobulinas membranares mas, tal como os TCRs, estas moléculas apresentam caudas citoplasmáticas curtas:   

mIgM e mIgD apresentam apenas 3 aminoácidos citoplasmáticos; mIgA apresenta apenas 14 aminoácidos citoplasmáticos; mIgG e mIgE apresentam apenas 28 aminoácidos citoplasmáticos.

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Em cada caso, a cauda citoplasmática é demasiado pequena para ser capaz de se associar a moléculas sinalizadoras intracelulares (e.g., tirosina cinases e proteinas G). Portanto, as imunoglobulinas membranares não constituem por si só o receptor completo e associam-se com proteinas acessórias (Igα e Igβ) para formar o complexo BCR: 





o complexo BCR é um complexo de proteinas transmembranres composto por uma mIg e heterodimeros Igα e Igβ ligados por pontes dissulfito; A cadeia Igα apresenta uma cauda citoplasmática mais longa contendo 61 aminoácidos e a cauda da cadeia Igβ contem 48 residuos; As caudas do heterodimero Igα/Igβ são suficientemente longas para interagir com moléculas sinalizadoras intracelulares.

Este complexo é diferente do TCR, como já foi visto anteriormente quando foi estudado o TCR.

A Superfamilia Imunoglobulina As estruturas de várias cadeias imunoglobulina pesadas e leves partilham várias caracteristicas, sugerindo que elas apresentam um ancestral comum. Em particular, todas as classes de cadeias pesadas e leves apresentam a mesma estrutura do dominio imunoglobulina (enrolamento imunoglobulina). Para além disso, um grande numero de outras proteinas possuem uma ou mais regiões homólogas com um dominio imunoglobulina, como já visto para o MHC e o TCR. Cada uma destas proteinas é classificada como membro da superfamila imunoglobulina e os genes que as codificam evoluiram independentemente e não partilham ligação genética ou função. As seguintes proteinas, em conjunto com as imunoglobulinas por si só, são membros representativos da superfamilia imunoglobulina:        

Heterodimero Igα/Igβ, parte do BCR; Receptor poli-Ig, que contribui para o componente secretório das IgA e IgM; Receptor da célula T (TCR); Proteinas acessória da célula T, incluindo CD2, CD4, CD8, CD28 e as cadeias γ, δ e ε do CD3; Moléculas MHC classe I e classe II; β2-microglobulina, uma proteina invariante associada com as moléculas MHC classe I; Várias moléculas de adesão celular, incluindo VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 e LFA-3; Factor de crescimento derivado das plaquetas.

Muitas outras proteinas também pertencem à superfamilia imunoglobulina. Análises cristalográficas ainda não foram feitas a todos os membros desta superfamilia. No entanto, a sequência de aminoácidos primária dessas proteinas sugere que todas elas contêm um dominio com enrolamento imunoglobulina tipico. Especificamente, todos os membros da superfamilia imunoglobulina contêm pelo menos um ou mais segmentos de 110 aminoácidos capazes de se arranjarem nesse enrolamento.

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A maior parte dos membros da superfamilia imunoglobulina não é capaz de se ligar a antigénios. Assim, a estrutura caracteristica Ig encontrada em tantas proteinas membranares deve apresentar uma outra função para além da ligação a antigénios. Uma possibilidade é que o enrolamento imunoglobulina poderá facilitar as interacções entre proteinas membranares.

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MATURAÇÃO, ACTIVAÇÃO E REGULAÇÃO DOS LINFÓCITOS ORGANIZAÇÃO E EXPRESSÃO DE GENES IMUNOGLOBULINA

Diversidade de Imunoglobulinas Uma das caracteristicas mais importantes do sistema imune dos vertebrados é a sua habilidade para responder a uma gama aparentemente ilimitada de antigénios estranhos pois virtualmente todos os anticorpos estudados até agora contêm uma unica sequência de aminoácidos na região variável mas apenas um numero limitado de sequências invariáveis na região constante. A base genética para esta combinação numa unica molécula proteica encontra-se na organização dos genes de imunoglobulinas (Ig):   



No DNA da linha germinativa, multiplos segmentos de genes condificam porções das cadeias leve ou pesada de uma única imunoglobulina; Estes segmentos de genes são carregados nas células germinativas mas não podem ser transcritos e traduzidos em cadeias completas até serem rearranjados em genes funcionais; Durante a maturação das células B na medula óssea, certos segmentos desses genes são aleatoriemante baralhados por um sistema genético dinâmico capaz de gerar mais de 106 combinações; Processos subsequentes aumentam a diversidade do reportório de locais de ligação do anticorpo para um numero que excede 106 em pelo menos duas ou três ordens de magnitude.

Assim, os processos de desenvolvimento das células B são cuidadosamente regulados: 





A maturação de uma célula B progenitora progride através de uma sequência ordenada de rearranjos de genes Ig, acoplada com modificações dos genes que contribuem para a diversidade do produto final; No final deste processo, uma célula B madura, imunocompetente, conterá sequências codificantes para uma região variável funcional da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve; Assim, a célula B individual é antigenicamente comprometido com um epitopo especifico.

Depois da estimulação antigénica de uma célula B madura nos orgãos linfóides periféricos, rearranjos adicionais de segmentos de genes da região constante podem gerar alterações no isotipo expresso, o que produz alterações nas funções biológicas efectoras da molécula de imunoglobulina sem alterar a sua especificidade. Assim, as células B madura contêm DNA cromossómico que já não é semelhante ao DNA da linha germinativa. Assim, enquanto pensamos no DNA genómico como uma impressão digital genética estável, a linhagem de células linfocitárias não retem uma cópia intacta desta impressão. O rearranjo genómico é uma Joana Maria Soares Pereira

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caracteristica essencial da diferenciação dos linfócitos, e nenhum outro tipo de célula dos vertebrados sofre este processo.

Modelo Genético Compativel com a Estrutura das Imunoglobulinas Como sabemos, existe um enorme reportório de respostas dos anticorpos (10 8). No entanto, se todos os anticorpos diferentes que levam a esta gama de diversidade de respostas fossem expressos por genes no nosso genoma, seria necessário cerca de 1/3 do genoma. Assim, é dificil iconciliar esta diversidade com os modelos genéticos clássicos. Portanto, qualquer modelo viável da organização dos genes das imunoglobulinas tem de ter em conta as seguintes propriedades dos anticorpos:   

A vasta diversidade de especificidades dos anticorpos; A presença de regiões variáveis nas cadeias leve e pesada das Ig na extermidade N-terminal e de uma região constante na extermidade C-terminal; A existência de isotipos com a mesma especificidade antigénica, que resulta da associação de uma determinada região variável com diferentes regiões constantes da cadeia pesada.

Surgiram dois grupos de teorias na tentativa de descrever a organização dos genes das imunoglobulinas: 1. Teorias da linha germinativa – o genoma contido nas células germinativas, ovulo e epsermatozóide, contem um grande reportório de genes das imunoglobulinas. Assim, estas teorias não invocam mecanismos genéticos especiais na origem da diversidade de anticorpos. Argumentam que o imenso valor vital do sistema imune justifica a dedicação de uma fracção significativa do genoma à codificação de imunoglobulinas; 2. Teorias de variação somática – o genoma contem um pequeno numero de genes das imunoglobulinas, a partir dos quais um grande numero de anticorpos especificos são gerados nas células somáticas por maturação ou recombinação. Independentemente da diversidade ser gerada por mecanismos da linha germinativa ou somáticos, um paradoxo mantem-se: Como é que a estabilidade é mantida nas regiões constantes (C) enquanto um mecanismo diversificante gera a região variável (V)? 



As teorias da linha germinativa não parecem ser capazes de responder a esta questão porque parece dificil que um mecanismo evolutivo fosse capaz de gerar diversidade na parte variável de vários genes das cadeias pesadas e leves preservando a região constante; As teorias da variação somática não parecem ser capazes de responder a esta questão porque parece dificil conceber um mecanismo que diversificasse a parte variável de um unico gene das cadeias pesadas e leves nas células somáticas sem alterar a sequência de aminoácidos codificada pela regiãos constante.

Em 1976, S. Tonegawa e N. Hozumi encontraram a primeira evidência directa de que genes separados codificam as regiões V e C das imunoglobulinas e que os genes são rearranjados no decurso da diferenciação das células B, o que dá peso às teorias da variação somática e explica a diferença de variação nas duas regiões das imunoglobulinas. Joana Maria Soares Pereira

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Organização dos Genes das Imunoglobulinas As cadeias leves λ e κ e as cadeias pesadas são codificadas por familias multigénicas separadas situadas em diferentes cromossomas. No DNA da linha germinativa, cada uma destas familias multigénicas contêm várias sequências codificantes, desiganadas segmentos de genes, separadas por regiões não codificantes. Durante a maturação das células B, esses segmentos de genes são rearranjados e juntos de modo a formar genes de imunoglobulinas funcionais: 



As familias λ e κ da cadeia leve contêm segmentos de gene V (variavel), J (joining) e C (constante), sendo que os segmentos VJ rearranjados codificam a região variável das cadeias leves e o segmento C codifica a região constante; As familias da cadeia pesada contêm segmentos de gene V (variavel), D (diversidade), J (joining) e C (constante), sendo que os segmentos VDJ rearranjados codificam a região variável das cadeias pesadas e o segmento C codifica a região constante.

Os segmentos J codificam a região terminal das regiões constante que se ligam às regiões constantes, daí o J de Joining. Cada segmento de genes V é precedido na sua terminação 5’ por um pequeno exão que codifica um pequeno péptido sinal (L) que guia a cadeia leve ou pesada através do reticulo endoplasmático. Este péptido sinal é clivado das cadeias leves e pesadas nascentes antes da montagem da molécula de imunoglobulina final. Assim, os aminoácidos codificados por esta sequência não aparecem na molécula de imunoglobulina. Familia de Multigenes das Cadeias λ A familia de multigenes das cadeias λ na liha germinativa de ratinho contêm:   

3 segmentos de genes Vλ, cada um com uma sequência sinal a pequena distância na exterminada 5’; 4 segmentos de genes Jλ; 4 segmentos de genes Cλ.

Jλ4 é um pseudogene, um gene defeituoso que é incapaz de codificar uma proteina, e genes deste tipo são indicados com o simbolo psi (ψ). No entanto, o parceiro de região constante do J λ4 (Cλ4) é um gene prefeitamente funcional. Assim, os segmentos de genes Vλ e os três Jλ funcionais codificam a região variável da cadeia leve e cada um dos segmentos de genes Cλ funcionais codificam a região constante de cada um dos três subtipos de cadeias (λ1, λ2 e λ3). No entanto, em humanos, este locus é mais complexo, contendo 31 segmentos de genes Vλ, 4 segmentos de genes Jλ e 7 segmentos Cλ, e ainda bastantes pseudogenes de cada tipo de genes.

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Familia de Multigenes das Cadeias κ A familia de multigenes das cadeias κ em ratinho, sendo semelhante em humano, contem:   

Aproximadamente 85 segmentos de genes Vκ, cada um com uma sequência sinal a pequena distância na exterminada 5’; 5 segmentos de genes Jκ, um dos quais é um pseudogene não funcional; Um unico segmentos de genes Cκ.

Tal como na familia de multigenes das cadeias λ, os segmentos de genes Vκ e Jκ codificam a região variável da cadeia pesada κ e o segmento Cκ codifica a região constante. No entanto, como só existe um único segmento Cκ, não existem subtipos de cadeias κ. Por outro lado, comparando o arranjo dos genes desta familia e os da familia λ, vemos que o arranjo de cada uma é muito diferente. Familia de Multigenes das Cadeias Pesadas A organização dos genes das cadeias pesadas das imunoglobulinas é semelhante, mas mais complexa, è dos genes κ e λ das cadeias leves. No entanto, um segmento de genes adicional codifica parte da região variável das cadeias pesadas:



Segmento D (diversidade) – segmento que se liga aos segmentos de genes VH e JH para codificar a região variável interira da cadeia pesada. Codifica aminoácidos no CDR3 e contribui para a geração da diversidade de anticorpos. Encontra-se entre os segmentos de genes VH e JH.

A familia de multigenes das cadeias pesadas em humano, sendo semelhante em ratinho, contem:    

51 segmentos de genes VH localizados a montante dos segmentos de genes DH e cada um é precedido por uma sequência sinal a pequena distância na extremidade 5’; 27 segmentos de genes DH localizados a jusante dos segmentos de genes VH; 6 genes JH funcionais a jusante dos segmentos de genes DH; Uma série de segmentos CH a jusante dos segmentos de genes JH, sendo que cada um codifica a região constante de um isotipo de cadeia pesada das imunoglobulinas. Os segmentos de genes CH consistem em exões codificantes e intrões não codificantes. Cada exão codifica um domino separado da região constante da cadeia pesada.

A conservação de funções biológicas efectoras importantes da molécula de anticorpo é mantida pelo numero limitado de genes de região constante da cadeia pesada. Em humanos e ratinhos, os segmentos de genes CH são arranjados sequencialmente na ordem Cμ, Cδ, Cγ, Cε e Cα e este arranjo não é acidental, ele está relacionado com a expressão sequencial das classes de imunoglobulinas no curso do Joana Maria Soares Pereira

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desenvolvimento das células B e a resposta inicial IgM das células B quando encontram pela primeira vez um antigénio.

Rearranjos dos Genes das Regiões Variáveis Genes funcionais que codificam as cadeias leves e pesadas das imunoglobulinas são montadas por eventos de recombinação ao nivel do DNA. Estes eventos e os eventos paralelos que envolvem genes do receptor das células T são os unicos rearranjos de DNA especificos de um local conhecidos nos vertebrados. Os rearranjos de genes das regiões variáveis ocorrem numa sequência ordenada durante a maturação das células B na medula óssea:   

Os genes das regiões variáveis das cadeias pesadas rearranjam primeiro; Depois rearranjam os genes das regiões variáveis das cadeias leves; No final do processo, cada célula B contem uma unica sequência de DNA para a região variável funcional para a sua cadeia pesada e outra para a sua cadeia leve.

O processo de rearranjo de genes das regiões variáveis produz células B maduras, imunocompetentes, sendo cada uma dessas células consignada a produzir anticorpos com um local de ligação codificado por uma sequência particular dos seus genes V rearranjados. Por outro lado, rearranjos dos genes da região constante da cadeia pesada gerará alterações seguintes na classe de imunoglobulina (isotipo) expressa por uma célula B, mas estas alterações não afectarão a especificidade antigénica da célula. Os passos no rearranjo de genes das regiões variáveis ocorrem numa sequência ordenada, mas são eventos aleatórios que resultam na determinação aleatória da especificidade da célula B. Rearranjos V-J das Cadeias Leves A expressão de ambas as cadeias leves κ e λ requer rearranjos dos segmentos de genes V e J da região variável:  



Em humanos, qualquer um dos segmentos de genes Vλ funcionais pode combinar-se com qualquer uma das quatro combinações Jλ-Cλ; Em ratinho, é mais complicado, sendo que o rearranjo de DNA pode juntar o segmento de gene Vλ1 com qualquer um dos segmentos Jλ1 ou Jλ3, ou o segmento de gene Vλ2 com o segmento de gene Jλ2; No DNA de cadeia leve κ, qualquer um dos segmentos de genes Vκ pode ser combinado com qualquer um dos segmentos de genes Jκ.

Assim, os genes λ e κ rearranjados contêm as seguintes regiões na ordem 5’→3’:     

Um pequeno exão sinal (L); Uma sequência não codificante (intrão); Um segmento VJ; Um segundo intrão; A região constante.

A montante de cada segmento sinal do gene encontra-se uma sequência promotora. A sequência de cadeia leve rearranjada é transcrita pela RNA polimerase a partir do exão L através do segmento C até ao sinal stop, gerando um transcrito de RNA primário para a cadeia leve. Os intrões no transcrito Joana Maria Soares Pereira

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primário são removidos por enzimas de processamento de RNA, e o mRNA de cadeia leve resultante sai assim do nucleo. O mRNA de cadeia leve liga-se a ribossomas e é traduzido na proteina de cadeia leve. A sequência sinal no N-terminal transporta a cadeia polipeptidica para o lumen do reticulo endoplasmático rugoso e é depois clivada, portanto, não está presente no produto proteico de cadeia leve. Esquematicamente, para as cadeias κ, o processo de rearranjo e expressão é o seguinte:

Rearranjos V-D-J das Cadeias Pesadas A produção de genes de cadeia pesada funcionais requer dois eventos de rearranjo separados dentro da região variável: 1. Um segmento de gene DH primeiro combina-se com um segmento JH; 2. O segmento DHJH resultante aproxima-se e combina-se com um segmento VH para gerar uma unidade VHDHJH que codifica a região variável inteira. Assim, no DNA de cadeia pesada, os rearranjos da região variável produz um gene rearranjado que contêm as seguintes regiões na ordem 5’→3’:     

Um pequeno exão L; Um intrão; Um segmento VDJ; Outro intrão; Uma série de segmentos de genes C.

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Tal como nos genes das cadeias leves, uma sequência promotora está localizada a uma pequena distância a montante de cada sequência L da cadeia pesada. Assim que o rearranjo é concluido, a RNA polimerase pode ligar-se à sequência promotora e transcrever o genes de cadeia pesada inteiro, incluindo os intrões. Inicialmente, ambos os segmentos de genes C μ e Cδ são transcritos. Poliadenilação diferencial e splicing de RNA remove os intrões e processa o transcrito primário para gerar mRNA, incluindo tanto o transcrito Cμ como o Cδ. Estes dois mRNAs são depois traduzidos, e o péptido sinal do polipéptido nascente resultante é clivado, gerando cadeias μ e δ acabadas. A produção de dois mRNAs de cadeia pesada permite que a célula B madura, imunocompetente, expresse ambas IgM e IgD com especificidade antigénica idêntica na sua superficie. Esquematicamente, o processo de rearranjo e expressão é o seguinte:

Mecanismos de Rearranjos de DNA das Regiões Variáveis Estudos de sequenciação de DNA revelaram a presença de sequências sinal de recombinação (RSS) unicas nas extremidades de cada segmento de genes V, D e J da linha germinativa:   

Uma RSS está localizada a 3’ de cada segmento de gene V, a 5’ de cada segmento de gene J e dos dois lados de cada segmento de gene D; Estas sequências funcionam como sinais para o processo de recombinação de rearranja os genes; Cada RSS contem um heptamero palindrómico conservado e um nonamero rico em AT conservado separado por uma sequência interveniente com 12 ou 23 pares de bases.

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As sequências intervenientes de 12- e 23-bp correspondem, respectivamente, a uma ou duas voltas da hélice de DNA. Por esta razão, as sequências são deignadas sequência sinal de recombinação one-turn (one-turn RSS) e sequência sinal de recombinação two-turn (two-turn RSS).

  

A RSS Vκ apresenta um espaço one-turn e a RSS Jκ apresenta um espaço two-turn; No DNA de cadeia leve λ, esta ordem é revertida, isto é, a RSS Vλ apresenta um espaço two-turn e a RSS Jλ apresenta um espaço one-turn; No DNA de cadeia pesada, as RSS dos segmentos de genes VH e JH apresentam espaços two-turn enquanto cada lado dos segmentos de genes DH apresentam espaço one-turn.

A lei one-turn/two-turn diz que RSS com um espaço one-turn se conseguem ligar apenas a sequências com um espaço two-turn. Esta lei assegura, por exemplo, que um segmento VL se liga apenas a um segmento JL a não a outro segmento VL e também que os segmentos VH, DH e JH se combinam na ordem apropriada e que outros segmentos os mesmo tipo não se ligam um ao outro. A recombinação V-(D)-J, que ocorre nas junções entre as RSSs e as sequência codificantes, é catalizada por enzimas colectivamente designadas recombinase V(D)J. Estas enzimas são os unicos produtos de genes especificos das células linfóides que estão envolvido no rearranjo V-(D)-J:  

RAG-1 e RAG-2 – produtos de genes activantes da recombinação; TdT – terminal deoxynucleotidyl transferase.

A recombinação de segmentos de genes da região variável consite nos seguintes passos, catalizados por um sistema de enzimas recombinases: 1. Reconhecimento de RSSs por enzimas recombinase, seguida de sinapse na qual duas sequências sinal e as sequências codificantes adjacentes (segmentos de genes) são aproximadas; 2. Clivagem de uma cadeia de DNA pelas RAG-1 e RAG-2 nas junções das RSSs com as sequências codificantes; Joana Maria Soares Pereira

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3. Uma reacção catalizada pelas RAG-1 e RAG-2 na qual o grupo –OH 3’ livre no corte na cadeia de DNA ataca a ligação fosfodiester que liga a cadeia oposta à RSS, simultaneamente produzindo uma estrutura hairpin na extremidade de corte da sequência codificante e a quebra da cadeia dupla na RSS; 4. Corte do hairpin para gerar locais de adição de nucleótidos de região P, seguida de primming de alguns nucleótidos a parte da sequência codificante por uma endonuclease de cadeia simples; 5. Adição de cerca de 15 nucleótidos, designados nucleótidos de região N, nas extermidades de corte das sequências codificantes de segmentos V, D e J das cadeias pesadas por uma enzima TdT; 6. Reparo e ligação para juntar as sequencias codificantes e para juntar as sequências sinal, catalizada por enzimas doublestrand break repair normais (DSBR), que são expressas em todas as células somáticas. A recombinação resulta na na formação de uma encaixe codificante, entre as duas sequências codificantes, e um encaixe sinal, entre as RSSs. A orientação transcripcional dos segmentos de genes a serem ligados determina o destino do encaixe sinal e dos DNA interveniente: 



Quando os dois segmentos de genes estão na mesma orientação transcripcional, a combinação resulta na delecção do encaixe sinal e do DNA interveniente como um produto circular; Menos frequentemente, se os dosi genes tiverem orientações opostas, a combinação resulta por inversão do DNA, resultando na retenção de ambos os encaixes no cromossoma.

No locus κ humano, cerca de metade dos segmentos de genes Vκ estão invertidos relativamente aos Jκ e a sua combinação é feita assim por inversão. A TdT é um membro dos factores non-homologous end joining (NHEJ) que são expressos em qualquer célula e estão envolvidos no reparo do DNA. Estas adicionam nucleótidos ao DNA e fecham espaços entre dois pedaços de DNA. Constituem um complexo enzimático cujas enzimas são:   

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DNA-PKs; Ku-70 e Ku-86; Artemis;

  

Pol μ; DNA-ligase IV; XRCC4.

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Qualquer deficiência nestas enzimas, NHEJ e Rags, leva a doenças autoimunes pois os linfócitos ficam incapazes de produzir anticorpos. Junção Flexivel dos Segmentos Uma das caracteristicas notáveis da recombinação de segmentos de genes é a diversidade de junções codificantes que são formadas entre dois quaisquer segmentos. Apesar das quebras na cadeia dupla de DNA para inicai os rearranjos V-(D)-J serem introduzidos precisamente nas junções das RSSs e das sequências codificantes, a ligação subsequente das sequências codificantes é imprecisa. A diversidade juncional nas ligações V-J e V-D-J são geradas por um numero de mecanismos:    

Variação no corte do hairpin para gerar nucleótidos P; Variações no aparamento das sequências codificantes; Variações na adição de nucleótidos N; Flexibilidade na junção de sequências codificantes – a introdução de aleatoriedade no processo de junção ajuda a gerar diversidade de anticorpos contribuindo para a hipervariabilidade do local de ligação ao antigénio.

A junção flexivel pode gerar hipervariebilidade por alterar o open reading frame. No entanto, podemos ter duas consequências: 



Rearranjo não produtivo - os segmentos de genes podem ser ligados fora de fase, de modo que o open reading frame não é preservado e a unidade VJ ou VDJ resultante provavelmente pode conter condões stop, de modo que interrompe a tradução; Rearranjo produtivo – os segmentos de genes podem ser ligados em fase, de modo que o open reading frame é preservado e a unidade VJ ou VDJ pode ser traduzida inteiramente, levando a um anticorpo completo.

Se um alelo rearranja não produtivamente, uma célula B pode ser capaz de rearranjar o outro alelo produtivamente. Se um gene de cadeia leve e um de cadeia pesada rearranjados em fase não forem produzidosm a célula B morre por apoptose. Estima-se que apenas um 1/3 das combinações VL-JL e 1/3 das combinações VH-DH-JH são produtivas. Como resultado, menos de 1/9 (11%) das células pré-B na medula ossea maturam e deixam-na como células B imunocompetentes.

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Exclusão Alélica As células B, como todas as células somáticas, são diplóides e contêm os cromossomas maternos e os paternos. No entanto, apesar de uma célula B ser diplóide, ela expressa os genes rearranjados de apenas um cromossoma. O processo pelo qual isto ocorre, designado exclusão alélica, assegura que células B funcionais nunca contêm mais de uma unidade VHDHJH e VLJL: 



É essencial para a especificidade antigénica da célula B, porque a expressão de ambos os alelos levaria a multiespecificidade das células B; Este fenómeno sugere que assim que um rearranjo VH-DHJH produtivo e um rearranjo VL-JL produtivo ocorrem, a maquinaria de recombinação é desligada, de modo que os genes de cadeia leve e pesada em cromossomas homólogos não são expressos.

O modelo de exclusão alélica diz que assim que um rearranjo produtivo é alcançado, a sua proteina codificada é expressa e a presença desta proteina actua como sinal para prevenir rearranjos de genes futuros. De acordo com este modelo: 1. A presença de de cadeia pesada μ sinaliza na célula B de modo a que esta desligue o rearranjo de outros alelos de cadeia pesada e inicie o rearranjo de genes de cadeia leve; 2. Se um rearranjo κ produtivo ocorrer, as cadeias leves κ são produzidas e emparelham com as cadeias pesadas de modo a formar uma molécula de anticorpo completa. A presença deste anticorpo desliga os rearranjos seguintes das cadeias leves; 3. Se um rearranjo κ é não produtivo para ambos os alelos κ , rearranjos dos genes de cadeias λ começam. Se nenhum rearranjo dos alelos λ for produtivo, a célula B para a maturação e morre por apoptose.

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Produção da Diversidade de Anticorpos Sete modos de diversificação de anticorpos foram já identificados em ratinho e humanos:       

Segmentos de multiplos genes da linha germinativa; Junção combinatória V-(D)-J; Flexibilidade juncional; Adição de nucleótidos região P (adição P); Adição de nucleótidos região N (adição N); Hipermutação somática; Associação combinatória de cadeias leves e pesadas.

Apesar da contribuição exacta de cada uma destas vias de diversificação para a diversidade total do anticorpo não ser conhecida, cada uma destas contribui significativamente para o imenso numero de anticorpos distintos que o sistema imune mamifero é capaz de gerar. Segmentos de Multiplos Genes da Linha Germinativa Um inventório dos segmentos de genes V, D e J funcionais no DNA da linha germinativa de um humano revela 51 VH, 25 D, 6 JH, 40 Vκ, 5 Jκ, 31 Vλ e 4 Jλ segmentos de genes. Em adição a estes segmentos funcionais existem ainda vários pseudogenes e devemos ter em emnte que estes valores foram obtidos de apenas um individuo, podendo variar entre diferentes individuos. Em ratinho, apesar dos valores serem conhecidos com menos precisão, parecem existir cerca de 135 VH, 13 D, 4 JH, 85 Vκ, 4 Jκ, 3 Vλ e 3 Jλ segmentos de genes: 

Apesar do numero de genes encontrados na linha germinativa de humanos e ratinhos ser menor ao esperado pelo modelo da linha germinativa, os multiplos segmentos de genes V, D e J da linha germinativa contribuem claramente para a diversidade de locais de ligação ao antig+enio nos anticorpos.

Junção Combinatória V-(D)-J A contribuição dos multiplos segmentos de genes da liha germinativa para a diversidade dos anticorpos é magnificada pelo rearranjo aleatório desses segmentos nas células sométicas. É possivel calcular quanta diversidade pode ser alcançada pelo rearranjo de genes: 





A habilidade de qualquer um dos segmentos de genes VH combinar com qualquer um dos segmentos DH e com qualquer um dos segmentos JH fornece uma quantidade consideravel de diversidade de cadeias pesadas; De modo semelhante, a combinação de qualquer um dos um dos segmentos de genes V L combinar com qualquer um dos segmentos JH fornece uma quantidade consideráve de cadeias leves; A combinação de cadeias leves com cadeias pesadas aumenta a diversidade um modo colossal.

No entanto, é importante ter em conta que estes são calculos minimos de diversidade potencial. A flexibilidade juncional, as adições de nucleótidos P e N e, especialmente, a hipermutação somática contribuem bastante para a diversidade dos anticorpos, e que estes valores elevados não significam que a um determinado momento da sua vida um individuo tenha este numero de variedades de anticorpos, mas sim o reportório total que podemos encontrar em vários individuos. Joana Maria Soares Pereira

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FCUP/ICBAS Multiplos segmentos da linha germinativa Em Humano V D J Junção combinatoria V-D-J e V-J (numero possivel de combinações) Associações combinatórias possiveis das cadeias leves e pesadas Em Ratinho V D J Junção combinatoria V-D-J e V-J (numero possivel de combinações) Associações combinatórias possiveis das cadeias leves e pesadas

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Cadeia pesada

Cadeias leves κ

λ

51 27 6

40 0 5

30 0 4

51 x 27 x 6 = 8262

40 x 5 = 200

30 x 4 = 120

8262 x (200 + 120) = 2,64 x 10

6

134 13 4

85 0 4

2 0 3

134 x 13 x 4 = 6968

85 x 4 = 340

2x3=6

6968 x (340 + 6) = 2,41 x 10

6

Flexibilidade Juncional A enorme diversidade gerada por meio das combinações dos segmentos V, D e J é de seguida aumentada por um fenómeno designado flexibilidade juncional:  

A recombinação envolve a ligação RSSs para formar um encaixe sinal e a ligação de sequências codificantes para formar o encaixe codificante; Apesar das RSSs serem sempre ligadas de modo preciso, a ligação das sequências codificantes é normalmente imprecisa.

A flexibilidade juncional leva a vários rearranjos não produtivos mas também gera combinações produtivas que codificam aminoácidos alterantivos em cada junção codificante, aumentanto a diversidade de anticorpos: 



A variação na sequência de aminoácidos gerada pela flexibilidade juncional nas junções codificantes caem na terceira região hipervariável (CDR3) no DNA da cadeia leve a da cadeia pesada; Visto que a CDR3 tem a maior contribuição para a ligação ao antigénio pela molécula de anticorpo, as alterações de aminoácidos gerados pela flexibilidade juncional são importantes na geração da diversidade dos anticorpos.

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Adição P Após a primeira clivagem de uma unica cadeia de DNA na junção de um segmento de genes de região variável e a RSS ligada, os nucleótidos na terminação da sequência codificante formam uma estrutura em hairpin. Este hairpin é depois clivado por uma endonuclease:  



A segunda clivagem por vezes ocorre a uma posição que deixa uma pequena cadeia simples na terminação da seuqência codificante; A adição subsequente de nucleótidos complementares a esta cadeia (adição P) por enzimas de reparação gera uma sequência palindrómica na junção codificante e, assim, esses nucleótidos são designados nucleótidos P; Variações na posição na qual o hairpin é cortado leva, assim, a variações na sequência da junção codificante.

Adição N As junções codificantes da região variável em genes rearranjados de cadeias pesadas contêm pequenas sequências de aminoácidos que não são codificadas pelos segmentos de genes V, D ou J na linha germinativa. Esses aminoácidos são codificados por nucleótidos adicionados durante o processo de junção de D a J e de V a DJ por uma reacção catalizada pela TdT, processo esse designado adição N:   

Cerca de 15 nucleótidos podem ser adicionados às junções DH-JH e VH-DH-JH; A diversidade adicional gerada pela adição de nucleótidos N é bastante elevada porque as regiões N parecem consistir em sequências completamente aleatórias; Como esta diversidade ocorre nas junções V-D-J codificantes, está localizada no CDR3 dos genes de cadeia pesada.

Hipermutação Somática Toda a diversidade de anticorpos descrita até agora tem origem em mecanismos que operam durante a formação de regiões variáveis especificas por rearranjo de genes. Diversidade de anticorpos adicional é gerana em unidade de genes de regiões variáveis rearranjados por um processo designado hipermutação somática. Como resultado, nucleótidos individuais nas unidades VJ ou VDJ são substituidos por outros alternativos, potencialmente alterando a especificidade das imunoglobulinas codificadas:

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  

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A hipermutação somática rearranja regiões V localizadas numa sequência de DNA contendo cerca de 1500 nucleótidos, o que inclui o total dos segmentos VJ ou VDJ; A hipermutação somática a uma frequência de 10-3 pares de base por geração. Esta taxa é bastante superior à taxa de mutação espontânea (10-8) de outros genes; Visto que o comprimento combinado dos genes da região variável das cadeias pesada e leve é cerca de 6000 bp, a hipermutação somética introduzirá pelo menos uma mutação a cada duas divisões celulares no par de genes VH e VL que codificam um anticorpo.

O mecanismo de hipermutação somática ainda não foi determinado, mas envolve a enzima AID (activation induced cytidine deaminase). A maior parte das mutações são substituições em vez de delecções ou inserções. A hipermutação somática introduz essas substituições de um modo quase completamente aleatório:  

Certos motivos de nucleótidos e sequências palindrómicas dentro dos VH e VL podem ser especialmente susceptiveis a hipermutação somática; Hipermutações somáticas ocorrem por todo o segmento VJ ou VDJ, mas em células B maduras estão agrupadas nos CDRs das sequências VH e VL, onde influenciam a afinidade geral para o antigénio e entrarão na selecção de células B com maior afinidade para um determinado antigénio durante a maturação.

A hipermutação somática aumenta progressivamente ao longo da primeira, segunda e terceira imunizações aumentando a afinidade do anticorpo para um antigénio. Isto permite que células B especificas para um antigénio sejam seleccionadas e que a diversidade de anticorpos seja produzida mesmo depois dos genes serem rearranjados e de uma célula B se tornar especifica para um antigénio. Isto é, permite que células B alterem de especificidade ou aumentem a sua especificidade para um antigénio. Joana Maria Soares Pereira

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Associação Combinatória de Cadeias Leves e Pesadas Em humanos, existe a potencialidade de gerar 8262 genes de cadeia pesada e 320 genes de cadeia leve como resultado dos rearranjos de genes das regiões variáveis. Assumindo que qualquer um dos genes de cadeia leve ou pesada possiveis podem ocorrer aleatoriamente na mesma célula, o numero potencial de combinações das cadeias leves com as cadeias pesadas possiveis é 2.644.240: 



Este numero é provavelmente superior à quantidade de diversidade combinatoria actualmente gerada num individuo, porque não será provável que todas as VH e VL se emparelhem umas com as outras; Para alem disso, o processo de recombinação não é completamente aleatório. Nem todos os segmentos VH, D e VL são usados com a mesma frequência. Alguns são usados mais frequentemente, outros apenas ocasionalmente, e ainda outros quase nunca.

Apesar do numero de diferentes locais de anticorpos diferentes que o sistema imune é capaz de gerar ser dificil de calcular com precisão, sabe-se que este é elevado. Devido ao grande numero de novas sequências criadas por flexibilidade juncional, adição P e adição N serem no terceiro CDR, elas estão posicionadas para influenciar a estrutura do local de ligação do anticorpo. Em adição a estas fontes de diversidade de anticorpos, o fenomeno de hipermutação somática contribui de enormemente para o reportório de anticorpos depois da estimulação pelo antigénio. No entanto, estes processos ocorrem mais commumente para ratinhos e humanos, sendo que outros animais, como as aves, usam outros mecanismos e mais frquentemente a mutação somética.

Class Switching entre Genes da Região Constante Depois da estimulação antigénica de uma célula B, o DNA de cadeia pesada pode sofrer mais rearranjos nos quais a unidade VHDHJH pode combinar com qualquer outro segmento de gene CH. O mecanismo exacto deste processo, designado classe switching ou isotype switching, ainda não é claro, mas involve sequências de DNA designadas regiões de switch localizadas 2-3 kb a montante de cada segmento CH (excepto Cδ):  

Estas regiões de switch são relativamente grandes (2-10 kb) e compostas por multiplas cópias de pequenas repetições (GAGCT e TGGGG); Uma proteina ou sistema de proteinas que constitui a recombinase de switch (enzima AID) reconhece estas repetições e liga-se a elas levando a uma recombinação do DNA que resulta no switch de classe.

Proteinas intracelulares regulatórias conhecidas como citocinas actuam como “factores de switch” e têm um papel importante na determinação da classe particular de imunoglobulias que é expressa como sequência do switching:  

Interleucina 4 (IL-4), por exemplo, induz o class switching de Cμ para Cγ1 ou Cε; Em alguns casos, a IL-4 induz switching de um modo sucessivo, sendo primeiro de C μ para Cγ1 e depois de Cγ1 para Cε.

A examinação dos produtos de excisão de DNA produzidos durante o switching de Cμ para Cγ1 mostraram que era gerada um produto de excisão circular contendo Cμ em conjunto com a terminação 5’ da região de switch γ1 (Sγ1) e a terminação 3’ da região de switch μ (Sμ). Em adição, o switch de Cγ1 Joana Maria Soares Pereira

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para Cε produziu produtos de excisão circular contendo o Cγ1 em conjunto com porções das regiões de switch μ, γ e ε.

Assim, o class switching depende da actuação de três elementos:   

Regiões de switch; Recombinase de switch (enzima AID); Citocinas sinais que dictam o isotipo para o qual a célula B troca.

Expressão de Genes Ig Como na expressão de outros genes, o processamento pós-transcripcional de transcritos primários de imunoglobulinas é necessário para produzir mRNAs funcionais: 



Os transcritos primários produzidos a partir de genes de cadeia pesada e leve rearranjados contêm sequências de DNA intervenientes que incluem intrões não codificantes e segmentos de gene J não perdidos durante o rearranjo V-(D)-J; Os segmentos de gene C das cadeias pesadas estão organizados como uma série de exões codificantes e intrões não codificantes. Cada exão de segmento de gene CH corresponde a um dominio da região constante ou a uma região dobradiça da cadeia pesada.

Assim, o trascrito primário deve ser processado para remover as sequências de DNA intervenientes e os exões que permanecem deve ser ligados por RNA splicing. O processamento do transcrito primário no nucelo remove cada uma destas sequências interveniente para gerar o produto mRNA final. O mRNA é depois exportado do nucleo para ser traduzido por ribossomas nas cadeias H ou L completas.

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O processamento de um transcrito primário de cadeia pesada pode dar origem a diferentes mRNAs, o que explica como uma única célula B é capaz de produzir formas secretada ou membranares de uma imunoglobulina particular e simultaneamente expressar IgM e IgD. Expressão de Imunoglobulinas Secretadas e Membranares Uma imunoglobulina particular pode existir tanto na forma membranar ou secretada. As duas formas diferem na sequência de aminoácidos dos dominios C-terminal da cadeia pesada (CH3/CH3 na IgA, IgD e IgG e CH4/CH4 na IgE e IgM):  

A forma secretada apresenta uma sequência hidrofilica com cerca de 20 aminoácidos no dminio C-terminal; Na forma membranar esta região é substituida por uma sequência com cerca de 40 aminoácidos contendo um segmento hidrofilico que se extende para fora da célula, um segmento hidrofóbico transmembranar e um pequeno segmento hidrofilico no C-terminal que se extende para o citoplasma.

Por algum tempo, a existência destas duas formas parecia inconsistente co a estrutura do DNA da linha germinativa para a cadeia pesada, que contem um único segmento de gene CH correspondente a cada classe e subclasse. A sequenciação do segmento de gene Cμ mostrou que: 



Este consiste em quatro exões (Cμ1, Cμ2, Cμ3 e Cμ4) cada um correspondente a quatro dominios na molécula IgM. O exão Cμ4 contem uma sequência de nucleótidos (designada S) em 3’ que codifica a sequência hidrofilica do dominio CH4 da IgM secretada; Dois exões adicionais designados M1 e M2 localizam-se 1,8 kb a jusante do 3’ do exão Cμ4, sendo que M1 codifica o segmento transmembranar e M2 codifica o segmento citoplasmático do dominio CH4 na IgM membranar.

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Outros estudos de sequenciação revelaram que todos os segmentos de genes C H apresentam dois exões M1 e M2 adicionais a jusante que codificam os segmentos transmembranar e citoplasmático. O transcrito primário produzido por transcrição de um gene μ rearranjado contem duas sequências sinalizadoras de poliadenilação, ou locais poli-A, no segmento Cμ:  



O local 1 localiza-se na extremidade 3’ do exão Cμ4, e o local 2 localiza-se na extremidade 3’ do exão M2; Se a clivagem do transcrito primário e adição da cauda poli-A ocorre no local 1, os exões M1 e M2 são perdidos. A excisão de intrões e o splicing dos exões que ficam produz assim mRNA que codifica a forma secretada da cadeia pesada; Se a clivagem e poliadenilação do transcrito primário ocorre, por outro lado, no local 2 um diferente padrão de splicing resulta. O splicing remove a sequência S na extremidade 3’ do exão Cμ4, que codifica a extremidade C-terminal hidrofilica da forma secretada e liga o exão Cμ4 com os exões M1 e M2, produzindo mRNA para a forma membranar da cadeia pesada.

Assim o processamento diferencial de um transcrito primário determina se será produzida a forma membranar ou secretada de uma imunoglobulina. Expressão Simultânea de IgM e IgD O processamento de RNA diferencial também tem subjacente a expressão de IgM e IgD membranares pelas células B maduras pois a transcrição de genes de cadeia pesada rearranjados pelas células B produz transcritos primários que contêm ambos os segmentos de genes Cμ e Cδ: 



Os segmentos de genes Cμ e Cδ estão juntos no gene rearranjado (apenas a uma distência de cerca de 5 kb) e a ausência de um local de switch entre eles permite que a região VDJCμCδ inteira seja transcripta numa único transcrito primário com cerca de 15 kb, que contem quatro locais poli-A; Os locais 1 e 2 estão associados com Cμ como já descrito e os locais 3 e 4 estão localizados em locais semelhantes no segmento de gene Cδ;

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 

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Se o transcrito de cadeia pesada é clivada e poliadenilada no local 2 depois dos exões Cμ, o mRNA codificará a forma membranar da cadeia pesada μ; Se a poliadenilação ocorrer a jusante do local 4 depois dos exões Cδ, o mRNA codificará a forma membranar da cadeia pesada δ.

Já que as células B maduras expressam as IgM e IgD na sua membrana, ambas as vias de processamento devem ocorrer simultaneamente.

Organização e Rearranjo dos Genes TCR Os genes que codificam os receptores αβ e γδ das células T são expressos apenas na linhagem das células T. Os quatro loci TCR (α, β, γ e δ) estão organizados na linha germinativa de um modo bastante semelhante à organização de multigenes das imunoglobulinas (Ig):   

Como no caso dos genes Ig, os genes TCR funcionais são produzidos por rearranjos de segmentos V e J nas familias das cadeias α e γ e segmentos V, D e J das familias de cadeias β e δ; No ratinho, os segmentos de genes das cadeias α, β e γ estão localizados nos cromossomas 14, 6 e 13, respectivamente; Os segmentos de genes δ localizam-se no cromossoma 14 entre os segmentos Vα e Jα. Esta localização é significante, porque um rearranjo produtivo dos segmentos de genes da cadeia α elimina Cδ, de modo que, uma determinada célula T, o receptor αβ não pode ser co-expresso com o receptor γδ.

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A organização da familia de multigenes de TCR em humanos é geralmente semehlante à do ratinho, apesar do numero de segmentos diferir: Gene

Localização cromossómica

Em Humano Cadeia α Cadeia δ Cadeia β Cadeia γ Em Ratinho Cadeia α Cadeia δ Cadeia β Cadeia γ

Numero de segmentos de genes V D J C

14 14 7 7

50 3 57 14

14 14 6 13

100 10 20-30 7

3 2

70 3 13 5

1 1 2 2

2 2

50 2 12 3

1 1 2 3

A cadeia α, como a cadeia L das imunoglobulinas, é codificada por segementos de genes V, J e C e a cadeia β, como a cadeia H das imunoglobulinas, é codificada por segmentos de genes V, D, J e C. O rearranjo dos segmentos de genes das cadeias α e β do TCR resulta em junção VJ da cadeia α e junção VDJ da cadeia β: 



Depois da transcrição de genes TCR rearranjados, processamento de RNA e tradução, as cadeias α e β são expressas com um heterodimero ligado por pontes dissulfito na membrana da célula T; Ao contrário das imunoglobulinas, que podem ser membranares ou secretadas, o hetrodimero αβ é expresso apenas na forma membranar. Assim, não é necessário nenhum processamento diferencial de RNA para produzir formas membranar e secretada.

Cada região constante do TCR inclui:   

Uma sequência de conexão; Uma sequencia transmembranar; Uma sequência citoplasmática.

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O DNA da linha germinativa que codifica as cadeias α e β do TCR é muito mais simples que o DNA da linha germinativa que codifica a cadeia pesada das imunoglobulinas, que contem multiplos segemtnos de gene C que codificam distintos isotipos com diferentes funções efectoras:  

O DNA da cadeia α tem apenas um segmento de gene C; O DNA da cadeia β tem dois segmentos de gene C, mas os seus produtos proteicos diferem apenas em alguns aminoáicdos e não apresentam diferenças funcionais conhecidas.

Mecanismo de Rearranjo do DNA do TCR Os mecanismos pelos quais o DNA da linha germinativa para o TCR é rearranjado para formar genes do receptor funcionais parecem ser semelhantes aos mecanismos de rearranjo dos genes Ig: 



RSSs conservados, contendo tanto sequências de espaço 12-pb (one-turn) ou 23-pb (two-turn) foram identificadas na vizinhança de cada segmento de genes V, D e J no DNA da linha germinativa para o TCR; Todos os rearranjos de genes TCR seguem a lei one-turn/two.turn observada para os genes Ig, portnato a recombinação ocorre apenas entre dois tipos diferentes de RSSs.

Como as células pré-B, as células pré-T expressam genes activantes da recombinação (RAG-1 e RAG-2). A enzima recombinase RAG-1/2 reconhece os sinais de reconhecimento das RSSs e catalizam a junção V-J e V-D-J durante o rearranjo de genes do TCR pelos mesmo mecanismos deleccional ou inversional que ocorrem para os genes Ig:   

RAG-1/2 introduz um corte numa cadeia de DNA entre as sequências codificante e sinal; A recombinase depois cataliza a reacção de transfecção que resulta na formação de um hairpin na sequência codificante; Produtos de excisão circular são gerados por delecção durante o rearranjo dos genes de TCR.

Apesar das células B e T usarem mecanismos bastante semelhantes para o rearranjo de genes das regiões variáveis, os genes Ig não são normalmente rearranjados nas células T e os genes TCR não são rearranjados nas células B. Provavelmente, o sistema de enzimas recombinase é regulado em cada linhagem celular, de modo que apenas rearranjos de DNA do receptor correcto é que ocorrem. Rearranjo de segmentos de genes nas células B e T cria uma sequência de DNA unica para essa célula e Joana Maria Soares Pereira

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a sua progenia. O grande numero de configurações possiveis para os genes rearranjados faz com que esta sequência nova funcione como marcador que é especifico para o clone da célula. Exclusão Alélica dos Genes TCR Os genes δ estão localizados no complexo de genes α e são eliminados por rearranjos da cadeia α. Este evento fornece um modo irrevogável de exclusão dos genes δ localizados no mesmo cromossoma enquanto os genes α rearranjam. A exclusão alélica de genes para as cadeias α e β ocorre também, mas existem excepções: 

A organização dos segmentos de genes para cadeia β em dois grupos significa que, se rearranjos não produtivos ocorrerm, o timócito pode sofrer um segundo rearranjo. Isto aumenta a probabilidade de um rearranjo produtivo para a cadeia β. Assim que um rearranjo produtivo ocorrer para um alelo de cadeia β, o rearranjo do outro alelo é inibido.

Excepções à exclusão alélica são mais observadas para os genes de cadeias α do TCR:  



Análise a clones de células T que expressam TCRs αβ funcionais revelaram um numero de clones com rearranjos produtivos de dois alelos da cadeia α; Quando um linfoma de células T imaturo que expressa um TCR αβ particular é subclonado, vários subclones obtidos expressam o mesmo alelo de cadeia α mas um alelo de cadeia α diferente do expresso pela célula parental original; Estudos com ratinhos trangénicos indicam que a exclusão alélica é menos rigorosa para os genes de cadeia α do que para cadeia β.

Visto que a exclusão alélica não é completa para a cadeia α do TCR, existem ocasiões raras quando mais de uma cadeia α é expressa na membrana de uma determinada célula T, mas apenas uma levará a um receptor restrito a MHC próprio e, assim, funcional. Estrutura Geral dos Genes TCR Rearranjados A estrutura geral dos genes TCR rearranjados é a seguinte:



As regiões variáveis dos TCRs são codificadas por sequências VDJ e VJ rearranjadas. Nos genes TCR, a junção combinat´roia de segmentos de genes V parece gerar a CDR1 e a CDR2, enquanto a flexibilidade juncional e a adição de nucleótidos N gera a CDR3;

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

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Os genes TCR rearranjados também contêm um pequeno exão sinal (L) a montante das sequências VJ ou VDJ. Os aminoácidos codificados por este exão são clivados quando a cadeia polipeptidica nascente entra no reticulo endoplasmático; A região constante de cada cadeia TCR é codificada por um segmento de gene C que apresenta multiplos exões correspondendo aos dominios estruturais na proteina. O primeiro exão do segmento de gene C codifica a maior parte do dominio C da cadeia correspondente e a seguir encontra-se um pequeno exão que codifica a sequência de conexão, seguida de exões que codificam a região transmembranar e a cauda citoplasmática.

Diversidade de TCRs Apesar do DNA da linha germinativa para o TCR conter menos segmentos de genes V que o DNA da linha germinativa para as Ig, vários mecanismos que operam durante o rearranjo de genes de TCR contribuem para um alto grau de diversidade entre os TCRs:    

Junção combinatória de segmentos de genes de região variável; Junção alternativa de segmentos de genes de cadeia δ; Flexibilidade juncional; Adição P e adição N.

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O mecanismo pelo qual a diversidade para o TCR é gerada deve permitir que o receptor reconheça um grande numero de antigénios processados diferentes enquanto restringe o seu reportório de reconhecimento de MHC a um numero muito pequeno de moléculas de MHC do próprio: 



O DNA do TCR tem muito menos segmentos de gene V do que o DNA das Ig. Assim, foi postulado que o pequeno numero de segmentos de genes no DNA do TCR foi seleccionado para codificar um numero limitado de regiões CDR1 e CDR2 com afinidade para regiões das hélices α de moléculas MHC; Apesar desta ser uma ideia atractiva, o complexo TCR-péptido-MHC faz contacto através das CDR1 e CDR3. Portanto, os residuos do TCR que ligam o péptido versus os que ligam o MHC não são confinados apenas à região CDR3.

Em contraste com a limitada diversidade dos CDR1 e CDR2, a CDR3 do TCR tem ainda maior diversidade do que aquela observada nas imunoglobulinas. A diversidade na CDR3 é gerada por diversidade juncional na ligação dos segmentos V, D e J, na ligação de multiplos segmentos de genes D e na introdução de nucleótidos P e N nas junções V-D-J e V-J. Ao contrário dos genes Ig, os genes TCR não aparecem sofrer mutação somática extensiva. Isto é, os genes TCR funcionais gerados por rearranjos durante a maturação das células T no timo têm as mesmas sequências que aquelas encontradas na população de células T maduras periférica. A ausência de mutação somática nas células T assegura que a especificidade das células T não altera depois da selecção timica e, assim, reduz, a possibilidade de mutação aleatória que poderia gerar autoreactividade. No entanto, por vezes pode ser observada mutação somética. A junção combinatorial de segmentos de genes da região variável gera um grande numero de combinações de segmentos de genes aleatórios para todas as cadeias TCR, como ocorre para os genes de cadeia pesada e leve das Ig: 



Apesar de existirem menos segmentos de genes Vα e Vβ do que os segmentos de genes VH e VL das imunoglobulinas, esta diferença é compensada pelo grande numero de segmentos J no DNA da linha germinativa para o TCR; Assumindo que a especificidade de ligação ao antigénio de um determinado TCR depende da região variável de ambas as cadeias, associação aleatória dos segmentos Vα e Vβ leva a cerca de 106 combinações possiveis para o receptor αβ.

A localização das RSSs one-turn (12 pb) e two-turn (23 pb) no DNA das cadeias δ e β do TCR difere da localização no DNA das Ig. Devido a este arranjo, pode ocorrer junção alternativade segmentos de gene D enquanto a regra one-turn/two-turn é observada. Assim, é possivel que um segmento Vβ se combine directamente com um segmento Jβ ou Dβ, gerando uma unidade (VJ)β ou (VDJ)β. A junção alternativa de segmentos de genes de cadeia δ gera unidades semelhantes e, em adição, um Dδ pode combinar-se com outro originando (VDDJ)δ e, em humanos, (VDDDJ)δ. Este mecanismo, que não pode operar um DNA de cadeia pesada de Ig, gera diversidade adicional considerável nos genes TCR. A junção de segmentos de genes durante o rearranjo de genes TCR exibe flexibilidade juncional. Tal como nos genes Ig, a flexibilidade é capaz de gerar vários rearranjos não produtivos, mas também aumenta a diversidade codificando vários aminoácidos alternativos em cada junção.

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Para além disso, tanto nos genes Ig e TCR, nucleótidos podem ser adicionados nas junções entre alguns segmentos de genes durante os rearranjos:  

Variações na clivagem por endonucleases leva à adição de mais nucleótidos que são palindrómicos. Esta adição P pode ocorrer nos genes que codificam as cadeias TCR e Ig: A adição N, catalizada pela TdT, gera diversidade juncional adicional. Enquanto nos genes Ig ocorre apenas nos genes de cadeia pesada, esta adição ocorre em genes codificantes de todas as cadeias TCR, sendo adicionados cerca de 6 nucleótidos de um modo aleatório.

No entanto, algumas destas combinações levam a rearranjos não produtivos por inserção de codões stop que terminam prematuramente a cadeia TCR, ou por substituição de aminoácidos que tornam o produto não funcional. Apesar de cada região juncional no gene TCR codificar apenas 10-20 aminoácidos, uma grande diversidade pode ser gerada nestas regiões (estima-se que os efeitos combinados da adição N e da adição P podem gerar cerca de 1013 sequências de aminoácidos possiveis).

VISÃO GERAL DO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS

Visão Geral do Desenvolvimento dos Linfócitos A maturação dos linfócitos T e B envolve uma série de eventos que ocorrem nos órgãos linfáticos generativos (centrais):

  

A entrada (commitment) das células progenitoras na linhagem das células B e T; Um processo temporalmente ordenado de rearranjo de genes de receptores de antigénios e expressão de proteinas receptoras de antigénios; Eventos de selecção que preservam as células que produziram proteinas receptoras de antigénios correctas e eliminam células potencialmente perigosas que reconhecem fortemente antigénios do próprio. Estes checkpoints asseguram que apenas linfócitos que expressam receptores funcionais com especificidades uteis se maturam e entram no sistema imune periférico;

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 

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Proliferação de células progenitoras e imaturas mantidas num estádio precoce de desenvolvimento, fornecendo uma grande pool de células que podem gerar linfócitos uteis; Diferenciação de células B e T em subpopulações funcionalmente e fenotipicamente distinctas. As células B desenvolvem-se em células B foliculares, da zona marginal e B-1, e as células T desenvolvem-se em linfócitos T CD4+ helper e CD8+ citotóxicos e em células T γδ. Esta diferenciação em classes distinctas fornece uma especialização que é caracteristica do sistema imune adaptativo.

Após a geração de um diverso reportório linfóide nos órgãos linfáticos centrais, linfócitos naive adquirem a habilidade de re-circular e subsequentemente moverem-se de um orgão linfático secundário para outro na procura de um antigénio.

Entrada das Células Progenitoras na Linhagem das Células B e T Células estaminais pluripotentes na medula óssea (e fígado fetal), geralmente referidas como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), dão origem a todas as linhagens de células sanguineas, incluindo células da linhagem linfóide. As HSCs maturam-se em progenitores linfóides comuns (CLPs) que são capazes de dar origem a:    

Células B; Células T; Células naturalmente assassinas; Algumas células dendriticas.

A maturação das células B a partir de progenitores que entram na sua linhagem ocorre maioritariamente na medula óssea e, antes do nascimento, no fígado fetal: 



As células estaminais que derivam do figado fetal dão origem principalmente a um tipo de celula B designadas células B B-1; As células estaminais derivadas da medula óssea dão origem à maior parte das células B circulantes (células B foliculares).

Precursores dos linfócitos T deixam o figado fetal antes do nascimento e a medula óssea mais tarde na vida, e circulam para o timo, onde completam a sua maturação:  

A maior parte das células T γδ têm origem nas HSCs do figado fetal; A maior parte das células T, que são células T αβ, têm origem nas HSCs da medula óssea.

Em geral, menos diversidade de células B e T é gerada nos estádios iniciais da vida fetal. E apesar das suas diferentes localizações anatómicas, os primeiros eventos de maturação das células T e B são fundamentalmente semelhantes. A entrada na linhagem das células B ou das células T depende de instruções recebidas na superficie da célula, seguidas de indução de reguladores transcripcionais especificos que levam a que uma CLP assuma especificamente um destino B ou T. O desenvolvimento inicial das células B e T é caracterizado pela proliferação dos progenitores, estimulada pricipalmente pela citocina interleucina-7 (IL-7), resultando em aumentos marcados no numero de células: Joana Maria Soares Pereira

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

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A proliferação assegura que uma pool suficientemente grande de células progenitoras será gerada para eventualmente fornecer um reportório altamente diverso de linfócitos especificos para antigénios; A IL-7 é produzida pelas células estaminais na medula óssea e no timo e é essencial para a maturação das células T e B nos estádios iniciais de vida pois ratinhos com mutações no gene da IL-7 ou do receptor desta demonstram deficiências profundas em células T e B maduras e baixa maturação de precursores de linfócitos nos estádios inicias de desenvolvimento, no entanto, as células B humanas não requerem IL-7 para proliferar.

A actividade proliferativa no inicio do desenvolvimento dos linfócitos, levada a cabo principalmente pela IL-7, cessa antes do rearranjo de genes dos receptores estar completo. Sendo assim, a sobrevivência e a proliferação subsequentes dos linfócitos maduros dependem de sinais dos receptores das células pre-B e pre-T. De facto, a maior expansão das linhagens das células B e T ocorre como uma consequência da sinalização do pré-receptor de antigénios. Este é um checkpoint importante no desenvolvimento, pois apenas as células que expressam receptores funcionais podem seguir para a seguinte etapa.

Rearranjo e Expressão de Genes de Receptores de Antigénios Os produtos dos genes de receptores de antigénios fornecem também sinais que asseguram a sobrevivência selectiva de linfócitos com especificidades uteis. Cada clone do linfócitos T ou B produz um receptor de antigénio com uma estrutura de ligação ao antigénio unica e num individuo existem 107 ou mais clones de células T e B diferentes, cada com um unico receptor. A habilidade de cada individuo gerar estes reportórios de linfócitos diversos evoluiu de um modo que não requer um numero igualmente grande de genes de receptores de antigénios distintos. Caso contrário, uma grande proporção do genome mamifero (1/3) seria usado para codificar as moléculas de Ig e TCR. Assim: 1. Genes de receptores de antigénios funcionais são produzidos nas células B imaturas na medula ossea e nas células T imaturas no timo por um processo de rearranjo de genes, que é designado para gerar um grande numero de exões codificantes de regiões variáveis usando uma fracção relativamente pequena do genoma. Os eventos de rearranjo de DNA que levam à produção de receptores de antigénios não dependem da, ou não são influenciados pela, presença de antigénios. Ou seja, os receptores de antigénios são expressos antes dos encontros com antigénios.

Eventos de Selecção Pré-receptores de antigénios e receptores de antigénios fornecem sinais aos linfócitos em desenvolvimento que são necessários para a sobrevivência dessas células e sua proliferação e maturação continuada. O processo geral de maturação dos linfócitos pode ser resumido do seguinte modo: 1. O rearranjo de genes para Ig e TCR envolve a adição e remoção aleatória de bases entre segmentos de genes combinados entre si de modo a maximizar a diversidade; 2. Apenas um em três das células B e T em desenvolvimento que rearranja um gene de receptor de antigénio faz um rearranjo produtivo e, assim, é capaz de gerar uma proteina funcional. Nas células B em desenvolvimento, o primeiro gene de receptor de antigénio a ser completamente rearranjado é a cadeia pesada das Ig. Nas células T αβ, a cadeia β do TCR é rearranjada primeiro; Joana Maria Soares Pereira

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3. Células que rearranjam com sucesso os seus genes de cadeia pesada das Ig expressam a proteina de cadeia pesada e montam um pré-receptor de antigénio conhecido como o receptor da célula pré-B. De modo análogo, o mesmo ocorre para a cadeia β do TCR, formando-se um pré-TCR; 4. Depois deste checkpoint, os linfócitos desenvolvem-se nos orgãos linfáticos centrais e expressam o receptor de antigénio completo enquanto ainda estão imaturos, sofrendo depois eventos de selecção.

Na ausência de expressão do pré-receptor de antigénio, as células que fazem rearranjos não produtivos dos loci Igμ pesada ou TCRβ sofrem morte celular programada. Parece que a montagem dos complexo pré-BCR e pré-TCR, na ausência de qualquer ligando conhecido, fornece sinais para a sobrevivência, proloferação, exclusão alélica e desenvolvimento segunite das linhagens de células B e T. Quando os linfócitos se desenvolvem nos orgãos linfóides centrais e expressam o receptor de antigénios completo, ainda num estado imaturo, as células potencialmente perigosas que reconhecem avidamente estruturas do próprio serão eliminadas ou induzidas a alterar os seus receptores de antigénios e as células que expressam receptores de antigénios uteis serão preservados. Isto dá-se por eventos de selecção: 

Selecção positiva – processo envolvido na preservação de especificidades uteis. Na linhagem T, a selecção positiva assegura a maturação de células T cujos receptores se ligam com baixa avidez (fracamente) a moléculas MHC. As células T madura cujos precursores foram positivamente seleccionados por moléculas MHC do próprio no timo são capazes de reconhecer péptidos antigénicos estranhos apresentados pelas mesmas moléculas MHC do próprio nas células apresentadoras nos tecidos periféricos. A selecção positiva fornece sinais de

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sobrevivência aos linfócitos T e B que arranjaram apropriadamente os seus receptores de antigénios; 

Selecção negativa – processo que elimina ou altera os linfócitos em desenvolvimento cujos receptores de antigénios se ligam fortemente a antigénios do próprio presentes nos órgãos linfáticos generativos. A selecção negativa dos linfócitos em desenvolvimento é um mecanismo importante para a manutenção da tolerância a vários antigénios do próprio, o que é designado de tolerância central.

Tanto as células B ou T em desenvolvimento são susceptiveis a sofrer selecção negativa durante um curto periodo de tempo após os receptores de antigénios serem pela primeira vez expressos: 



As células T em desenvolvimento com alta afinidade para antigénios do próprio são eliminadas por apoptose, um processo conhecido como delecção clonal; Células B imaturas fortemente auto-reactivas serão induzidas a sofrer mais rearranjos de genes Ig e, assim, evitar a auto-reactividade, um processo designado de editing do receptor.

Geração de Subgrupos de Linfócitos O processo de selecção positiva fornece sinais que asseguram que os subgrupos de linfócitos T CD4+ e CD8+ são adequados para a classe de moléculas MHC apropriada que elas irão reconhecer:  



Precursores que expressam tanto CD4 e CD8 diferenciam-se tanto em células T CD4+ restritas a MHC classe II ou CD8+ restritas a MHC classe I; As células CD4+ que deixam o timo podem ser activadas por antigénios para se diferenciarem em células TH cujas funções efectoras são mediadas por proteinas membranares especificas e pela produção de citocinas; as células CD8+ podem diferenciar-se em linfócitos TC cuja prinipal função efectora é matar células alvo infectadas.

Um processo semelhante durante a selecção positiva das células B dirige o desenvolvimento destas células em dois subgrupos de linfócitos B periféricos distintos. Células B em desenvolvimento derivadas da medula óssea diferenciam-se:  

Células B foliculares que recirculam e medeiam respostas imunes dependentes de células T nos órgãos linfáticos secundários; Células B da zona marginal que residem na vezinhança dos seios marginais no baço e medeiam respostas amplamente independentes de células T a antigénios sanguineos.

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MATURAÇÃO, DIFERENCIAÇÃO E ACTIVAÇÃO DAS CÉLULAS B

Maturação dos Linfócitos B Os principais eventos durante a maturação dos linfócitos B são:  



Rearranjo e expressão de genes Ig numa ordem precisa; Selecção e proliferação das células B em desenvolvimento no checkpoint do pré-receptor de antigénios; Selecção do reportório de células B maduras.

Os linfócitos B, antes do nascimento, desenvolvem-se a partir de precursores no figado fetal, saco vitelino e baço e, depois do nascimento, são gerados maioritariamente na medula óssea. A maioria dos linfócitos B têm origem em progenitores na medula óssea adultos que são inicialmente Ig negativos, se desenvolvem em células B imaturas que expressam moléculas IgM membranares e, depois, deixam a medula óssea para maturarem no baço, onde as células B da linhagem folicular expressam IgM e IgD na sua superficie. É no baço que as células imaturas adquirem a habilidade de recircularem e povoar todos os órgãos linfáticos periféricos. As células B foliculares recirculantes residem nos foliculos linfáticos e têm a habilidade de reconhecer antigénios estranhos e de responder a estes sendo que o desenvolvimento de uma célula B madura a partir de um progenitor linfóide dura cerca de 2 a 3 dias. Células Progenitoras na Medula Óssea O desenvolvimento das células B inicia-se enquanto as células estaminais se diferenciam nas primeiras células da linhagem das células B, as células B progenitoras (célula pró-B) que expressam uma tirosina fosfatase transmembranar designada CD45R. As células pró-B proliferam na medula óssea, preenchendo os espaços extravasculares entre grandes sinusoides no eixo do osso. A proliferação e diferenciação das células pró-B em células B precursoras (células pré-B) requer o micro-ambiente fornecido pelas células do estroma da medula óssea. As células do estroma têm dois papeis importantes:  

Interagem directamente com células pró-B e pré-B; Secretam várias citocinas, notavelmente IL-7, que suportam o processo de desenvolvimento.

Na primeira etapa de desenvolvimento, as células pró-B requerem contacto directo com células do estroma na medula óssea. Esta interacção é mediada por várias moléculas de adesão celular, incluindo VLA-4 na células pró-B e o seu ligando, VCAM-1, na célula do estroma: 

Após o contacto inicial ser feito, um receptor na célula pró-B designado c-Kit interage com uma molécula na superficie da célula do estroma conhecida como factor stem-cell (SCF);

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

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Esta interacção activa a c-Kit, que é uma tirosina cinase, e a célula pró-B começa a dividir-se e a diferenciar-se em células pré-B e começa expressando um receptor para IL-7.

A IL-7 secretada pelas células do estroma dirige o processo de maturação, eventualmente induzindo a regulação de moléculas de adesão nas células pré-B, de modo que as células em proliferação são capazes de se desligar das células do estroma. Neste ponto, as células pré-B não requerem mais contacto directo com células do estroma mas continuam a requerer IL-7 para o crescimento e a maturação. Rearranjo de Genes Ig A maturação das células B depende do rearranjo do DNA para imunoglobulinas nas células estaminais linfóides:   

Primeiro ocorre na etapa das células pró-B rearranjo DH-JH dos genes de cadeia pesada; De seguida, ocorre um arranjo VH-DHJH; Se o primeiro arranjo não for produtivo, o arranjo VH-DH-JH continua no outro cromossoma.

Após a conclusão do rearranjo de cadeias pesada, a célula é classificada como uma célula pré-B e o desenvolvimento continuado de uma célula pré-B numa célula B imatura requer o rearranjo produtivo de genes de cadeia leve. Devido à exclusão alélica, apenas um isotipo de cadeia leve é expresso na membrana da célula B. A realização de um rearranjo de cadeia leve produtivo compremete a, agora, célula B imatura a uma especificidade antigénica particular determinada pela sequência VDJ da cadeia pesada e a sequência VJ da cadeia leve:  

As enzimas recombinase RAG-1 e RAG-2, que são necessárias para o rearranjo de genes de cadeia pesada e de cadeia leve, são expressas durante as etapas das células pró-B e pré-B; A enzima TdT, que cataliza a inserção de nucleótidos N nas junções codificantes D H-JH e VH-DHJH, está activa durante a etapa de células pró-B. como a expressão de TdT é desligada quando ocorre o rearranjo de cadeias leves, nucleótidos N não são normalmente encontrados nas junções codificantes VL-JL.

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A fase da medula óssea do desenvolvimento das células B culmina na produção de células B imaturas que expressam IgM membranar. Nesta etapa de desenvolvimento, a célula B não está completamente funcional e antigénios induzem morte ou anergia (falta de resposta) em vez de divisão e diferenciação. A maturação completa é sinalizada pela co-expressão de IgD e IgM na membrana. Esta progressão envolve uma alteração no processamento do RNA do transcrito primário de cadeia pesada que permite a produção de dois mRNAs, um que codifica a forma membranar da cadeia μ e outro que codifica a forma membranar da cadeia δ.

Apesar da IgD ser uma marcador superficial das céluls B naive maduras, a sua função ainda não é conhecida. Contudo, visto que ratinhos knockout para Igδ apresentam numeros normais de céluls B completamente funcionais, a IgD não é essencial nem para o desenvolvimento das células B nem para a resposta a antigénios. Receptor da Célula Pré-B Na célula pré-B, a cadeia μ membranar encontra-se associada com um cadeia leve substituta (surrogate light chain), um complexo constituido por duas proteinas, que se associam para formar uma estrutura semelhante a uma cadeia leve: Joana Maria Soares Pereira

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 

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Uma sequência V-like desiganada Vpré-B; Uma sequência C-like designada λ5.

O complexo membranar da cadeia pesada μ com a cadeia leve substituta surge na célula pré-B associado com o heterodimero Igα/Igβ para formar o receptor da célula pré-B e apenas células pré-B que são capazes de expressar cadeias pesadas μ membranares em associação com cadeias leves substitutas são capazes de proceder na via de maturação. Existe também a especulação de que o receptor das células pré-B reconhecem ligandos ainda não identificados nas membrana das células do estroma, transmitindo um sinal à células pré-B que previne o rearranjo VH-DHJH do outro alelo da cadeia pesada, levando assim a exclusão alélica.

Após o establecimento de um receptor da célula pré-B efectivo, cada célula pré-B sofre multiplas divisões celulares, produzindo 32 a 64 descendentes. Cada uma das células produzidas deve assim rearranjar diferentes segmentos de genes de cadeia leve, aumentando assim a diversidade geral de reportório de anticorpos. O papel critico do receptor da célula pré-B foi demosntrado com ratinhos knockout nos quais o gene que codifica a proteina λ5 do receptor foi inactivado. O desenvolvimento das células B nesses ratinhos ficou bloqueada na etapa pré-B, o que sugere que: 

Um sinal gerado atraves do receptor é necessário para que as células pré-B procedam para a etapa das células B imaturas.

Factores de Transcrição e Defeitos no Desenvolvimento das Células B Vários factores de transcrição diferentes actuam no desenvolvimento das células hematopoiéticas e cerca de uma duzia deles parecem ter papeis no desenvolvimentos das células B, sendo que quatro são particularmente importantes:    

E2A; Early B-cell factor (EBF); B-cell specific antivator protein (BSAP); Sox-4.

Ratinhos que não apresentam E2A não expressam RAG-1, são incapazes de fazer rearranjo DHJH e falham na expressão de λ5, um componente critico da cadeia leve sustituta, sendo um padrão semelhante também obeservado para ratinhos deficientes em EBF. Assim: Joana Maria Soares Pereira

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

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E2A e EBF apresentam papeis importantes no desenvolvimento inical das células B e podem também apresentam papeis importantes nas etapas inicias de entrada na linhagem cas células B.

A supressão do gene Pax-5, cujo produto é o factor de transcrição BSAP, também resulta na retenção do desenvolvimento das células B numa etapa inical: 

 

Locais de ligação de BSAP são encontrados nas regiões promotoras de vários genes especificos das células B, incluindo Vpre-B e λ5, num numero de regiões de switch de Ig e no enhancer da cadeia pesada de Ig; BSAP tem um papel importante nas etapas iniciais do desenvolvimento das células B; É também expresso no sistema nervoso central e a sua ausência resulta em defeitos severos no desenvolvimento cerebral.

No entanto, apesar de não se conhecer o local exacto de acção de Sox-4, este afecta as etapas iniciais da activação das células B. E também é preciso ter em conta que, apesar de todos estes factores de transcrição afectarem o desenvolvimento em etapas inicias, alguns deles estão activos em etapas mais tardias. Falhas semelhantes no desenvolvimento dos linfócitos são também observadas quando existe uma mutação no gene que codifica a subunidade catalitica da proteina cinase dependente do DNA (DNAPKCS), designada mutação da imunodeficiência severa combinada (SCID). 



Enquanto a actividade recombinase da SCID é capaz de marcar sequências de reconhecimento consensus (sinais) nas extremidades dos elementos codificantes V, D e J e induzir quebras de cadeia dupla nas fronteiras sinais/codificantes, ela não é capaz de mediar a formação de junções codificantes a uma frequência significante; Esta incapacidade reflecte um defeito geral no reparo de quebras de DNA de cadeia dupla e a morte dos linfócitos por incapacidade de reparar quebras cromossómicas resultantes da tentativa de recombinação.

E o mesmo se observa também em casos de mutação de proteinas envolvidas na via de sinalização do receptor da célula pró-B, como BLNK, e do receptor da célula pré-B, como Btk, o que impede a passagem destas células à etapa seguinte e provoca uma imunodeficiência

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Marcadores de Superficie A progressão a partir da célula progenitora até à célula B madura é tipificada por um padrão alterado de marcadores de superficie:



   

CD45R - na etapa pró-B, as células não apresentam as cadeias leves ou pesadas dos anticorpos mas expressam esta forma de proteina tirosina fosfatase encontrada nos leucócitos, e durante todas as outras etapas; Igα/Igβ – expressas na etapa pró-B e também encontradas em associação com as formas membranares dos anticorpos em etapas mais tardias do desenvolvimento das células B; CD19, CD43 e CD24 – parte do co-receptor da célula B, leucossialina e uma molécula conhecida como heatstable antigen (HSA), respectivamente. Expressas nas células pró-B também; C-Kit – expressa apenas na superficie das células pró-B e é um receptor para o ligando promotor do crescimento presente nas células do estroma; CD25 – expressa nas células pré-B em substituição de CD43 e constitui o receptor para IL-2.

Enquanto as células progridem da etapa pró-B para a pré-B, expressam muitos dos marcadores que estava presentes durante a etapa pró-B. Contudo, deixam de expressar c-Kit e CD43 e começam a expressar CD25. A apresentação do receptor da célula pré-B (pré-BCR) é uma caracteristica saliente da etapa pré-B. Depois do rearranjo da cadeia leve, imunoglobulinas membranares que contêm tanto as cadeias leves como pesadas surgem, e as células, agora classificadas como células B imaturas, perdem o pré-BCR e não expressam mais CD25. Existem anticorpos monoclonais que são capazes de reconhecer todos estes marcadores antigénicos, tornado possivel reconhecer e isolar as várias etapas do desenvolvimento das células B pelas técnicas de imunohistoquimica e citometria de fluxo. Subgrupos de Células B Subgrupos de células B distintos desenvolvem-se a partir de diferentes progenitores:  

Células B B-1 – têm origem em células HSCs derivadas do figado fetal; Células B B-2 – têm origem em células HSCs derivadas da medula óssea.

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Notch2

As células B B-1 diferem da maior parte dos linfócitos e desenvolvem-se de um modo unico:   



  

Expressam a molécula CD5 (Ly-1); No adulto, grandes numeros destas células são encontrados como uma auto “repopulação” nas cavidades pleural e peritoneal; Desenvolvem-se mais cedo que as células B convencionais e expressam um reportório relativamente limitado de genes V e exibem muito menor diversidade juncional do que as células B convencionais (a TdT não é expressa no figado fetal); Secretam espontaneamente anticorpos IgM que normalmente reagem com polissacarideos e lipidos microbianos. Estes anticorpos são por vezes designados anticorpos naturais porque estão presentes em individuos sem imunização, apesar de ser possivel que a flora microbiana do tracto gastrointestinal seja a fonte de antigénios que estimula a sua produção; Fornecem uma fonte de produção rápida de anticorpos contra micróbios em locais particulares, como o perineurio; Na pleura, podem diferenciar-se em cerca de metade das células secretoras de IgA na lâmina própria; São análogas às células T γδ pois ambas possuem reportórios de receptores de antigénios limitados e estão ambas envolvidas na resposta a antigénios microbianos comummente encontrados nas primeiras etapas das respostas imunes.

As células B B-2 passam rapidamente através de duas etapas transicionais e podem desenvolver-se em dois grupos distintos de células: 

Células B da zona marginal – localizam-se primariamente nas vizinhanças dos seios marginais no baço e são de algum modo semelhantes às células B-1 pois apresentam diversidade limitada e são capazes de responder a antigénios polissacarideos e produzir anticorpos naturais. Expressam IgM e o marcador de superficie CD21. Respondem muito rapidamente a micróbios sanguineos e diferenciam-se em células plasmáticas secretoras de IgM de curta vida. Apesar de geralmente mediarem respostas imunes independentes de células T contra patogénios circulantes, estas células parecem também ser capazes de mediar algumas respostas imunes

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dependentes de células T. Surgem por diferenciação da célula B madura progenitora na presença de Notch2; 

Células B foliculares – constituem a maior parte das células B maduras e co-expressam cadeias pesadas μ e δ em associação com cadeias leves κ ou λ e, assim, produzem tanto IgM e IgD membranares. Ambas as classes de Ig utilizam o mesmo exão VDJ e associam-se com cadeias pesadas idênticas e, assim, exibem a mesma especificidade de antigénio. Deste modo, splicing alternativo permite que uma célula B produza simultaneamente mRNAs e proteinas maduras de dois isotipos diferentes de cadeia pesada. O mecanismo pelo qual uma célula começa a expressar ambos os isotipos ainda é desconhecido mas a co-expressam de IgM e IgD é alcançada pela aquisição de competência funcional e de habilidade para recircular, e esta é a razão pela qual células B foliculares são também designadas células B maduras.

A correlação entre a expressão de IgD e a aquisição de competência funcional sugere que a IgD é o receptor activador essencial das células B maduras. No entanto, não existe evidência para uma diferença funcional entre IgM e IgD membranares. As células B foliculares são na maior parte das vezes designadas células B recirculantes, visto que migram de um orgão linfático para o seguinte, residindo em nichos especializados conhecidos como

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foliculos de células B. Nestes nichos, estas células B são mantidas, em parte, por sinais transmitidos por um ligando trópico do familia de citocinas tumor necrosis factor (TNF) designado de BAFF ou BlyS.

Células B maduras, naive, respondem a antigénios e, a não ser que as células encontrem antigénios que reconhecem com alta afinidade e a que respondem, elas morrem em dias. Resumidamente, as principais caracteristicas dos diferentes subgrupos de células B são: Propriedade/Actividade Quando produzido pela primeira vez Regiões N nas junções VDJ Reportório da região V Localização primária Modo de renovação Produção de imunoglobulinas espontânea Isotipos secretados Resposta a carboidratos antigénicos Resposta a proteinas antigénicas Necessidade de ajuda das células T Hipermutação somática Desenvolvimento de memória

Células B-1

Células B-2 convencionais

Células B-2 da zona marginal

Feto

Após nascimento

Após nascimento

Algumas Restrito Cavidade corporais (peritoneal, pleural) Auto-renovação

Extensivas Diverso Órgãos linfáticos secundários Repostas na medula óssea

Sim Parcialmente restrito

Alta

Baixa

Baixa

IgM >> IgG

IgG > IgM

IgM > IgG

Sim

Talvez

Sim

Talves

Sim

Sim

Não

Sim

Por vezes

Baixa-nenhuma

Alta

?

Baixa-nenhuma

Sim

?

Baço Grande longevidade

Selecção do Reportório de Células B Maduras O reportório de células B maduras é positivamente seleccionado da pool de células B imaturas. A selecção positiva está bem definida nos linfócitos T e é responsável por preservar as células T CD4 + e Joana Maria Soares Pereira

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CD8+ restritas a MHC do próprio de uma pool de células T imaturas não seleccionadas. Não existe uma restrição comparável para o reconhecimento de antigénios pelas células B. No entanto, a selecção positiva parece ser um fenómeno gerado para identificar linfócitos que completaram o seu programa de rearranjo com sucesso e possivelmente facilitando a produção de subgrupos de células T ou B:  

Acredita-se que apenas células B que expressam moléculas Ig membranares funcionais recebem sinais de subrevivência constitutivos derivados do BCR; Antigénios do próprio parecem influenciar a força do sinal do BCR e, assim, a escolha subsequente da linhagem de células B periféricas durante a maturação de células B.

Células B imaturas de reconhecem antigénios do próprio com grande avidez podem ser induzidas a alterar as suas especificidades por um processo designado de editing do receptor: 





Neste processo, o reconhecimento de antigénios leva à reactivação de genes Rag, a eventos adicionais de recombinação V-J de cadeia leve, e à produção de novas cadeias Ig leves, permitindo que a célula expresse diferentes receptores de cálula B que não são auto-reactivos; Este processo ocorre normalmente em genes κ de cadeia leve, sendo que exões VJκ que codificam os dominios variáveis das cadeias leves auto-reactivas são eliminados e substiuidos por novos exões exões VJκ ou por rearranjos da cadeia leve λ; O novo exão exões VJκ deverá ser gerado pelo rearranjo de um gene V a montante do gene V original que produziu uma cadeia leve auto-reactiva com um segmento J a jusante do segmento J originalmente rearranjado.

Células B imaturas que expressam receptores de alta afinidade para antigénios próprios e que encontram esses antigénios na medula óssea devem morrer ou não maturar se não forem editados. A eliminação é geralmente designada selecção negativa e é parcialmente responsável pela manutenção da tolerância das células B a antigénios próprios que estão presentes na medula óssea: 



Os antigénios que medeiam a selecção negativa – normalmente antigénios próprios abundantes ou multivalentes (e.g., membranares) – fornecem sinais fortes a linfócitos B imaturos que expressam IgM que parecem ser especificos para esses antigénios próprios; O reconhecimento do antigénio pela a morte por apoptose das células B imaturas, quando o editing falha.

Assim que é feita a transição para a etapa das células B maduras+IgD+IgM, o reconhecimento de antigénios leva a proliferação e diferenciação, e não a apoptose oi editing do receptor. Como resultado, as células B maduras que reconhecem antigénios com grande afinidade nos tecidos linfóides periféricos são activadas e esse processo leva a respostas imunes humorais. Podemos ter quatro destinos diferentes para as células B imaturas na medula óssea dependendo da avidez e do tipo de ligando que ligam: 

Molécula própria multivalente – quando as células B imaturas expressam receptores que reconhecem ligandos multivalentes, como moléculas membranares próprias, elas são eliminadas de reportório (delecção clonal). Estas células B ou sofrem editing do receptor, de modo que a auto-reactividade do receptor é eliminada, ou sofrem morte celulars programada ou apoptose (selecção negativa);

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

Molécula própria soluvel – células B imaturas que se ligam a antigénios próprios soluveis capazes de fazer cross-link com o receptor da célula B são mantidos num estado de não resposta ao antigénio (anérgico) e carregam muito poucas IgM membranares. Estas células migram para a periferia onde expressam IgD mas se mantêm anérgicas. Se em competição com outras células B na periferia, elas são rapidamente perdidas;



Molécula própria que não permite cross-link e com baixa afinidade – células B imaturas que ligam estes ligandos não recebem qualquer sinal como resultado da sua interacção e maturam normalmente para expressar tanto IgM como IgD na superficie da célula. Tais células são potencialmente auto-reactivas e são clonalmente ignorantes já que o seu ligando está presente mas não é capaz de as activar;



Reacção não própria – células B imaturas que não encontram antigénio maturam normalmente, migram da medula óssea para os tecidos linfóides periféricos onde se tornam células B recirculantes maduras carregadoras de IgM e IgD na sua superficie.

Activação e Proliferação das Células B Após o exporte de células B da medula óssea, ocorre activação, proliferação e diferenciação na periferia na presença de antigénio. A activação e selecção clonal conduzida pelo antigénio de células B naive leva à produção de células B de memória e de plasmócitos e na ausência de activação induzida pelo antigénio, as células B naive na periferia apresentam uma curta longevidade, morrendo em poucas semanas por apoptose.

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Células B naive são células que não se dividem e que se encontram na etapa G 0 do ciclo celular. A activação dirige as células naive para o ciclo celular, progredindo através da fase G 1 para a S, na qual o DNA é replicado. A transição de G1 para S é um ponto de restrição critico no cicli celular. Assim que a célula alcança a etapa S, ela complete o ciclo, movendo-se através G2 para a mitose (M). Estes sinais e eventos podem ser agrupados em duas categorias: 



Sinais de competência – dirigem a célula B de G0 para G1, tornando a célula competente para recebr os sinais seguintes para o nivel seguinte de sinais; Sinais de prograssão – dirigem depois a célula de G1 para S e no final para a divisão celular e diferenciação.

A competência é alcançada, não por um mas, por dois eventos de sinalização distintos, que são designados sinal 1 e sinal 2. Esses eventos de sinalização são gerados por diferentes vias com antigénios dependentes do timo (dependentes de células TH – TD antigen) e não dependentes do timo (não dependentes de células TH – TI antigen), mas ambas as vias incluem sinais gerados quando antigénio multivalentes se ligam e fazem cross-link de mIg. Assim que a célula B adquiriu uma sinal de competência efectivo na activação inicial, a interacção de citocinas e possivelmente outros ligandos com o BCR fornece sinais de progressão. Tradução de Sinais de Activação Todos os isotipos de mIg apresentam caudas citoplasmáticas muito curtas, sendo que tanto mIgM e mIgD nas células B extendem para o citoplasma apenas três aminoácidos, mIgA extende 14 aminoácidos e mIgG e mIgE extendem 28 aminoácidos. Em cada caso, a cauda citoplasmática é muito curta para ser capaz de gerar um sinal em associação com moléculas de sinalização intracelulares, como tirosina cinases e proteinas G. Assim, as mIgs estão associadas com um heterodimero Igα/Igβ, formando o receptor das células B (complexo BCR). Assim, o BCR divide-se funcionalmente em:  

Molécula Ig de ligação ao ligando; Heterodimero Igα/Igβ de tradução de sinal.

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Uma divisão funcional semelhante marca oo pré-BCR, que traduz sinais via um complexo consitindo num heterodimero Igα/Igβ e cadeias pesadas μ combinados com cadeias substitutas de cadeia leve. A cadeia Igα apresenta uma cauda citoplasmática longa com cerca de 61 aminoácidos e a cadeia Igβ apresenta uma cauda com 48 aminoácidos. As caudas citoplasmáticas de ambas as cadeias contêm motivos ITAM, que são encontrados também em várias molécula do complexo TCR. interacções com as caudas citoplasmáticas de Igα/Igβ traduzem estimulos produzidos por cross-link de moléculas mIg em sinais intracelulares efectivos.

O cross-link de BCRs resulta na indução de várias vias de tradução de sinal e na activação da célula B. estas incluem: 

Compartimentação da função nas subunidades do receptor – a via começa com receptores de antigénios que são compostos por uma subuinidade de sinalização e outra de ligação ao antigénio. A subunidade de ligação ao antigénio confere especificidade mas apresenta caudas citoplasmáticas muito curtas para traduzir o sinal para o citoplasma da célula. A subuinidade sinalizadora apresenta caudas citoplasmáticas mais longas que são os tradutores de sinal no complexo receptor;



Activação de tirosina cinases associadas à membrana – a proteinas tirosina cinases associadas ao receptor (Lyn, Blk e Fyn) catalizam fosforilações durante as primeiras etapas da tradução de sinal que são essenciais para a formação de um complexo receptor de sinalização funcional;



Montagem de uma complexo de sinalização grande com actividade tirosina cinase – as tirosinas fosforiladas dos ITAMs no BCR fornecem locais de ancoragem para moléculas que se ligam a estes receptores;

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

Recrutamento de outras vias de tradução de sinal – sinais apartir do BCR resultam na produção de mensageiros secundários que activam várias vias de sinalização importantes, a via da PKC, a via do cálcio e a via das proteinas Ras-MAP cinase;



Alterações na expressão de genes – um dos resultados importantes dos processos de tradução de sinal é a geração ou translocação para o nucleo de factores de transcrição activos que estimulam ou inibem a transcrição de genes especificos.

Falhas na tradução de sinal podem levar a severas consequências para o sistema imunitário. Complexo Co-receptor da Célula B A estimulação através dos receptores de antigénios pode ser modificada siginificativamente por sinais através de co-receptores. Nas células B, um componente da membrana, desigando co-receptor da célula B fornece sinais estimulantes. O co-receptor da célula B é um complexo de três proteinas: 



CD19 – membro da superfamilia de imunoglobulinas, tem uma longa cauda citoplasmática e três dominios extracelulares; CR2 (CD21) – receptor de C3d, um produto da quebra do sistema complemento, que é um importante mecanismo efector para a destruição de invasores. O envolvimento da C3d na via de actividade do co-receptor revela diferentes braços do sistema imune a interagirem entre si. CR2 também funciona como um receptor para uma molécula membranar e para a proteina transmembranar TAPA-1 (CD81).

Em adição ao co-receptor estimulador, outra molécula, CD22, que é constitutivamente associada com o receptor de células B não activas, fornece sinais negativos que fazem com que seja mais dificil activar a célula B. O papel mediado pelo co-receptor é o seguinte: 1. O componente CR2 do complexo co-receptor liga-se a antigénios revestidos por complemento que foram capturados pelas mIg na célula B; 2. Isto liga o co-receptor ao BCR e permite que o componente CD19 do co-receptor interaja com o componente Igα/Igβ do BCR; 3. Fosforilação de CD19 permite que este se ligue a moléculas sinalizadoras; 4. Estas moléculas são então capazes de contribuir para o processo de activação e o complexo coreceptor serve para amplificar o sinal transmitido pelo BCR. Este fenómeno explica como células B naive, que normalmente expressam mIg com baixa afinidade para antigénios, são capazes de responder a muito baixas concentrações de antigénio numa resposta primária. Tais respostas, mesmo que inicialmente de baixa afinidade, desenpenham papeis significantes na geração de anticorpos de alta afinidade.

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No entanto, o componente CD19 do co-receptor da célula B é capaz de desempenhar um papel independente do CR2, o receptor do complemento. Papel das Células T H A activação das células B por proteinas antigénicas soluveis requer o envolvimento de células TH. A ligação do antigénio a mIg das células B não induz por si só um sinal de competência efectivo sem interacção adicional com moléculas membranares em células TH. Em adição, um progressão mediada por citocinas é requerida para a proliferação das células B.

Este processo dependente de células T (TD) é mais complexo do que a activação independente de células T (TI). Depois da ligação do antigénio por mIg nas células B, o antigénio é internalizado por endocitose mediada pelo receptor e processado na via endocitica em péptidos. A ligação do antigénio inicia também a sinalização através do BCR que induz a célula B a regular um numero de moléculas membranares, incluindo moléculas MHC classe II e ligando co-estimulador B7: 

Expressão aumentada de ambas estas proteinas membranares melhora a habilidade das células B funcionarem como células apresentadoras de antigénios na activação de células T H.

As células B ajudam assim o seus ajudantes porque os péptidos antigénicos produzidos nas vias de processamento antigénicas associam-se com moléculas MHC classe II e são apresentadas na membrana Joana Maria Soares Pereira

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das células B às células TH, induzindo a sua activação. Quando a concentração de antigénio é elevada, macrófagos e células dendriticas são APCs efectivas, mas, quando os niveis de antigénio caem, as células B tornam-se as principais apresentadoras de antigénio às células TH. Assim que a célula TH reconhece um péptido antigénico processado apresentado por uma molécula MHC classe II na membrana de uma célula B, as duas células interagem para forma um conjugado B-T:  

Nestes conjugados, as células TH apresentam o aparelho de Golgi e centros microtubulares rearranjados para a junção com a célula B; Este ajuste estrutural facilita a libertação de citocinas para a célula B especifica para o antigénio.

A formação do conjugado B-T não leva apenas a libertação direccionada de citocinas das células TH mas também à regulação de CD40L, uma proteina membranar das células TH que depois interage com CD40 nas células B para fornecer um sinal essencial para a activação de células B dependente de células T:  

CD40 – pertence à familia TNF de proteinas membranares e citocinas soluveis que regulam a porliferação celular e a morte celular por apoptose; CD40L – pertence à familia de receptores de TNF (TNFR).

Interacções de CD40L com CD40 nas células B fornece um sinal (sinal 2, ou secundário) à célula B que, em conjunto com o sinal gerado pela mIg (sinal 1, ou primário), dirige a célula B para G 1. Os sinais apartir de CD40 são traduzidos por um numero de vias de sinalização intracelulares resultando no fim na alteração da expressão de genes. Apesar das células B estimuladas por proteinas membranares a partir de células T H activadas serem capazes de proliferar, elas falham na diferenciação a não ser que citocinas estejam também presentes. Isto sugere que ambos os sinais de contacto e das citocinas são necessários para induzir a proliferação e diferenciação de células B.

Assim que é activada, a célula B começa a expressar receptores membranares para várias citocinas, como IL-2, IL-4, IL-5 e outras. Esses receptores ligam depois citocinas produzidas pela célula T H com quem interagem. Os sinais produzidos pela interacções citocina-receptor suportam a proliferação das células B e é capaz de induzir a diferenciação em plasmócitos e células B de memória, o class switching e a maturação da afinidade.

Resposta Humoral A cinetica e outras caracteristicas da resposta humoral diferem consideravelmente dependendo se a resposta humoral resulta de uma activação de células B naive (resposta primária) ou de células B de memória (resposta secundária). Em ambos os casos, a activação leva à produção de anticorpos secretados de vários isotipos, que diferem na sua habilidade de mediar funções efectoras especificas: Joana Maria Soares Pereira

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O primeiro contacto de um antigénio exógeno com um individuo gera uma resposta humoral primária, caracterizada pela produção de plasmócitos secretores de anticorpos e de células B de memória. A cinética desta resposta depende de:    

Natureza do antigénio; Via de administração do antigénio; Presença ou ausência de adjuvantes; Espécies ou estirpes a serem imunizadas.

Em todos os casos, contudo, uma resposta primária é caracterizada por:  

Uma fase lag, durante a qual células B naive sofrem selecção clonal, subsequente expansão clonal e diferenciação em células de memória ou plasmócitos; Um aumento logaritmico dos niveis séricos de anticorpos, a seguir à fase lag, que atinge um pico, estabiliza por algum tempo e depois cai.

A duração da fase lag varia com a natureza do antigénio: 



A imunização de ratinhos com um antigénio como eritrócitos de carneiro (SRBCs) tipicamente resulta numa fase lag de 3-4 dias. Oito ou nove divisões celulares sucessivas de células B activadas durante 4-5 dias geram depois plasmócitos e células de memória. O pico dos niveis de plasmócitos é alcançado aos dias 4-5 enquanto o pico de anticorpos séricos é alcançado por volta dos dias 7-10; Para antigénios soluveis, a fase lag é um pouco mais longa, normalmente durando cerca de uma semana. O pico nos niveis de plasmócitos é alcançado aos dias 9-10 e o pico de anticorpos séricos é alcançado ao dia 14.

Durante a resposta humoral primária, IgM é secretada inicialmente, normalmente seguida por um switch de modo a aumentar a proporção de IgG. Dependendo da persistência do antigénio, a resposta primária pode durar vários periodos, variando de alguns dia a várias semanas. As células de memória formadas durante a resposta primária param de se dividir e entram na fase G0 do ciclo celular. Estas células têm tempos de vida variáveis, com algumas persistindo durante toda a vida do individuo. A capacidade de desenvolver uma resposta humoral secundária depende da existência desta população de células B de memória tal como de células T de memória. A activaçãode células de memória resulta numa resposta de anticorpos secundária que pode ser distinguida da primária de vários modos: Joana Maria Soares Pereira

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 

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Tem um periodo lag inferior, antige maior magnitude, dura menos tempo; Caracterizada pela secreção de anticorpos com elevada afinidade para o antigénio, e isotipos diferentes de IgM predominam.

Propriedade Células B que respondem Periodo Lag aseguir à administração do antigénio Tempo do pico de resposta Magnitude do pico de resposta Isotipo produzido Antigénios Afinidade dos anticorpos

Resposta primária Células B naive

Resposta secundária Células B de memória

Geralmente 4-7 dias

Geralmente 1-3 dias

7-10 dias

3-5 dias Geralmente 100-1000 vezes superior que a resposta primária

Varia dependendo do antigénio IgM predomina primariamente na resposta Dependento do timo e independente do timo Inferior

IgG predomina Dependente do timo Superior

Um grande factor na resposta mais rápida e na maior magnitude das resposta secundárias é o facto de populações de células B de memória especificas para um determinado antigénio serem maiores que as populações correspondentes de céluls B naives e também o facto das células de memória serem mais faceis de activar do que as células B naive. O processo de afinidade da maturação e o class switching são responsáveis pela maior afinidade e diferentes isotipos ixibidos numa resposta secundária. Os maiores niveis de anticorpos acoplados com a maior afinidade geral fornece uma defesa do hospedeir eficiente contra a re-infecção. A alteração nos isotipos fornece anticorpos cujas funções efectoras são particularmente moldadas a um determinado anitgénio. A existência de células B de memória de grande longevidade conta para a existência de um fenómeno designado “original antigenic sin”, que foi inicialmente observado quando a resposta de anticorpos a vacinas da gripe foi monitorizada em adultos: 





A monitorização revelou que a imunização com uma vacina de uma estirpe da gripe elicitava uma resposta de anticorpos responsáveis para essa estirpe mas também elicitava, paradoxalmente, uma resposta de anticorpos de grande magnitude para outras estirpes de gripe às quais o individuo tinha sido exposto na infância. Parecia assim que a primeira exposição ao antigénio tivesse deixado uma impressão longa no sistema imunitário; Este fenómeno pode ser explicado pela presença de uma população de células de memória, elicitada pela estirpe de gripe encontrada na infância, que é activada por epitopos reactivos na vacina da estirpe encontrada mais tarde; Este processo gera uma resposta secundária, caracterizada por anticorpos com maior afinidade para a primeira estirpe viral.

Papel das Células T H na Resposta Humoral a Haptenos Quando animais são imunizados com pequenos compostos orgânicos (haptenos) conjugados com grandes proteinas (carregaoras), o conjugado induz uma resposta imune humoral consistindo em anticorpos tanto para os epitopos hapteno e para os epitopos inalterados da proteina carregadora. Vérios estudos demonstraram que a geração da resposta humoral requer o reconhecimento do antigénio tanto pelas células TH como pelas células B, cada uma reconhecendo diferentes epitopos no mesmo antigénio. Joana Maria Soares Pereira

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Isto é conhecido como o efeito hapteno e é caracterizado por: 



O hapteno tem de estar quimicamente acoplado a uma molécula carregadora maior para induzir uma resposta humoral ao hapteno. Se um animal for imunizado com o hapteno e o carregador em separado, muito poucos ou nenhuns anticorpos são gerados; De modo a gerar uma resposta humoral secundária a um hapteno, o animal tem ser imunizado de novo com o mesmo conjugado usado na primeira imunização. Se a segunda imunização for feita com o mesmo hapteno mas o conjugado for diferente não existe resposta secundária.

Vários estudos demonstraram que as células imunizadas contra o haptenos e as células imunizadas contra o carregador constituem populações distinctas. Estas experiências demosntraram que a resposta de células B condicionadas a haptenos a conjugados carregadores de haptenos requer a presença de células TH CD4+ condicionadas a carregador especificas para epitopos do carregador. As experiências com conjugados carregadores de haptenos revelaram que tanto as células T H como as B têm de ser capazes de reconhecer determinantes antigénicos na mesma molécula para que ocorra a activação das células B. Esta propriedade da interacção das células T com as B na resposta humoral é designada reconhecimento associativo.

Locais in vivo para a Indução da Resposta Humoral A activação e diferenciação das células B ocorre em locais anatomicos definidos cuja estrutura estabelece certas restrições aos tipos de interacções celulares que ocorrem. Quando um antigénio é introduzido no corpo torna-se concentrado em vários órgãos linfáticos periféricos:  

Antigénios sanguineos são filtrados pelo baço; Antigénios presentes nos espaços tecidulares drenados pelo sistema linfático são filtrados pelos nodos linfáticos regionais.

Um nodo linfático é um filtro extremamente eficiente capaz de reter mais de 90% de antigénios que passam atraves dele pelos vasos linfáticos aferentes. Antigénios ou complexos anticorpo-antigénio entram no nodo linfático tanto sozinhos como associados a células transportadoras de antigénios (e.g, células de Langerhans ou dendriticas) e a macrófagos e, enquanto este atravessa toda a arquitectura celular do nodo, encontrará um de três tipos de células apresentadoras de antigénios:   

Células dendriticas no paracortex; Macrófagos espalhados por todo o nodo; Células dendriticas foliculares nos foliculos e centros germinativos.

O desafio antigénico que leva a uma resposta imune humoral envolve uma série de eventos complexos, que ocorrem em microambientes distintos dentro do nodo linfático. Vias ligeiramente diferentes Joana Maria Soares Pereira

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operam durante uma resposta primária e secundária porque muito do tecido antigénico está complexado com anticorpos circulantes na resposta secundária. Assim, a indução da resposta humoral ocorre do seguinte modo:   

Assim que a activação das células B mediada por antigénios ocorre, pequenos focus de células B em proliferação formam-se nas extremidades da zona rica em células T; Estas células B diferenciam-se em plasmócitos secretando isotipos IgM e IgD; A maior parte dos anticorpos produzidos durante a resposta primária têm origem nos plasmócitos destes focus.

Uma sequência de eventos semelhante ocorre no baço, onde a activação de células B inicial ocorre na Tcell-rich periarterial lymphatic sheat, PALS. Alguns dias após a formação dos focus nos nodos linfáticos, algumas células B activadas, em conjunto com algumas células TH, podem migrar dos focus para foliculos primários. Estes foliculos desenvolvemse depois em foliculos secundários, que fornecem um microambiente especializado favorável a interacções entre células B, células TH activadas e células dendriticas foliculares. Após estas interacções, as células B activadas migram para o centro do foliculo secundário, formando um centro germinativo. É importante ter em atenção que, apesar de partilharem a morfologia altamente ramificada das células dendriticas derivadas da medula óssea, as células dendriticas foliculares:  

Não têm origem na medula óssea, não expressam moléculas MHC classe II e não apresentam antigénios a células T CD4+; Apresentam longas extensões, ao longo das quais se encontram receptores Fc e receptores do complemento. Estes receptores permitem que a célula dendritica folicular retenha e apresente complexos antigénio-anticorpo por longos periodos de tempo, mesmo meses, na superficie da célula.

Centros Germinativos e Diferenciação de Células B Induzida p or Antigénio Os centros germinativos surgem entre 7-10 dias após a exposição inicial a antigénios dependentes do timo e podemos distinguir duas zonas distintas: 

Zona escura (Dark zone) - Durante a primeira etapa da sua formação, as células B activadas sofrem proliferação intensa. As células B em proliferação, conhecidas como centroblastos, surgem nesta zona e distinguem-se pelo seu grande tamanho, citoplasma extenso, cromatina difusa e ausência de Ig membranares. Os centroblastos eventualmente dão origem a centrócitos, que são pequenas células B que não se dividem e expressam Ig membranares;



Zona clara (Light zone) – os centrócitos movem-se da zona escura para esta região, que contem células dendrtiticas foliculares, onde alguns centrócitos fazem contacto com antigénios apresentados como complexos antigénio-anticorpo na superficie de células dendrititicas foliculares.

Três eventos de diferenciação importantes ocorrem nos centros germinativos: 

Maturação da afinidade;

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 

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Class switching; Formação de plasmócitos e células B de memória.

Maturação da Afinidade Resumidamente, os eventos celulares nos centros germinativos processam-se do seguinte modo:



  

Células B estimuladas por antigénios migram para os centros germinativos, onde reduzem a expressão de Ig membranares e sofrem rápida divisão celular e mutação de genes de região V de imunoglobulinas rearranjados na zona escura; Subsequentemente, a divisão pára e as células B migram para a zona clara e aumenta a expressão de Ig membranar. Nesta etapa designam-se centrócitos; Na zona clara, os centrócitos devem interagir com células dendriticas foliculares e células T helper para sobreviverem; As células dendriticas foliculares ligam complexos antigénio-anticorpo ao longo das suas extensões e os centrócitos devem competir uns com os outros para ligar o antigénio. As células B que apresentam Ig membranares de alta afinidade são aquelas que competem com sucesso;

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 

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Aquelas células B que perdem nesta selecção mediada pelo antigénio morrem por apoptose; As células B que passam na selecção e recebem um segundo sinal de sobrevivência a partir das células T helper diferenciam-se em células B de memória ou plasmócitos secretores de anticorpos.

Assim, o principal objectivo dos centros germinativos é gerar células B de alta afinidade a partir de células B de baixa afinidade. Em geral, a maturação da afinidade e a formação de células B de memória requer os centros germinativos. Contudo, algum class switchig e a formação significante de plasmócitos ocorre também fora dos centros germinativos.

Papel da Hipermutação Somática Monitorizando os genes de anticropos durante uma resposta imune observa-se que ocorrem mutações extensivas nos genes Ig que respondem à infecção das células B no centros germinativos. A introdução de mutações pontuais, delecções e inserções nos genes de imunoglobulina rearranjados é um processo bastante direccionado:  

A maior parte destas mutações ocorre na região que se extende desde cerca de 0,5 kb a 5’ até 1,5 kb a 3’ dos segmentos V(D)J dos genes de imunoglobulina rearranjados; Apesar do processo de hipermutação inserir mutações por toda a região V, a selecção conduzida pelo antigénio resulta na eventual emergência de genes de imunoglobulinas nos quais a maior parte das mutações se encontram nas CDRs.

As taxas extremamentes elevadas (1 a cada 2 divisões) e a direcção precisa da hipermutação são caracteristicas extraordinárias unicas do sistema imunitário e a determinação deste mecanismo ainda se encontra desconhecido. Como a mutação somática ocorre aleatoriamente, gerará poucas células com receptores de alta afinidade e muitas células com receptores com afinidade igual ou mais baixa que os da célula mãe para um antigénio particular. Assim, é necessária selecção para derivar uma população de células que apresentam maior afinidade. O centro germinativo á o local de selecção:  

Células B que apresentam receptores de alta afinidade para o antigénio serão positivamente selecionadas e deixam o centro germinativo; Células B que apresentam receptores de baixa afinidade sofrem selecção negativa e morrem no centro germinativo.

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Papel da Selecção A hipermutação somática dos genes das regiões variáveis das cadeias pesada e leve ocorre quando os centroblastos proliferam na zona escura do centro germinativo. A selecção ocorre nas zona clara, na população de centrócitos que não se dividem. O factor mais importante na selecção é a habilidade de moléculas Ig membranares nos centrócitos reconhecerem e ligarem antigénios apresentados por células dendriticas foliculares: 

 

Como as superficies das células dendriticas foliculares estão ricamente cobertas por receptores Fc e do complemento, antigénios complexados com anticorpos ou antigénios ligados a fragmentos do complemento gerados durante a activação do complemento são capazes de se ligar às células dendriticas foliculares; Um centrócito cujas Ig membranares se liga e sofre crosslinking com antigénios ligados a células dendriticas foliculares recebem um sinal que é essencial para a sua sobrevivência; Aqueles que não recebem este final morrem.

Contudo, os centrócitos devem competir para as pequenas quantidades de antigénios apresentados nas células dendriticas. Como a quantidade de antigénio é limitada, os centrócitos com receptor de maior afinidade têm maior probabilidade de se ligar com sucesso do que aqueles com menor afinidade. Apesar da ligação do antigénio ser necessária para a sobrevivência do centrócito, não é suficiente. Um centrócito deve receber sinais gerados por interacção dom células T CD4+ helper para sobreviver. Centrócitos que não recebem estes dois sinais sofrem apoptose nos centros germinativos. De facto, uma das caracteristicas dos centros germinativos é a morte celular por apoptose que ai ocorre. Isto é claramente evidente pela presença de fragmentos de cromatina condensada, indicativa de apoptose, em macrófagos especificos que removem células por fagocitose nos tecidos linfáticos. Class Switching Os anticorpos têm duas actividade importantes:  

Ligação especifica a um antigénio, que é determinada pelos dominios VH e VL; Participação em várias funções biológicas efectoras, que é determinada pelo isotipo do dominio constante da cadeia pesada.

O class switching permite que qualquer dominio VH se associe com a região constante de qualquer isotipo. Isto permite que a especificidade do anticorpo continue constante enquanto as actividades biológicas efectoras da molécula variam. Um numero de citocinas afectam a decisão de qual class de Ig é escolhida quando uma célula B que carrega IgM sofre class switch. A resposta humoral a antigénios dependentes do timo é marcada por um class switching extensivo para isotipos diferentes de IgM, enquanto a resposta humoral a antigénios independentes do timo (independentes de células T) é dominada por IgM. No caso dos antigénios dependentes do timo, a interacção de células B com as células T helper é necessária, isto é, é necessária a maturação da afinidade feita pela selecção nos centros germinativos. Esta interacção é feita CD40 na célula B e CD40L na célula T helper e é essencial para a indução do class switch. A importância da interacção CD40/CD40L é ilustrada pelo sindroma X-linked hyper-IgM, uma imunodeficiência nas quais as células TH falham na expressão de CD40L. Os pacientes com esta doença produzem IgM mas não outros isotipos. Tais pacientes falham na geração de populações de células de Joana Maria Soares Pereira

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memória, falham na formação de cnetros germinativos, e os seus anticorpos não sofrem hipermutação somática.

Células de Memória e Plasmócitos Depois das células B serem seleccionadas nos centros germinativos para aquelas que carregam mIg de alta afinidade para antigénios apresentados pelas células dendriticas foliculares, algumas células B diferenciam-se em plasmócitos e outras tornam-se células de memória: Propriedade Marcadores membranares Imunoglobulinas Receptores do complemento Localização anatómica Longevidade Recirculação Afinidade do receptor Moléculas de adesão

Célula B naive

Célula B de memória

IgM, IgD Baixo Baço Curta Sim Afinidade média baixa Baixo ICAM-1

IgM, IgD(?), IgG, IgA, IgE Alto Medula óssea, nodo linfático, baço Pode ser longa Sim Afinidade média elevada devido à maturação da afinidade Alto ICAM-1



Plasmócitos – geralmente não apresentam imunoglobulinas membranares detectáveis e, em vez disso, sintetizam grandes niveis de anticorpos secretados (a taxas superiores a 1000 moléculas de anticorpo por célula por segundo). A diferenciação das células B em plasmócitos requer uma alteração no processamento de RNA de modo que a forma secretada da cadeia pesada é sintetizada em vez da membranar. Em adição, apresentam uma taxa de expressão de cadeia pesada muito mais elevada. A transcrição aumentada pelos plasmócitos pode ser explicada pela sintese de maiores niveis de factores de transcrição que se ligam aos enhancers das imunoglobulinas. Para alem disso, alguns memcanismos devem estar coordenados para aumentar a transcrição dos genes de cadeia pesada e de cadeia leve, mesmo estando estes genes em diferentes cromossomas;



Células B de memória – células B que sobrevivem à selecção na zona clara dos centros germinativos podem diferenciar-se neste tipo de células semelhantes a células B naive mas com

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propriedades diferentes. Por exemplo, à excepção das imunoglobulinas membranares, algumas moléculas membranares distinguem as células B naive das de memória. As células B naive expressam apenas IgM e IgD enquando as células B de memória, devido ao class switching, expressam isotopos adicionais, incluindo IgG, IgA e IgE.

MATURAÇÃO, DIFERENCIAÇÃO E ACTIVAÇÃO DAS CÉLULAS T

Maturação dos Linfócitos T A maturação dos linfócitos T a partir dos seus progenitores envolve:    

Rearranjo e expressão sequencial dos genes TCR; Proliferação celular; Selecção induzida pelo antigénio; Aquisição de capacidades funcionais.

Em vários aspectos, este mecanismo é semelhante à maturação das células B. Contudo, a maturação das células T apresenta algumas caracteristicas unicas que reflectem a especificidade dos linfócitos T para péptidos antigénicos associados a MHC próprio e a necessidade de um microambiente especializados para a selecção de células com esta especificidade. Papel do Timo na Maturação das Células T O timo é o principal local de maturação das células T. Esta funcção do timo é demonstrada por deficiências imunológicas associadas com a ausência de timo:

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 

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Se o timo é removido de ratinhos neo-natais, estes animais falham no desenvolvimento de células T maduras; A ausência congenital de timo, como ocorre no sindrome de DiGeorge em humanos ou em estirpes de ratinhos nus, é caracterizada por baixo numero de células T maduras em circulação e nos tecidos linfóides periféricos e deficiência severa na imunidade mediada por células T.

O timo regride com a idade e é virtualmente indectável em humanos após a puberdade, mas alguma maturação de células T continua através da vida adulta, como indicada pela reconctituição com sucesso do sistema imune em adultos que recebem transplantes de medula óssea. É possivel que o resto do timo regredido seja adequado para alguma maturação de células T. Como as células T de memória apresentam uma longa longevidade (talvez mais de 20 anos em humanos) e se acumulam com a idade, a necessidade de gerar novas células T diminui enquanto o individuo envelhece. Os linfócitos T têm origem em precursores que surgem no figado fetal e na medula óssea adulta e que se fixam no timo: 









Em ratinhos, os linfócitos imaturos são primeiro detectados no timo no dia 11º de uma gestação normal de 21 dias, o que corresponde a mais ou menos 7-8 semanas de gestação; Células T em desenvolvimento no timo são designadas timócitos e os timócitos mais imaturos não expressam TCR nem co-receptores CD4 ou CD8, são encontrados nos seios subcapsulares e na região cortical do timo; A partir daqui, os timócitos migram para e através do córtex, onde a maior parte dos eventos da maturação subsequente ocorrem; É no córtex que os timócitos primeiro expressam TCRs γδ e αβ, e as células T αβ se começam a maturar em células T CD4+ restritas a MHC classe II ou CD8+ restritas a MHC classe I; Enquanto estes timócitos entram nas etapas finais da maturação, eles migram para o córtex da medula e saem do timo através da circulação.

O ambiente timico fornece estimulos que são necessários para a proliferação e maturação dos timócitos. A maior parte destes estimulos têm origem em células timicas para além das células T em maturação. Estas incluem células epiteliais timicas e macrófagos e células dendriticas derivadas da medula óssea: 

 

No córtex, as células epiteliais formam uma rede de processos citoplasmáticos longos, à volta dos quais os timócitos devem passar para alcançar a medula. Também existem células epiteliais na medula; Células dendriticas derivadas da medula óssea estão presentes na fronteira corticomedular e na medula e macrófagos estão presentes principalmente na medula; A migração dos timócitos através deste arranjo anatómico permite interacções fisicas entre timócitos e estas outras células, que são necessárias para a maturação dos linfócitos.

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Dois tipos de moléculas produzidas pelas células não-linfóides timicas são importantes para a maturação das células T: 



Moléculas MHC classe I e classe II – expressas nas células epiteliais e nas células dendriticas no timo. As interacções dos timócitos em maturação com estas moléculas MHC no timo são essenciais para a selecção do reportório de células T maduras; Citocinas e quimiocinas – secretadas pelas células do estroma do timo, incluindo as células epiteliais, e estimulam a proliferação de células T imaturas e orquestram a transição do córtex para a medula da linhagem de timócitos αβ, respectivamente. A citocina melhor definida é a IL7, que é um critico factor de crescimento linfopoietico, e quimiocinas como CCL21 e CCL19, que são reconhecidas pelo receptor de quimiocinas CCR7 nos timócitos, medeiam o movimento guiado dos timócitos pelo timo.

As taxas de proliferação e morte celular por apoptose são extremamente elevadas nos timócitos corticais. Um único precursor dá origem a muita progenia, e 95% dessas células morre por apoptose antes de alcançar a medula. A morte celular deve-se à combinação de rearranjos não produtivos do gene de cadeia β do TCR, à não selecção positiva por moléculas MHC no timo e a selecção negativa induzida por antigénios próprios. Para além disso, timócitos corticis são sensiveis a radiação a glucocorticóides, sendo que, in vivo, altas doses de corticóides induzem morte apoptótica dos timócitos corticais. Inicio da Maturação das Células T no Timo Durante a maturação das células T, existe uma ordem precisa na qual genes TCR são rearranjados e o TCR e os co-receptores CD4 e CD8 são expressos:  

No ratinho, a expressão superficial de TCRγδ ocorre primeiro, 3 a 4 dias após as células precursoras chegarem ao timo, e o TCRαβ é expresso 2 ou 3 dias depois; No timo humano fetal, a expressão do TCRγδ começa às 9 semanas de gestação, seguida pela expressão do TCRαβ às 10 semanas.

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Os timócitos corticais, que são recém-chegados apartir da medula óssea, contêm genes TCR na sua configuração da liha germinativa e não expressam TCR, cadeias CD3 ou ξ, ou CD$ ou CD8. Estas células são designada timócitos duplo-negativos e esta etapa de maturação é conhecida como a etapa das células pró-T:  

A maioria dos timócitos duplo-negativos (>90%) dará origem a células T que expressam TCRαβ e restritas a MHC com CD4 ou CD8; Proteinas Rag-1 e Rag-2 são expressas primeiro nesta etapa e são necessárias para o rearranjo de genes do TCR.

Os rearranjos Dβ-Jβ no locus da cadeia β do TCR ocorre primeiro, e envolve a combinação do segmento de gene Dβ1 com um dos seis segmentos Jβ1 ou combinação do segmento Dβ2 com um dos seis segmentos Jβ2. Os rearranjos Vβ-DJβ ocorrem na transição entre a etapa das células pró-T e a subsequente etapa das células pré-T durante o desenvolvimento das células T αβ. As sequências de DNA entre os segmentos que sofrem rearranjo, incluindo genes D, J e possivelmente Cβ1 (se os segmentos Dβ2 e Jβ2 forem usados), são eliminados durante estes processos de rearranjo formando no final uma cadeia β funcional. Receptor da Célula Pré-T Se um rearranjo produtivo do genes da cadeia β do TCR ocorrer numa determinada célula pré-T, a proteina da cadeia β é expressa na superficie em associação com uma proteina invariante designada pré-Tα e com proteinas CD3 e ξ para formar um receptor da célula pré-T. O pré-TCR medeia a selecção das células pré-T em desenvolvimento que produtivamente rearranjaram a cadeia β do TCR, pois cerca de dois terços das células T em desenvolvimento adiciona ou remove bases nas junções de rearranjo que de um modo não multiplo de três e, assim, esses rearranjos falham na codificação da proteina β do TCR. A função do complexo pré-TCR no desenvolvimento das células T é semelhante à do pré-BCR no desenvolvimento das células B: Joana Maria Soares Pereira

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Sinais a partir do pré-TCR medeiam a sobrevivência das células pré-T e contribuem para a expansão proliferativa durante o desenvolvimento das células T; Os sinais do pré-TCR também iniciam a recombinação do locus da cadeia α do TCR e dirige a transição a etapa duplo-negativa para a etapa duplo-positiva do desenvolvimento dos timócitos, levando também à expressão de CD4 e CD8; Estes sinais também inibem o rearranjo seguinte de locus de cadeia β do TCR limitando a acessibilidade dos outros alelos à maquinaria de recombinação. Isto resulta numa exclusão alélica da cadeia β.

Tal como nas células pré-B, não se sabe qual, se existir, ligando o pré-TCR reconhece. A sinalização do pré-TCR, tal como a sinalização do pré-BCR, poderá ser iniciada de um modo dependente de ligando e é também dependente da montagem do complexo pré-TCR. Esta sinalização é mediada por um numero de cinases citosólicas e proteinas adaptadoras que são conhecidas por também estarem envolvidas na sinalização do TCR. A função essencial dos pré-TCR na maturação das células T foi demonstrada por numerosos estudos com ratinhos mutados geneticamente: 



Em ratinhos deficientes em Rag-1 ou Rag-2, os timócitos não são capazes de rearranjar os genes das cadeias α e β e falham na maturação após a etapa duplo-negativa. Se um gene β rearranjda funcionalmente é introduzido nestes ratinhos deficientes como um transgene, a cadeia β expressa associa-se com pré-Tα para formar um pré-TCR, e a maturação procegue para a etapa duplo-positiva. Um transgene de cadeia α sozinho não liberta a maturação porque a cadeia β é necessária para a formação do pré-TCR; Ratinhos KO que não apresentam qualquer componente do complexo pré-TCR (i.e., a cadeia β TCR, pré-Tα, CD3, ξ ou Lck – tirosina cinase envolvida na sinalização do TCR e do pré-TCR) mostram um bloqueio na maturação das células T na etapa duplo-negativa.

Produção de Timócitos Efectores e Expressão do TCR Na etapa seguinte da maturação das células T, os timócitos expressam CD4 e CD8 e são designados timócitos duplo-positivos. Células T duplo-positivas também induzem a expressão do receptor CCR7 de quimiocinas, que guia estas células do córtex até à medula, onde quimiocinas especificas para este receptor são secretadas por células do estroma. A expressão de CD4 e CD8 é essencial para os eventos de selecção subsequentes: 

 

O rearranjo dos genes da cadeia α do TCR e a expressão de heterodimeros TCR αβ ocorre na população CD4+CD8+ duplo-positiva, mesmo antes ou durante a migração dos timócitos do córtex para a medula; Uma segunda onda de expressão de genes Rag no final da etapa pré-T promove a recombinação do gene α do TCR; Assim que o rearranjo da cadeia α começa, este procegue por 3 ou 4 dias (em ratinho) até a expressão de Rag-1 e Rag-2 ser desligada por sinais do TCR αβ durante a selecção positiva.

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Os passos envolvidos no rearranjo de genes de cadeia α do TCR são bastante semelhantes aos que ocorrem durante o rearranjo dos genes de cadeia β do TCR. No entanto, como não existem segmentos D no locus TCR α, o rearranjo consiste apenas na junção de segmentos V e J:  

O grande numero de segmentos Jα permite multiplas tentativas de junção V-J produtiva em cada cromossoma, aumentando assim a probabilidade de um TCR αβ funcional ser produzido; Em contraste, com o locus da cadeia β do TCR, onde a produção da proteina e formação do préTCR suprime rearranjos seguintes, existe muito pouca, se nenhuma, exclusão alélica no locus da cadeia α.

Assim, rearranjos produtivos de cadeias α do TCR poderão ocorrer em ambos os cromossoma e, se isto acontecer, a célula T irá expressar duas cadeias α. De facto, cerca de 30% das células T periféricas expressam dois TCRs diferentes, com diferentes cadeias α mas com a mesma cadeia β. A consequência funcional desta expressão dual de receptores é ainda desconhecida mas como apenas um é necessário para a selecção positiva, será possivel que o segundo TCR não apresente qualquer afinidade para MHC próprio e, assim, não terá função. A regulação transcripcional do gene de cadeia α ocorre de um modo bastante semelhante à da cadeia β: 



Existem promotores a 5’ de cada gene Vα que apresentam baixo nivel de actividade e são responsáveis por alto nivel de transcrição de células T especificas quando em proximidade com um enhancer localizado 3’ do gene Cα; A incapacidade de rearranjar com sucesso a cadeia α do TCR em cada cromossoma leva a uma falha na selecção positiva e estes timócitos morrem por apoptose pois não fizeram um rearranjo produtivo.

A expressão do gene TCR α cedo na etapa duplo-positiva leva à formação do TCRαβ completo, que é expresso na superficie celular em associação com proteinas CD3 e ξ. A expressão coordenada das proteinas CD3 e ξ e a montagem de compexos TCR intactos são necessárias para a expressão na superficie. O rearranjo de genes TCRα resulta na delecção do locus δ que se encontra entre segmentos V. Como resultado, esta célula não é capaz de se tornar uma célula T γδ. A expressão de genes Rag e recombinação seguinte de genes TCR cessa depois desta etapa de maturação e as primeiras células a expressar TCRs encontram-se no córtex tímico, sendo esta expressão baixa comparada com células T maduras. Por virtude da sua expressão de complexos TCR completos, as células duplo-positivas são capazes de responder a antigénio e são sujeitas a selecção positiva e negativa. Células que sofrem esta selecção com sucesso progridem para se maturarem em células CD4+ ou CD8+, que são designadas timócitos single-positivos. Assim, as etapas da maturação das células T podem ser distinguidas pela expressão de CD4 e CD8. Esta maturação fenotipica é acompanhada pela maturação funcional: 

Células CD4+ - adquirem a habilidade de produzir citocinas em resposta à estimulação de antigénio subsequente e expressar moléculas efectoras (como ligando CD40) que “ajudam” os linfócitos B e os macrófagos;

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Células CD8+ - tornam-se capazes de produzir moléculas que matam outras células.

Timócitos single-positivos maduros entram na medula timica e depois deixam o timo para povoarem tecidos linfáticos periféricos.

Marcadores de Superficie Apesar dos co-receptores CD4 e CD8 não serem expressos nas fases inicias da etapa duplo-negativo, o programa de diferenciação progride e é marcado por alterações na expressão de moléculas de superficie como c-Kit, CD44 e CD25: 

 

A população de timócitos inicial apresenta c-Kit, o receptor de factores de crescimento para as células estaminais, e CD44, uma molécula de adesão envolvida no povoamento do timo. CD25, a cadeia β do receptor de IL-2, também surge cedo na etapa duplo-negativa. Durante este periodo, as células estão a proliferar mas os genes TCR continuam não rearranjados; A célula pára de expressar c-Kit, reduz marcadamente a expressão de CD44, e liga a expressão de genes Rag-1 e Rag e começa a rearranjar genes TCR; A partir daqui, a célula expressa TCR ou pré-TCR, tal como proteinas acessórias do complexo TCR e também co-receptores.

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Processos de Selecção Durante a Maturação das Células T αβ A selecção de células T αβ em desenvolvimento é dependente do reconhecimento do antigénio (complexos péptido-MHC) no timo e é responsável por preservar células uteis e eliminar aquelas que podem ser potencialmente perigosas: 

 

O reportório de céluls T imaturo, não seleccionado, consiste em células cujo receptor é capaz de reconhecer qualquer péptido antigénico (próprio ou estranho) apresentado por qualquer molécula MHC (própria ou estranha), mas também podem ser expressos receptores incapazes de detectar qualquer complexo MHC-antigénio; Em todos os individuos, as unicas células T úteis são aquelas especificas para péptidos estranhos apresentados por moléculas MHC próprias; Em todos os individuos, as células T que reconhecem antigénios próprios com alta avidez podem levar a auto-imunidade.

Assim, os processos de selecção actuam no reportório de células T imaturas para assegurar que apenas as células uteis completam o processo de maturação. Quando timócitos duplo-positivos primeiro expressam TCRs αβ, esses receptores encontram péptidos próprios (os unicos péptidos normalmente presentes no timo) apresentados por moléculas MHC próprias (as unicas moléculas MHC disponiveis para apresentar péptidos) prinicpalmente nas células epiteliais timicas no córtex mas também em células dendriticas nesta localização. Esta apresentação pode levar a dois resultados:



Selecção positiva – processo no qual timócitos cujo TCR liga com baixa avidez (i.e., fracamente) a complexos péptido-MHC próprios são estimulados a sobreviver, e timócitos cujos receptores não reconhecem moléculas MHC próprias são induzidos a morrer por uma via de apoptose geral. Isto assegura que as células T que maturam são restritas a MHC próprio. Este processo também fixa a restrição a MHC classe I ou classe II dos subgrupos de células T, assegurando que as células T CD8+ sejam especificas para péptidos apresentados por moléculas MHC classe I e as células T CD4+ sejam especificas para péptido apresentados por moléculas MCH classe II;

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Selecção negativa – processo no qual timócitos cujos TCRs se ligam foretmente a péptidos antigénicos próprios em associação com moléculas MHC próprias são eliminados. Isto elimina células T em desenvolvimento que são altamente autorreactivas contra antigénios próprios que estão presentes em elevadas concentrações no timo.

O resultado final destes processos de selecção é que o reportório de células T maduras que deixam o timo é restrito a MHC próprio e tolerante a vários antigénios próprios. Selecção Positiva de Timócitos: Desenvolvimento da Restrição MHC A selecção positiva funciona de modo a promover a sobrevivência e expansão selectiva de timócitos com TCRs restritos a MHC próprio: 

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

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Timócitos duplo-positivos são produzidos sem qualquer estimulação antigénica e começam a expressar TCRs αβ com especificidades aleatoriamente geradas; No córtex timico, essas células imaturas encontram células epiteliais que apresentam uma variedade de péptidos próprios ligados a moléculas MHC classe I e classe II; Se o TCR numa célula reconhecer péptidos apresentados por moléculas MHC classe I e ao mesmo tempo CD8 interagir com moléculas MHC classe I, essa célula T recebe sinais que previnem a sua morte e promovem a sua maturação continuada; Para proceder na via de maturação, a célula T deve continuar a expressar TCR e CD8 mas pode perder a expressão de CD4; O resultado é o desenvolvimento de uma célula T CD8+ restrita a MHC classe I.

Um processo inteiramente análogo leva ao desenvolvimento de células T CD4+ restritas a MHC classe II e qualquer célula T que expressa u TCR que não reconhece uma molécula MHC carregada com péptido no timo morrerá e será perdida. Os papeis essenciais das moléculas MHC e da especificdade do TCR na selecção positiva foram establecidos por uma variedade de linhas experimentais: 

Se um timo de uma estirpe pura for transplantado em animais quiméricos de outra estirpe, as células T que maturam são restritas ao tipo de MHC apresentado pelo timo. Os timos tranplantados têm de ser irradiados ou tratados com drogas citotóxicas para matar todos os macrófagos, células dendriticas e células linfóides residentes originárias da medula óssea. De novo, células T desenvolvem-se nestes timos, e a sua habilidade para reconhecer antigénios é restrita a produtos de genes MHC expressos nas células epiteliais timicas e não necessariamente a produtos de genes expressos nas células extratimicas. Assim, o epitélio timico é o elemento do hospedeiro critico para selecção positiva (i.e., o desenvolvimento de padrões de restrição MHC das células T);

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Se um TCR αβ transgénico com uma restrição MHC conhecida é expresso numa estirpe de ratinho que também expressa o alelo MHC para o qual o TCR é especifico, as células T irão maturar e popular tecidos linfóides periféricos. Se o ratinho é de outro haplótipo MHC e não expressa a molécula MHC que o TCR transgénico reconhece, existrião numeros normais de timócitos CD4+CD8+ mas muito poucas células T maduras que expressam o TCR transgénico. Este resultado demonstra que timócitos duplo-positivos devem expressar TCRs que se ligam a moléculas MHC próprias para serem positivamente seleccionadas.

Durante a transição de células duplo-positivas para single-positivas, os timócitos com TCRs restritos para classe I tornam-se CD8+CD4- e as células com TCRs restritos para classe II tornam-se CD4+CD8-:  

CD4 e CD8 funcionam como co-receptores com o TCR durante a selecção positiva e reconhecem moléculas MHC quando os TCRs reconhecem complexos péptido-MHC; Sinais apartir do complexo TCR e dos co-receptores funcionam em conjunto para promover a sobrevivência dos timócitos e esta função das moléculas CD4 e CD8 é semelhante aos seus papeis na activação de células T maduras.

Nesta etapa da maturação, existirá uma perda aleatória do gene CD4 ou CD8, e apenas aquelas células que expressam o co-receptor correcto (i.e., CD4 numa célula T restrita a classe II ou CR8 numa células restrita a classe I) continuarão a maturação. É também possivel que a expressão do co-receptor errado seja activamente suprimida, mas como isto é alcançado é desconhecido. Várias linhas experimentais demonstraram como ocorre esta transição: 

Ratinhos KO que não expressam MHC classe I nas células epiteliais timicas não desenvolvem células T CD8+ mas desenvolvem timócitos CD4+CD8- e células T CD4+. Inversamente, ratinhos deficientes em MHC classe II não desenvolvem células T CD4+ mas desenvolvem células T CD8+. Estes resultados demonstram que as células epiteliais timicas devem expressar moléculas MHC

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classe I ou classe II para seleccionar positivamente células single-positivo CD8+ ou CD4+, respectivamente; Em ratinhos transgénicos que expressam TCRs restritos a MHC classe II, as células T que se desenvolvem são quase exclusivamente CD4+, mesmo havendo numeros normais de timócitos CD4+CD8+. Inversamente, se um TCR trasngénico é restrito a classe I, as células T que maturam são CD8+. Assim, o co-receptor e a especificidade MHC do TCR deverão igualar se um linfócito se está a desenvolver numa célula T madura.

Para além disto, os péptidos ligados às moléculas MHC nas células epiteliais timicas têm um papel essencial na selecção positiva. Estes péptidos associados a MHC nas células apresentadoras de antigénio timicas provavelmente têm duas funções nas selecção positiva:  

Promovem a expressão estável das moléculas MHC na superficie da célula; Influenciam as especificidades das células que são seleccionadas.

Obviamente, o timo não é capaz de conter os antigénios estranhos aos quais um individuo é capaz de responder. Assim, péptidos estranhos não podem estar envolvidos na selecção positiva de células T que por fim recenhocerão esses péptidos. No entanto, péptidos próprios são necessários para a selecção positiva e o papel exacto que têm neste processo foi sujeito de numerosos estudos. Para resolver o papel dos péptidos na selecção de células T, foi necessário desenvolver sistemas nos quais a gama de péptidos apresentados a timócitos em desenvolvimentos era limitada e fácil de manipular experimentalmente: 



Para a selecção positiva dependente de MHC classe I, isto foi conseguido pelo o uso de ratinhos deficientes em TAP-1 ou β2-microglobulina. Nestes ratinhos, as moléculas classe I são instáveis e não são carregadas com péptidos citosólicos, mas podem ser carregadas com péptidos exogenamente adicionados. Se timos de tais ratinhos forem cultivados sem a adição de péptidos, poucas celulas maturam. A adição de péptidos aumenta drasticamente o + desenvolvimento de células T CD8 singlepositivo, indicando selecção positiva de timócitos que expressam TCRs restritos a MHC classe I; Uma descoberta chave nestas experiências foi que um ou poucos péptidos induziam a selecção positiva de um grande reportório de células T CD8+ que podiam potencialmente reconhecer vários péptidos não relacionados. Contudo, a ausência de péptido era suficiente para gerar um numero normal de células T maduras. Para além disso, misturas complexas de péptidos induziam a maturação de mais células T CD8+ do que os péptidos unicos.

A conclusão retirada destas experiências é que: 

Péptidos ligados a moléculas MHC são necessários para a selecção positiva de células T e alguns péptidos são melhores que outros no suporte deste processo.

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A descoberta de que péptidos diferem no reportório de células T que seleccionam sugerem que a especificidade do reconhecimento de antigénio, e não apenas o reconhecimento de MHC, têm alguma papel na selecção positiva, pois o reconhecimento fraco, ou com baixa avidez, de péptidos no timo protege células T imaturas de uma via de morte apoptótica e permite que as células completem a sua maturação. Este modelo de selecção positiva baseado no fraco reconhecimento de antigénios próprios levanta uma questão fundamental: Como é que a selecção positiva dirigida por antigénios próprios produz um reportório de células T maduras especificas para antigénios estranhos? 

A resposta mais provável é que a selecção positiva permite que diferentes clones de células T sobrevivam e se diferenciem, e que várias células T que reconhecem péptidos próprios com baixa avidez irão, após a maturação, reconhecer com sucesso péptidos estranhos com uma afinidade suficientemente elevada para serem activadas e gerarem respostas imunes.

Selecção Negativa de Timócitos: Tolerância Central A selecção negativa de timócitos funciona induzindo a morte apoptótica de células cujos receptores reconhecem complexos péptido-MHC no timo com alta avidez:    

Entre as células T duplo-positiva que são geradas no timo, algumas poderão expressar TCRs que reconhecem antigénios próprios com alta afinidade; Os péptidos presentes no timo são péptidos próprios derivados de proteinas antigénicas altamente expressas tal como de algumas proteinas restritas a tecidos particulares; Em células T imaturas, a consequência do reconhecimos de antigénios com alta avidez é a induzão da apoptose; Assim, os timócitos imaturos que expressam receptores de alta afinidade para antigénios próprios no timo são eliminados, resultando na selecção negativa do reportório de células T.

Este processo elimina as células T auto-reactivas potencialmente mais perigosas e é um dos mecanismos que asseguram que o sistema imune não responde a vários antigénios próprios, uma propriedade desiganada de auto-tolerância. Esta tolerância induzida nos linfócitos imaturos pelo reconhecimento de antigénios próprios nos órgãos linfáticos generativos (ou centrais) é também chamada de tolerância central, para ser contrastada com a tolerância periférica induzida nos linfócitos maduros por antigénios próprios nos tecidos periféricos. A prova formal da eliminação de clones de células T reactivos para antigénios no timo (também designada delecção clonal) surgiu de várias linhas experimentais que permitiram que os investigadores observassem os efeitos do reconhecimento de antigénios próprios por um grande numero de células T em desenvolvimento: 



Quando ratinhos transgénicos para TCR são expostos ao péptido para o qual o TCR é especifico, uma grande quantidade de morte celular é induzida no timo e ocorre um bloqueio no desenvolvimento de células T maduras que expressam TCR transgénico; Uma delecção semelhante de células T imaturas é observado se ratinhos transgénicos que expressam um TCR especifico para um péptido antigénico conhecido são criados com ratinhos que expressam esse antigénio ou se os ratinhos são injectados com grandes doses de antigénio. Isto pode ser mimisado in vitro cultivando timos intactos de ratinhos transgénicos para TCR com

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altas concentrações de péptido para o qual o TCR é especifico. Em todos estes exemplos, existe um bloqueio da maturação das células T depois do etapa cortical duplo-positiva, presumivelmente porque timócitos imaturos expressam o TCR transgénico, reconhecem o antigénios nas células apresentadoras de antigénio e são eliminadas. A delecção de células T imaturas auto-reactivas ocorre quando o TCR num timócito CD4+CD8+ se liga fortemente a um péptido próprio apresentado por outra célula timica. A selecção negativa pode ocorrer tanto na etapa duplo-positiva no cortex e em células T single-positivas acabadas de gerar na medula. As células apresentadoras de antigénios timicas que medeia a selecção negativa são principalmente células dendriticas e células epiteliais timicas medulares, enquanto as células epiteliais corticas são especialmente efectivas na indução da selecção negativa:  

Células T duplo-positivas são levadas para a medula timica pelas quimiocinas especificas CCR7, as CCL21 e CCL19; Na medula, células epiteilais timicas medulares expressam uma proteina nuclear designada AIRE (regulador autoimune) que induz a expressão de um numero de genes tecido-especificos no timo, fazendo assim um hospedeiro de péptidos tecido-especificos disponiveis para apresentação no timo a células T duplo-positivas e single-positivas durante o processo de selecção negativa.

O factor chave determinante da escolha entre selecção positiva e negativa é a força de reconhecimento do antigénio:  

Baixa avidez leva a selecção positiva; Alta avidez leva a selecção negativa.

As moléculas CD4 e CD8 provavelmente têm um papel na selecção negativa, como têm na selecção positiva, porque estes co-receptores participam no reconhecimento de moléculas MHC que apresentam péptidos próprios. A base celular da selecção negativa no timo é a indução de morte por apoptose por sinais activos promotores de morte que são gerados quando o TCR de timócitos imaturos se ligam com alta afinidade ao antigénio. Isto contrasta com a via de apoptose induzida pela ausência de selecção positiva. A indução por sinalização do TCR de uma proteina pró-apoptótica designada Bim tem um papel importante na indução de dano mitocondrial e apoptose de timócitos durante a selecção negativa. O reconhecimento de antigénios próprios no timo é capaz de gerar também uma população de células T reguladoras (células T naturalmente reguladoras), cuja função é prevenis reacções autoimunes. Não é claro como um antigénio próprio causa delecção de algumas células T imaturas e o desenvolvimento de células T reguladoras a partir de outros timócitos imaturos com a mesma especificidade.

Linfócitos T γδ Os timócitos que expressam TCR αβ e γδ são linhagens separadas com um precursor comum. Nos timos fetais, os primeiros rearranjos de genes TCR envolvem os loci γ e δ e a recombinação destes loci procegue de um modo semelhante ao observado para os outros genes do outro TCR, apesar da ordem de rearranjos parecer ser menos rigido do que nos outros loci. Joana Maria Soares Pereira

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Células T que expressam funcionalmente cadeias γ e δ não expressam TCRs αβ, e vice versa. A independência destas linhagens é indicada por várias linhas de evidência:  

Células T maduras que expressam αβ normalmente contêm rearranjos de genes δ com quadro de leitura errado, indicando que essas células nunca foram capazes de expressar receptores γδ; Ratinhos KO para o gene da cadeia δ do TCR desenvolvem numeros normais de células T αβ e ratinhos KO para o gene da cadeia β do TCR desenvolvem numeros normais de células T γδ.

A diversidade do reportório de células T γδ é teóricamente maior que a do reportório de células T αβ, em parte devido à permissão de junção D-D. Pradoxalmente, contudo, a diversidade actual de TCRs γδ expressos é limitada porque apenas alguns dos segmentos V, D e J disponiveis são usados nas células T γδ maduras, por razões desconhecidas. A diversidade limitada faz lembrar a diversidade limitada do subgrupo B-1 dos linfócitos B e sugere que as células T γδ funcionam como defensores iniciais contra um numero limitado de micróbios comummente encontrados nas barreiras epiteliais (defesa inata). Em humanos, menos de 5% das células T apresentam o heterodimero γδ e a percentagem de células T γδ nos órgãos linfáticos de ratinho apresentam cerca de 1% a 3%. Em adição à sua presença no sangue e nos tecidos linfáticos, estas células também aparecem na pele, no epitélio intestinal e no epitélio pulmonar, constituindo mais de 1% das células da epiderme de pele de ratinho. As células T δγ caracterizam-se por:  

Não são restritas a MHC; Não expressam os co-receptores CD4 e CD8 presentes nas populações de células T αβ.

Linfócitos T Naturalmente Assassinos (NK -T Cells) As células T naturalmente assassinas não são restritas a MHC e não reconhecem péptidos apresentados por células apresentadoras de antigénios:   

Expressam TCRs αβ; São restritas a CD1; Apresentam uma marcador superficial encontrados nas células naturalmente assassinas, daí o seu nome.

Os TCRs das células T-NK reconhecem lipidos antigénicos ligados à fenda das moléculas CD1. As moléculas CD1 são moléculas semelhantes a MHC classe I feitas de uma cadeia pesada e β2-microglobulina. A cadeia pesada apresenta uma fenda construida por residuos hidrofóbicos que consegue ligar e apresentar lipidos antigénicos. Estes lipidos antigénicos podem ser derivados de micróbios endocitados ou de lipidos próprios. Uma grande quantidade de células T-NK restritas a CD1 apresentam um receptor de células T invariante, resultante de um unico e esterotipico rearranjo de genes de cadeia α do TCR. para além disso, as células T-NK secretam citocinas e participam na defesa do hospedeiro, mas são também relevantes de um ponto de vista regulatório no contexto de auto-imunidade e alergia. Células T αβ em desenvolvimento a expressar TCRs invariantes serão positivamente selecionados no córtex timico na etapa duplo-positiva por CD1 e lipidos próprios apresentados na superficie de outros timócitos corticais. Essas células T-NK selecionadas não expressam CCR7 e, assim, não migram para a

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medula como outras células T αβ convencionais. Estas células recebem instruções para sair do timo e se alojarem num numero de locais periféricos, principalmente o figado.

Activação dos Linfócitos T Linfócitos T naive alojam-se nos órgãos linfáticos secundários, onde podem encontrar antigénios apresentados por células dendriticas maduras em moléculas MHC classe I ou classe II e serem activados. Isto resulta na expanção da pool de linfócitos especificos para um antigénio e na diferenciação destas células em linfócitos efectores e de memória:

Proteinas antigénicas que atravessam as barreiras epiteliais são capturadas por células dendriticas imaturas e transportadas para os nodos linfáticos, e os antigénios que entram no sangue são capturados pelas células dendriticas e levados para o baço. Se estes patogénios estiverem associados a PAMPs, como ligandos para os TLRs, as células dendriticas são activadas e induzidas a expressar coestimuladores como proteinas B7 na superficie da célula. As células dendriticas que encontraram micróbios e interanlizaram os seus antigénios começam a maturar e a migrar para as zonas de células T dos órgãos linfáticos secundários como os nodos linfáticos. Assim, a partir daqui, o processo de activação das células T ocorre do seguinte modo:  



As células T naive a as células dendriticas são levadas para as zonas de células T por quimiocinas que activam o receptor de quimiocinas CCR7; Quando alcançam estas áreas de células T, as células dendriticas apresentam antigénios em moléculas MHC e também expressam co-estimuladores que podem fornecer sinais secundários às células T naive; Quando uma célula T naive com a especificidade correcta reconhece antigénios, na forma de complexos péptido-MHC, e recebe sinais via a interacção de B7 com receptores de coestimuladores na célula T, essa célula T naive é activada.

Células T estimuladas por antigénios que receberam o sinal 1 através do receptor de antigénio e o sinal 2 via receptores de co-estimuladores podem ser induzidas a secretar citocinas e a expressar receptores de citocinas. A citocina interleucina-2 (IL-2) fornece sinais autocrinos a células T activadas, levando à Joana Maria Soares Pereira

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expansão de clones especificos para o antigénio, e, em conjunto com outras citocinas produzidas pelas células T e outras APCs, também estimula a diferenciação das células T em células efectoras e de memória. Algumas destas células T activadas deixam os órgãos linfáticos onde a activação ocorreu e entram na circulação. Outras células T CD4+ ficam no órgão linfático, onde ajudam linfócitos B a diferenciarem-se em plasmócitos.

Depois, as células T efectoras reconhecem antigénios em órgãos linfáticos ou em tecidos não-linfáticos periféricos e são activados a desempenhar as suas funções efectoras. Estas células são capazes de migrar para qualquer local de infecção ou inflamação. Aqui, estas células encontram de novo o antigénio para o qual são especificos e respondem de modo a eliminar a fonte de antigénio: 



As células T efectoras CD4+ subgrupos expressam moléculas membranares e secretam citocinas que activam (ajudam) macrófagos a matar micróbios fagocitados. Algumas células T CD4+ helper continuam nos órgãos linfáticos e ajudam células B a diferenciar-se em células que secretam anticorpos para ligar a antigénios; Linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTLs), as células efectoras do subgrupos CD8, matam células infectadas e tumores, células que apresentam antigénios associados a MHC classe I.

As células T de memória são uma população expandida de células T especificas para antigénios que são capazes de responder rapidamente a antigénios e diferenciar-se em células efectoras que eliminam o antigénio. Em geral, a activação de células T de memória dependenapenas da ligação do TCR, e sinais secundários co-estimuladores não são necessários nesta etapa de diferenciação. A resposta das células T decai depois do antigénio ser eliminado. Este decaimento é importante para que o sistema imune retome o estado de descanso, ou homeostasia. Isto acontece principalmente porque a maioria das células T activadas por antigénio morrem por apoptose pois, enquanto o antigénio é eliminado, os linfócitos são privados de estimulos de sobrevivência que são normalmente fornecidos prlo antigénio e por co-estimuladores e citocinas produzidos durante as reacções inflamatórias ao antigénio. Joana Maria Soares Pereira

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A sequência de eventos nas respostas das células T CD4+ e CD8+ são fundamentalmente semelhantes. No entanto, existem bastantes diferenças na iniciação e culminação destas respostas.

Activação dos Linfócitos T CD4 + A diferenciação dos linfócitos T CD4+ naive em células efectoras da imunidade mediada por células requer o reconhecimento do antigénio e co-estimulação. A iniciação das respostas imunes mediadas por células requer que as células T CD4+ e os antigénio que elas reconhecem estejam presentes no mesmo tecido linfóide ao mesmo tempo. Isto é alcançado pela recirculação de células T naive e pelo transporte de antigénios para os órgãos linfáticos: 

 

Células T naive migram do sangue para órgãos linfáticos, de um órgão linfático para outro, e de novo para o sangue, até que encontrem o antigénio para o qual eles expressam receptores especificos; O antigénio é entregue nos nodos linfáticos pela drenagem linfática e ao baço pelo sangue; As células dendriticas têm um papel importante na recolha de antigénios nos locais de infecção e na migração através dos vasos linfáticos até aos nodos linfáticos. Durante a sua migração para os nodos linfáticos, as células dendriticas maturam e tornam-se eficientes células apresentadoras de antigénios (APCs).

Depois, a activação das células T CD4+ naives requer a apresentação de antigénios pelas células dendriticas. Assim que se encontram nos nodos linfáticos, as células dendritica apresentam péptidos derivados de proteinas antigénicas endocitadas em associação com moléculas MHC classe II a células T CD4+ naive: 



Reacções imunes mediadas por células T CD4+ são elicitadas por proteinas antigénicas de micróbios extracelulares que são ingeridos pelas células dendriticas, ou por proteinas antigénicas soluveis que são administradas com adjuvates, no caso das vacinações, e recolhidas pelas células dendriticas; Estes antigénios microbianos ou soluveis são internalizados em vesiculas pelas células dendriticas e apresentadas em associação com moléculas MHC classe II.

Alguns quimicos introduzidos atraves da pele também elicitam reacções de células T, deignadas “contact sensitivity reactinos”. Acredita-se que estes quimicos se ligam e modificam proteinas próprias, criando novos determinantes antigénicos que são apresentados a células T CD4+ ou CD8+. Em adição à apresentação de antigénios, as células dendriticas respondem a estruturas microbianas pela expressão de altos niveis de co-estimuladores, como proteinas B7-1 e B7-2, que fornecem sinais secundários para a activação de células T, e pela secreção de citocinas como IL-2, que estimula a deiferenciação de células T. Os sinais co-estimuladores são geralmente essenciais para a activação e diferenciação das células T CD4+, sendo as CD8+ menos dependentes. A proliferação das células T em resposta ao reconhecimento do antigénio é mediada principalmente por uma via de crescimento autocrina, na qual a célula T que responde secreta as sua citocinas promotoras do crescimento e também exprime receptores superficiais para essas citocinas. O principal factor de crecimento autocrino da maior parte das células T é a IL-2: 

A produção de IL-2 e a expressão de receptores de alta afinidade para a IL-2 requer o reconhecimento do antigénio por células T especificas tal como co-estimulação;

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Assim, as células que reconhecem antigénios produzem IL-2 e também respondem preferencialmente a esta citocina, assegurando que as células T especificas para o antigénio são as que mais proliferam.

O resultado da proliferação de células T naive é a expansão clonal, que gera a partir de uma pequena pool de linfócitos naive especificos o grande numero de células necessária para eliminar o antigénio. Estes numeros decaem rapidamente enquanto o antigénio é eliminado e, depois da resposta imune retroceder, o numero de células de memória sobreviventes especificas para o antigénio é na ordem de 1 em 104. Enquanto os antigénios são eliminados, várias células T activadas morrem por apoptose, fornecendo assim um mecanismo homeostático que leva o sistema imune ao seu estado basal de descanso depois na infecção ser eliminada. Algumas das células T que proliferaram diferenciam-se em células efectoras e outra progenia de linfócitos T estimulados por antigénios diferenciam em células de memória, que apresentam grande tempo de vida e respondem rapidamente a antigénios.

Activação das Células T CD8 + A activação de células T CD8+ naive também requer reconhecimento de antigénios e sinais secundários, mas a natureza dos sinais secundários é diferente da das células CD4+. Para serem estimuladas a se proliferar e diferenciar em CTLs efectoras, células T CD8+ naive devem reconhecer péptidos antigénicos associados a MHC classe I e também encontrar co-estimuladores nas APCS ou sinais fornecidos pelas células T helper. As células dendriticas também têm um papel importante na activação de células T CD8 + naive: 

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

A resposta das células T CD8+ é elicitada por péptidos microbianos que estão presentes no citosol de células infectadas e são apresentados por moléculas MHC classe I. Os micróbios que produzem antigénios citosólicos são tipicamente virus, que expressam proteinas no citoplasma de células infectadas; As células T CD8+ têm de responder também a algumas bactérias fagocitadas e virus se esses micróbios ou suas proteinas antigénicas forem transportadas para fora dos fagossomas para o citosol. Células dendriticas que expressam esses antigénios citosólicos são capazes de activar células T CD8+ naives, do mesmo modo que iniciam as respostas das células T CD4+

Contudo, a indução da resposta das células T CD8+ tem um problema especial porque o antigénio que estas células reconhecem pode ser poduzido num tipo de célula que não é uma APC profissional e não é capaz de activar células T naive. De modo a iniciar a resposta, o antigénio tem acesso à via MHC classe I das células dendriticas. As células dendriticas têm a especial habilidade de capturar e ingerir células infectadas por virus ou tumorais, e apresentar os antigénios virais ou tumorais a células T CD8 + naives:

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Nesta via, os antigénios ingeridos são transportados das vesiculas para o citosol, donde os péptidos entram na via classe I, uma caracteristica unica das células dendriticas e designada de apresentação cruzada.

A activação completa das células T CD8+ e a sua diferenciação em CTLs funcionais pode requerer a participação de células TH CD4+. Isto é, as células TH fornecem “sinais secundários” às células T CD8+. O requerimento de células TH pode variar de acordo com o tipo de exposição do antigénio: 



No cenário de uma resposta imune inata forte a um micróbio, se APCs profissionais estão directamente infectadas pelo micróbio, ou se a apresentação cruzada de antigénios microbianos é eficiente, a ajuda das células TH CD4+ pode não ser necessária; Células TH CD4+ podem ser necessárias para a resposta das CTLs a infecções de virus latentes, transplantes de órgãos, e tumores, sendo que todos tendem a gerar reacções imunes inatas fracas.

As células TH podem promover a activação de células T CD8+ através de vários mecanismos:  

Células TH podem secretar citocinas que estimulam a diferenciação de células T CD8+; Células TH estimuladas por antigénios expressam um membro da familia de TNFs designado ligando CD40 (CD40L), que se liga a CD40 nas APCs e activa estas APCs a serem mais eficientes na estimulação da diferenciação de células T CD8+.

Os efeitos das células TH parecem ser principalmente na diferenciação de células CD8+ em células de memória mais funcioanis, e menores nas expansão clonal inicial e no desenvolvimento inicial das CTLs. Antes da exposição ao antigénio, a frequência de células T CD8+ naives especificas para qualquer antigénio de 1 em 105 a 106 linfócitos. A seguir à exposição ao antigénio, o numero de células T CD8 + especificas para esse antigénio aumenta para mais de 1 em 10.

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Estudos em ratinhos revelaram uma grande expansão não esperada de células T CD8 + durante a fase aguda de infecções com micróbios intracelulares. Apesar de ter sido mais dificil quantificar a expansão de células T CD4+ estimulada por antigénios, ela parece ser muito menor à expansão clonal das células T CD8+: 

Isto seria de esperar, porque CTLs CD8+ desempenham as suas funções efectoras atacando directamente células infectadas, enquanto células TH CD4+ unicas secretam citocinas que activam várias células efectoras como macrófagos e, assim, um numero bastante maior de CTLs são necessárias para a imunidade protectiva.

Várias citocinas funcionam como factores de crescimento para dirigir a expansão clonal das células T CD8+. Estas incluem IL-12, IL-15 e IL-7.

Papel dos Co-estimuladores na Activação das Células T A proliferação e diferenciação das células T naive requer sinais fornecidos por moléculas nas APCs, desigandas co-estimuladores, em adição a sinais induzidos por antigénios:  

O sinal secundário para a activação das células T é designada co-estimulação porque funciona em conjunto com o antigénio para estimular a célula T; Na ausência de co-estimulação, as células T que encontram antigénios não respondem e morrem por apoptose ou entram num estado de anergia.

A via co-estimulatória melhor caracterizada na activação das células T envolve a molécula de superficie CD28 das células T, que se liga às moléculas co-estimulatórias B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) expressas em APCs activadas: 



CD28 fornece sinais que aumentam as respostas das células T a antigénios, incluindo sobrevivência celular, produção de citocinas como IL-2 e diferenciação de células T naive em células efectoras e de memória; B7-1 e B7-2 são estruturalmente semelhantes a glicoproteinas de cadeia unica integrais da membrana, cada com dois dominios Ig-like extracelulares, apesar de na superficie celular a B7-1 existir como dimero e B7-2 como um monómero. As moléculas B7 são expressas principalemnte nas APCs, incluindo células dendriticas, macrófagos e linfócitos B. Estão ausentes ou são expressas em baixos niveis em APCs em descanso e são indusidas por vários estimulos.

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O papel essencial dos co-estimuladores B7 na activação das células T foi estabelecido por vários tipos de experiências: 

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In vitro, populações purificadas de células T CD4+ respondem a antigénios secretando citocinas e proliferando quando o antigénio é apresentado pelas APCs que expressam moléculas B7 mas não quando o antigénio é apresentado por APCs que não expressam B7. Um anticorpo inactivador que se liga a CD28 é capaz de fornecer um sinal so-estimulador artificial e induzir as respostas das células T mesmo quando as APCs não apresentam moléculas B7; Se uma população de células T CD4+ é cultivada com agentes que fazem cross-linking com TCR, como anticorpos anti-CD3, as células T produzem muito poucas citocinas e não proliferam. De novo, se um sinal so-estimulador adicional é fornecido por anitcorpos que se ligam a CD28, a célula T é capaz de responder. O sinal co-estimulatório fornecido pelo anticorpo anti-CD28 na ausência de sinal TCR não induz por si só a reposta das células T; Ratinhos KO que não apresentam B7-1 e B7-2 são deficientes em respostas dependentes de células T à imunização com proteinas antigénicas.

A expressão de co-estimuladores é regulada e assegura que as respostas dos linfócitos T são iniciadas no momento e local adequado: 

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A expressão de co-estimuladores B7 é aumentada por produtos microbianos que se ligam a TLRs e por citocinas como IFN-γ produzidas durante as reacção imunes inatas a micróbios. A indução de co-estimuladores por micróbios e por citocinas da imunidade inata promove as respostas das células T a antigénios microbianos; Em adição, células T activadas expressam CD40L na sua superficie, que se liga a CD40 expresso nas APCs e fornece sinais que aumentam a expressão de co-estimuladores B7 nas APCs.

De todas a potenciais APCs, as células dendriticas maduras expressam o niveis mais elevados de coestimuladores e, como resultado, são os estimuladores mais potentes de células T naive (que são completamente dependentes da co-estimulação para activação). Os adjuvantes têm como papel estimular a expressão de co-estimuladores nas APCs e a ausência de co-estimuladores em APCs não activadas nos tecido normais contribui para a manutenção de tolerância a antigénios próprios. como tais APCs tecidulares são capazes de apresentar antigénios próprios a células T, a falta de expressão de co-estimuladores assegura que células T potencialmente auto-reactivas são sejam activadas e se tornem anérgicas. Células T efectoras e de memória anteriormente activadas são menos dependentes da co-estimulação pela via B7:CD28 que as células naive. Esta propriedade das células efectoras e de memória permite que elas respondam a antigénios apresentados por várias APCs que possam residir em tecidos não-linfóides e que expressam menores niveis de B7. Assim, a diferenciação de células T CD8 + em CTLs efectoras requer co-estimulação mas CTLs efectoras são capazes de matar outras células que não expressam coestimuladores. Uma função essencial da via B7:CD28 é a produção de células T reguladoras:   

Células T reguladoras são células T CD4+CD25+ que são capazes de suprimir a função das células T efectoras; Uma grande proporção destas células desenvolvem-se no timo e são conhecidas como células T naturalmente reguladoras; O desenvolvimento de células T naturalmente reguladoras requer B7 e CD28.

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O mecanismo bioquimico pelo qual interacções CD28:B7 promovem a activação das células T é incompletamente conhecido: 

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Sinais mediados por CD28 aumentam a produção de citocinas, especialmente o factor de crescimento de células T autócrino IL-2. Isto ocorrerá por uma combinação de transcrição aumentada e estabilização do mRNA de IL-2; Ainda, sinais CD28 promivem a sobrevivência de células T, em parte por aumento da expressão da proteina anti-apotótica Bcl-x.

A via CD28:B7 de co-estimulação é o protótipo de uma familia muito maior de receptores e ligando que funcionam para estimular e inibir as células T.

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Uma proteina designada ICOS (co-estimulador induzivel) é homólogo do CD28 e deve o seu nome ao facto de ser induzido nas células T após a activação. O ligando para ICOS é homólogo de B7-1 e B7-2. ICOS parece ser particularmente importante na estimulação da produção de certas citocinas, notavelmente IL-10, e na activação de células T efectoras previamente diferenciadas; Uma proteina designada CTLA-4 (CD152) é também homóloga do CD28, liga-se a B7-1 e B7-2, e é expressa em células T activadas. As contrário do CD28, CTLA-4 funciona para terminar as respostas das células T e tem um papel importância da auto-tolerância e se for inibido a resposta das células T não termina.

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Para elém desta via, a interacção de CD40L nas células T com CD40 nas APCs melhora a activação das células T. Isto ocorre porque o compromisso de CD40 nas APCs activa as APCs para as tornar mais potentes, talvez por aumentar a expressão de moléculas B7 e a secreção de citocinas como IL-2, que promove a diferenciação das células T. Assim, a via CD40 amplifica indirectamente as respostas das células T e não funciona como uma via de co-estimulação por si só: 

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Células T naive são activadas por complexos péptidoMHC em APCs previamente activadas por PAMPs em TLRs; O reconhecimento do antigénio pelas células T em conjugação com a activação de CD28 induz a expressão de ligando CD40 (CD40L) nas células T activadas; CD40L liga-se a CD40 nas APCs e estimula a expressão de moléculas B7 e a secreção de citocinas que activam as células T; Assim, CD40L nas células T torna as APCs melhor APCs e as vias B7 e CD40 estimulam-se mutuamente.

Muitas outras moléculas superficiais das células T, incluindo CD2 e integrinas, fornecem sinais coestimulatórios in vitro, mas o seu papel fisiológico em ratinhos e humano é menos claro.

Tradução do Sinal pelo Complexo TCR As vias de sinalização das células T activam coordenadamente a transcrição de genes que são silenciosos nas células naive e cujos produtos medeiam as respostas e funções das células T activadas. O reconhecimento do antigénio pelo TCR inicia uma sequência de sinais bioquimicos nas células T que resulta na activação transcripcional de genes particulares e a entrada das células no ciclo celular. Estes genes exprossos nas células T depois do reconhecimento do antigénio codificam várias proteinas que medeiam as respostas biológicas destas células. Factor de Transcrição

Várias caracteristicas gerais importantes da tradução do sinal das células T estão já establecidas: 

A activação das células células T involve a integração de sinais a partir de multiplos receptores – o TCR fornece especificidade e os receptores de citocinas e co-estimuladores têm papeis importantes na expansão clonal e diferenciação;

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As respostas bioquimicas iniciais ao reconhecimento do antigénio consiste num agrupamento de co-receptores com o receptor do antigénio e a fosforilação de tirosinas de motivos ITAM – o TCR não apresenta actividade enzimática intrinseca mas está associado com com o complexo de proteinas CD3 e ξ que ligam enzimas e contêm ITAMs. A fosforilação de tirosinas nos ITAMs inicia a tradução de sinal e a activação a jusante de tirosina cinases, que por sua vez fosforilam residuos de tirosina noutras proteinas adpatadoras. Os eventos subsequentes na tradução de sinal são gerados por recrutamento especifico de enzimas chave sendo que cada uma inica vias de sinalização a jusante distinctas;



Sinais a partir do receptor de antigénio activam coordenadamente um numero de vias bioquimicas importantes sendo as mais importantes a via das Ras-MAP cinase, a via da proteina cinase C (PKC) e a via de cálcio-calcineurina – a activação destas enzimas ocorre em minutos após o reconhecimento do antigénio. As enzimas activadas em cada uma destas vias induzem a expressão de de vários genes nas células T, um processo de leva várias horas.

Formação da Sinapse Imunológica Quando o complexo TCR reconhece péptidos associados a MHC numa APC, várias moléculas da superficie das células T e moléculas de sinalização intracelulares são rapidamente mobilizadas para o local de contacto APC-célula T. Esta região é designada sinapse imunológica, ou cluster supramolecular de activação (SMAC): 

As moléculas das células T que se rapidamente mobilizadas para o centro da sinapse incluem o complexo TCR (o TCR e as cadeias CD3 e ξ), os co-receptores CD4 ou CD8, receptores para coestimuladores (como CD28), enzimas como PKC-θ e proteinas adpatadoras que se associam com

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as caudas citoplasmáticas dos receptores transmembranares. Nesta porção da sinapse, designada c-SMAC (para cluster supramolecular de activação central), a distância entre a membrana plasmática da célula T e a da APC é cerca de 15 nm; As integrinas ficam na periferia da sinapse, onde funcionam para estabilizar a ligação da célula T com a APC, formando uma porção periférica da SMAC designada p-SMAC. Nesta parte da sinapse, as duas membranas estão a uma distância de cerca de 40 nm.

c-SMAC p-SMAC

Várias moléculas de sinalização encontradas nas sinapses estão localizadas em regiões da membrana plasmática que apresentam um conteudo lipidico diferente do resto da membrana e que são designadas jangadas lipidicas (lipid rafts) ou micro-dominios enriquecidos em glicolipidos e colesterol. A sinalização do TCR e dos receptores co-estimuladores é iniciada nestas jangadas e induzem rearranjos do citoesqueleto que permitem que as jangadas se fundam e formem a sinapse imunológica. É devido à composição destas jangadas que os vários componentes membranares da interacção de podem mover na membrana. As sinapses imunológicas podem ter várias funções durante e depois da activação da célula T: Joana Maria Soares Pereira

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Apesar da tradução de sinal do TCR ser iniciada antes da formação da sinapse e ser necessária para a formação da sinapse, a sinapse imunológica por si só é capaz de fornecer uma interface unica para o desencadeamento do TCR. A activação da célula T necessita de ultrapassar os probelmas de uma geralmente baixa afinidade dos TCRs para ligandos péptido-MHC e a presença de poucas moléculas MHC a apresentar qualquer péptido numa APC. A formação da sinapse ultrapassa estes problemas. A sinapse representa um local no qual activações repetidas dos TCRs podem ser sustentadas com este baixo numero de complexos péptido-MHC na APC, facilitando assim a sinalização prolongada e efectiva da célula T;



A sinapse assegura a entrega especifica de granulos secretórios e sinais apropriados a APCs ou alvos. A entrega vectorial de granulos secretórios contendo perforina e granzimas pelas CTLs a células alvo ocorre na sinapse. De modo semelhante, interacções CD40L-CD40 são facilitadas pela acumulação destas moléculas na sinapse imunológica. Algumas citocinas são também secretadas de um modo directo na fenda sináptica;

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A sinapse é um local importante para o turnover de moléculas de sinalização, principalmente por ubiquinação e entrega em endossomas tardios e lisossomas. Esta degradação de proteinas sinalizadoras podem contribuir para a terminação da activação das células T.

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MECANISMOS EFECTORES DAS RESPOSTAS IMUNES AS CITOCINAS

As Citocinas As citocinas são proteinas secretadas pelas células da imunidade inata e dapatativa que mediam muitas das funções destas células:  

 

São produzidas em resposta a micróbios e outros antigénios, e diferentes citocinas estimulam diversas respostas de células envolvidas na imunidade e inflamação; Na fase de activação das respostas imunes adaptativas, as citocinas estimulam o crescimento e diferenciação de linfócitos, e na fases efectoras da imunidade inata e adaptativa activam diferentes células efectoras para que estas eliminem micróbios e outros antigénios; As citocinas também estimulam o desenvolvimento de células hematopoiéticas; As citocinas são importantes como agentes terapeuticos e como alvos de antagonistas especificos em várias doenças imunes e inflamatórias.

A nomenclatura das citocinas baseia-se normalmente nas suas fontes celulares:   

Monocinas – designação original das citocinas produzidas por fagócitos mononucleares; Linfocinas – designação original das citocinas produzidas por linfócitos; Interleucinas – citocinas que são produzidas por uns leucócitos (e.g., macrófagos ou células T) e que actuam noutros leucócitos.

Com o desenvolvimento de anticorpos anti-citocinas e de sondas moleculares, tornou-se claro que a mesma proteina pode ser sintetizada por linfócitos, monócitos e por uma variedade de células tecidulares, incluindo células endoteliais e algumas células epiteliais. Assim, o termo genérico citocina é o nome preferido para esta classe de mediadores. Por outro lado, o termo interleucina é imperfeito porque muitas citocinas que são sintetizadas apenas por leucócitos e que actuam apenas em leucócitos não são designadas interleucinas, por razões históricas, enquanto muitas citocinas designadas de interleucinas são produzidas ou actuam noutras células para além dos leucócitos. Todavia, o termo tem tido sucesso porque enquanto novas citocinas são molecularmente caracterizadas, é-lhes atribuido um numero interleucina (IL) (e.g., IL-1, IL-2, e por ai fora) para manter a nomenclatura standard.

Propriedades Gerais das Citocinas As citocinas são polipeptidos produzidos em resposta a micróbios e outros antigénios que medeiam e regulam as reacções imunes e inflamatórias.

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Apesar das citocinas serem estruturalmente diversas, elas partilham várias propriedades: 1. A secreção de citocinas é um evento breve e limitado. As citocinas não são normalmente armazenadas e a sua sintese é iniciada por transcrição de genes como resultado da activação celular. Tal activação da transcrição é transiente e os mRNAs que codificam as citocinas são instáveis, de modo que a sintese de citocinas é transiente. A produção de algumas citocinas deve ser adicionalmente controlada por processamento de RNA e por mecanismos póstradução, como libertação proetolitica de um produto activo de um precursor inactivo. O processamento proteolitico é importante, por exemplo, na produção de TNF, IL-1 e TGF-β activos. Quando sintetizadas, as citocinas são rapidamente secretadas, resultando numa explosão quando necessárias; 2. As acções das citocinas são muitas vezes pleiotrópicas e redundantes. O pleitotropismo referese à habilidade de uma citocina actuar em diferentes tipos de células. Esta propriedade permite que a citocina medeie diversos efeitos biológicos, mas limita altamente o uso terapeutico das citocinas porque a administração de uma citocina para um efeito clinico desejado pode resultar em muitos efeitos indesejados. A redundância refere-se à propriedade de multiplas citocinas apresentarem os mesmos efeitos funcionais. Devido a esta redundância, antagonistas contra uma unica citocina ou mutação de um gene de citocina não terão consequências funcionais, pois outras citocinas irão compensar; 3. As citocinas muitas vezes influenciam a sintese e a acção de outras citocinas. A habilidade de uma citocina estimular a produção de outras leva a casacatas nas quais uma segunda ou terceira citocina mediarão os efeitos biológicos da promeira. Duas citocinas podem antagonizar a acção de ambas, produtir efeitos adaptativos, ou, em alguns casos, produzir efeitos maiores que os antecipados ou sinérgicos; Joana Maria Soares Pereira

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4. As acções das citocinas podem ser locais ou sistémicas. A maior parte das citocinas actuam próximo do local onde são produzidas, tanto na célula que a secreta (acção autócrina) ou numa célula vizinha (acção parácrina). As células T muitas vezes secretam citocinas no local de contacto com as APCs, na sinapse imunológica. Esta pode ser a razão do facto das citocinas muitas vezes actuarem em células que estão em contacto com os produtores de citocinas. Quando produzidas em grandes quantidades, as citocinas podem entrar na circulação e actuar num local distante do local de produção (acção endócrina). O TNF é um exemplo de uma citocina que tem efeitos sitémicos e locais importantes; 5. As citocinas iniciam as suas acções ligando-se a receptores membranares especificos nas células alvo. Os receptores para as citocinas ligam os seus ligandos com altas afinidades, com constantes de dissociação entre 10-10-10-12 (os anticorpos tipicamente ligam os antigénio com 10-7-10-11 e os TCRs ligam péptidos associados a MHC com 10-5-10-7). Assim, apenas pequenas quantidades de uma citocina são necessárias para ocupar os receptores e provocar uma Joana Maria Soares Pereira

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resposta biológica. A maior parte das células expressa baixos niveis de receptores de citocinas (na ordem dos 100-1000 receptores por célula), mas estes são adequados para induzir respostas;

6. Sinais externos regulam a expressão de receptores de citocinas e, assim, a resposta das células às citocinas. Por exemplo, a estimulação de células B ou T por antigénios leva a uma maior expressão de receptores de citocinas. Por esta razão, durante uma resposta imune, os linfócitos especificos para antigénios são quem responde preferencialmente às citocinas secretadas. Este é um mecanismo para a manutenção da especificidade das respostas imunes, apesar da citocinas não serem especificas para os antigénios. A expressão dos receptores é também regulada pelas citocinas por si só, incluindo a mesma citocina que liga o receptor, permitindo a amplificação positiva ou o feedback negativo; 7. As respostas celulares da maior parte das citocinas consistem em alteraçõs na expressão de genes nas células alvo, resultando na expressão de novas funções e, por vezes, na proliferação das células alvo. Muitas das alterações na expressão de genes induzidas pelas citocinas resulta na diferenciação dos linfócitos T e B e na activação de células efectoras como os macrófagos. Por exemplo, as citocinas estimulam o switch de isotipos de anticorpos nas células B, a diferenciação de células TH em subgrupos TH2 e TH1, e a activação de mecanismos microbicidas na fagocitose. Excepções são as quimiocinas, que elicitam alterações rápidas na afinidade das integrinas e na reorganização do esqueleto que favorecem a migração, e uma citocina designada TNF, que é capaz de induzir a apoptose activando enzimas celulares, sem transcrição de novos genes ou sintese proteica; 8. As respostas celulares às citocinas são fortemente reguladas, e existem mecanismos de feedback inibitórios para terminar essas respostas. Estes mecanismos incluem a indução pelas citocinas de genes que codificam inibidores dos receptores de citocinas ou das vias de sinalização a jusante activadas pelos recepotres. Os inibidores incluem receptores “armadilha” de citocinas expressos na superficie celular, moléculas que bloqueiam interacções entre cinases Joana Maria Soares Pereira

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sinalizadoras, fosfatases que contra-atacam os efeitos cinases activadoras, e moléculas que bloqueiam interacções produtivas de factores de transcrição induzidos por citocinas com o DNA. Categorias Funcionais das Citocinas As citocinas podem ser classificadas em três categorias funcionais principais com base nas suas acções biológicas principais: 1. Mediadoras e reguladoras da imunidade inata – produzidas principalmente por fagócitos mononucleares em resposta a agentes infecciosos. PAMPs, como o LPC e DNA de cadeia dupla viral, ligam-se a TLRs na superficie das células ou nos endossomas dos macrófagos e estimulam a sintese e secreção de algumas das citocinas importantes da imunidade inata. As mesmas citocinas podem também ser secretadas por macrófagos que são activados por células T estimuladas por antigénios (i.e., como parte da imunidade adaptativa mediada por células). A maior parte dos membros deste grupo de citocinas actuam em células endoteliais e leucócitos para estimular as reacções inflamatórias iniciais aos micróbios, e alguns funcionam para controlar estas respostas. As células naturalmente assassinas e as células T naturalmente assassinas também produzem citocinas durante as reacções imunes inatas; 2. Mediadoras e reguladoras da imunidade adaptativa – produzidas principalmente por linfócitos T em resposta ao reconhecimento especifico de antigénios estranhos. Algumas citocinas das células T funcionam principalmente para regular o crescimento e diferenciação de várias populações de linfócitos e, assim, têm um papel importante na fase de activação das respostas imunes dependentes de células T. Outras citocinas derivadas das células T recrutam, activam e regulam células efectoras especializadas, como fagócitos mononucleados, neutrófilos e eosinófilos, para que estes eliminem antigénios na fase efectora das respostas imunes adaptativas; 3. Estimuladoras da hematopoiese – produzidas pelas células do estroma da medula óssea, leucócitos e outras células e estimulam o crescimento e diferenciação de leucócitos imaturos. Caracteristicas Exemplos Principal fonte celular

Imunidade inata TNF, IL-1, IL-12, IFN-γ* Macrófagos, células NK

Prinicpais funções fisiológicas

Mediadores da inflamação (local e sistémica)

Estimulo

LPS (endotoxina), peptidoglicanos bacterianos, RNA viral, citocinas derivadas das células T (IFN-γ)

Proteinas antigénicas

Quantidade produzida

Pode ser elevada; detectavel no soro

Geralmente baixa; not«rmalmente não detectavel no soro

Efeitos locais ou sistémicos

Ambos

Normalmente apenas local

Doenças sistémicas (e.g., choque séptico) Inibidores Corticosteróides *O IFN-γ tem papeis importantes na imunidade inata e adaptativa. Papel em doença

Joana Maria Soares Pereira

Imunidade adaptativa IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ Linfócitos T Regulação do crescimento e diferenciação dos linfócitos; activação de células efectoras (macrófagos, eosinófilos, mastócitos)

Dano tecidular local (e.g, inflamação granulomatosa) Ciclosporina, FK-506

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Em geral, as citocinas da imunidade inata e adaptativa são produzidas por diferentes populações de células e actuam em diferentes células alvo. Contudo, estas distinções não são absolutas porque a mesma citocina pode ser produzida durante reacções da imunes inatas e adaptativas, e diferentes citocinas produzidas durante tais reacções podem ter acções sobrepostas. Receptores das Citocinas e Sinalização Todos os receptores de citocinas consistem numa ou mais proteinas transmembranares cujas porções extracelulares são responsáveis pela ligação às citocinas e cujas porções citoplasmáticas são responsáveis pela iniciação das vias de sinalização intracelulares: 

Estas vias de sinalização são tipicamente activadas pelo agrupamento do receptor induzido pelo ligando, aproximando as porções citoplasmáticas de duas ou mais moléculas de receptor num processo análogo ao da sinalização dos receptores de antigénios das células B e T.

Existem vários critérios pelos quais os receptores de citocinas são classificados. A classificação mais usada é feita com base nas homologias estruturais dos dominios extracelulares de ligação às citocinas e mecanismos de sinalização intracelulares partilhados. Assim, de acordo com esta classificação, os receptores de citocinas podem ser divididos em várias familias: 1. Receptores de citocinas do tipo I – também designados receptores hemopoietina, contêm uma ou mais cópias de um dominio com dois pares de residuos de cisteina conservados e uma sequência próxima da membrana de triptofano-serina-X-triptofano-serina (WSXWS), onde X pode ser qualquer aminoácido:  Ligam tipicamente citocinas que têm uma estrutura secundária de quatro α-hélices, designadas citocinas do tipo I. As caracteristicas conservadas dos receptores formam estruturas que ligam citocinas com estrutura secundária em quatro α-hélices, mas a especificidade para citocinas individuais é determinada por residuos de aminoácidos que variam entre receptores;  Consistem em cadeias unicas de ligação ao ligando e uma ou mais cadeias de transdução do sinal, que são normalmente partilhadas por receptores para diferentes citocinas. Todos os receptores de citocinas do tipo I usam vias de sinalização Jak-STAT que induzem a transcrição de novos genes; 2. Receptores de citocinas do tipo II – são semelhantes aos receptores do tipo I em virtude dos dois dominios extracelulares como cisteinas conservadas, mas não contêm o motivo WSXWS. Estes receptores consistem numa cadeia polipeptidica de ligação ao ligando e uma cadeia de transdução do sinal. Todos os receptores de citocinas do tipo II usam vias de sinalização JakSTAT; Joana Maria Soares Pereira

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3. Receptores da familia IL-1 – partilham sequências citosólicas conservadas, designadas dominios Toll-like/IL-1 receptor (TIR) e usam vias de transdução do sinal semelhantes e que induzem a transcrição de novos genes; 4. Receptores de TNF – são parte de uma grande familia de proteinas (algumas não são receptores de citocinas) com dominios extracelulares triméricos conservados ricos em cisteinas, e mecanismos de sinalização intracelulares partilhados que induzem a apoptose ou estimulam a expressão de genes; 5. Receptores α-helicais com sete dominios membranares – são também designados receptores serpentina, porque os seus dominios transmembranares atravessam para trás e para a frente a membrana, e receptores acoplados a proteinas G, porque as suas vias de sinalização enfovem proteinas de ligação ao GTP (proteinas G). O genoma dos mamiferos codifica muitos destes receptores envolvidos em vários tipos de respostas ceulares. No sistema imune, membros desta classe de receptores medeiam respostas rápidas e transientes a quimiocinas e vários mediadores inflamatórios diferentes.

Os membros de uma familia definida pelos dominios extracelulares normalmente usam vias de sinalização semelhantes, mas podem existir excepções. No entanto, os principais mecanismos de transdução do sinal usados pelos receptores de citocinas podem ser resumidos na seguinte tabela: Joana Maria Soares Pereira

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FCUP/ICBAS Via de transdução do sinal

2009/2010 Receptores de citocinas

Via Jak-STAT

Receptores de citocinas tipo I e tipo II

Sinalização do receptor de TNF por TRAFs

Familia de receptores de TNF: TNRRII, CD40

Sinalização do receptor de TNF por dominios de morte

Familia de receptores de TNF: TNFRI, Fas

Via dominio TIR/IRAK

Receptores de IL-1 e IL-18

Receptores associados a cinases

Receptor de TGF-β, receptor de MCSF, receptor de factor stem cell

Sinalização de proteinas G

Receptores de quimiocinas

Imunologia Mecanismo de sinalização Fosforilação e activação dos factores de transcrição STAT mediadas por Jak Ligação das proteinas adaptadoras da familia TRAF, activação de factores de transcrição Ligação de proteinas adaptadoras da familia de dominios de morte, activação das caspases Ligação de cinases da familia IRAK a dominios TIR, activação de factores de transcrição Actividade cinase intrinseca no receptor, activação de factores de transcrição Torca de GTP e dissoação de Gα-GTP de Gβγ, Gα-GTP activa várias enzimas celulares

Antagonistas de Citocinas Já foi reportado um numero de proteinas que inibem a actividade biológica das citocinas. Estas proteinas actuam por um de dois modos: 1. Ligam directamente ao um receptor de citocinas mas não activam a célula; 2. Ligam directamente a citocina, inibindo a sua actividade. O inibidor mais bem caracterizado é o antagonista do receptor de L1 (IL-1Ra), que se liga ao receptor de IL-1 mas não apresenta actividade:   

A ligação de IL-1Ra ao receptor de IL-1 bloqueia a ligação de IL-1α e IL-1β; Julga-se que a produção de IL-1Ra tem papel da regulação da intensidade da resposta inflamatória; Foi clonado e está a ser investigado como um potencial tratamento de doenças inflamatórias crónicas.

Outros inibidores das citocinas são encontrados na corrente sanguinea e no fluido extracelular. Estes antagonistas soluveis têm origem na clivagem enzimática do dominio extracelular de receptores de citocinas. Entre os receptores de citocinas soluveis que foram detectados encontram-se aqueles para:  IL-2;  IFN-α e –γ;  IL-4;  TNF-β;  IL-6;  LIF.  IL-7; Destes, o receptor soluvel para IL-2 (sIL-2R), que é libertado na activação crónica de células T, é o melhor caracterizado. Um segmento que contem os 192 aminoácidos N-terminal da subunidade α é libertado por clivagem proteolitica, formando um receptor de IL-2 soluvel de 45 kDa. Este receptor é capaz de ligar IL-2 e prevenir a sua interacção com o receptor membranar de IL-2. A presença de sIL-2R Joana Maria Soares Pereira

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é usado como marcador da activação crónica de células T e é observada num numero de doenças, incluindo autoimunidade, rejeição de transplantes ou SIDA. Alguns virus também produzem proteinas de ligação a citocinas ou mimicos de citocinas. A evolução de tais estratégias anti-citocinas por patogénios microbianos é uma boa evidência biológica da importância das citocinas na organização e promoção de respostas imune anti-microbianas eficientes: 



Os poxvirus codificam uma proteina soluvel que liga TNF e uma proteina soluvel que liga IL-1. Como tanto o TNF como a IL-1 exibem um largo espectro de actividade na resposta inflamatória, estas proteinas soluveis que ligam citocinas podem proibir ou diminuir os efeitos inflamatórios das citocinas, conferindo assim ao virus uma vantagem selectiva; O virus Epstein-Barr produz uma molécula semelhante a IL-10 (IL-10 viral ou vIL-10) que se liga ao receptor de IL-10 e, como a IL-10 celular, suprime respostas mediadas por células T H1, que são efectivas contra muitos parasitas intracelulares como os virus.

Moléculas produzidas por virus que mimetizam as citocinas permitem que o virus manipule a resposta imune de modos que ajudam a sobrevivência do patogénio. Esta é uma modificação interessante e poderosa que alguns virus sofreram na sua luta continua para ultrapassar a barreira formidável da imunidade do hospedeiro. A seguinte tabela lista um numero de produtos virais que mimetizam citocinas ou os seus receptores: Virus Leporipoxvirus Vários poxvirus Vaccinia, virus da varíola Epstein-Barr Herpesvirus-8 humano Citomegalovirus

Produto Receptor soluvel de IFN-γ Receptor soluvel de IFN-γ Receptor soluvel de IL-10β Homólogo de IL-10 Homólogo de IL-6, homólogos das quimiocinas MIP-I e MIP-II Três homólogos de receptores de quimiocinas diferentes, um dos quais liga três quimiocinas soluveis diferentes (RANTES, MCP-1 e MIP-1α)

Para além destes antagonistas, é claro agora também que as células evoluiram mecanismos sofisticados para prevenir a respostas às citocinas. Como exemplo, existe a familia de proteinas supressoras da sinalização das citocinas (proteinas SOCS) que completam um loop de feedback negativo para atenuara transdução de sinal de citocinas que actuam através da via Jak/STAT: 

 



As proteinas SOCS inibem componentes da cascata de sinalização das citocinas via ligação directa ou prevenindo o acesso ao complexo de sinalização, actuando principalmente sobre a vias dos TLRs e do receptor da IL-1; As proteinas SOCS também parecem marcar transdutores de sinal para destruição proteossomal; Análises de ratinhos geneticamente modificados nos quais as proteinas SOCS são sobreespressas ou eliminadas estableceram que esta familia de reguladores negativos apresenta papeis indispensáveis na regulação das respostas das citocinas em células do sistema imune e noutros tecidos; Outras evidências sugerem também que a ruptura da expressão ou actividade das SOCS está associada com várias doenças imunes e inflamatória, o que faz crer que a manipulação da actividade das SOCS pode fornecer uma futura estratégia terapeutica na gestão de desordens imunológicas.

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Citocinas que Medeiam e Regula m a Imunidade Inata Um importante componente da resposta imune inata inicial a virus e bactérias é a secreção de citocinas, que medeiam muitas das funções efectoras da imunidade inata. As principais citocinas da imunidade inata são:           

Tumor necrosis factor (TNF); Interleucina-1 (IL-1); Quimiocinas; Interleucina-12 (IL-12; Interferões tipo I (IFN-α e IFN-β); Interleucina-10 (IL-10); Interleucina-6 (IL-6); Interleucina-15 (IL-15); Interleucina-18 (IL-18); Interleucina-23 (IL-23); Interleucina-27 (IL-27).

No entanto, uma citocina, o IFN-γ, tem papeis importantes na imunidade inata e na adaptativa. Joana Maria Soares Pereira

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Resumidamente, as caracteristicas destas citocinas são: Citocina

Tamanho (kD)

Principais fontes celulares

Principais alvos celulares e efeitos biológicos Células endoteliais: activação (inflamação, coagulação) Neutrófilos: activação Hipotálamo: febre Figado: sintese de proteinas de fase aguda Musuclo, tecido adiposo: catabolismo Vários tipos celulares: apoptose Células endoteliais: activação (inflamação, coagulação) Hipotálamo: febre Figado: sintese de proteinas de fase aguda

Tumor necrosis factor (TNF)

17 kD, 51 kD homotrimero

Macrófagos, células T

Interleucina-1 (IL-1)

17 kD forma madura; 33 kD precursores

Mcrófagos, células endoteliais, algumas células epiteliais

Quimiocinas

8-12 kD

Macrófagos, células endoteliais, células T, fibroblastos, plaquetas

Interleucina-12 (IL-12)

Heterodimero de 35 kD + subunidades 40 kD

Macrófagos, células dendriticas

IFNs tipo I (IFN-α, IFN-β)

IFN-α: 15-21 kD IFN-β: 2-25 kD

IFN-α: macrófagos IFN-β: fibroblastos

Interleucina-10 (IL-10)

Homodimero de 34-40 kD; subunidades 18 kD

Macrófagos, células T (principalmente células T reguladoras)

Interleucina-6 (IL-6)

19-26 kD

Macrófagos, células endoteliais, células T

Interleucina-15 (IL-15)

13 kD

Macrófagos, outras

Interleucina-18 (IL-18)

17 kD

Macrófagos

Células NK e células T: sintese de IFN-γ

Macrófagos e células dendriticas

Células T: manutenção das células T produtoras de IL-17

Macrófagos e células dendriticas

Células T: inibição das células TH1; possivel papel na diferenciação de TH1 Células NK: sintese de IFN-γ

Interleucina-23 (IL-23) Interleucina-27 (IL-27)

Heterodimero de subunidades unicas de 19 kD e 40 kD de IL-12 Heterodimero de subunidades de 28 kD e 13 kD

Leucócitos: quimotaxia, activação, migração para tecidos Células T: diferenciação TH1 Células NK e células T: sintese de IFN-γ, actividade citotóxica aumentada Todas as células: estado antiviral, expressão aumentada de MHC classe I Células NK: activação Macrofagos, células dendriticas: inibição da produção de IL-12 e expressão de coestimuladores e moléculas MHC classe II Figado: sintese de proteinas de fase aguda Células B: proliferação de células produtoras de antigénios Células NK: proliferação + Células T: proliferação (células CD8 de memória)

Tumor Necrosis Factor (TNF) O TNF é o principal mediador das respostas inflamatórias agudas contra bactérias gram-negativas e outros micróbios infecciosos e é responsável por muitas das complicações sistémicas das infecções sistémicas:  

O nome desta citocina deriva da sua identificação original como um factor sérico que causa necrose de tumores; O TNF é também designado TNF-α para distingui-lo do TNF-βaltamente relacionado, também designado linfotoxina (LT).

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Produção, Estrutura e Receptores Esta citocina pode ter várias fontes celulares, mas uma é principal entre todas:    

Fagócitos mononucleares activados – principal fonte de TNF; Células T estimuladas por antigénios; Células naturalmente assassinas; Mastócitos.

O estimulo mais potente que elicita a produção de TNF pelos macrófagos é a ligação de TLRs como LPS e outros produtos microbianos, e grandes quantidades desta citocina serão produzidas durante infecções por bactérias gram-negativas, que libertam LPS. No entanto, o IFN-γ, produzido por células T e células naturalmente assassinas, aumenta a sintese de TNF por macrófagos estimulados por LPS. Em fagócitos mononucleares, a sintese de TNF ocorre em vários passos e podemos ter dois tipos de TNF durante o processo: 

TNF membranar – o TNF é inicialmente sintetizado como uma proteina membranar do tipo II não-glicosilada com uma região N-terminal intracelular e uma grande região C-terminal extracelular. É expressa como um homodimero e é capaz de se ligar a receptores de TNF do tipo II (TNF-RII);



TNF secretada – a forma membranar do TNF é clivada por uma metaloproteinase associada à membrana libertando um polipéptido de 17 kD. Três destas cadeia polipéptidicas polimerizam para formar uma proteina de TNF circular com 51 kD. Esta TNF secretada assume uma forma de pirâmide triangular, sendo cada lado formado por uma subunidade. Os locais de ligação do receptor localizam-se na base da pirâmide, permitindo ligações simultâneas da citocina a três moléculas de receptor.

Existem dois receptores de TNF distintos, que apresentam ambos uma afinidade baixa não usual para receptores de citocinas: 1. Receptor de TNF do tipo I (TNF-RI) – tem tamanho molecular de 55 kD e uma constante de afinidade de 1x10-9 M; 2. Receptor de TNF do tipo II (TNF-RII) – tem tamanho molecular de 75 kD e uma constante de afinidade de 5x10-10 M. Ambos os receptores de TNF estão presentes na maior parte dos tipos de células. Os receptores de TNF são membros de uma familia de proteinas maior, muitas das quais estão envolvidas nas respostas imune e inflamatórias. Estes receptores existem como um trimero na membrana plasmática mesmo antes da ligação do TNF mas a transdução do sinal difere entre receptores: 

A ligação de citocinas a alguns membros da familia de receptores de TNF, como TNF-RI, TNF-RII e CD40 leva ao recrutamento de proteinas, designadas factores associados ao receptor de TNF (TRAFs) para os dominios citoplasmáticos dos receptores. Os TRAFs activam factores de transcrição, principalmente o factor nuclear κB (NF-κB) e a proteina activadora-1 (AP-1);

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A ligação de citocinas a outros membros da familia, como TNF-RI, leva ao recrutamento de uma proteina adaptadora que activa caspases e provoca apoptose.

Assim, diferentes membros da familia de receptore de TNF são capazes de induzir a expressão de gene a a morte celular, e alguns são capazes de fazer ambos. No entanto, ratinhos KO para TNF-RI mostram defesas do hospedeiro mais fracas, sugerindo que o TNF-RI é mais importante para a função da citocina. Acções Biológicas A principal função fisiológica do TNF é estimular o recrutamento de neutrófilos e monócitos para os locais de infecção e activar essas células a erradicar micróbios. O TNF medeia estes efeitos por várias acções nas células endoteliais vasculares e nos leucócitos: 



O TNF induz as células endoteliais vasculares a expressar moléculas de adesão que torna a superficie endotelial adesiva para os leucócitos, inicialmente para os neutrófilos e subsequentemente para os monócitos e linfócitos. As moléculas de adesão mais importantes são as selectinas e ligandos para as integrinas dos leucócitos; O TNF estimula as células endoteliais e os macrófagos a secretar quimiocinas que aumentam a afinidade das integrinas dos leucócitos para os seus ligandos e induzem a quimotaxia e recrutamento de leucócitos. O TNF também actua em fagócitos mononucleares para estimular a

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secreção de IL-1, que funciona de modo semelhante ao TNF. Este é um exemplo de cascata de citocinas que apresentam actividade biológicas semelhantes ou complementares; O TNF estimula as actividades microbicidas dos neutrófilos e macrofagos.

As acções do TNF nas células endoteliais e nos leucócitos são criticas para as respostas inflamatórias locais contra os micróbios. Se quantidades inadequadas de TNF estão presentes (e.g., em animais tratados com anticorpos neutralizantes anti-TNF ou ratinhos KO para o gene TNF), uma consequência será a fallha na contenção de infecções. O TNF também contribui para as reacções inflamatórias locais que são nocivas para o hospedeiro (e.g., nas doenças autoimunes) e anticorpos neutralizantes para o TNF e receptores soluveis de TNF podem reduzir a inflamação em pacientes com artrite reumatóide e doença inflamatória intestinal.

Em infecções severas, o TNF é produzido em grandes quantidades e causa anormalidades patológicas e danos sistémicos. Se o estimulo para a produção de TNF for suficientemente forte, a quantidade de citocina produzida é tão grande que ela entra na corrente sanguinea e actua em locais distantes como uma hormona endocrina. As principais acções sistémicas do TNF são as seguintes: 



O TNF actua no hipotálamo para induzir febre e é, assim, designado como um pirogénio engógeno (para destingui-lo do LPS, que funciona como um pirogénio exógeno, derivado de micróbios). A produção de febre em resposta ao TNF (e IL-1) é mediada pela sintese aumentada de prostaglandinas pelas células hipotalámicas estimuladas pelas citocinas. Os inibidores da sintese de prostaglandias, como a aspirina, reduzem a febre bloquenado esta acção do TNF e da IL-1; O TNF actua nos hepatócitos para aumentar a sintese de certas proteinas séricas, como a proteina sérica amilóide A e fibrinogénio. O aumento de proteinas plasmáticas derivadas dos hepatócitos induzida pelo TNF e pela IL-1 e IL-6, duas outras citocinas da imunidade inata, constitui a resposta de fase aguda do estimulo inflamatório;

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A produção prolongada de TNF causa a pera de células musculares e de adipócitos. Esta perda resulta da supressão do apetite induzida pelo TNF e da sintese reduzida de lipoproteina lipase, uma enzima necessária para a libertação de ácidos gordos da lipoproteina circulantes de modo que estes não podem ser usados pelos tecidos; Quando grandes quantidades de TNF são produzidas, com concentrações séricas de cerca 10-7 M ou mais, a contractilidade do miocardio e o tonus do musculo liso vascular são inibidos, resultando uma queda marcada da pressão arterial, ou choque; O TNF causa trombose intravascular, principalmente como um resultado da perda das propriedade anticoagulantes normais do endotélio. O TNF estimula a expressão de factor tecidular pelas células endoteliais, um potentes activador da coagulação, e inibe a expressão de trombomodulina, um inibidor da coagulação. As alterações endoteliais são exacerbadas pelas actiação de neutrófilos, levando à tamponação por essas células. A habilidade desta citocina causar a necrose de tumores é um resultado da trambose dos vassos sanguineos tumorais; Elevados niveis circulantes de TNF causam disturbios metabólicos severos, como uma queda das concentrações de açúcar no sangue a niveis incompativeis com a vida. Isto deve-se ao uso elevado da glucose pelo musculo e à impossibilidade do figado repor a glucose.

Uma complicação da sepse bacteriana gram-negativa pode levar a um sindrome designado choque séptico (ou choque endotoxina), que é caracterizado por colapso vascular, coagulação intravascular disseminada e disturbios metabólicos: 

 

Deve-se à produção exacerbada de TNF e outras citocinas, incluindo IL-12, IFN-γ e IL-1, induzidas pelo LPS. Assim, a concentração de TNF sérica pode dar informação sobre infecções graves por bactérias gram-negativas; O choque séptico pode ser reproduzido em animais experimentais pela administração de LPS ou TNF; Antagonistas do TNF podem prevenir a mortalidade em modelos experimentais mas ensaios clinicos como anticorpos anti-TNF ou com receptores soluveis para o TNF não mostraram beneficios para os pacientes com sepse, talvez porque outras citocinas podem elicitar as mesmas respostas do TNF.

Existem várias citocinas e proteinas membranares pertencentes à familia de TNF e receptores de TNF, e todos têm funções importantes nas respostas imunes inata e adaptativa: 

  

Ligando CD40 e ligando Fas – ambos expressos em linfócitos T activados. O primeiro medeia a activação de macrófagos e células B e o segundo está envolvido na eliminação de alguns tipos de células; BAFF e APRIL – desempenham papeis importantes na sobrevivência e diferenciação de células B; Ligando relacionado com o TNF induzido por glucocorticoides (GITR) e ligando OX40 – são moléculas da familia TNF que podem estar envolvidas na regulação da resposta das células T; Receptor activador de NF-κB – expresso em osteoclastos e alguns macrófagos e células dendriticas. A citocinas que é o ligando deste receptor, designada ligando RANK, é produzida por células T activadas. A produção desta citocina activa os osteoclastos e, assim, tem um papel importante na reabsorção de osso em muitos estados de doença, notavelmente a artrite reumatóide.

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Interlucina-1 (IL-1) A principal função da IL-1, semelhante à do TNF, é funcionar como um mediador da resposta inflamatória do hospedeiro a infecções e outros estimulos. Esta citocina trabalha em conjunto com o TNF na imunidade inata e na inflamação. Produção, Estrutura e Receptores Esta citocina pode ter várias fontes celulares, mas uma é principal entre todas:    

Fagócitos mononucleares activados – principal fonte de IL-1. Sintese induzida por produtos microbianos, como LPS, e por outras citocinas, como TNF; Neutrófilos; Células epiteliais (e.g., queratinócitos); Células endoteliais.

Existem duas formas de IL-1, IL-1α e IL-1β, que são menos de 30% homólogas uma da outra mas ligam ao mesmo receptor de superficie e aprsentam as mesmas actividades biológicas. Ambos os polipeptideos IL-1 são sintetizados como precursores de 33 kD e são secretados como proteinas maduras de 17 kD:  



A forma activa da IL-1β é a forma clivada, mas a IL-1α é activa tanto como precursor de 33 kD ou como produto clivado menor; A IL-1β é clivada pela cisteina protease caspase-1 (também designada enzima conversora de IL1β), que foi o primeiro membro da familia de caspases, muitas das quais envolvidas na morte apoptótica, a ser identificado; A IL-1 é secretada por uma via não-clássica visto que, ao contrário da maior parte das proteinas secretadas, nem a IL-1α nem a IL-1β apresentam sequências sinais hidrofóbicas que encaminham o polipeptideo nascente para o reticulo endoplasmático.

IL-1α

IL-1β

A IL-1 medeia os seus efeitos biológicos através de um receptor membranar designado receptor IL-1 do tipo I, que usa vias de transdução do sinal qua activam os factores de transcrição NF-κB e AP-1. Este receptor é um membro de uma familia de proteinas membranares integrais que contêm um dominio extracelular de ligação ao ligando do tipo imunoglobulina e um dominio de sinalização TIR na região citoplasmática. Joana Maria Soares Pereira

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Imunologia

Os eventos de sinalização que ocorrem quando a IL-1 se liga ao receptor de IL-1 do tipo I são semelhantes aqueles associados com os TLRs, já que o dominio TIR também se encontra nos TLRs: 

Após a ligação de IL-1, a proteina adaptadora MyD88 é recrutada para o dominio TIR, seguida por duas proteina cinases, a cinase-4 associada com o receptor de IL-1 (IRAK4) e IRAK, e outra proteina adaptadora, TRAF-6;



A sinalização a jusante envolve vários eventos de fosforilação e formação de novos complexos com outras cinases e proteinas adaptadoras, eventualmente levando à activação de NF-κB.

Acções Biológicas Os efeitos biológicos da IL-1 são semelhantes aos do TNF e dependenm da quantidade de citocinas produzidas: 



Quando secretada a baixas concentrações, a IL-1 funciona como mediador da inflamação local. Actua nas células endoteliais para aumentar a expressão de moléculas de superficie que medeiam a adesão de leucócitos, como ligandos para as integrinas; Quando secretada em grandes quantidades, a IL-1 entra na corrente sanguinea e exerce efeitos endócrinos. A IL-1 sistémica induz febre, sintese de proteinas plasmáticas de fase aguda pelo figado, directamente e indirectamente através da estimulação da produção de IL-6, e produção de neutrófilos e plaquetas na medula óssea.

As semelhanças entre as acções da IL-1 e as do TNF parecem supreendentes porque as citocinas e os seus receptores são estruturalmente diferentes. A explicação provável para os efeitos biológicos semelhantes é que ambos os receptores de citocinas sinalizam através de proteinas homólogas e activam os mesmos factores de transcrição. Contudo, existem várias diferenças entre a IL-1 e o TNF. Por exemplo, a IL-1 não induz a morte apoptótica das células e, mesmo a altas concentrações sistémicas, não causa alterações patofisiológicas de choque séptico por si só. Os fagócitos mononucleares produzem um antagonista natural da IL-1 (IL-1Ra) que é estruturalmente homólogo da citocinas e liga aos mesmos receptores mas não é biologicamente activo, sendo assim um inibidor competitivo da IL-1:  

Pode ser um regulador endógeno da acção de IL-1; É usado para para tratar artrite reumatóide sistémica juvenil.

No entanto, a regulação da inflamação mediada pela IL-1 pode também ocorrer por expressão de receptores do tipo II, que liga IL-1 mas não traduz sinal. A principal função deste receptor será actuar como uma armadilha que inibe competitivamente a ligação de IL-1 ao receptor de sinalização do tipo I. Joana Maria Soares Pereira

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Quimiocinas As quimiocinas são uma grande familia de citocinas estruturalmente homólogas que estimulam o movimento de leucócitos e regulam a migração de leucócitos do sangue para os tecidos. Assim, o nome quimiocinas é uma contracção de “citocinas quimotácticas”:  

Algumas quimiocinas são produzidas por várias células em resposta a estimulos inflamatórios e recrutam leucócitos para os locais de infecção; Outras quimiocinas são produzidas constitutivamente em vários tecidos e recrutam leucócitos (principalmente linfócitos) para esses tecidos na ausência de inflamação.

Produção, Estrutura e Receptores Existem cerca de 50 quimiocinas humanas, todas delas sendo polipeptideos de 8-12 kD que contêm dois loops internos dissulfito. As quimiocinas são classificadas em quatro familias com base no numero e localização dos seus residuos de cisteina N-terminal:    

Familia CC - é uma das duas principais familias de quimiocinas, e os dois residuos de cisteina estão adjacentes; Familia CXC – é uma das duas principais familias de quimiocinas, e os dois residuos de cisteina encontram-se separados por um outro aminoácido; Familia C – apenas apresenta uma cisteina; Familia CX3C – as duas cisteinas encontram-se separadas por três aminoácidos.

Estas diferenças correlacionam-se com a organização das subfamilias em grupos de genes diferentes. As quimiocinas eram originalmente denominadas com base no modo como eram identificada e que respostas provocavam. Mais recentemete, uma nomenclatura standard é usada em parte com base nos receptores a que ligam. As quimiocinas das subfamilias CC e CXC são produzidas por leucócitos e por vários tipos de células tecidulares, como células endoteliais, epiteliais e fibroblastos:  

Em muitas destas células, a secreção de quimiocinas é induzida por micróbios, via sinalização do TLR, e por citocinas inflamatória, principalmente TNF e IL-1; Várias quimiocinas CC são também produzidas por células T estimuladas por antigénios, fornecendo uma ligação entre a imunidade adaptativa e o recrutamento de leucócitos inflamatórios.

As quimiocinas que são produzidas constitutivamente (i.e., sem qualquer estimulo inflamatório) nos órgãos linfóides estão envolvidas no trafego fisiológico de linfócitos através dos órgãos:

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



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As quimiocinas ligam-se a proteoglicanos nas células endoteliais e são apresentadas deste modo a leucócitos circulantes que se ligaram às superficies endoteliais via interacções dependnetes de selectinas; A apresentação endotelial fornece uma alta concentração local de quimiocinas, que causa a activação de integrinas dos leucócitos, fortalecendo a adesão, e a estimulação da mobilidade dos leucócitos e trans-migração através da parede do vaso sanguineo.

Os receptores das quimiocinas são receptores acoplados a proteinas G como sete dominios transmembranares α-helicais:   

Quando ocupados pelo ligando, estes receptores actuam como proteinas de troca de GTP, catalizando substituição de GDP por GTP; A forma associada ao GTP destas proteinas é capaz de activar uma variedade de enzimas celulares que modulam a configuração proteica do citosqueleto e a afinidade das integrinas; Os receptores de quimiocinas podem ser rapidamente inibidos, e este é um mecanismo provável para terminar as respostas.

Pelo menos 10 receptores distintos para quimiocinas CC (designados CCR1-CCR10) e seis para quimiocinas CXC (designados CXCR1-CXCR6 foram já identificads, e esta lista deve estar incompleta. Os receptores de quimiocinas são expressos em leucócitos, com os maiores numeros e diversidade observados nas células T. Os receptores exibem especificidade sobrepostas para quimiocinas entre cada familia, e os padrões de expressão celular dos receptores determina quais os tipos de células que respondem a qual quimiocina:  

Certos receptores de quimiocinas, principalmente CCR5 e CXCR4, actuam como co-receptores para o virus da imunodeficiência humana (HIV); Alguns linfócitos T activados secretam quimiocinas que ligam ao CCR5 e bloqueiam a infecção com HIV competindo com o virus.

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As quimiocinas e receptores conhecidas e as suas principais funções são as seguintes: Quimiocina Quimiocinas CC CCL1 CCL2 CCL3

Nome original

Receptor da quimiocina

I-309 MCP-1 MIP-1α

CCR8 CCR2 CCR1, CCR5

CCL4

MIP-1β

CCR5

CCL5 CCL7 CCL8 CCL9/CCL10 CCL11 CCL12 CCL13 CCL14 CCL15 CCL16 CCL17 CCL18

RANTES MCP-3 MCP-2 Eotaxina Desconhecido MCP-4 HHC-1 MIP-1δ HHC-4 TARC DC-CK1

CCR1, CCR3, CCR5 CCR1, CCR2, CCR3 CCR3, CCR5 CCR1 CCR3 CCR2 CCR2, CCR3 CCR1, CCR5 CCR1, CCR3 CCR1, CCR2 CCR4 ?

CCL19

MIP-3β/ELC

CCR7

CCL20

MIP-3α

CCR6

CCL21

SLC

CCR7

CCL22 CCL23 CCL24 CCL25 CCL26 CCL27 CCL28 (Cont.)

MDC MPIF-1 Eotaxina-2 TECK Eatoxina-3 CTACK MEC

CCR4 CCR1 CCR3 CCR9 CCR3 CCR10 CCR10

Joana Maria Soares Pereira

Principal função Recrutamento de monócitos e migração de células endoteliais Recrutamento de leucócitos Recrutamento de leucócitos Recrutamento de células T, células dendriticas, monócitos e células NK, co-receptor do HIV Recrutamento de leucócitos Recrutamento de leucócitos Recrutamento de leucócitos ? Recrutamento de eosinófilos, basófilos e TH2 Recrutamento de leucócitos Recrutamento de leucócitos ? Recrutamento de leucócitos ? Recrutamento de células T e basófilos Alojamento de linfócitos e células dendriticas Migração das células T e das células dendriticas para zonas parafoliculares dos nodos linfáticos ? Migração das células T e das células dendriticas para zonas parafoliculares dos nodos linfáticos Recrutamento de células T e basófilos ? Recrutamento de eosinófilos, basófilos e TH2 Migração dos astrócitos Recrutamento de eosinófilos, basófilos e TH2 Migração de células da derme Migração de células da derme

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Quimiocina Nome original Quimiocinas CXC CXCL1 GROα CXCL2 GROβ CXCL3 GROγ CXCL4 PF4 CXCL5 ENA-78 CXCL6 GCP-2 CXCL7 NAP-2 CXCL8 IL-8 CXCL9 Mig CXCL10 IP-10 CXCL11 I-TAC CXCL12 SDF-1α/β CXCL13 BCA-1 CXCL14 BRAK CXCL16 Quimiocinas C XCL1 Linfotactina XCL2 SCM-1β Quimiocinas CX3C CX3CL1

Fractaquina

Receptor da quimiocina CXCR2 CXCR2 CXCR2 CXCR3B CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR3 CXCR3, CXCR3B CXCR3 CXCR4 CXCR5

Imunologia Principal função

CXCR6

Recrutamento de neutrófilos Recrutamento de neutrófilos Recrutamento de neutrófilos Agregação de plaquetas Recrutamento de neutrófilos Recrutamento de neutrófilos Recrutamento de neutrófilos Recrutamento de neutrófilos Recrutamento de células T efectoras Recrutamento de células T efectoras Recrutamento de células T efectoras Recrutamento de leucócitos, co-recepotr do HIV Migração das células B para os foliculos ? ?

XCR1 XCL1

Recrutamento de células T e células NK ?

CX3CR1

Recrutamento de células T, células NK e macrófagos; activação de células T citotóxicas e de células NK

Acções Biológicas As quimiocinas envolvidas nas reacções inflamatórias são produzidas por leucócitos em resposta a estimulos externos, e as quimiocinas que regulam o trafego celular através dos tecidos são produzidas constitutivamente por várias células nesses tecidos. As quimiocinas foram discobertas com base na suas actividades quimio-atractoras, mas sabe-se já que elas têm várias funções importantes no sistema imune e noutros sistemas: 

As quimiocinas recrutam as células da defesa do hospedeiro para locais de infecção. O recrutamento de leucócitos é regulado por várias acções sequenciais das quimiocinas nestas células. As quimiocinas ligadas a proteoglicanos nas células endoteliais actuam em leucócitos que rolam sobre a superfice endotelial e aumentam a afinidade das integrinas dos leucócitos para os seus ligandos, o que permite que o TNF, a IL-1 e as quimiocinas funcionem cooperativamente. As quimiocinas induzem o movimento dos leuc+ocitos e a sua migração através de um gradiente quimico de citocinas estimulando a polimerização e despolimerização alternadas dos filamentos de actina. Diferentes quimiocinas actuam em diferentes células e, em coordenação com o tipo de molécula de adesão expressa, controlam assim a natureza do infiltrado inflamatório;



As quimiocinas regulam o trafego de linfócitos e outros leucócitos através dos tecidos linfóides periféricos. Diferentes quimiocinas promovem a migração de células T, células B e células dendriticas para órgãos linfóides periféricos. Várias quimiocinas também promovem a migração de células T efectoras e de memória previamente activadas para tecidos não linfóides, incluindo orgãos mucosos e a pele. Estas selectividade dos diferentes tipos de células para

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Imunologia

diferentes locais anatómicos depende a uma grande extensão do local onde as quimiocinas são produzidas e dos receptores de quimiocinas que são expressos nessas células; 

As quimiocinas promovem a angiogénese e a cura de feridas. Estas actividades estão associadas principalmente com a familia de quimiocinas CXC, e envolve tanto quimiocinas próangiogénicas, expressas logo após o dano do tecido, e quimiocinas anti-angiogénicas, expressas no final do processo de cura. Os efeitos angiogénicos podem ser uma combinação da produção de factores inflamatórios pelas células inflamatórias e pelos fibroblastos sob indução das quimiocinas e de efeitos directos das quimiocinas nas células vasculares, como células endoteliais, que expressam o receptor CXCR2;



As quimiocinas estão envolvidas no desenvolvimento de diversos orgãos não linfóides. Ratinhos KO para o receptor CXCR4 apresentam defeitos fatais no desenvolvimento do coração e do cerebelo. Estes papeis das quimiocinas aumetam a possibilidade de muitas outras funções, ainda não descobertas, de envolvimento na morfogénese.

Interleucina-12 (IL-12) A IL-12 é um mediador principal da resposta imune inata inicial contra micróbios intracelulares e é um indutor chave da imunidade mediada por células, a resposta imune adaptativa contra esses micróbios:  

Esta citocina foi originalmente identificada como um activador da função citotóxica das células naturalmente assassinas; As suas acções mais importantes são estimular a produção de IFN-γ pelas células T e células NK e suportar a diferenciação de células TH CD4+ naive em células produtoras de IFN-γ (TH1).

Produção, Estrutura e Receptores A IL-12 existe como um heterodimero ligado por pontes dissulfureto de subunidade de 35 kD (p35) e 40 kD (p40): 



Subunidade p35 – tem uma estrutura globular constituida por quatro hélices α, que é partilhada por várias citocinas diferentes do tipo I ou da familia de citocinas hematopoiéticas; Subuinidade p40 – é homóloga à porção extracelular da cadeia α do receptor de IL-6.

A IL-12 pertence a uma familia de pelo menos cinco citocinas heterodiméricas cujas subunidades são homólogas a uma ou a ambas as cadeias p35 e p40 da IL-12. Dois membros desta familia, IL-23 e IL-27, têm papeis importantes, em conjunto com a IL-12, nas respostas imune protectoras e patológicas mediadas por células T. A síntese de IL-12 é feita pelas células dendriticas activadas e os macrófagos activados: 

Muitas células parecem sintetizar a subunidade p35, mas apenas os fagócitos e as células dendriticas produzem o componente p40 e, assim, a citocina biologicamente activa;

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





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Durante as reacções imunes inatas a micróbios, a IL-12 é produzida em resposta à sinalização do TLR induzida por vários estimulos microbianos, incluindo LPS, infecção por bactérias intracelulares e infecções por virus; Em adição, as células TH estimulados por antigénios induzem a produção de IL-12 por macrófagos e células dendriticas, principalmente pela ligação do ligando CD40 das células T ao CD40 das células dendriticas e dos macrófagos; O IFN-γ produzido por células NK ou células T também estimula a produção de IL-12.

Assim, a IL-12 é produzida pelas APCs quando elas:  

Apresentam antigénios a células T; Durante as fases de indução e efectora das respostas imunes mediadas por células.

O receptor da IL-12 (IL-12R) é um mebro da familia de receptores de citocinas do tipo I. É um heterodimero composto por subuinidades β1 e β2, sendo ambas homólogas a uma subunidade do receptor de IL-6. A p40 da IL-12 liga-se à subunidade β1 do receptor da IL-12 e a p35 liga-se à subunidade β2, sendo ambas as cadeias necessárias para uma ligação com alta afinidade à citocina e para a sinalização. A via de sinalização usada pelo receptor da IL-12 é a via JakSTAT, na qual: 



A ligação da citocina ao receptor activa as proteinas tirosina cinases associadas ao receptor designadas Janus cinases (Jak); No fim leva à activação de factores de trascrição designados transdutores do sinal e activadores da transcrição (STATs).

Muitas citocinas usam esta via para induzir respostas em células alvo, e diferentes citocinas activam diferentes combinações de Jaks e STATs. No caso do receptor da IL-12:  

A Jak Tyk2 associa-se com a subunidade β1 do receptor e a Jak2 associa-se com a subunide β2; A proteina STAT principalmente envolvida, que é necessária para a maior parte dos efeitos biológicos da IL-12, é a STAT4.

A expressão da cadeia β2 do receptor da IL-12 é aumentada por citocinas, principalmente pelo IFN-γ (cuja produção é estimulada pela IL-12), e isto é um exemplo de uma loop positivo de amplificação nas respostas imunes. Acções Biológicas A IL-12 é crucial para a iniciação da sequência de respostas que envolvem os macrófagos, as células NK e os linfócitos T que resulta na eliminação total dos micróbios intracelulares: Joana Maria Soares Pereira

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A IL-12 estimula a produção de IFN-γ pelas células NK e pelos linfócitos T. Os macrófagos e as células dendriticas produzem IL-12 em resposta a muitos micróbios. A IL-12 secretada estimula as células NK e as células T a produzir IFN-γ, que depois activa os macrófagos a matarem os micróbios fagocitados. Assim, a imunidade inata contra muitos micróbios é mediada por citocinas que actuam na seguinte sequência: Micróbios → macrófagos e células dendriticas → IL-12 → IFN-γ → activação dos macrófagos → morte dos micróbios Grandes quantidades de IL-12 são produzidas em sepse severa por gram-negativas, resultando na produção de IFN-γ, que actua em sinergia com o LPS bacteriano estimulando a produção de TNF pelos macrófagos, o principal mediador do choque séptico. Antagonistas da IL-12 previnem a letalidade em alguns modelos experimentais de choque séptico induzido por LPS;



A IL12, em conjunto com o IFN-γ, promove a diferenciação de linfócitos TH CD4+ em células TH1 produtoras de IFN-γ. O subgrupo TH1 das células TH activa fagócitos na imunidade mediada por células;



A IL-12 aumenta as funções citotóxicas de células NK e células T CD8 +, ambas activadas. Esta função é também importante na imunidade mediada por células.

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Estudos com ratinhos KO e o fenótipo raro de pacientes com mutações no receptor de IL-12 suportam a conclusão de que a IL-12 é importante para a produção de IFN-γ, diferenciação de células TH1 e para a resistência do hospedeiro a micróbios intracelulares. No entanto, a interpretação destes defeitos genéticos é complicada devido ao facto dos genes mutados estarem também envolvidos na função da IL-23, porque esta contem a mesma cadeia p40 e porqeu o seu receptor apresenta IL-12Rβ1. E ainda, a sisntese de IFN-γ não é completamente eliminada em ratinhos deficientes em IL-12 provavelmente devido à acção de citocinas compensatórias. A IL-12 é uma ponte importante entre a imunidade inata e adaptativa pois:  

É produzida durante as reacções imunes inatas inicias contra micróbios intracelulares; Promoven as respostas imunes adaptativas que protegem o hospedeiro contra esses micróbios.

Interferões do Tipo I (IFNs) Os interferões do tipo I (IFNs) são uma grande familia de citocinas estruturalmente relacionadas que medeiam a resposta imune inata inicial contra infecções virais. O termo interferão deriva da habilidade destas citocinas interferirem com a infecção viral. Existem muitos IFNs do tipo I, todos eles com uma homologia estrutural considerável e codificados por genes num único cluster no cromossoma 9. Em humanos, os IFNs do tipo I incluem:     

IFN-α (que pode depois ser sub-dividido em 13 subtipos diferentes); IFN-β; IFN-ε; IFN-κ; IFN-ω.

Produção, Estrutura e Receptores As células dendriticas plasmocitoides e os fagócitos mononucleares são as principais fintes de IFN-α. Por outro lado, o IFN-β é uma unica proteina produzida por várias célula, como os fibroblastos, e é por vezes designada IFN dos fibroblastos. As células dendriticas plasmocitoides, que circulam no sangue humano e estão presentes em vários tecidos, são uma fonte particular de IFNs do tipo I na resposta inata inicial contra muitos virus e os principais estimulos para a sintese de IFNs do tipo I são: 



 

O estimulo mais potente são os ácidos nucleico virais, que se ligam a vários receptores intracelulares ou sensores qye estão ligados à via de sinalização que activa a familia de factores de transcrição factor regulador do interferão (IRF); TLR3, TLR7 e TLR9, todos nas membranas endossomais, reconhecem dsRNA, DNA de cadeia simples e DNA CpG não-metilado, respectivamente, levando a activação do IRF e à expressão de genes; Os sensores citoplasmáticos RIG-I e MDA-5 reconhecem RNA viral e também induzem a expressão de IFN do tipo via activação de RIF; Células T activadas por antigénios estimulam os fagócitos monucleares a produzirs IFNs do tipo através da via CD40-CD40L.

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Todos os IFNs do tipo I ligam o mesmo receptor de superficie e induzem respostas biológicas semelhantes. O receptor de IFN do tipo I é um membro da familia de receptores de citocinas do tipo II composto por um heterodimero de dois polipeptideos estruturalmente relacionados, IFNAR1 e IFNAR2, que estão associados com as tirosinas cinases da familia Janus Tyk2 e Jak1, respectivamente. Após ligação ligação dos IFN do tipo I ao receptor, via clássica de sinalização que transduz o sinal dos IFNs do tipo I é:  

As cinases ficam activas e levam à fosforilação de STAT1 e STAT2, formação de um heterodimero e recrutamento de IRF9; O complexo STAT-1/2:IRF9 resultante transloca-se para o núcleo e liga-se a sequências de ácidos nucleicos designadas elementos de resposta estimulados por IFN (ISREs) que estão presentes em vários genes diferentes, induzindo a sua transcrição.

Em adição a esta via clássica de sinalização pelo receptor de IFN do tipo I, várias outras vias de sinalização iniciadas pelo receptor de IFNs do tipo I também contribuem para as respostas biológicas das células a IFNs do tipo I: 



A fosforilação de STAT1 leva à formação de homodimeros de STAT1 que ligam a diferentes sequências de ácidos nucleicos, designadas IFN-γ-activated sites (GAS), que estão presentes em alguns dos genes que contêm ISREs e noutros genes; O receptor de IFNs do tipo I também activa vias dependentes de MAP cinases e vias de PI-3 cinase, ambas contribuindo para as respostas biológicas das células a IFNs do tipo I.

É importante salientar que a regulação pelos IFNs do tipo I da transcrição de genes é regulada por diferentes proteinas co-activadoras, que formam complexos com dimeros STAT ligados a sequências ISRE e GAS. Joana Maria Soares Pereira

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Acções Biológicas As acções dos IFNs do tipo I protegem contra infecções virais e promovem a imunidade mediada por células contra micróbios intracelulares: 

Os interferões do tipo I inibem a replicação viral. O IFN leva a que as células sintetizem um numero de enzimas que interferem com a transcrição de RNA ou DNA viral e com a replicação viral. A acção antiviral dos IFNs do tipo I é principalmente uma acção parácrina, pelo que uma célula infectada por um virus secreta IFN para proteger células vizinhas que não estão infectadas. Uma célula que respondeu ao IFN e é resistente a infecções virais encontra-se em estado antiviral. O IFN secretado por uma célula infectada pode também actuar de um modo autocrino para inibir a replicação viral nessa célula;



Os IFNs do tipo I aumentam a expressão de moléculas MHC classe I. Como as CTLs CD8+ reconhecem antigénios estranhos ligados a moléculas MHC classe I, o IFN do tipo I aumenta o reconhecimento de antigénios virais associados a classe I em células infectadas e, assim, a eficiência da morte dessas células mediada por CTLs. O IFN tipo I também aumenta a actividade citotóxica de células NK;



Os interferões do tipo I estimulam o desenvolvimento de células TH1 em humanos. Este efeito deve-se principalmente à habilidade dos IFNs do tipo I promoverem nas células T a expressão de receptores funcionais para a principal citocina indutora de TH1, IL-12;



Os IFNs do tipo I promovem o sequestro de linfócitos nos nódulos linfáticos, aumentando assim a activação dos linfócitos por antigénios concentrados no nódulos, especialmente nas infecções virais;



Os interferões do tipo I inibem a proliferação de vários tipos de células, incluindo linfócitos, in vitro. Isto deve-se à indução das mesmas enzimas que bloqueiam a replicação viral, mas isto também envolve outras enzimas que alteram o metabolismo de aminoácidos como triptofano.

Assim, as principais actividades dos IFNs do tipo I funcionam em conjunto para eliminar as infecções virais: 

Ratinhos KO pra o receptor de IFNs do tipo I são susceptiveis a infecções virais;

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 

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Imunologia

IFN-α está em uso clinico como um agente anti-viral para alguns problemas hematológicos malignos; IFN-β é usado como uma terapia para a esclerose multipla, mas os mecanismos do seu efeito benáfico nesta doença ainda são desconhecidos.

Interleucina-10 (IL-10) A IL-10 é um inibidor dos macrófagos e células dendriticas activadas e, assim, está envolvida no controlo das reacções imunes inatas e da imunidade mediada por células. Produção, Estrutura e Receptores A IL-10 é um membro de uma familia de citocinas diméricas nãocovalentemente ligadas, sendo que cada cadeia contem um dominio de seis α-hélices que intercalam com a outra cadeia. A esta familia também pertencem IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26: 

 

O receptor de IL-10 pertence à familia de receptores de citocinas do tipo II e consiste em duas cadeias, que se associam com as cinases da familia Janus Jak1 e Tyk2, sendo a STAT3 a principal molécula a jusante na sinalização a ser induzida pela IL-10; A IL-10 é produzida principalmente por macrófagos e células T reguladoras, ambas activadas; Como é tanto produzida por e inibe as funções dos macrófagos, esta citocina é um exemplo de um regulador de feedback negativo.

Não é claro quais os diferentes estimulos que poderão actuar nos macrófagos para induzir a produção de uma citocina regulatória como a IL-10 ou citocinas efectoras como TNF e IL-12, ou quais os estimulos que elicitam a produção de todas estas citocinas mas com diferentes cinéticas. No entanto, a IL-10 é também produzida por alguns tipos de células não-linfóides (e.g., queratinócitos). Acções Biológicas Os efeitos biológicos da IL-10 resultam da sua habilidade para inibir muitas das funções dos macrófagos activados. Os macrófagos respondem aos mic´robios secretando citocinas e expressando coestimuladores que aumenta a activação de células T e a imunidade mediada por células. A IL-10 actua nos macrófagos activados para terminar essas respostas e levar o sistema ao seu estado de repouso quando a infecção é eliminada: 

A IL-10 inibe a produção de IL-12 por macrófagos activados e pelas células dendriticas. Como a IL-12 é um estimulo critico para a secreção de IFN-γ e é um indutor das reacções imunes inatas e mediadas por células contra micróbios intracelulares. De facto, a IL-10 foi dscoberta como um inibidor da produção de IFN-γ;



A IL-10 inibe a expressão de co-estimuladores e de moléculas MHC classe II em macrófagos e células dendriticas. Devido a estas acções, a IL-10 serve para inibir a activação das células T e terminar as reacções imunes mediadas por células.

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O virus Epstein-Barr contem um gene homólogo à IL-10 humana, e a IL-10 viral tem as mesma actividade da citocina natural. Isto levanta a possibilidade interessante de que a aquisição do gene IL-10 durante a evolução do virus deu-lhe a habilidade de inibir a imunidade do hospedeiro e, assim, uma vantagem de sobrevivência no hospedeiro afectado. Outras Citocinas da Imunidade Inata A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina que funciona tanto na imunidade inata como na adaptativa: 

  

É sintetizada pelos fagócitos mononucleares, células endoteliais vasculares, fibroblastos e outras células em resposta a micróbios e outras citocinas, principlamente IL-1 e TNF. É também produzida por algumas células T activadas; A forma funcional da IL-6 é um homodimero, com cada subunidade a formar um dominio globular de quatro α-hélices; O receptor de IL-6 consiste numa proteina de ligação à citocina e numa subunidade de transdução do sinal, ambas pertencendo à familia de receptores de citocinas do tipo I; A principal via de sinalização induzida pela IL-6 envolve a activação de Jak1 e STAT3, e leva à transcrição de diferentes genes.

A IL-6 tem diversas acções, entre elas: Joana Maria Soares Pereira

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 

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Imunologia

Na imunidade inata, estimula a sintese de proteinas de fase aguda pelas hepatócitos e, assim, contribui para a resposta de fase aguda; Estimula a produção de neutrófilos, normalmente actuando em conjunto com factores estimuladores de colónias; Na imunidade adaptativa, a IL-6 estimula o crescimento de linfócitos B que se diferenciaram em produtores de anticorpos; Actua de modo semelhante como factor de crescimento para plasmócitos neoplásticos (mielomas), e muitas células de mieloma que crescem autonomamente secretam IL-6 como factor de crescimento autocrino; É capaz de promover o crescimento de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais, que são derivados dos mielomas; Promove as reacções imunes mediadas por células estimulando a produção de algumas citocinas pró-inflamatórias (principalmente IL-17) e inibindo a geração e as acções das células T reguladoras.

A interleucina-15 (IL-15) é uma citocina que serve funções importantes de estimulação do crescimento e de sobrevivência para as célula T e NK: 

 

  

É um membro da familia de citocinas do tipo I e é produzida por fagócitos mononucleares e, provavelmente, por outors tipos de células em resposta à infecção viral, ao LPS e a outros sinais que desencadeiam a imunidade inata; É estruturalmente homóloga à IL-2; O receptor para a IL-15 apresenta uma cadeia de ligação a citocinas que é homóloga mas distinta da cadeias α do receptor de IL-2, e as mesmas cadeias de transdução do sinal do receptor de IL-2. A cadeia α liga a IL-15 com alta afinidade; A ligação de IL-15 ao seu receptor activa vias dependentes de Jak3, STAT5 e Akt que promovem a sobrevivência da célula e levam à proliferação; As funções da IL-15 incluem a sobrevivência de células T CD8+, células NK e células T NK; A IL-15 parece ser necessária para a diferenciação e activação de células NK.

A interleucina-18 (IL-18) é uma citocina estruturalmente relacionada com a IL-1: 

 

Ao contrário da IL-1, as suas principais funções biológicas são aumentar a produção de IFN-γ pelas células T e promover a diferenciação de células T CD4+ TH1 produtoras de IFN-γ. Estes efeitos da IL-18 são sinérgicos com os da IL-12; As principais fontes de IL-18 são os macrófagos e as células dendriticas, e a produção é dependente de caspase-1, tal como na IL-1; O receptor de IL-18 é da familia IL-1/TLR e sinaliza através de um dominio TIR que recruta proteinas IRAK e TRAF, levando à activação dos factores de transcrição NF-κB e AP-1.

As interleucinas-23 e -27 são membros de uma familia de citocinas estruturalmente relacionadas com a IL-6 e com a IL-12, e os seus receptores são estruturalmente relacionados com os receptores de IL-6 e IL-12. Como a IL-12, as suas funções ligam a imunidade inata e a imunidade adaptativa:

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IL-23 Citocina heterodimérica composta por uma única cadeia de 19 kD (p19) emparelhada com a cadeia p40 de IL-12;

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

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Produzida por macrófagos e células dendriticas em resposta à infecção microbiana; O receptor de IL-23 é expresso em células T e células NK, e consiste num heterodimero de uma unica cadeia IL-23R e a cadeia IL-12Rβ1;



Contribui para a patologia inflamatória de doenças autoimunes como encefalomielite alérgica experimental; Parece ser importante para a resistência a algumas bactérias, incluindo o organismo gram-negativo Klebsiella pneumoniae; Um modo pelo qual influencia as respostas autoimunes e protectoras é através da promoção da diferenciação ou manutenção das célula T que produzem IL-17, uma citocina pró-inflamatória.









Imunologia IL-27 Heterodimero composto por uma subunidade αhelical (IL-17 p28), ligada a uma subunidade homóloga ao dominio estracelular do receptor de IL-6; Produzida por macrófagos e células dendriticas em resposta a patogénios; Liga-se a um receptor de alta afinidade heterodimerico, IL-27R, composto pela cadeia gp130 IL-6 e por uma segunda cadeia homóloga que é mais expresso em células NK e NK-T em repouso, células T de memória e efectoras e células T reguladoras; A sua influência nas respostas imunes é complexa e inclui tanto funções pró-inflamatórias e reguladoras; Como a IL-12, promove a diferenciação TH1 e a produção de IFN-γ pelas células T; Ratinhos KO para IL-27R desenvolvem respostas inflamatórias mediadas por células T contra certos patogénios infecciosos, o que indica um papel da IL-27 no controlo das respostas das células T.

Várias citocinas foram identificadas por homologia de sequências como pertencentes à familia de citocinas relacionadas com IL-10:   

Incluem IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26; Todas ligam receptores de citocinas do tipo II que partilham várias subunidades; Parecem regular reacções inflamat´roias em tecidos, mas as suas funções fisiológicas ainda não são conhecidas.

Papeis das Citocinas na Imunidade Inata e na Inflamação Diferentes citocinas têm papeis chave na imunidade inata contra diferentes classes de micróbios. Em infecções por bactéria extracelulares piogénicas (pus-forming), os macrófagos respondem às endotoxinas bacterianas e, talvez, contra outros produtos microbianos produzindo TNF, IL-1 e quimiocinas: 



TNF e IL-1 actuam no endotélio vascular no local de infecção para induzir a expressão de moléculas de adesão que promovem a ligação estável dos neutrófilos e monócitos sanguineos ao endotélio neste local; Quimiocinas produzidas por macrófagos e células endoteliais estimulam a extravasão do leucócitos para a infecção, onde a reacção da imunidade inata é montada para eliminar os micróbios infecciosos.

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Como seria de esperar, o TNF, a IL-1 e as quimiocinas são as primeiras citocinas a serem secretadas, pois são elas que abrem o caminho dos leucócitos para o local de infecção. Só depois outras citocinas são secretadas. A IL-12 e o IFN-γ são as citocinas mais importantes nas respostas imunes contra bactérias intracelulares: 



Os macrófagos e as células dendriticas respondem a muitos micróbios, incluindo bactérias intracelulares e produtoras de LPS, secretando IL-12, que induz a produção local de IFN-γ a partir de células NK e células T; O IFN-γ activa depois os macrófagos a destruir micróbios fagocitados.

A IL-12 também estimula a subsequente resposta imune adaptativa e dirige-a para as células TH1, que são mediadores da imunidade celular e a resposta mais efectiva na destruição de bactérias intracelulares. Estas acções da IL-12 são complementadas pela IL-18. O recrutamento e a activação de leucócitos mediados por citocinas são responsáveis por danos em tecidos normais que normalmente acompanham as reacções imunes inatas às infecções. Estas citocinas derivadas de macrófagos, especialmente o TNF e a IL-1, são também responsáveis pelas manifestações sistémicas da infecção. Em infecções virais, IFNs do tipo I são secretados por células infectadas, células dendriticas e macrófagos e funcionam para inibir a replicação e infecção virais, e outras citocinas são também secretadas:   

A IL-15 estimula o desenvolvimento e, talvez, a activação de células NK; A IL-12 aumenta a actividade cititóxica das células NK; A morte de células infectadas por virus mediada por células NK elimina os resevatórios de infecção.

Assim, as citocinas dominantes produzidas em resposta a diferentes micróbios contribuem para a natureza das reacções imunes inatas contra esses micróbios:   

A resposta inicial contra bactérias piogénicas consiste principalmente em neutrófilos; A resposta contra bactérias intracelulares é dominada por macrófagos activados; A resposta contra virus consiste em células NK em adição a outras células inflamatórias.

Contudo, pode existir uma sobreposição considerável.

Citocinas que Medeiam e Regulam a Imunidade Adaptativa As citocinas medeiam a proliferação e a diferenciação dos linfócitos após o reconhecimento de antigénios na fase acticvadora das respostas imunes adaptativas e medeiam a activação de células efectoras especializadas na fase efectora da imunidade adaptativa. Joana Maria Soares Pereira

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A produção de citocinas é uma das principais respostas dos linfócitos T ao reconhecimento de antigénios, podendo as principais citocinas da imunidade adaptativas ser resumidas na sequinte tabela: Citocina

Tamanho (kD)

Principais fontes celulares

Interleucina-2 (IL-2)

14-17 kD

Células T

Interleucina-4 (IL-4)

18 kD

Células T CD4 (TH2), mastócitos

Interleucina-5 (IL-5)

45-50 kD; homodimero de subunidades de 20 kD

Células T CD4 (TH2)

Interferão-γ (IFN-γ)

50 kD (glicosilada); homodimero de subunidades de 21 a 24 kD

Células T (TH1, CD8 ), células NK

Transforming growth factorβ (TGF-β)

25 kD; homodimero de subunidades de 12,5 kD

Células T, macrófagos, outros tipos de células

Linfotoxina (LT)

21-24 kD, secretada como um homotrimero ou associado com LTβ2 na membrana celular

Células T

Interleucina-13 (IL-13)

15 kD

Células T CD4 (TH2), células NKT, mastócitos

Interleucina-17 (IL-17)

20-30 kD

Células T

+

+

+

Células T: proliferação, sintese aumentada de citocinas, potencia a apoptose mediada por FAS, promove o desenvolvimento de células T reguladoras, sobrevivência Células NK: proliferação, diferenciação Células B: proliferação, sintese de anticorpos (in vitro) Células B: switch de isotipo para IgE Células T: diferenciação de TH2, proliferação Macrófagos: inibição da activação mediada por IFN-γ Mastócitos: proliferação (in vitro) Eosinófilos: activação, produção aumentada Células B: proliferação, produção de IgA Macrófagos: activação (funções microbicidas aumentadas) Células B: switch de isotipo para subclasses de IgG opsonizantes e fixadoras do complemento Células T: diferenciação TH1 Várias células: expressão aumentada de MHC classe I e II, processamento e apresentação de antigénios a células T aumentada Células T: inibição da proliferação e das funções efectoras Células B: inibição da proliferação, produção de IgA Macrófagos: inibição da activação, estimulação dos factores angiogénicos Fibroblastos: sintese de colagénio aumentada Recrutamento e activação de meutrófilos Organogénese linfóide

+

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Principais alvos celulares e efeitos biológicos

Células B: switch de isotipos para IgE Células epiteliais: produção de muco aumentada Fibroblastos: sintese de colagénio aumentada; Macrófagos: sintese de colagénio aumentada Células epiteliais: produção de quimiocinas aumentada Macrófagos: produção de quimiocinas e citocinas aumentada Células epiteliais: produção de GM-CSF e GCSF

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Interleucina-2 (IL-2) A IL-2 é um factor de crescimento, sobrevivência e diferenciação para os linfócitos T, e desempenha um papel principal na regulação das respostas das células T através da sua acção nas células T reguladoras:  

Devido à sua habilidade para suportar a proliferação de células T estimuladas por antigénios, a IL-2 foi inicialmente designada factor de crescimento de células T; Acuta nas mesmas células que a produzem ou em células adjacentes, actuando, assim, como um factor de crescimento e sobrevivência autócrino ou parácrino.

Produção, Estrutura e Receptores A produção e secreção de IL-2 é feita principalmente pelos linfócitos T CD4+: 

  

A activação de células T por antigénios e co-estimuladores estimula a transcrição do gene IL-2 e a sintese e secreção da proteina; A produção de IL-2 é transiente, com um pico de secreção a ocorrer 8 a 12 após a activação; As células T CD4+ secretam IL-2 na sinapse imunológica formada entre a células T e a APC; Receptores de IL-2 nas células T também tendem a localizar-se na sinapse, de modo que a citocina e os seus receptores atingem concentrações locais suficientemente altas para iniciar respostas celulares.

A IL-2 secretada é uma glicoproteina de 14-17 kD que apresenta uma estrutura globular com quatro α-hélices, o que coressponde a um fenótipo de citocinas que interagem com receptores de citocinas do tipo I. A expressão de receptores de IL-2 funcionais é induzida após a activação de células T naive e efectoras. No entanto, as células T reguladoras, que têm de estar num estado activado constante por antigénios próprios, apenas expressa receptores de IL-2. O receptor de IL-2 (IL-2R) consiste em três proteinas nãocovalentemente associadas incluindo IL-2Rα (CD25), IL-2R/15Rβ e γc. Das três cadeias, apenas IL-2Rα é unica do IL-2R:  



A IL-2 liga-se à cadeia α com baixa afinidade, e não leva a qualquer resposta sinalizadora citoplasmática detectável; IL-2R/15Rβ, que também faz parte do receptor de IL-15, contribui para a ligação de IL-2 e entra na via de sinalização dependente de Jak3-STAT5; A cadeia γ é partilhada com receptores de IL-4, IL-7 e IL-15, e é

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assim designada de cadeia γ comum (γc). Apesar desta cadeia não estar directamente envolvida na ligação de IL-2, a sua associação com o complexo receptor é também necessa´ria para a entrada nas vias de transdução do sinal de MAP cinases e PI-3 cinase. A regulação da expressão de receptores de IL-2 é feita do seguinte modo:  



Os complexos IL-2Rβγc são expressos a baixos niveis em células T em descanso (e em células NK) e ligam com uma afinidade de aproximadamente 10-9 M; A expressão de IL-2Rα é induzida de novo e a expressão de IL-2Rβ é sobre-regulada com a activação de células T CD4+, CD8+ e de memória. Assim, esta subunidade é essencial para a activação das células T; As células que expressam IL-2Rα e formam complexos IL-2Rαβγ são capazes de ligar IL-2 mais fortemente, com uma afinidade de 10-11 M, e a estimulação do crescimento de tais células ocorre a concentrações de IL-2 similarmente baixas.

Estudos in vitro indicam que a IL-2, produzida em resposta à estimulação pelo antigénio, é necessária para a indução de IL-2Rα e IL-2Rβγ e, assim, as células T que produzem IL-2 ou células próximas das células produtoras de IL-2 são mais prováveis de responder à citocina. No entanto, as células T CD4+ reguladoras, que têm um papel essencial na manutenção da tolerância a auto-antigénios, expressam IL2Rα e IL-2Rβ mesmo sem activação por antigénios ou IL-2. Acções Biológicas a IL-2 foi originalmente descrita como um factor de crescimento das células T com base em estudos in vitro, mas mais recentemente outros estudos indicam outros papeis da IL-2 que deverão predominar in vivo: Joana Maria Soares Pereira

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

A IL-2 é requerida para a sobrevivência e, talvez, para a função das células T reguladoras, que suprimem respostas imunes contra antigénios próprios e outros. A expressão constitutiva de receptores de IL-2 nas células T reguladoras é consistente com a sua necessidade de IL-2 para a sobrevivência. Estudos em ratinhos KO forneceram evidências de que a função primária, não redundante, da IL-2 in vivo é a supressão de respostas I. Ratinhos que não apresentam IL-2, IL2Rα ou IL-2Rβ desenvolvem linfadenopatia e autoimunidade mediada por células T, e não apresentam células T reguladoras. Estas descobertas em ratinho indicam que outras citocinas pordem partilhar com a IL-2 o papel de factor de crescimento para células T mas as funções reguladoras da IL-2 não podem ser substituidas por outras citocinas;



A IL-2 estimula a sobrevivência, proliferação e diferenciação de células T activadas por antigénios. A IL-2 também promove a sobrevivência de células induzindo a proteina antiapoptótica Bcl-2. A IL-2 promove a progressão do ciclo celular através da sintese de ciclinas e da degradação de um bloqueador do ciclo celular, o p27. A IL-2 aumenta também a produção de outras citocinas efectoras, como IFN-γ e IL-4, pelas células T;



A IL-2 promove a proliferação e diferenciação de células naturalmente assassinas. Esta citocina estimula o crescimento de células NK e aumenta as suas funções citotóxicas, produzindo células designadas “lymphokine-activated killer cells”. Como as células NK, em semelhança com as células T em descanso, expressam IL-Rβγc (mas não IL-2Rα), podem ser estimuladas apenas por altos niveis de IL-2. Nas células NK, o complexo βγc está associado com a cadeia α do receptor de IL-15, e a IL-15 funciona como um factor de crescimento para estas células;



A IL-2 actua nas células B tanto como factor de crescimento mas também como um estimulo para a sintese de anticorpos, uma função demonstrada in vitro.

Interleucina-4 (IL-4) A IL-4 é o principal estimulo para a produção de anticorpos IgE e para o desenvolvimento de células T H2 apartir de células TH CD4+ naive: 

A IL-4 é a citocina que marca o subgrupo TH2 e funciona tanto como uma citocina indutora e efectora destas células.

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Produção, Estrutura e Receptores A IL-4 é um membro da familia de citocinas com uma estrutura de quatro α-hélices e as suas principais fontes celulares são:  

Linfócitos T CD4+ do subgrupo TH2; Mastócitos activados.

O receptor de IL-4 das células linfóides consiste numa cadeia α, que é membro da familia de receptores de citocinas do tipo I, associada com a cadeia γc partilhada por outros receptores de citocinas: 

Este receptor IL-4Rαγc sinaliza através da via Jak-STAT (Jak3- ou 4STAT6) e por uma via que envolve um substrato de resposta à insulina (IRS), designado IRS-2.

A IL-4 é a unica citocina que a activa a proteina STAT6, que induz a transcrição de genes que são responsáveis por muitas das acções da IL-4, como a diferenciação de TH2 e o switch pra IgE das células B. Acções Biológicas As acções biológicas da IL-4 incluem a estimulação de IgE e as reacções mediadas pro mastócitos/eosinófilos: 

A IL-4 é a principal citocina que estimula o switch de cadeias pesadas de Ig nas células B para o isotipo IgE. Ratinhos KO para IL-4 têm menos de 10% dos niveis normais de IgE. Os anticorpos IgE têm papeis importantes nas defesas mediadas por eosinófilos contra infecções helminticas ou artrópodes, sendo esta a principal função das células T H2 na defesa do hospedeiro. A IgE é também o principal mediador das reacções de hipersensibilidade imediatas (alergias) e a produção de IL-4 é importante para o desenvolvimento de alergias.a IL-4 também aumenta o switch para IgG4 e inibe o switch para IgG2 e IgG3, ambos estimulados por IFN-γ. Esta é uma das várias acções antagonistas reciprocas da IL-4 e do IFN-γ;



A IL-4 estimula o desenvolvimento de células TH2 a partir de células T CD4+ e funciona como um factor de crescimento autócrino para células TH2 diferenciadas. Assim, a IL-4 é responsável pela indução e expansão desta subgrupo. Ratinhos KO para IL-4 ou STAT6 mostram uma deficiência no desenvolvimento e na manutenção de células TH2, mesmo após os estimulos que são normalmente indutores potentes desta subgrupo. A IL-4 inibe também o desenvolvimento de células TH1 e TH17;



Em conjunto com a IL-13, contribui para a activação de uma forma alternativa de macrófagos que é distinta da resposta dos macrófagos ao IFN-γ. Os efeitos a IL-4 nos macrófagos incluem a indução da arginase levando à produção de colagénio, e a uma expressão aumentada de receptores de manose, que promve a fagocitose de micróbios.

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Interleucina-5 (IL-5) A IL-5 é um activador de eosinófilo e serve como uma ponte entre a activação de células T e a inflamação eosinofilica. Produção, Estrutura e Receptores A IL-5 é um membro da familia de citocinas tipo I composta por um homodimero de um polipeptideo que contem um dominio de quatro α-hélices e as suas principais fontes celulares são:  

Células T CD4+ do subgrupo TH2; Mastócitos activados.

O receptor de IL-5 é um heterodimero composto por uma unica cadeia α e uma cadeia β comum (βc), que també faz parte dos receptores de IL-3 e de factor estimulante d colónias de granulócitosmacrofagos (GM-CSF):   

A cadeia IL-5Rα é capaz de ligar IL-5 com baixa afinidade, mas não sinaliza; A cadeia βc não liga IL-5 por si só mas é necessária para uma ligação de alta afinidade pela cadeia α e para a entrada nas vias de transdução do sinal; A principal via de sinalização induzida pela IL-5 envolve Jak2 e STAB.

Acções Biológicas As principais acções da IL-5 são:   

Activar eosinófilos maduros; Estimular o crescimento e a diferenciação de eosinófilos; Estimular a proliferação de células B e a produção de anticorpos IgA.

Os eosinófilos antivados são capazes de matar helmintos. Os eosinófilos expressam receptores Fc especificos para antocpros IgG e IgA e são, assim, capazes de ligar micróbios opsonizados por IgG e IgA, como helmintos. Ratinhos KO para IL-5 são deficientes em respostas dos eosinófilos e são susceptiveis a infecções por helmintos. Interleucina-13 (IL-13) A IL-13 é estrutural e funcionalmente semelhante à IL-4 e desenpenha papeis chave na defesa contra helmintos e nas doenças alérgicas. Joana Maria Soares Pereira

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Produção, Estrutura e Receptores A IL-13 é um membro da familia de citocinas com uma estrututa com quatro α-hélices, com homologia de sequência limitada mas com homologia estrutural para com a IL-4 significativa sendo as suas principais fontes celulares:     

Principalmente células T CD4+ do subgrupo TH2; Células T CD8+; Células NK-T; Basófilos; Eosinófilos.

Esta citocina é codificada por um gene numa região do cromossoma 5 humano que inclui vários genes de citocinas importantes nas doenças alérgicas, incluindo IL-4, IL-5 e IL-9. O receptor funcional de IL-13 é um heterodimero da cadeia IL-4Rα e da cadeia IL-13Rα1:  

Este complexo é capaz de ligar tanto IL-4 como IL-13 com alta afinidade, e é responsável pelo facto da maior parte dos efeitos da IL-13 serem partilhados com a IL-4; O receptor IL-4R/IL-13Rα1 é expresso numa grande variedade de célulasm incluindo células B, fagócitos mononucleares, células dendriticas, eosinófilos, basófilos, fibriblastos, células endoteliais e células epiteliais bronquiais. As células T não expressam receptor de IL-13.

A sinalização do IL-13R é semelhante à sinalização do IL-4R, envolvendo a fosforilação mediada por Jak1 e Tyk2 da STAT6 tal como IRS2. Como o receptor de IL-13 não inclui a cadeia γc, alguns dos eventos de sinalização a jusante induzidos pela ligação de IL-4 ao receptor de IL-4 não são induzidos nem pela ligação de IL-4 nem de IL-13 ao IL-13R. Um segundo receptor de alta afinidade para IL-13, designado IL-3Rα2, não parece apresentam quaisquer funções sinalizadoras, e deverá actuar como um inibidor negativo dominante e/ou como um receptor armadilha que bloqueia os efeitos da IL-13 em certos tipos de células, incluindo células epiteliais bronquiais.

Acções Biológicas A IL-13 actua em conjunto com a IL-4 na produção dos efeitos associados com a inflamação alérgica e na defesa contra parasitas. Os padrões de distribuição distinctos dos receptores de IL-4 e IL-13, a diferença na sinalização por estes receptores e diferenças na indução e estabilidade de IL-4 e IL-13 provavelmente contribuem para o facto da IL-13 apresentar efeitos biológicos que são distinctos dos da IL-4: Joana Maria Soares Pereira

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

A IL-13 promove a fibrose como parte da fase de reparação de tecidos dos estados inflamatórios crónicos. A função fibrogénica da IL-13, que não é partilhada com a IL-4, deve-se à estimulação de fibroblastos e macrófagos para que estes sintetizem colagénio, em parte induzindo a expressão da enzima arginase-I, e à estimulação do macrófagos para que estes produzam TGF-β, que por si só promove a fibrose. A fibrose induzida por IL-13 contribui significativamente para a patologia da asma crónica, das doenças intersticiais do pulmão e das infecções parasiticas;



A IL-13 estimula a produção de muco pelas células epiteliais do pulmão. Esta propriedade também não é partilhada com a IL-4 e também contribui para a patogénese da asma. A secreção de muco mediada pela IL-13 deve-se aos efeitos da citocina na proliferação, diferenciação e função secretória das células epiteliais caliciformes bronqueiais;



A IL-13 induz o switch de classe para IgE das células B. Esta propriedade é partilhada com a IL-4. Ratinhos KO para IL-13 têm niveis de IgE reduzidos, mas produzem IL-4;



A IL-13 promove a inflamação induzindo a expressão de moléculas de adesão epiteliais (e.g., VCAM-1) e quimocinas, que medeiam o recrutamento de granulócitos e monócitos para os tecidos. Os efeitos pró-inflamatórios da IL-13 podem ser protectores contra infecções parasiticas e prejudiciais no caso de doença asmática e outras doenças dos pulmões.

Interferão-γ (IFN-γ) O IFN-γ é a principal citocina activadora de macrófagos e serve funções criticas na imunidade inata e na imunidade adaptativa mediada por células contra micróbios intra-celulares:  

É também designado IFN imune ou do tipo II; Apesar de apresentar alguma actividade anti-viral, não é uma citocina anti-viral potente, e funciona principalmente como um activador das células efectoras do sistema imune.

Joana Maria Soares Pereira

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Produção, Estrutura e Receptores O IFN-γ é uma proteina homodimérica e as suas principais fontes celulares são:   

Células naturalmente assassinas; Células CD4+ TH1, sendo caracteristica destes grupo de células; Células T CD8+.

As células NK secretam IFN-γ em resposta a ligandos activadores na superficie de células do hospedeiro infectadas ou em stress ou em resposta à IL-12, actuando como mediador da imunidade inata. No entanto, na imunidade adaptativa, as células T produzem IFN-γ em resposta ao reconhecimento de antigénios e a produção é aumentada pelas IL-12 e IL-18. Assim, a sequência de reacções que envolvem IL-12 e IFN-γ é central para a imunidade mediada por células contra micróbios intracelulares. O receptor de IFN-γ é composto por dois polipeptidos estruturalmente homólogs que pertencem à familia de receptores do tipo II, designadas IFN-γR1 e IFN-γR2: 





A IFN-γ liga-se e induz a heterodimerização de IFNγR1 e IFN-γR2, que se associam, respectivamente, com as cinases Jak1 e Jak2; A activação destas enzimas leva à fosforilação de STAT1 e à dimerização, à ligação de dimeros STAT1 a sequências GAS em regiões reguladoras de vários genes e transcrição desses genes, como no casos dos IFNs do tipo I; Os genes induzidos pelo IFN-γ codificam diferentes moléculas envolvidas no aumento das respostas imunes adaptativas e nas funções efectoras dos macrófagos.

Diferentes genes que resposndem ao IFN-γ são activados tanto pela STAT1 sozinha como por esta em conjunto com outros factores de transcrição, incluindo factor-1 de resposta ao IFN (IRF-1) e transactivador classe II, que são induzidos pela STAT1. Ratinhos KO para STAT1 são completamente insensiveis às acções do IFN-γ. Acções Biológicas As funções do IFN-γ são importantes na imunidade mediada por células contra micróbios intracelulares: 

O IFN-γ activa os macrófagos para que estes matem micróbios fagocitados. Em conjunto com o CD40L, o IFN-γ é o meio pelo qual as células TH1 aumentam a função dos macrófagos, e o IFN-γ é a unica via pela qual as células NK activam os macrófagos na imunidade inata. O IFN-γ aumenta a função microbicida dos macrófagos estimulando a sintese de espécies reactivas de oxigénio e óxido nitrico. O IFN-γ medeia estes efeitos principalmente activando a transcrição de genes que codificam as enzimas necessárias para a produção de espécies reactivas de oxigénio e intermediários reactivos de azoto. As moléculas reactivas são produzidas nos lisossomas e destroem micróbios que estão contidos nos fagolisossomas;

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Imunologia



O IFN-γ promove a diferenciação de células T CD4+ naive em células TH1 e inibe a diferenciação em células TH2. O IFN-γ estimula a produção de um factor de transcrição chamado T-bet que promove directamente a diferenciação em TH1. O efeito indutor de TH1 do IFN-γ é também parcialmente mediado indirectamente activando fagócitos mononucleares a produzirem IL-12, que é a principal citocina indutora de TH1. Em ratinho, o IFN-γ aumenta a expressão da cadeia sinalizadora do receptor de IL-12. A inibição da diferenciação em TH2 pelo IFN-γ envolve a supressão mediada pelo T-bet do GATA-3, um factor de transcrição que é necessário para a entrada das células T naive na linhagem TH2;



O IFN-γ actua nas células B para promover o switch para certas subclasses de IgG, principalmente IgG2 em ratinho, e para inibir o switch para isotipos dependentes de IL-4, como IgE e IgG1. As subclasses IgG induzidas pelo IFN-γ ligam receptores Fcγ em fagócitos e activam o complemento, e ambos estes mecanismos promovem a fagocitose de micróbios opsonizados. Assim, o IFN-γ induz as respostas de anticorpos que também participam na eliminação de micróbios mediada por fagócitos, em concerto com os efeitos directos activadores de macrófagos desta citocina;



O IFN-γ estimula a expressão de moléculas MHC classe I e classe II e de co-estimuladores nas APCs. O IFN-γ também estimula a produção de muitas proteinas envolvidas nao processamento de antigénios, incluindo TAP, os compnentes LMP-2 e LMP-7 do proteossoma, e HLA-DM. Assim o IFN-γ aumenta a apresentação de antigénios associada a MHC e amplifica a fase de reconhecimento das respostas imunes aumentando a expressão de ligandos que as células T reconhecem. O IFN-γ é também um activador das células endoteliais vasculares e potencia muitas das acções do TNF nas células endoteliais, promovendo a adesão e a extravasão dos linfócitos T para os locais de infecção.

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O efeito final destas actividade do IFN-γ é promover as reacções inflamatórias ricas em macrófagos enquanto inibe as reacções ricas em eosinófilos dependentes de IgE. Ratinhos KO para IFN-γ ou receptor de IFN-γ são suceptiveis a infecções com micróbios intracelulares, como micobactérias, devido à activação deficiente dos macrófagos. Transforming Growth Factor β (TGF-β) A principal acção do TGF-β no sistema imunitário é inibir a proliferação e a activação dos linfócitos e outros leucócitos. No entanto, o TGF-β é capaz de exercer tanto efeitos anti-inflamatórios como próinflamat´roios dependendo do momento da sua aparência, a quantidade produzida e a da razão de expressão sistémica/local:   

O TGF-β foi descoberto como um produto de tumores que promovia a sobrevivência de células em meios de cultura semi-sólidos; É actualmente uma familia de moléculas fortemente relacionadas codificadas por genes distintos, comummente designados TDF-β1, TGF-β2 e TGF-β3; As células do sistema imune sintetizam principalmente TGF-β1.

Produção, Estrutura e Receptores O TGF-β1 é uma proteina homodimérica que tem como principais fontes celulares:   

Células T estimuladas por antigénios; Fagócitos monucleares activados pelo LPS; Muitos outros tipos de células.

Algumas células T reguladoras produzem TGF-β e as mesmas c+elulas podem também produzir IL-10, que, como a TGF-β1 tem actividade imunossupressivas. A TGF-β1 é sintetizada como um precursor inactivo que é proteoliticamente clivado no complexo de Golgi e forma um homodimero. Este homodimero de TGF-β1 é secretado numa forma latente em associação com outros polipeptideos, que devem ser removidos extracelularmente por digestão enzimática antes da citocina se ligar aos receptores e exercer os seus efeitos biológicos. O receptor do TGF-β1 consiste em duas proteinas diferentes, activin receptor-like kinase5 (ALK5) e TGFβRII, que sinaliza através de um dominio serina/treonina cinase que fosforila factores de transcrição designados Smads: 

Aquando da ligação do TGF-β1, a ALK5 fosforila Smad2 e Smad3, que em complexo com Smad4, se translocam para o núcleo, se ligam a promotres de genes alvo e regulam a sua transcrição.

Acções Biológicas O TGF-β tem várias acções biológicas, entre elas: 

O TGF-β inibe a proliferação e as funções efectoras das células T e a activação dos macrófagos. O TGF-β também actua em outras células, como neutrófilos e células endoteliais, maioritariamente contra-atacando os efeitos das citocinas pró-inflamat´roias, por estas acções, o TGF-β actua para inibir as respostas imunes e inflamatórias. Ratinhos nos quais o gene TGF-β1 foi eliminado, ou nos quais o receptor de TGF-β foi selectivamente bloqueado em células T, desenvolvem lesões inflamatórias descontroladas e linfoproliferação;

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

O TGF-β regula a diferenciação de subgrupos de células T funcionalmente distinctos. Alguns estudos em ratinhos indicam que a sobrevivência ou diferenciação das células T reguladoras depende em parte do TGF-β. Em adição, o TGF-β produzido pelas células T reguladoras, ou talvez pelas células dendriticas, é capaz de bloquear o desenvolvimento de subgrupos de células T CD4+ TH1 e TH2 efectoras. Para além disso, o TGF-β em combinação com citocinas elicitadas durante as respostas imunes inatas, como a IL-5, pode promover a diferenciação do subgrupo de células T CD4+ que secreta IL-17. Assim, o TGF-β tem efeitos complexos nas respostas imunes mediadas por células T efectoras;



O TGF-β extimula a produção de anticorpos IgA induzindo o switch das células B para este isotipo. A IgA é o isotipo de anticorpo necessário para a imunidade das mucosas;



O TGF-β regula a reparação dos tecidos após as reacções imunes e inflamatórias locais. Esta função é mediada por acções especificas do TGF-β na sintese de colagénio e na produção de enzimas modificadoras da matriz pelos macrófagos e pelos fibriblastos, e contribuindo para a angiogénese.

Outras Citocinas da Imunidade Adaptativa A interleucina-17 (IL-17) inclui uma familia de seis citocinas estruturalmente relacionadas, algumas das quais promovem o dano tecidular em doenças de hipersensibilidades e outras são importantes para a defesa contra infecções bacterianas: 

As estruturas das citocinas IL-17 e dos seus receptores não são partilhadas por outras citocinas e as vias de transdução do sinal que os receptores usam ainda não estão completamente caracterizadas;

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



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A IL-17A e a F, que são os membros mais bem caracterizados da familia, são produzidas por vários tipos de células, incluindo um subgrupo de células T CD4+ efectoras diferentes das TH1 e TH2; A diferenciação e a manutenção destas células produtoras de IL-17 é dependente do TGF-β, da IL-23 e de citocinas produzidas durante as reacções imunes inatas, como a IL-6.

As principais funções da IL-17 são:  

As IL-17A e F estimulam as células endoteliais e os macrófagos a produzir IL-1, TNF e várias quimocinas, que promovem o recrutamento de neutrófilos; A IL-17 também induz as células a produzirem citocinas hematopoiéticas que estimulam a produção de neutrófilos pela medula óssea.

A IL-17 produzida pelas células T é responsável pela inflamação destrutiva caracteristica de vários modelos de doenças autoimunes. A interleucina-32 (IL-32), previamente designada natural killer cell transcript 4, é uma citocina próinflamatória:     

É principalmente expressa em células naturalmente assassinas, células T, células epiteliais e manócitos; É capaz de induzir as citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β em macrófagos; Desempenha um papel importante nas respostas imunes inata e adaptativa, apresentando sinergia com outros membros da imunidade inata; É estimulada pela Mycobacterium tuberculosis e actua de modo sinergético com os ligandos NOD1 e NOD2 para estimular a libertação de IL-1β e IL-6 de um modo dependente de caspase-1; A proteinase 3 é uma proteina de ligação a IL-32α especifica que cliva a citocina para aumentar a sua actividade.

Papel das Cirocinas das Células T nas Respostas Imunes Adaptativas Especializadas As citocinas da imunidade adaptativa são criticas para o desenvolvimento das respostas imunes e para a activação de células efectoras que servem para eliminar micróbios e outros antigénios. Uma caracteristica chave da imunidade adaptativa é o facto das respostas serem especializadas para eliminar diferentes tipos de micróbios. Muita desta especialização deve-se às acções de citocinas, que deverão ser produzidas por subpopulações de células TH: 





Diferentes tipos de micróbios estimulam células T CD4+ naive a diferenciarem-se em células efectoras que produzem grupos de citocinas distintos e desempenham funções ditintas, sendo os subgrupos melhor definidos as células TH1 e TH2; Muitos micróbios intracelulares (bactérias e virus) induzem o desenvolvimento de células TH1, que produzem IFN-γ, a citocina que activa e estimula a produção de anticorpos opsonizantes que promovem a fagocitose; Parasitas helminticos estimulam o desenvolvimento de células TH2, que produzem IL-4 e IL-5. A IL-4 aumenta a produção de anticorpos IgE especificos e a IL-5 activa eosinófilos, sendo que ambos contribuem para a destruição de parasitas.

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Citocinas que Estimulam a Hematopoiese As citocinas são necessárias para a hematopoiese normal na medula óssea e fornecem um meio refinamento da função da medula óssea em resposta à necessidade de leucócitos:  

Várias das citocinas geradas durante as respostas imunes inata e adaptativa estimulam o crescimento e a diferenciação de células progenitoras na medula óssea; Assim, as reacções imunes e inflamatórias, que consumem leucócitos, também elicitam a produção de novos leucócitos.

Os leucócitos maduros surgem a partir de células estaminais pluripotentes pela entrada numa linhagem particular (diferenciação) e expansão progressiva da progenia. A diferenciação e expanção das células progenitoras na medula óssea são estimuladas por citocinas, que são designadas factores estimulantes de colónias (CSFs) porque apresentam a habilidade de estimular a formação de colónias de células em culturas de medula óssea. Sob a influência de diferentes CSFs, estas colónias adquirem caracteristicas de linhagens celulares especificas (e.g., granulócitos, fagócitos mononucleares ou linfócitos). Os nomes das CSFs refletem os tipos de colónias que surgem de ensaios com estas citocinas, sendo as mais importantes as seguintes:   

Stem cell factor (c-Kit ligand); Interleucina-7 (IL-7); Interleucina-3 (IL-3);

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  

Granulocyte-monocyte CSF (GM-CSF); Monocyte CSF (M-CSF); Granulocyte CSF (G-CSF). 242

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Células do estroma da medula óssea Fibroblastos, células do estroma da medula óssea

Principais alvos celulares Células estaminais pluripotentes Progenitores linfóides imaturos

Todas

20-26 kD

Células T

Progenitores imaturos

Todas

18-22 kD

Células T, macrófagos, células endoteliais, fibroblastos

Progenitores imaturos e diferenciados, macrófagos maduros

Granulócitos e monócitos, actividade dos macrófagos

Monocyte CSF (M-CSF)

Dimero de 70-90 kD, subuinidades 40 kD

Macrófagos, células endoteliais, células da medula óssea, fibroblastos

Progenitores diferenciados

Monócitos

Granulocyte CSF (G-CSF)

19 kD

Macrófagos, fibriblastos, células endoteliais

Progenitores diferenciados

Granulócitos

Citocina Stem cell factor (c-Kit ligand) Interleucina-7 (IL-7) Interleucina-3 (IL-3) Granulocytemonocyte CSF (GM-CSF)

Tamanho (kD)

Imunologia

24 kD 25 kD

Principais fontes celulares

Principais populações de células induzidas

Linfócitos B e T

Stem Cell Factor (c-Kit Ligand) As células estaminas pluripotentes expressam um receptor membranar tirosina cinase que é o produto proteico do proto-oncogene celular c-Kit. A citocina que interage com este receptor é designada c-Kit ligand, ou stem cell factor, porque actua nas células estaminais imaturas: 

 

Esta citocina é sintetizada por células do estroma da medula óssea como uma proteina transmembranar ou secretada, ambas produzidas a partir do mesmo gene por splicing alternativo de RNA; Esta citocina é necessária para tornar as células do estroma da medula óssea responsivas a outras CSFs mas não provoca a formação de colónias por si só; Tem também um papel na sustentação da viabilidade e da capacidade proliferativa das células T imaturas no timo e dos mastócitos nos tecidos mucosos.

A forma soluvel da citocina está ausente em estirpes de ratinhos mutantes designados steel. Este ratinhos têm defeitos na produção de mastócitos mas não na maior parte das outras linhagens, sugerindo que a forma membranar é mais importante que a forma soluvel na estimulação das células T a maturarem nas várias linhagens hematopoiéticas. A eliminação de ambas as formas da citocina por KO de genes é letal. Interleucina-7 (IL-7) A IL-7 é um tipo de citocina da familia de citocinas de quatro α-hélices do tipo I secretada pelas células do estroma em muitos tecidos que estimula a sobrevivência e expansão de precursore imaturos nas lihagens de células T e B:  

O receptor de IL-7 consiste numa unica cadeia α de ligação a IL-7 associada com uma cadeia γc, pertencendo esta ultima também aos receptores de IL-2, IL-4 e IL-15; É essencial para a sobrevivência de células T naive, maduras e células de memócria, especialmente células de memória CD4+, ambas expressando grandes niveis de receptores de IL-7.

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Ratinhos KO para IL-7 ou para a cadeia α do receptor de IL-7 são linfopénicos, com um numero diminuido de células T e B. Por outro lado, ratinhos que não apresentam γc e humanos com mutações em γc mostram defeitos na maturação de linfócitos, uma doença conhecida nos humanos como imunodeficiência combinada severa X-linked. Interleucina-3 (IL-3) A IL-3 é um produto das células T CD4+ que actua nos progenitores da medula imaturos e promove a expansão de células que se diferenciam em todos os tipos de células hematopoiéticas conhecidos:  



É um membro da familia de citocinas constituidas por quatro α-hélices; Em humanos, o seu receptor consiste num componente de ligação a citocinas que é um membro da familia de receptores do tipo I e uma subunidade tradutora do sinal que é partilhada pelos receptores de IL-5 e GM-CSF. No entanto, em ratinho a subuinida tradutora do sinal do receptor de IL-3 é unica; A transdução do sinal em ambas as espécies envolve a via Jak-STAT.

As principais funções da IL-3 são as seguintes:  

Actua nos progenitores da medula imaturos e promove a expansão de células que se diferenciam em todos os tipos de células hematopoiéticas conhecidos; Promove o crescimento e desenvolvimento de mastócitos a partir de progenitores derivados da medula óssea, uma acção melhorada pela IL-4.

Contudo, ratinhos KO para o receptor de IL-3 não apresentam desrregulações notáveis na hematopoiese. A IL-3 humana foi identificada por clonagem de cDNA de uma molécula homóloga de ratinho mas tem sido dificil estabelecer um papel desta citocina na hematopoiese. De facto, muitas das acções da IL-3 de ratinho parecem ser realizadas pela GM-CSF humana. Outras Citocinas Hematopoiéticas As GM-CSF, M-CSF e G-CSF são citocinas produzidas por células T activadas, macrófagos, células endoteliais e células do estroma da medula óssea que actuam em progenitores da medula óssea para aumentar a produção de vários leucócitos:  

A GM-CSF promove a maturação de células da medula óssea em células dendriticas e monócitos; A G-CSF é gerada nos locais de infecção e actua como uma hormona endócrina para mobilizar neutrófilos a partir da medula óssea para repor aqueles consumidos das reacções inflamatórias.

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GM-CSF e G-CSF recombinantes são usadas para estimular a recuperação da medula óssea após a quimioterapia do cancro e transplante de medula óssea. Estas são algumas das aplicação das citocinas com maior sucesso. No entanto, existem outras terapias clinicas baseadas em citocinas, sendo entre elas as mais importantes: Agente

Remicade ou Humira

Natureza do agente Receptor de TNF quimérico/região constante da IgG Anticorpo monoclonal contra o receptor de TNF-α

Roferon

Interferão-α-2a

Intron A

Interferão-α-2a

Betaseron Avonex

Interferão-β-1b Interferão-β-1a

Actimmune

Interferão-γ-1β

Neupogen

G-CSF

Leukine

GM-CSF

Enbrel

Neumega ou Neulasta Epogen

Aplicação clinica Artrite reumatóide Artrite reumatóide Doença de Crohn Hepatite B Leucemia Hairy-cell Sarcoma de Kaposi Leucemia felina Hepatite C melanoma Esclerose multipla Esclerose multipla Doença granulomatosa crónica Osteoporose Estimula a produção de neutrófilos Redução da infecção em doentes de cancro tratados por quimioterapia e em pacientes com SIDA Estimula a produção de células mielóides após transplantes de medula óssea

Interleucina-11

Estimula a produção de plaquetas

Eritropoietina

Estimula a produção de eritrócitos

RESPOSTAS EFECTORAS MEDIADAS POR CÉLULAS

Imunidade Humoral e Mediada por Células Os ramos mediados por células e humoral do sistema imune assumem diferentes papeis na protecção do hospedeiro: 



Imunidade humoral – os efectores da imunidade humoral são os anticorpos especificos, moléculas altamente especificas que são capazes de ligar e neutralizar antigénios na superficie das células e nos espaços extracelulares pois o dominio principal da protecção por anticorpos encontra-se fora da célula. No entanto, se os anticorpos fossem os unicos agentes da imunidade, os patogénios que conseguiam escapar a estas moléculas e os que colonizam o ambiente intracelular iriam escapar ao sistema imune, o que não ocorre; Imunidade mediada por células – o seu principal papel é detectar e eliminar células que abrigam petogénios intracelulares. A imunidade mediada por células é também capaz de reconhecer e eliminar células, como células tumorais, que sofreram modificações genéticas de modo a expressarem antigénios atipicos das células normais.

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Tanto células especificas para antigénios como não-especificas para atigénios podem contribuir para a resposta imune mediada por células:  

Células especificas – incluem os linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) e as células TH CD4+ secretoras de citocinas que mediam as hipersensibilidades; Células não-especificas – incluem células naturalmente assassinas (NK) e células não-linfóides, como macrófagos, neutrófilos e eosinófilos.

A actividade destes componentes especificos e não-especificos depende normalmente de concentrações locais efectivas de várias citocinas. De facto, as células T, as células NK e os macrófagos são as fontes mais importantes das citocinas que organizam e suportam a imunidade mediada por células. Assim, apesar da imunidade humoral e da mediada por células apresentarem muitas caracteristicas distintas, elas não são completamente independentes. Células como macrófagos, células NK, neutrófilos e eosinófilos são capazes de usar anticorpos como receptores para reconhecer e marcar células para destruição. Para além disso, péptidos quimotacticos gerados pela activação do complemento são capazes de contribuir para o agrupamento dos tipos de células necessários para a resposta mediada por células.

Tipos de Reacções Mediadas por Células A importância da imunidade mediada por células torna-se evidente quando o sistema se encontra deficiente. Crianças com sindrome de DiGeorge, que nascem sem timo e, assim, não apresentam células T para a imunidade mediada por células, geralmente são capazes de lidar com infecções por bactérias extracelulares, mas não são conseguem eliminar efectivamente patogénios intracelulares. A sua falta de imunidade mediada por células funcional resulta em infecções repetidas por virus, bactérias intracelulares e fungos. A severidade da imunodeficiência mediada por células nestas crianças é tal que mesmo virus atenuados presentes numa vacina são capazes de produzir infecções que colocam a sua vida em risco. Joana Maria Soares Pereira

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Sabe-se que diferentes tipos de micróbios provocam respostas protectoras por células T distinctas: 1. A resposta imune adaptativa contra micróbios residentes dos fagossomas de fagócitos é mediada por linfócitos T CD4+ efectores, designadas células TH, que reconhecem antigénios microbianos e activam os fagócitos a destruir micróbios ingeridos - os fagócitos são as principais células da defesa do hospedeiro logo após a infecção. A função dos fagócitos é ingerir e matar micróbios mas muitos micróbios desenvolveram mecanismos que permitem que estes sobrevivam e mesmo repliquem dentro dos fagócitos, de modo que a imunidade inata é incapaz de erradicar infecções por tais micróbios. Nestas situações, a imunidade mediada por células aumenta as acções microbicidas dos fagócitos e, assim, a eliminação de micróbios. Na imunidade mediada por células contra micróbios fagocitados, a especificidade da resposta é devida às células T, mas a função efectora actual, isto é, a morte dos micróbios, é mediada pelos fagócitos. Esta cooperação dos linfócitos T com os macrófagos ilustra uma ligação importantes entre a imunidade adaptativa e a inata pois, por meios de secreção de citocinas, as células T estimulam a função e focam a ctividade de células efectoras não-especificas da imunidade inata, convertendo assim estas células em agentes da imunidade adaptativa; 2. A resposta imune adaptativa contra micróbios que infectam e replicam no citoplasma de vário tipos de células, incluindo células não-fagociticas, é mediada por células T CD8+ citocóxicas (CTLs), que matam células infectadas e eliminam reservatórios de infecção – as CTLs são o principal mecanismo de defsa contra micróbios que infectam vários tipos de células e replicam intracelularmente. Se as células infectadas não apresentarem a capacidade de matar micróbios, a infecção pode ser eliminada apenas destruindo essas células. A morte mediada por CTLs é também um mecanismo para a eliminação de micróbios que são recolhidos por fagócitos mas que escapam do fagossoma para o citoso, onde não são suceptiveis às actividade microbicidas dos fagócitos;

3. A activação de macrófagos e a inflamação dependentes de células T pode danificar tecidos normais – esta reacção é designada delayed-type hypersensitivity (DTH) e p termo hipersensibilidade refere-se ao dano tecidular causado por uma resposta imune. A DTH é um acompanhamento frequente da imunidade mediada por células protectora contra micróbios e a causa de muita da patologia associada com certos tipos de infecção. Este é também um mecanismo de dano tecidular en várias doenças autoimunes; Joana Maria Soares Pereira

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4. A resposta imune adaptativa contra parasitas helminticos é mediada por células T H2 – estas células estimulam a produção de anticorpos IgE e activam eosinófilos e mastócitos a destruirem helmintos. As reacções imunes mediadas por TH2 são caracterizadas por inflamação rica em eosinófilos; 5. O sistema imune inata também apresenta um braço celular mediado por células naturalmente assassinas (NK) – estas célula protegem contra células infectadas por virus e outros micróbios intracelulares, matando células infectadas no inicio da infecção. As respostas imunes mediadas por células consistem em:   

Desenvolvimento de células T efectoras a partir de células naive nos órgãos linfóides periféricos; Migração destas células T efectoras e de outros leucócitos para os locais de infecção; Activação de leucócitos mediada por citocinas para que estes destruam micróbios ou matem directamente células infectadas.

Joana Maria Soares Pereira

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Células T CD4 + Efectoras Uma das desobertas mais excitante na imunologia foi a identificação de subgrupos de células T CD4+ que diferem nas citocinas que produzem e nas suas funções efectoras:

As células T CD4+ podem diferenciar-se em subgrupos de células efectoras que produzem gupos distinctos de citocinas e, assim, desempenham funções efectoras distinctas. Um dos melhores exemplos da especialização da imunidade adaptativa é a habilidade dos linfócitos T CD4+ activarem diversos mecanismos efectores em resposta a diferentes tipos de micróbios. A base desta especialização está na heterogeneicidade de células T CD4+, ilustrada pela existência de subgrupos que diferem no modo como são induzidos, que citocinas produzem e quais os mecanismos efectores que activam. Células T H 1 e T H 2 Os subgrupos de células T efectoras mais bem definidos da linhagem CD4 + são as células TH1 e TH2, sendo o IFN-γ a citocina caracteristica das células TH1 e as IL-4 e IL-5 as citocinas caracteristicas das células TH2: 

Foram as primeiras populações de células T helper distinguidas em 1980 com base nas suas citocinas secretadas, estudando grandes paineis de linhas celulares clonadas derivadas de células T CD4+ de ratinho estimuladas por antigénios, estudo feito por Mosmann e Coffman (Mosmann et al. 1986).

É agora claro que células T individuais expressam várias misturas de citocinas e que existem muitas subpopulações com padrões heterogénios de produção de citocinas, especialmente em humanos. Contudo, reacções imunes crónicas são normalmente relacionadas com populações TH1 e TH2, sendo as proporções relativas destes subgrupos induzidas durante uma resposta imune os principai determinantes das funções portectoras e consequência patológicas da resposta. Joana Maria Soares Pereira

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As populações TH1 e TH2 são distinguidas principalmente pelas citocinas que produzem. As citocinas produzidas por estes subgrupos de células T não apenas determinam as suas funções efectoras como também participam no desenvolvimento de expansão dos respectivos subgrupos: 



O IFN-γ secretado pelas células TH1 promove a diferenciação de células TH1 e inibe a proliferação de células TH2; A IL-4 produzida pelas células TH2 promove a diferenciação de TH2 e a IL-10, também produzida pelas células TH2 (mas também em menor extensão pelas TH1), inibe o desenvolvimento de células TH1.

Assim, cada subgrupo amplifica-se a si próprio e regula o subgrupo reciproco. Por esta razão, assim que uma resposta imune se desenvolve ao longo de uma via ela torna-se altamente polarizada nessa direcção, e a polarização mais extrema é observada em infecções crónicas ou na exposição crónica a antigénios ambientais, onde a estimulação imune é persistente. Para além disso, as células T TH1 e TH2 podem também ser distinguidas pela expressão diferencial de moléculas de adesão e receptores para quimocinas e outras citocinas. Assim, resumidamente, as propriedades dos subgrupos TH1 e TH2 são: Propriedade Citocinas produzidas IFN-γ IL-4, IL-5, IL-13 IL-10 IL-3, GM-CSF Receptor de citocinas expresso Cadeia β IL-12R IL-18R Receptor de quimocinas expresso CCR4, CCR8, CXCR4 CXCR3, CCR5 Ligandos para E- e P-selectina Isotipos de anticorpos estimulados Activação de macrófagos

Subgrupo TH1

Subgrupo TH2

+++ +/++

+++ ++ ++

++ ++

-

+/++ ++ IgG2a (ratinho) Clássica

++ +/+/IgE, IgG1 (ratinho) / IgG4 (humano) Alternativa

Desenvolvimento dos Subgrupos TH1 e TH2 Os subgrupos TH1 e TH2 desenvolvem-se a partir dos mesmos precursores, que são os linfócitos T CD4+ naive, e o padrão de diferenciação é determinado por estimulos presentes desde inicio durante as respostas imunes: 

Os estimulos indutores da diferenciação mais imporantes são as citocinas, com IFN-γ e IL-12 a serem os principais indutores das células TH1 e IL-4 das células TH2.

Joana Maria Soares Pereira

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A diferenciação de TH1 ocorre em resposta a micróbios que infectam ou activam macrófagos e aqueles que activam células naturalmente assassinas: 



A diferenciação de células T CD4+ activadas por antigénios a células TH1 efectoras é estimulada por várias bactérias intracelulares, como Listeria e mycobacteria, e por alguns parasitas, como Leishmania, todos infectando macrófagos; Também pode ser estimulada por virus e por proteinas antigénicas administradas com fortes adjuvantes.

Uma caracteristica comum a todas estas condições de infecção e imunização é que estas elicitam reacções imunes inatas que se associam com a produção de certas citocinas, incluindo IL-12, IL-18 e interferões do tipo I. Alguns micróbios ligam-se a TLRs em macrófagos e células dendriticas e activam directamente estas células a secretar estas citocinas. Por outro lado, outros micróbios podem desencadear a secreção destas citocinas indirectamente, por exemplo, estimulando células NK a produzir IFN-γ, que por sua vez actua em macrófagos para induzir a secreção de IL-12:  

O IFN-γ produzido pelas células NK, tal como pelas células T que respondem e, talvez, também por alguns macrófagos e células dendriticas, é por si só uma citocina indutora das T H1; As células T podem também aumentar a produção de citocinas pelos macrófagos, em virtude da ligação de CD40L na células T ao CD40 nas APCs e estimulando a transcrição de genes de citocinas;

Joana Maria Soares Pereira

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A interleucina-12 (IL-12) é a principal citocina responsável pela diferenciação das células TH1 e pela indução da resposta imune mediada por células. Ratinhos KO para IL-12 são extremamente susceptiveis a infecções por micróbios intracelulares; A interleucina-18 (IL-18) actua de modo sinérgico com a IL-12.

A base molecular da diferenciação das TH1 envolve um jogo de sinais a partir do receptor da célula T, as citocinas IFN-γ e IL-12 e os factores de transcripção T-bet, STAT1 e STAT4. O factor de transcrição T-bet, um membro da familia de factores de transcrição T-box, é considerado o regulador mestre da diferenciação TH1:   

A expressão de T-bet é induzida nas células T CD4+ naive quando estas reconhecem antigénios e são expostas a IFN-γ; O IFN-γ activa o factor de transcrição STAT1, que por sua vez estimula a expressão de T-bet; O T-bet promove depois a produção de IFN-γ através de uma combinação da activação directa da transcrição do gene IFN-γ e induzindo a remodelação da cromatina do locus IFN-γ.

A habilidade do IFN-γ estimular a expressão de T-bet e a habilidade do T-bet aumentar a transcripção de IFN-γ monta um loop de amplificação positiva que dirige a diferenciação de células T através do fenótipo TH1. A interleucina-12 (IL-12) contribui para a linhagem TH1 ligando-se a receptores em células T CD4+ estimuladas por antigénios e activando o factor de transcrição STAT4, que aumenta ainda mais a produção de IFN-γ. Ratinhos deficientes em IL-12, IL-12R ou STAT4 não são capazes de montar respostas TH1 efectivas contra as infecções, e humanos com deficiências genéticas na via de sinalização do IL-12R apresentam respostas enfraquecidas contra infecções por vários tipos de bactérias intracelulares. A diferenciação TH2 ocorre em resposta a helmintos e alergénios e envolve um jogo de sinais apartir do receptor da célula Tm a citocina IL-4 e os factores de transcrição GATA-3 e STAT6:  

Helmintos e alergénios causam estimulação das células T crónica, normalmente sem respostas imunes inatas fortes que são necessárias para a diferenciação TH1; Assim, as células TH1 podem desenvolver-se em resposta a micróbios e antigénios que causam estimulação das células T repetida ou persistente com baixa inflamação ou activação dos macrófagos.

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A diferenciação de células T estimuladas por antigénios no subgrupo TH2 é dependente de IL-4, que funciona activando o factor de transcrição STAT6, e o STAT6, em conjunto com os sinais TCR, induz a expressão de GATA-3: 



 

O GATA-3 é um factor de transcrição que actua como um regulador mestre da diferenciação das células TH2, aumentanto a expressão de genes das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13, que estão localizadas no mesmo locus genético; O GATA-3 funciona interagindo directamente com os promotres destes genes e também causando a remodelação da cromatina, que abre o locus para aumentar a acessibilidade a outros factores de transcrição; O GATA-3 dirige células em diferenciação para o fenótipo TH2 aumentanto a sua própria expressão via feedback positivo; O GATA-3 bloqueia a diferenciação das TH1 inibindo a expressão da cadeia de sinalização do IL12R.

O papel obrigatório da IL-4 na diferenciação das TH2 levanta uma questão interessante: Como as células TH2 diferenciadas são a principal fonte de IL-4 durante as respostas imunes contra proteinas antigénicas, de onde surge a IL-4 antes do desenvolvimento de células TH2? Uma explicação provável é que as células T CD4+ estimuladas por antigénios secretam pequenas quantidades de IL-4 a partir da sua activação inicial. Se o antigénio for persistente e estiver presente em altas concentrações, a concentração local de IL-4 aumenta gradualmente. Se o antigénio também não elicitar a inflamação com produção de IL-12, o resultado é o aumento da diferenciação de células T em células TH2. Para além disso, em algumas situações, a IL-4 produzida por mastócitos e, possivelmente, outras populações de células pode contribuir para o desenvolvimento de TH2. Como podemos constatar, existe uma retroacção negativa que impede que um subgrupo celular se desenvolva quando outro já se está a desenvolver, por acção antagonista de citocinas secretadas e factores de transcrição expressos.    

T-bet inibe a expressão de GATA-3, e vice-versa; Na presença de IFN-γ há expressão de T-bet e inibição da expressão de GATA-3; Na presença de IL-4 há expressão de GATA-3 e inibição de T-bet; Na presença de IL-5 há expressão de GATA-3 e inibição de T-Bet.

Assim, estes estimulos influenciam o padrão de diferenciação de células T. No entanto, outros estimulos para alem das citocinas podem também influenciar o padrão de diferenciação de células T:  

Em geral, altas doses de antigénio sem adjuvantes favorecem a diferenciação TH2; Alguns estudos indicam que existem diferentes subgrupos de células dendriticas, que promovem selectivamente a diferenciação TH1 ou TH2;

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

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A construção genética do hospedeiro é um determinante importante do padrão de diferenciação de células T, já que ratinhos puros de algumas estripes desenvolvem respostas TH2 contra os mesmo micróbios que estimulam a diferenciação TH1 noutras estirpes.

Respostas Imunes Mediadas por T H 1 A principal função das células TH1 encontra-se na defesa contra as infecções mediada por fagocitose, especialmente infecções por micróbios intracelulares:   

O IFN-γ produzido pelas células TH1 estimula as actividades microbicidas dos fagocitos, promovendo assim a destruição intracelular de micróbios fagocitados; O IFN-γ também estimula a produção de anticorpos IgG opsonizantes e que ligam complemento, que promovem a fagocitose de micróbios; O TNF produzido pelas células TH1 activa neutrófilos, aumentando a morte de micróbios.

Muitas doenças autoimunes especificas de determinados órgãos e reacções inflamatórias, como granulomas, devem-se à activação excessiva das células TH1. No entanto, para que a fase efectora da imunidade mediada por células seja desencadeada, as células T efectoras têm de entrar em contacto com os fagócitos ou células infectadas que estão a apresentar os antigénios que iniciaram a resposta. Para localizar os micróbios em qualquer local, as células T efectoras têm de se expandir clonalmente e diferenciar-se nos órgãos linfóides, como os nódulos linfáticos, e entrar na circulação para depois entrar no local de infecção. Activação de Macrófagos e Outros Leucócitos Mediada por Células TH1 As células TH1 activam macrófagos para que estes eliminem micróbios fagocitados:  

Como sabemos. os monócitos são recrutados do sangue e são expostos a sinais a partir de células efectoras TH1 respondendo aos antigénios no tecido; Como resultado, esta interacção leva à conversão de monócitos a macrófagos activados que são capazes de matar micróbios.

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A activação consiste, assim, na expressão aumentada de várias proteinas que dotam os macrófagos activados com a capacidade de desempenhar funções especializadas, como matar micróbios. Este processo ocorre por sinais mediados por contacto fornecidos por interacções CD40L-CD40 e pela citocina IFN-γ, tal como na estimulação dos linfócitos B, e ocorre do seguinte modo: 1. Quando células efectoras TH1 são estimuladas por antigénios, as células secretam citocinas, principalmente IFN-γ, e expressam CD40L; 2. O IFN-γ é a principal citocina activadora de macrófagos. Ela activa algumas respostas de macrófagos por si só e actua em conjunto com os ligandos TLR, como o LPS, ou com sinais CD40 para elicitar outras respostas; 3. O CD40L liga-se ao CD40 nos macrófagos que estão a apresentar antigénios às células T e activa uma via de transdução de sinal intracelular que é semelhante à via activada pelos receptores de TNF; 4. A necessidade da interacção CD40L-CD40 na activação dos macrófagos assegura que os macrófagos que estão a apresentar antigénios às células T são também os macrófagos que são mais eficientemente activados pelas células T.

Em resposta aos sinais CD40 e IFN-γ, a produção de várias proteinas nos macrófagos é aumentada. A ligação ao CD40 activa os factores de transcrição NF-κB e AP-1 e o IFN-γ activa os factores de transcrição STAT-1 e factor-I de resposta do interferão (IRF-I). Como um resultado destes sinais, macrófagos activados produzem quantidades aumentadas de proteinas que são responsáveis pelas funções efectoras das células na imunidade mediada por células: Resposta dos macrófagos Produção de espécies reactivas de oxigénio, óxido nitrico e enzimas lisossomais Secreção de citocinas (TNF, IL-1, IL-12) Expressão aumentada de co-estimuladores B7, moléculas MHC

Papel na imunidade mediada por células Morte de micróbios nos fagolisossomas (função efectora dos macrófagos) TNF, IL-1: recrutamento de leucócitos (inflamação) IL-12: diferenciação TH1, produção de IFN-γ Activação de células T aumentada (amplificação)

As funções efectoras dos macrófagos activados são as seguintes: 1. Macrófagos activados matam micróbios fagocitados, principalmente produzindo espécies reactivas de oxigénio microbicidas, óxido nitrico e enzimas lisossomais – a activação do Joana Maria Soares Pereira

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macrófagos leva a uma sintese aumentada de espécies reactivas de oxigénio e óxido nitrico, tal como de enzimas lisossomais, todos sendo agente microbicidas potentes que são produzidos nos lisossomas dos macrófagos e matam micróbios ingeridos após os fagossomas fundirem como lisossomas. Estas substâncias tóxicas podem também ser libertadas os tecidos adjacentes, onde matam micróbios extracelulares e podem causar danos nos tecidos normais; 2. Macrófagos activados estimulam a inflamação aguda através da secreção de citocinas, principalmente, TNF, IL-1 e quimocinas, e mediadores lipidicos de curta vida, como factor activante das plaquetas, prostaglandinas e leucotrienos – a acção colectiva destas citocinas e destes mediadores lipidicos derivados dos macrófagos é produzir uma inflamação local que é rica em neutrófilos e recrutar mais monócitos, que se tornam macrófagos e fagocitam e destroem organismos infeccciosos; 3. Macrófagos activados removem tecidos mortos e facilitam a reparação depois da infecção estar controlada – macrófagos activados induzem a formação de tecido reparado secretando factores de crescimento que estimulam a proliferação de fibriblastos (factor de crescimento derivado de plaquetas), a sintese de colagénio (TGF-β) e a angiogénese (factor de crescimento de fibroblastos). Assim, os macrófagos activados actuam como um cirurgião endógeno que cauterizam a ferida e resolvem a reacção inflamatória. Apesar do macrófagos serem capazes de responder directamente aos micróbios nas reacções imunes inatas, a habilidade dos macrófagos matarem micoorganismos ingeridos é altamente melhorada pelas células T. É por isto que a imunidade mediada por células é capaz de eliminar micróbios que evoluiram de modo a sobreviver nos macrófagos na ausência de imunidade adaptativa. Em adição a estas funções efectoras, os macrófagos activados tornam-se APCs mais eficientes devido a:   

Niveis aumentados de moléculas envolvidas no processamento de antigénios (como componentes do proteossoma e catepsinas); Expressão aumentada de moléculas MHC classe II e de co-estimuladores; Produção de citocinas (como IL-12) que estimulam a proliferação e diferenciação de células T.

Estas respostas dos macrófagos funcionam para aumentar a activação das células T, servindo como mecanismos de amplificação da imunidade mediada por células. Alguns danos tecidulares podem normalmente acompanhar as reacções imunes mediadas por células TH1 contra micróbios pois os produtos microbicidas libertados pelos macrófagos e enutrófilos activados são capazes de danificar tecidos normais e não discriminam entre micróbios e tecidos do hospedeiro. Contudo, este dano tecidular é normalmente limitado em extensão e duração, e resolve-se enquanto a infecção é eliminada. no entanto, em alguns casos, as respostas TH1 cuasam dano tecidular significante. Respostas Imunes Mediadas por T H 2 A principal função efectora das células TH2 é promover as reacções imunes mediadas por IgE e eosinófilos/mastócitos, que protegem contra infecções helminticas secretando IL-4, IL-5 e IL-3, o que ocorre do seguinte modo:

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1. Os helmintos são demasiado grandes para ser fagocitados e podem ser mais resistentes às actividade microbicidas dos macrófagos que a maior parte das bactérias e virus; 2. A IL-4 e a IL-13 estimulam a produção de anticorpos IgE especificos para helmintos, que os opsonizam. Acredita-se que os eosinófilos ligam helmintos opsonizados com IgE e que são activados de modo a destrui-los. No entanto, parece que o receptor Fcε dos eosinófilos humanos não apresenta as cadeis sinalizadoras necessárias e, assim, estas células não podem ser activadas pela IgE; 3. A IL-5 pode activar directamente os eosinófilos na vizinhança dos helmintos; 4. Os eosinófilos activados libertam o conteudo dos seus granulos, incluindo proteinas básicas principais e proteinas catiónicas, que são capazes de destruir os resistentes integumentos dos helmintos. No entanto, os mastócitos expressam receptores Fcε funcionais e podem ser activados pelos helmintos revestidos por IgE, resultando na desgranulação por IgE, resultando em desgranulação. O conteudo dos grânulos dos mastócitos incluem aminas vasoactivas, citocinas como TNF e mediadores lipidicos, todos induzindo inflamação local que também funciona para destruir parasitas. Assim: 

Os anticorpos estimulados pelas citocinas TH2 não promovem a fagocitose ou activam o complemento eficientemente mas são capazes de neutralizar micróbios e toxinas.

As IL-4 e IL-13 são também capazes de activar macrófagos a expressar receptores de manose e a expressar enzimas que promovem o sintese de colagénio e a fibrose. Este processo é designado “activação alternativa de macrófagos”, para distingui-lo da activação induzida pelo IFN-γ, que resulta e, funções microbicidas potentes. Os macrófagos que são activados por citocinas TH2 contribuem para a formação de granulomas e remodelação de tecidos nos locais de infecções parasiticas crónicas ou doença alérgica, respectivamente. As citocinas produzidas pelas células TH2 estão também envolvidas na blocagem da entrada e na promoção da expulsão de micróbios nos tecidos mucosos, pois a IL-3 estimula a produção de muco e IL4 estimula o peristaltismo no sistema gastrointestinal. Assim: Joana Maria Soares Pereira

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As células TH2 desempenham um papel importante na barreira imunitária, isto é, na defesa do hospedeiro nas barreiras com o ambiente externo.

Para além disto, o alojamento selectivo de células TH2 em certos locais inflamatórios é dependente de quimocinas particulares. As células TH2 expressam receptores de quimocinas (i.e., CCR3, CCR4 e CCR8) que ligam a quimocinas (i.e., CCL11, CCL24, CCL26, CCL7, CCL13 e CCL22) que são altamente expressas em locais de infecção por helmintos ou de reacções alérgicas, particularmente nos tecidos mucosos.

Assim, as respostas imunes mediadas por células TH2 são a causa das reacções alérgicas, e podem interferir com as respostas imunes protectoras mediadas por TH1 contra infecções intracelulares. Células T H 1 e T H 2 na Doença Um dos modelos de dano tecidular mediado por células mais usado é o modelo animal exprimental da encefalomielite alérgica (EAE), que constitui um modelo experimental para doenças desmielizantes do sistema nervoso. Como esta doença constitui um tipo de doença autoimune, que normalmente são atribuidas a acções das células TH1, será de esperar que:  

A administração de IFN-γ deverá piorar os casos de EAE e anticorpos contra IFN-γ deverão melhorar os casos de EAE; A EAE deverá ser atenuada ou estar ausente em ratinhos deficientes em IFN-γ.

No entanto, estas hipóteses foram todas negadas e os resultados de tais testes foram os opostos: Joana Maria Soares Pereira

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Previsão Administração de IFN-γ piora a EAE Ratinhos KO para IFN-γ serão resistentes a EAE Anticorpos para IFN-γ protegem em EAE Ratinhos KO para TNF serão resistentes a EAE Administração de TNF piora a EAE

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Resultado Administração de IFN-γ protege da EAE A EAE piora em ratinhos KO para IFN-γ Anticorpos para IFN-γ pioram a EAE A EAE piora em ratinhos KO para TNF Administração de TNF protege da EAE

Enquanto os imunologistas se tornaram eficientes na clonagem de células T que causavam doenças autoimunes como EAE e artrite, estudos da patogenicidade de clones de células T que podem induzir EAE com paralisia mostraram a produção de citocinas TH1. Contudo, o grau de patgenicidade destes clones não se co-relacionavam com as quantidade de IFN-γ que tais clones produziam. Assim, existiam relações inversas entre os niveis de citocinas TH1 e destruição autoimune de tecidos em EAE. Por outro lado, estudando o papel da citocina IL-23 na EAE finalmente conseguiu responder a esta contrariedade, levando à descoberta de uma nova classe de células TH efectoras, as células TH17. Células T H 17 Sabe-se agora que, após estimulação antigénica, as células T CD4+ naive activas, expandem-se e diferenciam-se em diferentes subgrupos efectores designados TH1, TH2 e TH17 e caracterizados pela produção de citocinas distintas e pelas suas funções efectoras:

  

As células TH1 produzem IFN-γ e são capazes de mobilizar o braço celular do sistema imune para combater ptogénios intracelulares; As células TH2 secretam IL-4, IL-13 e IL-5, que são essenciais para a geração da classe apropriada de anticorpos e para a eliminação de patogénios extracelulares; A identificação da familia de citocinas IL-17 tal como da expansão de células T produtoras de IL17 mediada por IL-23 levou à descoberta de um novo subgrupo de células T designadas células TH17.

Joana Maria Soares Pereira

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De modo semelhante às células TH1 e TH2, as células TH17 requerem citocinas e factores de transcrição especificos para a sua diferenciação e vários dados sugerem que estas células têm papel importante na defesa do hospedeiro contra patogénios extracelulares, que não são eficientemente eliminados pela imunidade tipo TH1 e TH2. Como estes subgrupos apresentam funções efectoras especificas na eliminação das infecções, a expansão desregulada das células TH CD4+ efectoras causa imunopatologia:   

Excessiva resposta TH1 está associada como várias doenças autoimunes e inflamatórias; Produção de citocinas por TH2 aumentada está envolvida em doenças como alergia e asma; Vários dados sugerem que as TH17 são altamente pro-inflamatórias e que as células TH17 com especificidade para antigénios do próprio levam a autoimunidade severa em vários modelos animais.

A familia de citocinas IL-17 é um grupo de citocinas recentemente descoberto, que inclui vários membros que são produzidos por diferentes células e que apresentam diferentes funções, que são designados como IL-17 associados a uma letra de A a F: Membro

Outros nomes comuns

Receptores

Principais funções Patologia autoimune, recrutamento de neutrófilos e imunidade contra patogénios extracelulares

IL-17A

IL-17 e CTLA8

IL-17RA e IL-17RC

IL-17B

NA

IL-17RB

Actividades pro-inflamatórias?

IL-17C

NA

IL-17RE

Actividades pro-inflamatórias?

IL-17D

NA

Desconhecido

Actividades pro-inflamatórias?

IL-17E

IL-25

IL-17RA e IL-17RB

Induz respostas TH2 e suprime respostas TH17

NA

IL-17RA e IL-17RC

Heterodimero IL-17A-IL-17F

NA

IL-17RA e IL-17RC

vIL-17

ORF13

IL-17RA (e IL-17RC)

IL-17F

  

Recrutamento de neutrófilos e imunidade contra patogénios extracelulares Patologia autoimune, recrutamento de neutrófilos e imunidade contra patogénios extracelulares Desconhecido

Expressão +

Células TH17, células T CD8 , células T γδ, células NK, células NKT e células LTi Células do tracto gastrointestinal, pancreas e neurónios Células da prostata e do rim fetal Células do musculo, cérebro, coração, pulmão, pancreas e tecido adiposo Linfócitos intraepiteliais, células epiteliais do pulmão, macrófagos alveolares, eosinófilos, basófilos, células NKT, células TH2, mastócitos e células do tracto gastrointestinal e do útero + Células TH17, células T CD8 , células T γδ, células NK, células NKT e células LTi +

Células TH17, células T CD8 , células T γδ, células NK, células NKT e células LTi Herpesvirus saimiri

Enquanto IL-17E (IL-25) é principalmente produzida por células TH2, diferentes tipos de células incluindo células T, células T γδ, células NK e neutrófilos produzem IL-17A e IL-17F; Em células T CD4+, a expressão de IL-17A ocorre especificamente em células TH17 para as quais ficou como citocina caracteristica; Contudo, começa a ser claro agora que as células TH17 também produzem IL-17F, IL-21 e IL-22.

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Nas células TH17, tal como noutras células, a IL-17F é co-espressa com IL-17A sugerindo que estas duas citocinas podem mediar coordenadamente as suas funções efectoras. Isto é reforçado pelo facto das IL17A e IL-17F são também capazes de formar heterodimeros e, assim, deverão trabalhar em conjunto para induzir respostas imunes efectoras. No entanto, a IL-17A e a IL-17F podem também actuar independentemente. Diferenciação das Células TH17 em Ratinho A IL-23 foi inicialmente demonstrada na indução da produção de IL-17 em células T activadas e, como IL-23R não é expressa em células T naive, não é supreendente que tenha sido dificil demonstrar a indução directa das células TH17 pela IL-23. Contudo vários estudos sugeriram que:  

Isto é possivel se IL-4 e IFN-γ forem bloqueados; O TGF-β em acção na presença de citocinas pró-inflamatórias, principalmente IL-6, é suficiente para induzir a diferenciação de células T naive em células TH17.

É também importante ter em conta que, a estimulação de células T naive como TGF-β e IL-6 também aumenta a expressão de mRNA RORγt, que é o factor de transcrição caracteritico das células TH17. A fonte in vivo de TGF-β durante a diferenciação de células TH17 ainda é desconhecida, mas:  

Várias linhas de evidência sugerem que células T reguladoras Foxp3+ podem estar envolvidas na diferenciação de células TH17 através do fornecimento de TGF-β; In vitro, células densdriticas estimuladas com certos componentes microbianos, como LPS, são capazes de induzir células TH17, mas requerem uma fonte endógena de TGF-β, que pode ser fornecida na presença de células T reguladoras na cultura.

Em contraste com IL-6, a IL-2 não é necessária para a diferenciação das células TH17, de facto, inibe-a, mas é requerida na geração e sobrevivência de células T reguladoras. Assim, ratinhos deficientes em IL2 apresentam grande numero de células TH17 mas são deficientes em células T reguladoras periféricas, e sofrem imunopatologia linfoproliferativa severa. Isto é supreendente, dada a dependência de IL-2 de outros subgrupos de células T, e sugere que factores adicionais substitutos de IL-2 podem surgir surante o desenvolvimento das células TH17. Um candidato é a IL-21, outro membro da familia de citocinas de cadeia γ como a IL-2:  



A IL-21 é produzida pelas células TH17 após a estimulação por IL-6 e pela IL-21, apesar de outros subgrupos de células T poderem também produzir IL-21; A IL-21 actua de um modo autocrino para promover a diferenciação de células T H17 em conjunto com o TGF-β, e pode ainda compensar a ausência de IL-6 para a indução de RORγδ e a diferenciação de células TH17; Apesar de ainda não ser claro que a IL-21 aumenta a taxa de conversão de células TH17, esta citocina pode não ser essencial para a entrada na linhagem das células TH17 ou para as suas funções patogénicas.

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Ao contrário da IL-21, a IL-23 não é um factor de diferenciação das células TH17. Contudo, esta citocina estabiliza as células TH17 em diferenciação e leva a uma maturação destas células, por exemplo induzindo IL-22 nas células TH17, daí a identificação desta citocina como importante na linhagem de células TH17. Assim, usando todos estes dados, as principais citocinas e o seu papel na diferenciação das células T H17 em ratinho são as seguintes:  

TGF-β, IL-6 e IL-21 são importantes na diferenciação das células T CD4+ naive em células TH17; A IL-23, fornecida por outra fonte celular, é importante na manutenção e maturação das células TH17 efectoras.

Diferenciação das Células TH17 em Humano Apesar de existir acordo nos factores necessários para a geração das células TH17 em ratinho, as citocinas cruciais iniciadoras do desenvolvimento das células TH17 em humano ainda não são claras:  

A IL-23 é capaz de dirigir a diferenciação de células TH17 e culturas com IL-23 ou IL-1 estimulam o fenótipo TH17, com baixa ou nenhuma sinergia quando ambas as citocinas estão presentes; No entanto, outro estudo, identificou a IL-1 como uma citocina que dirige as células TH17 em humanos, com IL-23 e IL-6 como potenciadores dos efeitos da IL-1.

No entanto, a descrição da IL-21 como um factor de crescimento autocrino e o seu potencial de acoplamente com o TGF-β na geração de células TH17 de ratinho levanta a noção que estas citocinas podem também estar presentes na diferenciação de células TH17 humanas. Assim, usando todos estes dados, as principais citocinas e o seu papel na diferenciação das células T H17 em humano são as seguintes:  

TGF-β, IL-6, IL-21, IL-23 e IL-1 são importantes na diferenciação das células T CD4+ naive em células TH17; A IL-23, IL-6 e IL-1 são importantes na manutenção e maturação das células TH17 efectoras.

Apesar da sua diferenciação não ser idêntica, o fenótipo das células TH17 humanas apresentam semelhanças com as células TH17 de ratinho: Joana Maria Soares Pereira

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  



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Ambos os subgrupos porduzem IL-17, IL-17F e IL-22 como citocinas caracteristicas; A expressão de IL-23R e do receptor de quimocinas CCR6 definem adicionalmente este subgrupo; Parece que a produção de IFN-γ pelas células TH17 pode ocorrer em humanos com base na expressão de receptores de quimocinas: células CCR6+CCR4+ produzem IL-17 exclusivamente, enquanto CCR6+CXCR3+ produzem IL-17 e IFN-γ; As células TH17 podem também produzir IL-26 enquanto células TH17 de ratinho patogénicas produzem TNFα e IL-6.

Regulação da Diferenciação das Células TH17 pelas Células TH1 e TH2 Visto que os subgrupos de células TH1 e TH2 regulam a diferenciação de ambas, estas também paprecem regular negativamente a diferenciação das células TH17: 

A adição de IL-12, IFN-γ ou IL-4 a culturas inibe a diferenciação estimulada por IL-23 ou TGF-β mais IL-6 de células TH17 de ratinho e humanas.

No entanto, ainda não é claro por quanto tempo as células T H17 são susceptiveis a esta regulação. Um paradoxo nestes mecanismos é a observação de que um subgrupo de células TH17 podem co-produzir IFN-γ. Isto é particularmente aparente quando olhamos para células T de locais de inflamação, por exemplo, o cérebro de ratinhos após inducção de EAE ou o intestino de pacientes com doença de Crohn activa. Isto sugere, que o IFN-γ não consegue sempre desregular a produção de IL-17 e pode, de facto, contribuir para a função patogénica das células TH17. Para além disso, é interessante reparar que ratinhos que não apresentam o factor de transcrição T-bet das células TH1 produzem grandes numeros de células IL-17+, presumivelmente devido ao numero reduzido da produção de IFN-γ, sendo estes ratinhos extremamente susceptiveis à EAE e outros modelos de inflamação mediada pelas células TH17.

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Respostas Imunes Mediadas por T H 17 Até à data, as principais citocinas da familia IL-17 estudadas são a IL-17A, a IL-17E e a IL-17F e a principal função destas três citocinas é atrair quimicamente diferentes tipos de células através da indução de outras citocinas e quimiocinas: 



A IL-25 (IL-17E) induz a expressão de citocinas e quimiocinas do tipo TH2 e apresenta um papel nas respostas alérgicas do tipo TH2; Ambas IL-17A e IL-17F apresentam propriedades pro-inflamatórias e actuam numa larga gama de tipos celulares para induzir a expressão de citocinas (IL-6, IL-8, GM.CSF, G-CSF), quimiocinas (CXCL1, CXCL10) e metaloproteinases. Para além disso, estas citocinas são citocinas chave para o recrutamento, activação e migração de neutrófilos.

A análise funcional da IL-17 sugeriu um papel importante e unico para esta citocina na defesa do hospedeiro contra patogénios especificos pois a produção de IL-17 e o recrutamento de neutrófilos parecem ser importantes na defesa do hospedeiro contra infecções por bactérias gram-negativo e fungos. Em adição aos neutrófilos, a IL-17 parece também dictar a migração de outros tipos de células efectoras durante a infecção. Em suporte a esta hipótese, células TH17 especificas geradas durante a infecção micobacteriana induzem a expressão de CXCL9, CXCL10 e CXCL11, que atraem as células T H1 CD4+ para o pulmão de modo a controlar a infecção. Papel das Células T H 17 na Autoimunidade Em adição às infecções, as células TH1 desempenham um papel muito importante na indução e propagação de doenças autoimunes em modelos animais e, potencialmente, em doenças autoimunes em humanas:    

A espressão de IL-17 foi detectada em tecidos alvo durante a progressão de várias doenças autoimunes humanas como esclerose multiplas, artrite reumatóide e psoriase; Ratinhos deficientes em IL-17 ou ratinhos tratados com antagonista de IL-17R são resistentes ao desenvolvimento de artrite induzida por adjuvantes; Animais deficientes em IL-17 desenvolvem EAE com severidade reduzida; A administração de um anticorpo neutralizante de IL-17 em ratinhos imunizados com mielina antigénica previne a expressão de quimiocinas no cérebro e o desenvolvimento subsequente de EAE.

A IL-17 está envolvida na patogénese de várias doenças autoimunes em ratinho e possivelmente em humanos.

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A importância do subgrupo TH17 nas doenças autoimunes foi demosntarada em ratinhos deficientes em IL-23. Estes ratinhos apresentavam numeros semelhantes de células T produtoras de IFN-γ aos dos wildtype mas uma diminuição acentuada das células T produtoras de IL.17 e eram resistente ao desenvolvimento de EAE e artrite unduzida pelo colagénio. Enquanto muitos modelos animais de doenças autoimunes eram anteriormente pensados como mediados exclusivamente por células do tipo TH1, estas expriências demonstraram a importância do eixo IL-23/TH17 na patogenicidade destas doenças. No entanto, as células TH1 dos ratinhos deficientes não eram tão encefalitogénicas como as dos animais wildtype, sendo este resultado consistente com o papel do IL-23 na manutenção das células TH17 mas sugerindo também que a liminação da resposta TH17 pode alterar a função ou migração de células TH1 especificas.

Células T Reguladoras A tolerância ao “próprio” é um mecanismo regulatório imune importante que protege os tecidos do próprio de danos mediados pelo sistema imunitário e restringe as respostas imunes activas apenas contra os invasores microbianos. Assim existe define-se: 

Tolerância central – mecanismo pelo qual clones de linfócitos que reconhecem antigénios do próprio são eliminados no timo durante o desenvolvimento normal dos linfócitos.

Contudo, alguns clones de linfócitos com especificidade para antigénios do próprio são encontrados em animais e humanos sem autoimunidade. Para além disso, a autoimunidade é capaz de se desenvolver na ausência de defeitos na tolerância central, definindo-se: 

Tolerância periférica – inicialmente pensava-se que previnia a auto-agressão por células T autoreactivas que escapam da delecção timica mas trabalhos mais profundos levaram à caracterização de células T supressoras especificas, os reguladores das respostas imunes na periferia.

Existem vários tipos de células T reguladoras, incluindo:  

TCRαβ+CD4+; TCRαβ+CD8+;

 

TCRαβ+CD4-CD8-; TCRγδ+

No entanto, a maior parte da investigação tem-se focado nas células T reguladoras TCRαβ+CD4+, as quais se podem ainda dividir em vários subgrupos com fenótipos distinctos, perfis de citocinas secretadas e mecanismos de supressão diferentes. Entre estes subgrupos: Joana Maria Soares Pereira

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Células T CD4+ produzidas no timo e entregues na periferia como uma linhagem de linfócitos de longa vida especificos para antigénio próprios são designadas células T reguladoreas naturais CD4+CD25+ (nTreg); Células T CD4+ recrutadas de linfócitos circulantes e que adquirem propriedade reguladoras sobre condições particulares de estimulação dão designadas células T reguladoras induzidas (iTreg); Existem dois tipos de células T CD4+ reguladoras induzidas, as células T reguladoras 1 (TR1) e as células T helper 3 reguladoras (TH3).

As células T reguladoras estão envolvidas na regulação da resposta imune, manutenção da tolerância e homeostasia imunológica e controlo da autoimunidade e sobrevivência do cancro. Assim, as Tregs desempenham um papel importante na autoimunidade, alergia, cancro, doença infecciosa e indução de tolerância à transplantação. Como consequência, anormalidade no numero e funções das células T regs foram implicadas na patogénese destas condições clinicas. As Tregs são caracterizadas pelas expressão de Foxp3, um factor de repressão transcripcional que está fisicamente associado com a familia Rel de factores de transcrição, NFATs e NF-κB, e bloqueia a sua habilidade de induzir a expressão endógena dos seus genes alvo, incluindo genes de citocinas chave e serve como marcador de subgrupos de células T reguladoras:   

Células nTreg – CD4+CD25+Foxp3+; Células TR1 – CD4+CD25-Foxp3+; Células TH3 – CD4+CD25-Foxp3-

Mecanismos de Acção das Células T Reguladoras Diferentes subgrupos de células T reguladoras apresentam diferentes efeitos supressores, e estes são também mediados de maneiras diferentes: 

As células TR1 e TH3 dependem da produção de citocinas inibitórias, IL-10 e TGF-β, respectivamente, que inibirão a proliferação e aprodução de citocinas por células T efectoras,

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incluindo as células TH1, as células TH2 e as células T CD8+ citotóxicas, tanto directamente como através da influância inibitória da maturação e activação de células dendriticas ou APCs; 

As células nTreg (CD4+CD25+) inibem a proliferação de células T CD25-. Os mecanismos de supressão parece ser multifactorial e inclui contacto célula-célula. Estas células também expressam antigénio 4 citotóxico dos linfócitos T (CTLA4) que interage com CD80 e/ou CD86 na superficie das APCS e esta interacção fornece um sinal negativo para a activação das células T. Existe também alguma evidência que TGF-β secretado ou IL-10 secretada podem apresentar também um papel nestas células T reguladoras.

As células T reguladoras foram inicialmente descritas como células não especificas para antigénios que actuam através de um mecanismo dependente de APCs. As células T reguladoras requerem a activação via o seu TCR para se tornarem supressoras, mas quando activadas as suas funções efectoras são completamente não especificas. No entanto, foi observado que podem existir populações de células T reguladoras que são especificas para antigénios. Parece que as populações de células T reguladoras reconhecem antigénios próprios e estas células, tal como as células T convencionais, apresentam um reportório TCR policlonal e são seleccionadas por péptidos próprios. No entanto, péptidos próprios dirigem a selecção de timócitos CD4 +CD25+ reguladores por um processo que é distinto da selecção negativa e positiva. O numero crescente de mecanismos inibitórios descritos para as células T reguladoras sugere que astas células tomam uma abordagem multipla na regulação imune. É provável que a importância relativa de cada mecanismo inibitório é dependente do contexto e modulada pelo meio inflamatório e pela magnitude da resposta imune. Em conjunto, estes mecanismos fornecem um potente arsenal com o qual as células T reguladoras podem actuar. Joana Maria Soares Pereira

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Indução de Células T Reguladoras na Periferia e Manutenção As células T CD4+CD25- naive podem ser induzidas a se tornarem reguladoras na periferia por uma série de sinais:   

Exposição a antigénio na presença de citocinas imuno-supressoras como IL-10 e TGF-β e/ou ácido retinóico; Activação por células dendriticas imaturas; Activação no contexto de células T reguladoras naturais.

Muitos destes subgrupos de células T reguladoras actua secretando citocinas imunossupressoras IL-10 e/ou TGF-β, que aumentam a diferenciação em células T reguladoras e inibem a diferenciação de outros subgrupos de células T, o que diminui a resposta imune.

A manutenção das células T reguladoras na periferia é ajudada por sinais via IL-2, CD28 e TGF-β. Adicionalmente, as células requerem interacções com os seus ligandos na periferia para maturação e/ou sobrevivência seguinte. Assim que se encontram na periferia, as células T reguladoras são capazes de se expandir vigorosamente em resposta a sinais antigénicos e proliferativos. Acção das Células T Reguladoras na Diferenciação de Diferentes Subgrupos de Células T CD4 + Como sabemos, após a activação, uma células T CD4+ pode diferenciar-se em quatro subgrupos diferentes dependendo das citocinas presentes no meio e as citocinas secretadas por cada um destes subgrupos irá influenciar a diferenciação nos outros grupos. Será, assim, um balanço destas subgrupos que irá dictar a resposta observada na infecção: 

Na presença de IL-12 e interferões do tipo I e tipo II, produzidos na presença de patogénios intracelulares, as células T naive diferenciam-se em células TH1, que produzem IFN-γ, IL-12 e

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TNF-α. Estas citocinas vão induzir a aliminação destas parasitas e o IFN-γ inibe a diferenciação das células TH2 e TH17; Na presença de IL-4, produzida na presença de patogénios extracelulares como helmitos, as células T naive diferenciam-se em células TH2, que produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. A IL-4, a principal citocina secretada pelas células TH2, inibe a diferenciação de células TH1 e TH17; Elevados niveis de TGF-β e IL-6 promovem a diferenciação de células TH17, bastante envolvidas na defesa contra bactérias extracelulares, que não são eficientemente eliminadas pelas células TH1 e TH2; Quando os niveis de TGF-β e IL-10 são bastante elevados, o que normalmente ocorre quando uma reacção imune já ocorre há algum tempo, as células T naive na periferia são estimuladas a diferenciar-se em células T reguladoras, que produzirão TGF-β e IL-10 que inibirão a diferenciação dos outros subgrupos de células T. Isto permite que a infecção termine e previne o desenvolvimento de autoimunidade.

Células T CD8 + Citotóxicas Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) são gerados pela activação de células T citocóxicas (TC): 

 

Apresentam capacidade litica e são criticos no reconhecimento e na eliminação de células próprias alteradas (e.g., células infectadas com virus e células tumorais) e nas reacções de rejeição de enxertos; Geralmente são CD8+ e, assim, são retsritas a MHC classe I, apesar de em casos raros se ter mostrado que células T CD4+ restritas a MHC classe II podem funcionar como citotóxicas; Como virtualmente todas as células nucleadas expressam moléculas MHC classe I, as CTLs são capazes de reconhecer e eliminar quase qualquer célula alterada.

A respostas imune mediada por CTLs pode ser dividida em duas fases, reflectindo diferentes aspectos da respostas: 1. A primeira fase activa e diferencia células TC naive em CTLs efectoras funcionais; 2. Na segunda fase, as CTLs efectoras reconhecem complexos antigénio-MHC classe I em células alvo especificas, que leva a que destruam as células alvo. Joana Maria Soares Pereira

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Activação e Diferenciação em CTLs Efectoras As células TC naive são incapazes de matar células alvo e são, assim, referidas como precursores CTL (CTL-Ps) para denotar o seu estado funcional imaturo. Apenas após uma CTL-P ser activada é que esta célula se diferenciará numa CTL funcional com actividade citotóxica. A geração de CTLs a partir de CTL-Ps parece requerer pelo menos três sinais sequênciais: 1. Um sinal 1 especifico do antigénio transmitido pelo complexo TCR após reconhecimento de um complexo péptido-MHC classe I; 2. Um sinal co-estimulador transmitido pela interacção CD28-B7 da CLP e da célula apresentadora do antigénio; 3. Um sinal induzido pela interacção de IL-2 com o receptor de IL-2 de alta afinidade, resultando na proliferação e diferenciação de CTL-P activadas pelo antigénio em CTLs efectoras.

Células CTL-Ps inactivas não expressam IL-2 ou receptores IL-2, não proliferam e não apresentam actividade antigénica. A activação antigénica induz uma CTL-P a começar a expressar receptor IL-2 e, a uma menor extensão, IL-2, a principal citocina necessária para a proliferação e diferenciação de CTL-Ps activadas em CTLs efectoras. Em alguns casos, a quantidade de IL-2 secretada pela CTL-P activada pelo antige´nio pode ser suficiente para induzir a sua própria proliferação e diferenciação, o que é particularmente verdadeiro para CTL-Ps de memória, que apresentam requerimentos de activação mais baixos que as células naive. Joana Maria Soares Pereira

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No entanto, no geral, a maior parte das CTL-Ps activadas requerem IL-2 adicional produzida por células TH1 em proliferação para proliferar e diferenciar em CTLs efectoras. O facto do receptor de IL-2 não ser expresso até a CTL-P ser activada pelo antigénio mais a moléculas MHC classe I favorece a expansão clonal e aquisição de citotoxicidade apenas pelas CTL-Ps especificas para o antigénio. A dependência de IL-2 para a proliferação e diferenciação é facilmente demonstrada:   

Em ratinhos KO para IL-2, a ausência de IL-2 abortou a citotoxicidade mediada por CTLs; Após a eliminação do antigénio, os niveis de IL-2 caem, o que induz as células TH1 e as CTLs a sofrer morte celular programada or apoptose; Deste modo, a resposta imune é rapidamente terminada, diminuindo a probabilidade de dano tecidular não especifico a partir da resposta inflamatória.

O papel das células TH1 na geração de CTLs apartir de CTL-Ps ainda não é completamente compreendido e é improvável que as células TH1 e as CTL-Ps interajam directamente. No entanto, a IL-2 e a co-estimulação são importantes na transformação de CTL-Ps naive em células efectoras e as células TH1 podem ser mediadores no fornecimento destes requerimentos essenciais: 1. A interacção de células TH com células apresentadoras de antigénio pode resultar na produção de IL-2 pelas células TH1; 2. A acção parácrina desta citocina em CTL-Ps naive vizinhas cujos TCRs estão ligados pode levar à diferenciação e proliferação destas células em CTLs activas; 3. As TH1 podem induzir a sobre-regulação de moléculas co-estimuladoras na superficie de células apresentadoras de antigénios, ajudando as CTL-P a dividirem-se e a diferenciarem-se pela geração de niveis de co-estimulação adequados.

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Fase Efectora de Imunidade Mediada por CTLs A fase efectora da resposta mediada por CTLs envolve uma sequência de eventos cuidadosamente orquestrada que começa com o envolvimento da célula alvo pela célula atacante. Os principai eventos na morte mediada por CTLs são: 1. 2. 3. 4.

Formação de conjugado; Ataque membranar; Dissociação da CTL; Destruição da célula alvo.

Quando CTLs especificas para antigénios são incubadas com células alvo apropriadas, os dois tipos de células interagem e sofrem a formação de conjugados. A formação destes conjugados é seguida por vários minutos por por um passo dependente de Ca2+ e de energia no qual a CTL programa a célula alvo a morrer. Depois, a CTL dissocia-se da célula alvo e continua para se ligar a outra célula alvo. Durante um periodo de tempo variável (algumas horas) após a dissociação da CTL, a célula alvo morre por apoptose. A formação do conjugado ocorre porque o complexo TCR-CD3 na membrana das CTLs reconhece antigénio em associação com moléculas MHC classe I na célula alvo. Após este reconhecimento especifico do antigénio, o receptor integrina LFA-1 na membrana da CTL liga-se a ICAMs na membrana da célula alvo, resultando na formação de um conjugado:    

A activação das CTLs mediada pelo antigénio converte a LFA-1 de um estado de baixa avidez para um estado de alta avidez; Devido a este fenómeno, as CTLs aderem e formam conjugado apenas com as células alvo apropriadas que apresentam péptidos antigénicos com moléculas MHC classe I; A LFA-1 persiste no estado de alta avidez por cerca de 5-10 min após a activação mediada pelo antigénio e depois retoma ao estado de baixa avidez; A diminuição da avidez da LFA-1 facilitará a dissociação da CTL da célula alvo.

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As CTLs apresentam no seu citoplasma grânulos de armazenamente intracelulares bastante densos. Estes grânulos foram isolados por fraccionamento e medeia o dano da célula alvo por si só. São constituidos por:  

Perforina – monómero de proteinas de 65 kDa formadoras de poros e homólogas ao componente C9 terminal do sistema complemento; Granzimas – várias serina proteases.

As CTL-Ps não apresentam grânulos citoplasmáticos e perforinas e parece que, após a activação, estes grânulos citoplasmáticos surgem carregando monómeros de perforina recentemente expressos. Imediatamente após a formação do conjugado CTL-célula alvo, o aparelho de Golgi e os grânulos reorientam-se no citpolasma das CTLs para se concentrarem junto da junção com a célula alvo. Evidências sugerem que monómeros de proforina e proteases granzima são depois libertados por exocitose no espaço juncional entre as duas células.

Quando os monómeros de perforina contactam coma membrana da célula alvo, sofrem uma aletração conformacional, expondo um dominio anfipático que se insere na membrana da célula alvo. Os monómero polimerizam (na presença de Ca2+) para formar poros cilindricos com um diâmetro interno de 5-20 nm. Assim, um grande número de poros perforina são visiveis na membrana das células alvo na região da formação do conjugado. Resumidamente, este processo ocorre do seguinte modo: Joana Maria Soares Pereira

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1. A interacção da CTL com a célula alvo provoca um aumento dos niveis de Ca 2+ intracelulares; 2. Estes niveis de Ca2+ elevados induzem a exocitose, na qual os grânulos se fundem com a membrana celular da CTL; 3. A perforina monomérica é libertada no pequeno espaço entre as duas células; 4. Os monómeros de perforina libertados sofrem uma alteração conformacional induzida pelo Ca 2+ que permite que estes se insiram na membrana da célula alvo; 5. Na presença de Ca2+, os monómeros polimerizam na membrana; 6. A polimerização leva à formação de poros cilindricos. Devido a esta função, a perforina pode ajudar na entrada de granzima na célula alvo de dois modos:  

A formação do poro na membrana celular da célula alvo permite a entrada directa da granzima libertada no espaço entre as duas células na célula alvo; A perforina assiste a entrada através de uma via que envolve um receptor designado receptor de manose-6-fosfato. Muitas células alvo apresentam este receptor na sua superficie e este liga gramzima B. Os complexos granzima B/receptor manose-6-fosfato são internalizados e surgem dentro de vesiculas. Neste caso, a perforina é necessa´ria para a libertação da granzima B das vesiculas no citoplasma da célula alvo.

Assim que entra no citoplasma da células alvo, a granzima B inicia uma cascata de reacções que resulta na freagmentação do DNA da célula alvo em oligomeros de 200 bp, tipos de fragmentos de DNA tipicos da apoptose:   

Como as granzimas são proteases, não capazes de mediar directamente a fragmentação de DNA, activando por outro lado uma via apoptotica na célula alvo; Este processo apoptótico não requer sintese de mRNA nem proteico tanto na CTL como na célula alvo; Este processo também é capaz de fragmentar DNA viral, destruindo células infectadas por virus e o DNA viral destas células. Esta fragmentação de DNA viral previne a replicação viral continuada e montagem no periodo antes da célula alvo ser destruida.

Por outro lado, algumas linhas de CTLs potentes não apresentam porforinas nem granzimas. Nestes casos, a citotoxicidade é mediada pela via de sinalização Fas/FasL:

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A proteina transmembranar Fas, que é um mebro da familia de receptores TNF, é capaz de fornecer sinais de morte quando faz ligação cruzada com o seu ligando natural, um membro da famila tumor necrosis designado Fas ligando (FasL); O FasL é encontrado na membrana de CTLs e sua interacção com o Fas nas células alvo desencadeia a apoptose.

Assim, as CTLs de ratinhos são capazes de matar células alvo por mecanismos mediados por perforinas, por um mecanismo que envolve a ligação de Fas na célula alvo com FasL apresentado na membrana da CTL, ou, em alguns casos, por uma combinação dos dois mecanismos. Assim, existem dois mecanismos responsáveis pela iniciação a morte apoptótica da célula alvo mediada pelas CTLs: 1. Fornecimento direccional de proteinas citotóxicas (perforina e granzimas) que são libertadas das CTLs e entram nas células alvo; 2. Interacções de FasL membranar da CTLs com o receptor Fas na superficie da célula alvo, o que se designada de via FasL-Fas.

Cada um destes eventos de iniciação resultam na activação de uma via de sinalização que culmina na morte da célula alvo por apoptose. Uma caracteristica da morte celular por apoptose é o envolvimento da familia caspase de serina protease, que clivam após um residuo de aspartato:   

Normalmente, as caspases estão presentes na célula como proenzimas inactivas – procaspases – que requerem clivagem proteolitica para conversão às formas activas; A clivagem de uma procaspase produz um iniciador caspase activo, que cliva outra procaspase, activando assim a sua actividade proteolitica; O resultado final é a desmontagem sistemática e ordenada da célula que marca a apoptose.

Assim, esquematicamente, o mecanismo pelo qual estas duas vias entram na via apoptótica das caspases é o segunite: Joana Maria Soares Pereira

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As CTLs usam granzimas e FasL para iniciar cascatas de caspases nos seus alvos. As granzimas introduzidas na célula alvo a partir da CTL mediam os eventos proteoliticos que activam um iniciador caspase. De modo semelhante, a ligação do Fas numa célula alvo pelo FasL na CTL causa a activação de um iniciador caspase na célula alvo. O resultado final das vias mediadas por perforina/granzima e Fas é a activação de vias de morte dormentes que estão presentes na célula alvo. Assim, a CTL não só mata a célula alvo como a induz a cometer suicidio.

Células Naturalmente Assassinas As células naturalmente assassinas foram descobertas por acidente quando imunologistas mediam a actividade in vitro de células especificas de tumores recolhidas de ratinhos com tumores como células com actividade citotóxica não especifica e que actuavam de igaul modo em ratinhos com tumor e sem tumor:  

Estas células constituem cerca de 5%-10% da população de linfócitos recirculantes e apresentam uma morfologis de linfócitos grandes granulares; Estão envolvidas nas defesas imunes contra virús e tumores.

Como as células naturalmente assassinas produzem um numero de citocinas imunologicamente importantes, estas células desempenham papeis importantes na regulação imune e influenciam tanto a imunidade adaptativa como a inata. Por exemplo:  

A produção de IFN-γ pelas células naturalmente assassinas pode afectar a participação de macrófagos na imunidade inata pela activação de actividade fagociticas e microbicidas; O IFN-γ derivado de células naturalmente assassinas pode influenciar a diferenciação de populações de células TH em TH1 vs. TH2 pelos seus efeitos inibitórios na expansão de TH2 e estimulação do desenvolvimento TH1 via indução de IL-12 por macrófagos e células dendriticas.

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As células naturalmente assassinas estão envolvidas na resposta inicial contra as infecções por certos virus e bactérias intracelulares: 

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A actividade das células naturalmente assassinas é estimuladas por interferões do tipo I, pela IL-12 e pelas IL-15. E, no curso de uma infecção viral, o nivel destas citocinas aumenta rapidamente, seguido por uma onda de células naturalmente assassinas que atinge um máximo em 3 dias; As células naturalmente assassinas são a primeira linha de defesa contra infecções viricas, controlando a replicação viral durante o tempo necessário para a activação, proliferação e diferenciação de células CTLP em CTLs funcionais no dia 7.

Desenvolvimento e Caracteristicas das Células Naturalmente Assassinas As células naturalmente assassinas derivam do figado fetal e da medula óssea após o nascimento e são células linfóides que partilham um progenitor comum com as células T, mas a sua linhagem detalhada ainda continua desconhecida: 



No embrião, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são geradas num região que dá origem a todas as linhagens de células do sangue. Apesar dos passos intermediários entre as HSCs e as células naturalmente assassinas ainda não serem conhecidos, já foram identificados precursores que são capazes de gerar células naturalmente assassinas no figado, timo, sangue e baço fetal, como progenitores T-NK bipotentes; No nascimento, o local da hematopoiese muda do figado fetal para a medula óssea. Aqui, os percursores de células NK (NKPs), mas não progenitores T-NK bipotentes, foram identificados. As células naturalmente assassinas encontradas no figado e timo adultos devem ser derivados da medula óssea, mas também podem ser restos da vida fetal.

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As células naturalmente assassinas expressam alguns marcadores membranares que são encontrados em monócitos e granulócitos, tal como alguns que são tipicos das células T. No entanto, diferentes células naturalmente assassinas expressam diferentes grupos de moléculas membranares e não se sabe se estas heterogenicidade reflecte subpopulações de células naturalmente assassinas ou diferentes estágios na sua activação ou maturação. As principais moléculas membranares expressas em células naturalmente assassinas são:    

CD3-; CD56+; CD2+ - subunidade β do receptor de IL-2; CD16+ - receptor para o fragmento Fc da IgG;

  

CD95L - FasL Ly49+ (em ratinho); CD8+ - apenas observado em algumas.

A diferenciação das células naturalmente assassinas ocorre enquanto os percursores interagem com citocinas e com células do estroma na medula óssea. Moléculas de superficie são sequencialmente expressas por células naturalmente assassinas em maturação e podem ser usadas como marcadores de intermediários do desenvolvimento em ratinhos e humanos. Apesar de alguns marcadores diferirem entre as duas espécies, muitas são partilhadas e podem ser usada para deliniar estágios comuns da diferenciação das células naturalmente assassinas: 1. A etapa 1 (commitment) é marcada pela aquisição da expressão de receptor-β da IL-2 (IL-2Rβ); 2. A etapa 2 (maturação) pode ainda ser dividida em vários passos. A aquisição da expressão de moléculas de proteina 1 receptor das células NK (NKR-P1), como NK1.1 em ratinhos e CD161 em humanos) e CD2 identifica as células NK imaturas que não são liticas. DX5 em ratinho e CD56 em humanos são subsequentemente adquiridas em conjunto com o potencial citolitico. A expressão do complexo CD94-NKG2 é adquirida mais tarde, mas antes da maturação final, que resulta na expressão de receptores de MHC especificos (Ly49 em ratinhos e KIRs em humanos).

Os precursores de células naturalmente assassinas requerem citocinas como interleucina-15 (IL-15) para a maturação e sobrevivência, mas outras moléculas soluveis e não soluveis podem participar no desenvolvimento e maturação destas células. Joana Maria Soares Pereira

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As células naturalmente assassinas são exportadas para a periferia, formando uma pool periférica que é encontrada no sangue, em todos os órgãos linfóides e alguns tecidos parenquimais (pulmões e figado). As células naturalmente assassinas periféricas devem recircular entre os diferentes órgãos e tecidos. Em humanos, foram já descritos dois subgrupos de células naturalmente assassinas que são especializadas na produção de citocinas ou morte, no entanto, esta divisão não foi claramente mostrada em ratinho.

Apesar de existirem algumas semelhanças entre as células naturalmente assassinas e os linfócitos T, existem diferenças entre as células NK e os linfócitos: 



As células naturalmente assassinas não se desenvolvem exclusivamente no timo, o que é demonstrado por ratinhos que não apresentam timo, apresentando poucas ou nenhumas células T mas apresentam populações funcionais de células NK; Ao contrário das células T e B, as células naturalmente assassinas não sofrem rearranjo de genes de receptores, o que é demonstrado pela observação de que células naturalmente assassinas se desenvolvem em ratinhos KO para RAG-1 e RAG-2, que não desenvolvem nem células T nem B.

O poder das células naturalmente assassinas e de outras vias protectoras da imunidade inata é claramente demonstrado pela sobrevivência de ratinhos KO para genes RAG, que não apresentam células T nem células B. Funções Citotóxicas das Células Naturalmente Assassinas As células naturalmente assassinas matam células tumorais e células infectadas por virús por processos semelhantes aos empregues pelas CTLs: 1. As células naturalmente assassinas carregam FasL na sua superficie e induzem a morte em células alvo que apresentam Fas; 2. O citoplasma das células naturalmente assassinas contem numerosos granulos que contêm perforina e granzimas. No entanto, ao contrário das CTLs, que necessitam de ser activadas antes dos granulos surgirem, as células naturalmente assassinas são constitutivamente citotóxicas, apresentando grandes granulos no seu citoplasma. Após uma célula naturalmente assassina Joana Maria Soares Pereira

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aderir a uma célula alvo, ocorre desgranulação com a libertação de perforina e granzimas na junção das duas células, sendo os papeis destes dois tipos de proteinas citotóxicas os mesmos nas CTLs.

Apesar destas semelhanças, as células naturalmente assassinas diferem das CTLs de vários modos significantes: 1. As células naturalmente assassinas não expressam receptores de células T especificos para antigénios nem CD3; 2. O reconhecimento de células alvo pelas células naturalmente assassinas não é restrito a MHC; 3. A presença de moléculas MHC classe I inibe a sua actividade citotóxica; 4. A actividade das células naturalmente assassinas não aumenta após uma segunda imunização, ou seja, a resposta das células naturalmente assassinas não gera memória imunológica. Devido ao facto das células naturalmente assassinas verem a sua actividade citotóxica inibida pela presença de moléculas MHC classe I deve-se ao facto da actividade citotóxica contra estas células ser feita pelas CTLs e as NK são importantes na defesa contra virus que se alojam em qualquer célula e têm como principal acção viral a diminuição da expressão de moléculas MHC para que estas não sejam eliminadas. Assim, as células naturalmente assassinas actuam em conjunto com as CTLs fazendo primeiro a eliminação de células com expressão reduzida de moléculas MHC, eliminando indiscriminadamente células com uma expressão de MHC inferior à normal, e deixando as células com niveis superiores ou normais de moléculas MHC para as células T. No entanto, isto levanta a questão intrigante de como é que estas células não atacam eritrócitos, que são células não nucleadas, não expressando moléculas MHC classe I. Seria de esperar que estas células fossem eliminadas pelas células naturalmente assassinas mas, ao que parece, estas células têm outros receptores membranares que impedem a actividade citotóxica das células naturalmente assassinas. Joana Maria Soares Pereira

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Receptores de Activação e de Inibição Dado que as células naturalmente assassinas não expressam receptores especificos para antigénios, os mecanismos pelos quais as células naturalmente assassinas reconhecem células próprias alteradas e destinguem estas das células normais têm sido alvo de investigação. Existem dois modelos para explicar: 1. Two-receptor model – postula que as células naturalmente assassinas empregam duas categorias diferentes de receptores, um que fornece sinais inibitórios à células naturalmente assassina e outro que fornece sinais activadores; 2. Opposing-signals model – tem como base a ideia do modelo anterior mas tem em conta que existem vários receptores diferentes na membrana celular para sinais activadores e um numero de tipos diferentes de receptores inibitórios, sendo o mais correcto. É o balanço entre sinais activadores e inibitórios que permite que as células naturalmente assassinas destingam as células saudáveis das células infectadas ou canceroas. É importante ter em conta que sinais activadores das células naturalmente assassinas adicionais podem ser fornecidos por factores soluveis, incluindo citocinas como interferões tipo I, TNF-α, IL-12 e IL-15. A natureza exacta dos receptores membranares nas células naturalmente assassinas tem sido estudada: 1. Receptores activadores – a ligação cruzada por anticorpos de muitas moléculas encontradas na superficie das células naturalmente assassinas podem activar estas células artificialmente, mas os ligandos naturais de muitos destes receptores de activação não são conhecidos. Alguns candidatos de receptores de activação são:  Membros das proteinas de ligação a carboidratos conhecidos com lectinas tipo-C, assim designados porque apresentam dominios de reconhecimento de carboidratos dependentes de cálcio (Ex: NKR-P1);  CD2, receptor da molécula de adesão LFA-3;  CD16, receptor FcγIII e que, apesar de ser responsável pelo reconhecimento mediado por anticorpos e morte de células alvo pelas células naturalmente assassinas, não está provavelmente envolvido na morte não dependente de anticorpos;  NKp30, NKp44 e NKp46. 2. Receptores inibitórios – dois grupos principais de receptores inibitórios foram já encontrados em células naturalmente assassinas, a familis de receptores inibitórios C-lectina (CLIR) e um grupo de receptores inibitórios da superfamilia Ig (ISIR) conhecido como receptores inibitórios killercell (KIR). Apesar destes grupos serem quimicamente diferentes, em conjunto são referidos como a superfamilia de receptores inibitórios (IRS). Os mais importantes são:  Em humanos, o receptor inibitório C-lectina CD94/NKG2, um heterodimero composto por duas glicoproteinas, reconhece HLA-E em potenciais células alvo. Como as moléculas de HLA-E pertencem ao MHC classe I, são bons indicadores dos seus niveis. Estes receptores não são especificos para um alelo particular de HLA e enviam siniais inibitórios às células naturalmente assassinas com o resultado final de inibição da morte da potencial célula alvo quando os niveis de MHC classe I são normais;  Em ratinho, o receptor LY49 é o homólogo do CD94/NKG2; Joana Maria Soares Pereira

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

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Em contraste, os receptores KIR são especificos para um ou um numero limitado de produtos polimórficos de um loci HLA particular. No entanto, em contraste com as células B e T, as células NK não são limitadas na expressão de receptores KIR.

Como os sinais de receptores inibitórios apresentam poder dominate sobre os sinais de receptores activadores, um sinal negativo de qualquer receptor inibitório, tanto CD94/NKG2 ou KIR, é capaz de bloquear a lise de células alvo por células naturalmente assassinas. Assim, as células que expressam niveis normais de moléculas MHC classe I inalterados tendem a escpara de todas as formas de morte mediada por células naturalmente assassinas. Assim, no opposing-signals model da regulação de células naturalmente assassinas podemos ter dois casos: 1. Os receptores de activação ligam-se a ligandos na célula alvo, e estes ligandos podem ser padrões anormais de glicolisação da superficie de células tumorais ou células infectadas por virus. O reconhecimento destes determinantes pelos receptores de activação das células naturalmente assassinas sinaliza a estas células a morte da célula alvo; 2. Estes sinais podem ser sobrepostos por um sinal de receptores inibitórios. Isto previne a morte da célula alvo e a proliferação das células naturalmente assassinas e a indução da secreção de citocinas como IFN-γ e TNF-α.

A consequência geral deste modelo é a poupança de células que expressam indicadores criticos de normalidade, moléculas MHC classe I, e matar células que não apresentam este indicador.

Citotoxicidade Mediada por Células Dependente de Anticorp os Um numero de células que apresentam potencial citotóxico expressam receptores membranares para a região Fc da molécula de anticorpo, sendo o tipo de citotoxicidade desempenhado por estas células designado citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC): 



Quando o anticorpo está especificamente ligado a uma célula alvo, estas células carregadoras de receptores conseguem ligar à região Fc do anticorpo, e assim à célula alvo, e causam subsequentemente a lise da célula alvo; Apesar destas células citotóxicas não serem especificas para o antigénio, a especificidade do anticorpo dirige-as para as células alvo especificas.

Entreas as células que medeiam a ADCC encontram-se:  

Células naturalmente assassinas; Macrófagos;

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 

Neutrófilos; Eosinófilos.

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A morte de células alvo pela ADCC parece envolver um numero de mecanismos citotoxicos diferentes mas não a lise mediada pelo complemento: 

 



Quando macrófagos, neutrófilos ou eosinófilos ligam uma célula alvo pelo receptor Fc, elas tornam-se mais metabolicamente activas e, como resultado, o nivel de enzimas liticas nos seus granulos ou lisossomas aumenta; A libertação de enzimas liticas no local de contacto resultará no dano da célula alvo; Monócios, macrófagos e células NK activadas secretam TNF que tem efeito citotóxico na célula alvo; Como células naturalmente assassinas e eosinófilos contêm perforina em granulos citoplasmáticos, a morte da célula alvo também podem envolver o dano membranar mediado por perforinas de modo semelhante ao descrito para as CTLs.

Não são todos os isotipos de anticorpos que têm este papel, como sabemos, sendo de esperar que os mais envolvidos neste processo sejam as moléculas de IgG. Actividade funcional Neutralização Opsonização Sensibilização para morte por células NK Sensibilização de mastócitos Activação do complemento Distribuição Transporte através do epitélio Transporte através da placenta Difusão para locais extravasculares Nivel sérico médio (mg/mL)

IgM + +

IgD -

IgG1 ++ +++

IgG2 ++ *

IgG3 ++ ++

IgG4 ++ +

IgA ++ +

IgE -

-

-

++

-

++

-

-

-

+++ IgM + -

IgD -

+ ++ IgG1 +++

+ IgG2 +

+ +++ IgG3 ++

IgG4 +/-

+ IgA +++ -

+++ IgE -

+/-

-

+++

+++

+++

+++

++

+

1,5

0,04

9

3

1

0,5

1,2

3x10

-5

Células Dendriticas As células da familia dendritica encontram-se na maior parte dos órgãos e actuam principalmente como sentinelas, capazes de detectar “sinais de perigo”:  

Encontram-se no coração, no figado, no rim, etc., tal como nas superficies mucosas como os pulmões e o intestino; Nestes tecidos, encontram-se num estado imaturo e têm a capacidade de reconhecer e capturar antigénios microbianos através de receptores especificos.

Como as células T e B se encontram principalmente nos órgãos linfóides, levanta-se a questão de como é que estas células podem ser activadas por patogénios que invadem tecidos periféricos. Várias experiências mostraram que a imunidade das células T é induzida quando os antigénios alcançam Joana Maria Soares Pereira

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tecidos linfóides organizados e efatizam que as células apresentadoras de antigénios funcionam de modo critico como moventadores de antigénios da periferia para tecidos linfóides organizados.

As células dendriticas apresentam propriedades unicas que permitem que elas formem uma ligação entre a periferia e órgãos linfóides, onde as respostas imunes são geramente iniciadas. As caracteristicas das células dendriticas que as tornam células apresentadoras de antigénios por excelência são:    

Localizam-se nos locais de entrada de microorganismos (epitélio) e nos tecidos; Apresentam receptores para capturar e responder aos microorganismos, como TLRs e receptores de manose; Migram para zonas de células T dos órgãos linfóides, tendo o CCR7 (receptor das citocinas CCL19 e CCL21) uma importância elevada e permitindo que estas se localizam com as células T naive; As células dendriticas maturas expressam elevados niveis de moléculas co-estimulatórias necessárias à activação dos linfócitos naive.

Uma das marcas das células dendriticas é a sua capacidade de migrar. As células dendriticas, normalmente, apresentam como localização as áreas de entrada de antigénios, como a derme, os epitélios, as zonas marginais do baço, e, assim, são uma das primeiras linhas de defesa contra os antigénios. Quando reconhecem um antigénio, estas células são capazes de o internalizar, por fagocitose ou endocitose mediada por receptores, e migram para os nódulos linfáticos, principalmente para as zonas ricas em células T, e apresentam-nos via MHC classe II às células T. Isto permite a activação das células T e provoca a sua diferenciação. Joana Maria Soares Pereira

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No entanto, é necessário ter am conta que, para que efectuem a sua função de apresentação de antigénios, as células dendriticas necessitam de ser activadas: 





Se as células dendriticas não forem activadas, não conseguem exercer função apresentadora pois não expressam moléculas co-estimulatórias na sua superficie, promovendo um estado de anergia nas células T; A activação é feita pelos micróbios antigénicos e leva ao aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias (B7 – expressão aumentada pelo reconhecimento de PAMPs pelos TLRs), que promovem a activação das células T quando a célula dendritica apresenta péptidos antigénicos; A função apresentadora das células dendriticas pode ser melhorada pelas células T activadas por ligação do CD40L das células T ao CD40 das células dendriticas. Células T activadas apresentam expressão de CD40L e esta ligação aumenta a activação das células dendriticas, melhorando a sua actividade.

Origem e Desenvolvimento das Células Dendriticas As células dendriticas têm origem nas células estaminais hematopoiéticas na medula óssea e o seu desenvolvimento é caracterizado por: 1. Progenitores das células dendriticas na medula óssea migram via corrente sanguinea e alojamse em tecidos periféricos onde encontram vários factores de crescimento essenciais como GMCSF, IL-4, IL-15, TNF-α, TGF-β e IL-3 secretados por vários tipos de células incluindo células endoteliais, mastócitos, queratinócitos e fibroblastos no microambiente; 2. Tais factores de crescimento determinam o destino dos progenitores que se diferenciam em células dendriticas de Langerhans imaturas, células dendriticas intersticiais ou células dendriticas plasmacitoides. As células dendritica seguem a linhagem das células mielóides, mas podem também seguir a linhagem das células linfóides, e, portanto, progenitores nestas linhagens dão origem a vários tipos de células dendriticas dependendo do tecido onde se alojam. Joana Maria Soares Pereira

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Assim, existem diferentes subpopulações de células dendriticas, e estas diferem na localização, fenótipo e actividade biológica, factores estes que são usados na classificação de diferentes células dendriticas: Principais subgrupos de células dendriticas em ratinho

+

CD8α CD11b high

-

CD8α + CD11b high

-

Plasmocitóides low

Langerhans

Fenótipo

CD11c + CD8α CD11b + DEC205 CD4

CD11c CD8α + CD11b DEC205 + CD4

CD11c +/CD8α CD11b + B220 + GR-1

CD11c dull CD8α high DEC205 + Langerin

Órgão

Baço e outros

Baço e outros

Baço e outros

Epitélio da pele, outros

Áreas ricas em células T

Zonas marginais (baço), sinus subcapsular, dome subepitelial

Epitélio da pele, áreas ricas em células T dos nódulos linfáticos

Microambiente

Zonas marginais, áreas ricas em células T (nodulo linfático)

high

Dermais high

CD11c CD8α + CD11b + DEC205

CD8α CD11b high

Derivadas de monócitos low

CD11c CD8α CD11b + DEC205 CD4

CD11c CD8α + CD11b + DEC205 CD4

Derme da pele, outros

Placas de Peyer

Baço inflamado

Derme da pele, áreas ricas em células T dos nódulos linfáticos

Áreas ricas em células T do dome subepitelial, foliculos associados ao epitélio, foliculos de células B

?

No baço do ratinho, as subpopulações de células dendriticas mais importantes são: 



Células dendriticas convencionais (cDC) – normalmente referidas como células dendriticas linfóides e podem ser CD8α- ou CD8α+, expressando altos niveis de MHC classe II e CD11c. Ou seja, podem ser CD11c- CD8α+ DEC205+ ou CD11c+ CD8α- DEC205-; Células dendriticas plasmocitóides (pDC) – apresentam baixos niveis de MHC classe II e de CD11c, apresentando o fenótipo CD8α+/− CD11b−B220+ Gr-1+.

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Células Dendriticas Convencionais Como já sabemos, existem duas subpopulações de células dendriticas convencionais:  

CD8α+ CD11c- DEC205+; CD8α- CD11c+ DEC205-.

Ambas as populações têm a capacidade de captar antigénio externos, processar e apresentar moléculas MHC classe II, mas estas duas subpopulações diferem nos seus marcadores membranares, diferindo assim também nas suas capacidade efectoras: Molécula TLR3 TLR7 TLR11 CD36 Clec9A (DNGR I)

 

+

CD8α + + + +

-

CD8α + -

Como CD36 e Clec9A são receptores envolvido na fagocitose de células mortes, as células CD8α+ são mais eficientes na fagocitose destas células; Extressam TLRs endossómicos e membranares mas, devido à presença de TLRs intracelulares, ambas são capazes de reconhecer e apresentar antigénios intracelulares, como DNA viral, e serem activados por estes. Neste caso, os antigénios intracelulares são encaminhados para o interior de endossomas e são ai reconhecidos. Se isso não ocorrer, existem outros receptores citosólico que têm o mesmo efeito.

No entanto, as células CD8α+ são mais eficientes na apresentação cruzada de antigénios ligados a células ou soluveis. Isto é, são mais eficientes a apresentar péptidos externos por via MHC classe I, o que é importante para iniciar respostas contra tumores, antigénios virais e desenvolver tolerância a antigénios próprios. Assim, este processo é critico para a indução de respostas imunes adaptativas contra antigénios virais e outros antigénios que não são sintetizados pelas APCs profissionais que podem activar os linfócitos T CD8+.

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A proliferação das CTLs após estas via de apresentação cruzada de antigénio pode ocorrer de três modos:   

As células T CD8+ reconhecem antigénio e co-estimuladores na membrana da célula dendritica, proliferando na ausência de células TH; As células TH CD4+ produzem citocinas que estimulam a diferenciação das CTLs; As células TH CD4+ aumentam a habilidade das células dendriticas estimularem a diferenciação das CTLs, pela ligação CD40-CD40L.

Para além desta diferente capacidade, as subpopulações de células dendriticas convencionais também diferem no papel na indução de respostas imunes contra patogénios, devido ao facto de produzirem diferentes citocinas: 



Células dendriticas CD8α+ - são especializadas na indução de respostas T CD8+ anti-virais devido à capacidade de fazerem apresentação cruzada. Como produzem altos niveis IL-12p70 e TGF-β, têm papel fundamental na indução de respostas TH1 e da indução de células T reguladoras, respectivamente; Células dendriticas CD8α- - estão principalmente envolvidas na imunidade mediada por células T CD4+, particularmente durante infecções bacterianas, e são importantes na indução de respostas TH2.

Joana Maria Soares Pereira

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No entanto, estudos recentes onde se analisaram respostas imunológicas in vivo durante a infecção mostraram que:  

Células dendriticas CD8+ estão envolvidas na indução de respostas T CD4+ e T CD8+ não só durante infecções virais, mas também durante infecções bacteriana e parasiticas; Sobre certas condições experimentais, as células dendriticas CD8- podem produzir IL-12 e podem, por isso, estar envolvidas na indução de respostas TH1 contra patogénios.

Assim, resumidamente, as caracteriticas das células dendriticas convencionais CD8α+ são:  

  

São extremamente eficientes na produção de IL-12 in vivo após estimulação microbiana e durante a infecção; Apresentam a capacidade de produzir elevados niveis de IL-12p70 e, por isso, estimular as respostas TH1, mas este mecanismo parece ser independente de IL-12 mas dependente de CD70; Quando activadas, produzem TGF-β sendo mais eficientes na indução de células T Foxp3+, isto é, células T reguladoras, o que não é observado para as células dendriticas CD8-; Podem activar respostas T CD4+ e T CD8+, devido à capacidade de fazer apresentação cruzada; São altamente eficientes no processamento e apresentação de antigénios via MHC-classe I e representam o principal subtipo para a indução de respostas T CD8+ contra patogénio in vivo, particularmente durante infecções virais.

E as caracteriticas das células dendriticas convencionais CD8α- são: 

  

São eficientes na captura de patogénio e antigénios derivados de patogénios por fagocitose e endocitose e apresenta-los às células T CD4+ através de moléculas MHC classe II, induzindo eficientemente respostas T CD4+; Não são capazes de fazer apresentação cruzada, não activando células T CD8+; São mais eficientes na indução de respostas TH2; Não induzem as células T reguladoras pois não secretam TGF-β, ao contrário das células dendriticas CD8+.

Células Dendriticas Plasmacitoides Estas células diferenciam-se das células dendriticas convencionais por serem CD11clow CD8+/- CD118- Gr1+ e por expressarem selectivamente, no ratinho:  

Siglec-H, que também é expresso em alguns macrófagos; BST-2 (“bone marrow stromal antigen-2”), que é reconhecido pelo anticorpo PDCA-1, e pode ser expresso noutras células quando expostas a IFN tipo I e IFN-γ.

Assim, é facil por citometria de fluxo identificar a presença de células dendriticas plasmocitoides e convencionais no baço de ratinhos pelo uso de anticorpos para marcadores celulares diferentes.

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Estas células secretam grandes quantidade de IFN tipo I, que induz um forte estado anti-viral, e secretam também IL-12, IL6, TNF-α e quimiocinas inflamatórias. Os interferões do tipo I secretados por estas células conferem-lhes as suas funções e caracterizam-se por:      

Diminuem a replicação viral, inibindo-a através da indução de enzimas que bloqueiam a replicação viral; Aumentam a expressão de MHC classe I e a actividade das células naturalmente assassinas; Promovem a sobrevivência das células T activadas e a formação de células de memória; Promovem a actividade T CD8+ citolitica, e a produção de IFN-γ por células T CD8+; Promovem a polarização das células T CD4+ para TH1 em humanos; Promovem a diferenciação e maturação das células dendriticas permitindo que estas apresentem e façam apresentação cruzada de antigénio a células T naive.

Para além disso, ao produzirem IL-6 e IFNs do tipo 1, as células dendriticas plasmacitóides podem induzir a diferenciação de células B em plasmócitos produtores de imunoglobulinas e, ao produzirem quimiocinas, podem atrair células T CD4+ e CD8+ activadas para os sitios de infecção. Tal como as células dendriticas convencionais CD8+, as células dendriticas plasmacitoides expressam moléculas MHC classe II e moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86, apresentando antigénios a células T CD4+, e também são capazes de fazer apresentação cruzada de antigénios a células T CD8+. No entanto, a expressão de MHC por estas células é menor, sendo esta função efectuada com menor eficiência. Quando activadas, estas células dendriticas são capazes de produzir interleucina-12. Assim, para além da função de activação das células T, estas células apresentam também as funções da IL-12:   

Estimula a produção de IFN-γ pelas células NK e pelos linfócitos T; Em conjunto com o IFN-γ, promove a diferenciação de linfócitos TH CD4+; Aumenta as funções citotóxicas de células NK e T CD8+ activadas.

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As células dendriticas plasmacitoides apresentam TLRs endossomais (TLR7 e TLR9) mas, ao contrário das convencionais, não expressam TLR2, TLR4, TLR5 ou TLR3. Assim, não são activadas por antigénios extracelulares (função dos TLR2, TLR4 e TLR5) nem dsRNA viral intracelular (função do TLR3) por esta via. Deste modo, são activadas apenas por antigénios especificos, que são os ligandos dos TLRs que expressam:  

TLR9 – reconhece genomas virais de DNA de cadeia dupla ricos em sequencias CpG nãometiladas; TLR7 – reconhecem RNA viral de cadeia simples.

No entanto, expressam também outros dois receptores de padrões citosólicos que não pertencem à familia dos toll-like receptors e que reconhecem RNA viral:  

RIG-I – reconhecem preferencialmente ssRNA e dsRNA curtos; MDA5 – reconhece dsRNAs longos.

Assim, a activação e maturação das células dendriticas plasmacitoides é feita por antigénios intracelulares que se ligam a estes receptores, havendo um aumento da secreção das citocinas mencionadas e a um aumento da expressão de moléculas MHC classe II e moléculas co-estimuladoras (CD80, CD86 e CD40), ficando estas células aptas para a activação das células T.

Outras Populações de Células Dendriticas nos Nódulos Linfáticos No nódulo linfático podemos também encontrar células dendritica provenientes da pele, sendo as mais importantes: 

Células de Langerhans – apresentam fenótipo CD11chighCD8αdullDC205highLangerin(CD207)+. Estão presentas no epitélio da pele constituindo, em espaço ocupado, grande parte do epitélio. Derivam dos monócitos presentes no sangue, que na pele se diferenciam em células de Langerhans. Após activação entram no sistema linfático e migram para os nódulos linfáticos, onde activam células T;

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

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Células dendriticas da derme – apresentam o fenótipo CD11chighCD8α-CD11b+DEC205+. Estão presentes na derme, ou seja, na camada da pele inferior à localização das células de Langerhans, e quando activadas também viajam para os nódulos linfáticos.

Superantigénios Os superantigénios são proteinas virais ou bacterianas que ligam simultaneamente o dominio Vβ do TCR e a cadeia α de uma moléculas MHC classe II. Foram já identificados superantigénios endógenos exógenos e o cross-link de uma TCR e uma moléculas MHC classe II por qualquer um dos tipos de antigénios desencadeia um sinal activador que induz a activação e proliferação de células T: 



Superantigénios endógenos – são proteinas membranares codificadas por certos virus que infectam células de mamiferos. Um grupo, codificado pelo viru do tumor mamário de ratinhos (MTV), é capaz de integrar o DNA de certas estirpes de ratinhos e, após a integração, proteinas retrovirais são expressas na membrana de células infectadas. Estas proteinas virais, designadas determinates minor lymphocyte stimulating (MIs), ligam sequências Vβ particulares nos TCRs e liga de modo cruzado o TCR a uma moléculas MCH classe II. Foram já identificadas quatro MIs, originárias de diferentes estirpes de MTV; Superantigénios exógenos – são proteinas soluveis secretadas por bactérias. Entre elas existem uma variedade de exotoxinas secretadas por bactérias gram-positivas, como staphylococca enterotoxins, toxic-shock-syndrome toxin e exfoliative-dermatitis toxin. Cada um destes superantigénios exógenos liga sequências Vβ particulares nos TCRs e faz liga o TCR a uma molécula de MHC classe II.

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Os principais superantigénios exógenos podem ser resumidos na seguinte tabela: Superantigénio Staphylococcal enterotoxins SEA SEB SEC1 SEC2 SEC3 SED SEE Toxic-shock-syndrome toxin (TSST1 Exfoliative-dermatitis toxin (ExFT) Mycoplasma-arthritis supernatant (MAS) Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPE-A, B, C, D)

Especificidade Vβ Ratinho Humano

Doença Intoxicação alimentar Intoxicação alimentar Intoxicação alimentar Intoxicação alimentar Intoxicação alimentar Intoxicação alimentar Intoxicação alimentar Sindrome do choque tóxico Sindrome de pele escaldada

1, 3, 10, 11, 12, 17 3, 8.1, 8.2, 8.3 7, 8.2, 8.3, 11 8.2, 10 7, 8.2 3, 7, 8.3, 11, 17 11, 15, 17 15, 16 10, 11, 15

nd 3, 12, 14, 15, 17, 20 12 12, 13, 14, 15, 17, 20 5, 12 5, 12 5.1, 6.1-6.3, 8, 18 2 2

Artrite, choque

6, 8.1-8.3

nd

Febre reumática, choque

nd

nd

Como os superantigénios ligam fora da fenda de ligação ao antigénio do TCR, qualquer células T que expresse uma sequência Vβ particular pode ser activada pelo superantigénio correspondente, sem ter em conta a especificidade antigénica do TCR. Deste modo, os superantigénios terão vários efeitos sobre as células T: 

A activação é policlonal e á capaz de afectar uma percentagem significante da população TH total e as activações massivas que seguem o cross-link por uma superantigénio resulta numa produção exacerbada de citocinas das células TH, levando a uma citotoxicidade sistémica. A intoxicação alimentar induzida por staphylococcal enterotoxins e o choque tóxico induzido por toxic-shock-syndrome toxin são dois exemplos de consequências provocadas pela produção elevada de citocinas induzida pelos superantigénios;



Os superantigénios influenciam a maturação de células T no timo pois induzirão selecção negativa de todos os timócitos que apresentam o dominio Vβ do TCR correspondente à especificdade do superantigénio. Tal delecção massiva pode ser causada por superantigénios endógenos ou exógenos e é caracterizada pela ausência de todas as células T cujos receptores possuem dominios Vβ alvo do superantigénio.

A produção de superantigénios corrompe eficientemente a resposta imunitária, premitindo que o microorganismo a que este pertence se atravesse o sistema imunitário sem ser eliminado. Um mecanismos pelo qual isto é feito é através da indução de anergia nas células T contra os antigénios e Joana Maria Soares Pereira

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os superantigénios. Assim, a produção de superantigénios evoluiu principalmente como um mecanismo de invasão do sistema imune.

MIGRAÇÃO LEUCOCITÁRIA E INFLAMAÇÃO

Migração Leucocitária e Inflamação Muitos tipos de leucócitos movem-se de uma parte do corpo para outro. Isto é especialmente verdadeiro para os linfócitos, que circulam continuamente no sangue e na linfa e, em comum com outros tipos de leucócitos, migram para os tecidos dos locais de infecção ou tecidos danificados. Esta recirculação não aumenta apenas a hipotese de linfócitos especificos para um antigénio particular encontrar esse antigénio como também é critica para o desenvolvimento da resposta inflamatória:  

A inflamação é uma resposta complexa ao dano local ou outros danos e é caracterizada por rubor, calor, inchaço e dor; A inflamação envolve várias células do sistema imune e numerosos mediadores.

A montagem e a regulação das respostas inflamatórias seriam impossiveis sem a migração controlada de populações de leucócitos.

Recirculação de Linfócitos Os linfócitos são capazes de um nivel extraordinário de recirculação, movendo-se continuadamente através do sangue e da linfa para vários órgãos linfóides:  



Após uma viagem de cérca de 30 min na corrente sanguinea, cerca de 45% dos linfócitos são carregados do sangue directamente para o baço, onde residem durante cerca de 5h; Numeros semelhantes de linfócitos (42%) saem do sangue para vários nodulos linfaticos periféricos, onde residem durante cerca de 12h; Um numero pequeno de linfócitos (10%) migram para tecidos extra-linfóides tericários atravessando as células endoteliais dos capilares.

Os tecidos extra-linfóides terciários apresentam normalmente poucas células linfóides, se algumas, mas são capazes de as importar durante uma resposta inflamatória. O tecidos terciários mais imunologicamente activos são aqueles que fazem uma interface com o ambiente externo, como:    

Pele; Epitélio mucoso do tracto gastrointestinal; Epitélio mucoso do tracto pulmonar; Epitélio mucoso do tracto genito-urinário.

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O processo de recirculatção de linfócitos continuada aumenta a probabilidade de linfócitos especificos para determinados antigénios encontrar esse antigénio. Um linfócitos individual pode fazer um circuito completo do sangue para os tecidos e linfa e voltar a fazer o mesmo uma ou duas vezes por dia. Como apenas cerca de um em 105 linfócitos reconhece um antigénio particular, um grande numero de células T ou B faz contacto com células apresentadoras de antigenios num curto espaço de tempo para que seja gerada uma resposta imune especifica. Deste modo, a probabilidade de uma pequena percentagem de linfocitos especificos fazer contacto com o antigénio correspondente é elevada pela elevada recirculação. Para além disso, isto pode também ser melhorado por factore que regulam, organizam e direccionam a circulação de linfócitos e células apresentadoras de antigénios.

Moléculas de Adesão Celular O endotélio vascular serve como “porteiro” regulando o movimento de moléculas e leucócitos sanguineos. Para que os leucócitos circulantes entrem nos tecidos inflamados ou nos tecidos linfóides perif+ericos, as células devem aderir e passar entre as células endoteliais que revestem os vasos sanguineos, um processo de signados de extravasão:

As células endoteliais expressam moléculas de adesão celular (CAMs) especificas para leucócitos: 

 



Algumas destas proteinas membranres são expressas constitutivamente, e outras são expressas apenas em resposta a concentrações locais de citocinas produzidas durante uma resposta inflamatória; Os linfócitos recirculantes, os monócitos e os granulócitos apresentam receptores que ligam as CAMs no endotélio vascular, permitindo que estas células extravasem para os tecidos; Em adição ao seu papel na adesão de leucócitos às células endoteliais, as CAMs nos leucócitos também servem para aumentar a força das interacções funcionais entre células no sistema imune; Várias moléculas de adesão contribuem para as interacções entre células TH e APCs, TH e células B e CTLs e células alvo.

A maior parte das CAMs pertencem a quatro familias de proteinas:

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1. Selectinas – a familia selectina de glicoproteinas membranares apresenta um dominio distal lectin-like que permite que estas moléculas se ligue a grupos carboidratos especificos. As selectinas interagem principalmente com unidade de carboidratos “sialylated”, que se encontram ligadas muitas vezes a moléculas mucin-like. A familia de selectinas inclui três moléculas, designadas L, E e P. A maior parte dos leucócitos circulantes expressam L-selectina, enquanto as E-selectina e P-selectina são expressadas nas células vasculares endoteliais. Estas moléculas são responsáveis pela adesão inicial dos leucócitos ao endotélio vascular; 2. Mucinas – são um grupo de proteinas ricas em serina e treonina que são altamente glicosiladas. A sua estrutura extendida permite que estas apresentem ligandos carboidratos “sialylated” às selectinas. Por exemplo, as L-selectinas nos leucócitos reconhecem carboidratos em duas moléculas mucin-like (CD34 e GlyCAM-1) expressas em certas células endoteliais dos nódulos linfáticos. Outra molécula mucin-like (PSGL-1) encontrada em neutrófilos interage com E- e Pselectinas expressas no endotélio inflamado; 3. Integrinas – são proteinas heterodiméricas (constituidas por uma cadeia α e uma β) que são expressas por leucócitos e facilitam a adesão do endotélio vascular e outras intercações célulacélula. As integrinas são agrupadas em categorias de acordo com o tipo de cadeia β que contêm. Diferentes integrinas são expressas por diferentes populações de leucócitos, permitindo que estas células se liguem a diferentes CAMs que pertencem à superfamilia de imunoglobulinas expressas ao longo do endotélio vascular. Algumas integrinas devem ser activadas antes de serem capazes de ligar com alta afinidade aos seus ligandos;

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4. ICAMS – várias moléculas de adesão contêm um numero variável de dominios immunoglobulinlike e, assim, são classificadas na superfamilia de imunoglobulinas. Incluidas neste grupo estão ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 e VCAM, que são expressas nas células endoteliais vasculares e ligam a várias moléculas de integrinas. Uma importante molécula de adesão designada MAdCAM-1 apresenta tanto dominios Ig-like como mucin-like. Esta molécula é expressa no endotélio mucoso e dirige a entrada de linfócitos para as mucosas. Ela liga-se a integrinas pelos seus dominios Ig-like e a selectinas pelos seus dominios mucin-like. Integrinas As integrinas, como já mencionado, são moléculas heterodiméricas com uma subunidade α e uma subunidade β. Foram já identificados 18 tipos de subunidades α e 8 subunidades β, e foram já identificados 24 tipos de integrinas diferentes, sendo as mais importantes:

Estas molécula ligam os seus ligandos com alta afinidade, no entanto, para o fazerem necessitam de ser activadas. A activação das integrinas é feita do seguinte modo: 1. Diferentes conformações das integrinas estão associadas cim distintas afinidades; 2. Sinais de activação intracelulares induzem a transição entre estes estados de afinidade, o que aumenta a ligação do ligando. Este processo é conhecido regulação da avidez das integrinas; 3. Quando activadas, as integrinas podem agrupar-se, de modo a mediar interacções multivalentes com os ligandos. Joana Maria Soares Pereira

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Extravasão de Neutrófilos Enquanto uma resposta inflamatória se densenvolve, várias citocinas e outros mediadores inflamat´roios actuam nos vasos sanguineos locais, induzindo a expressão aumentanda de CAMs endoteliais. Assim, diz-se que o endotélio está activado ou inflamado. Os neutrófilos são geralmente o primeiro tipo de células que se ligam ao endotélio inflamado e extravasam para os tecidos. Para alcançar isto, os neutrófilos devem reconhecer o endotélio infalamdo e aderir fortemente o suficiente para que saiam do sangue. Os neutrófilos ligados devem depoir penetrar na camada endotelial e migrar para os tecidos vizinhos. Os monócitos e os eosinófilos extravasão por um processo semelhante, mas os passos estão melhor establecidos para os neutrófilos. O processo de extravasão dos neutrófilos pode ser dividido em quatro passos sequenciais: 1. Rolagem - os neutrófilos ligam-se fracamente ao endotélio por interacção de baixa afinidade de selectinas. Durante uma resposta inflamatória, citocinas e outros mediadores actuam no endotélio local, induzindo a expressão de moléculas de adesão da familia de selectinas. Estas Ee P-selectinas ligam-se a moléculas de adesão mucin-like na membrana dos neutrófilos. Esta interacção prende o neutrófilo brevemente mas a força da circulação sanguinea desprene do neutrófilo. As molécula de selectinas noutras células endoteliais prendem de novo o neutrófilo e este processo repetido faz com que o neutrófilo se movimento ligeiramente pelo endotélio; 2. Activação por estimulos quimio-atractores – enquanto o neutrófilo rola, ele é activado por várias moléculo quimio-atractoras. Estas são caracteristicas permanentes da superficie endotelial ou secretadas localmente por células envolvidas na resposta inflamatória. Entre os quimio-atractores estão membros das quimiocinas, sendo que a IL-8 e a MIP-1β são duas quimiocinas envolvidas no processo. No entanto, nem todos os quimio-atractores pertencem à familia das quimiocinas;

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3. Adesão – a ligação destes quimio-atractores na membrana dos neutrófilos desencadeia um sinal activador mediado por proteinas G associadas com o receptor. Este sinal induz uma alteração conformacional nas moléculas de intgrina nos neutrófilos, aumentando a sua afinidade para as ICAMs no endotélio. Subsequentemente, as interacções entre as integrinas e os ICAMs estabiliza a adesão do neutrófilo às células endoteliais, permitindo que a célula adira firmemente à célula endotelial; 4. Migração trans-endotelial – subsequentemente, o neutrófilo migra atarvés da parede do vaso para os tecido. Os passos na migração trans-endotelial e como é que é dirigida ainda são desconhecidos. No entanto, será mediada por quimio-atractores e interacções integrina-ITAMs ou por um estimulo de migração separado.

Extravasão de Linfócitos Vérios subgrupos de linfócitos exibem extravasão directa em locais inflamatórios e órgãos linfóides sencundários. Assim, a recirculação de linfócitos é cuidadosamente controlada para assegurar que as populações de células T e B adequadas são recrutadas para tecidos diferentes.

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Tal como com os neutrófilos, a extravasão de linfócitos envolve interacções entre um numero de moléculas de adesão celular: Receptor nas células

Expressão

Ligandos no endotélio

Passos envolvidos na interacção

CLA ou ESL-1

Células T efectoras

E-selectina

Rolagem

L-selectina

Todos os leucócitos

GlyCAM-1, CD34, MAdCAM-1

Rolagem

LFA-1

Subgrupos de leucócitos

ICAM-1, 2, 3

Adesão

LPAM-1

Células T efectoras

MAdCAM-1, VCAM-1

Rolagem/adesão

Mac-1

Monócitos

VCAM-1

PSGL-1

Neutrófilos

E- e P-selectinas

Rolagem

VLA-4

Neutrófilos, células T, monócitos

VCAM-1, MAdCAM-1, fibronectina

Rolagem

VLA-6

Células T

Laminina

--

--

Principais funções Alojamento na pele e migração para tecidos inflamados Recirculação de linfócitos via HEVs para nódulos linfáticos periféricos e migração para locais terciários inflamados Papel geral na extravasão de linfócitos via HEVs e migração de leucócitos para tecidos inflamados Alojamento de células T ao intestino via HEV mucoso, migração para tevidos imflamados Migração de monócitos para tecidos inflamados Migração de neutrófilos para tecidos inflamados Papel geral na migração de leucócitos para tecidos inflamados Alojamento de células T progenitoras no timo, possivel papel no alojamento de células T em tecidos não mucosos

O processo geral é semelhante ao que se passa durante a extravasão de neutrófilos e compreende as mesmas quatro etapas de contacto e rolagem, activação, adesão e, finalmente, migração transendotelial. Vénulas de Endotélio Alto Algumas regiões do endotélio vascular nas vénulas pós-capilares de vários órgãos linfóides são compostas por células especializadas com uma forma cuboide e são designadas vénulas de endotélio alto (HEVs):   

As suas células contrastam em aparência com as células endoteliais achatadas que revestem o resto dos capilares; Cada um dos órgãos linfóides secundários, com a excepção do baço, contêm HEVs; Estima-se que cerca de 1,4x104 linfócitos extravasam a cada segundo através das HEVs num único nódulo linfático.

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O desenvolvimento e a manutenção das vénulas de endotélio alto nos órgãos linfóides são influenciados por citocinas produzidas em resposta à captura de antigénios. Por exemplo, estas vénulas não se desenvolve em animais criados num ambiente livre de germes. O papela da activação antigénica dos linfócitos na manutençãos das HEVs é demonstrado pelo bloqueio cirurgico da vasculatura linfática aferente de um nódulo, de modo que a entrada de antigénios é bloqueada. Num curto periodo de tempo, as HEVs mostram uma função inibida e, eventualmente, revertem para uma morfologia mais achatada. As vénulas de endotélio alto expressam uma variedade de moléculas de adesão celular e, como outras células endoteliais vasculares, expressam CAMs das familias das:   

Selectinas (E- e P-selectinas); Mucinas (GlyCAM-1 e CD34); ICAM (ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1 e MAdCAM-1).

Algumas destas moléculas de adesão estão distribuidas de um modo especifico dos tecidos. Estas moléculas de adesão tecido-especificas são designadas adressinas vasculares (Vas) porque servem para dirigir a extravasão de diferentes populações de linfócitos recirculantes para órgãos linfóides particulares.

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Alojamento de Linfócitos O processo geral de extravasão de linfócitos é semelhante à extravasão de neutrófilos. No entanto, uma caracteristica importante que destingue os dois processos é que diferentes subgrupos de linfócitos migram diferencialmente entre tecidos diferentes, um pocesso designado trâfego ou alojamento:  

Os diferentes padrões de trâfego de subgrupos de linfócitos são mediados por combinações unicas de moléculas de adesão e quimiocinas; Os receptores que dirigem a circulação de várias populações de linfócitos para tecidos linfóides e inflamatórios particulares são designados receptores de alojamento.

Foram já identificados um numero de moléculas de adesão celular de linfócitos e células endoteliais que participam na interacção de linfócitos com HEVs e com o endotélio de locais terciários ou locais de infecção. Para além disso, as quimiocinas apresentam um papel principal na determinação da heterogenicidade dos padrões de circulação de linfócitos. Recirculação de Linfócitos Naive Um linfócito naive não é capaz de montar uma resposta imune até que seja activada para se tornar uma células efectora: 



A activação de uma célula naive ocorre em microambientes especializados nos tecidos linfóides secundários (e.g., nódulos linfáticos periféricos, placas de Peyer, amigdalas e baço). Nestes microambientes, as células dendriticas capturam antigénios e apresentam-nos a linfócitos naive resultando na sua activação; As células naive não exibem preferência para um tipo particular de tecido linfóide secundário e, por outro lado, circulam indiscriminadamente para tecidos linfóides secundários por todo o corpo reconhecendo moléculas de adesão em HEVs.

A ligação inicial de linfócitos naive a HEVs é geralmente mediada pela ligação do receptor de alojamento L-selectina a moléculas de adesão com GlyCAM-1 e CD34 nas HEVs. O padrão de trâfego das células de naive é desenhado para manter estas células constantemente em recirculação através do tecido linfóide secundário, cuja função primária é aprisionar antigénios sanguineos ou tecidulares.

Assim que linfócitos naive encontram antigénios num tecido linfóide secundário, eles ficam activados e aumentam para linfoblastos. A activação dura cerca de 48h e, durante esta fase, as células são retidas na região paracortical do tecido linfóide secundário. Durante esta fase, designada fase shut-down, Joana Maria Soares Pereira

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linfócitos especificos para antigénios não são detectados na circulação e ocorre proliferação e diferenciação rápida de células naive. As células efectoras e de memória que são geradas por esta processo deixam depois o tecido linfóide e começam a recircular. Recirculação de Linfócitos Efectores e de Memória Os padrões de trâfego dos linfócitos de memória e efectores defirem dos dos linfócitos naive: 



As células efectoras tendem a alojar-se em regiões de infecção reconhecendo o endotélio vascular inflamado e moléculas quimio-atractoras que são geradas durante a resposta inflamatória; As células de memória alojam-se selectivamente no tipo de tecido onde inicialmente encontraram antigénio. Isto assegura, provavelmente, que uma célula de memória particular regresse ao tecido onde é mais provável re-encontrar o antigénio que reconhece.

As células efectoras e de memória expressam niveis aumentados de certas moléculas de adesão celular, como LFA-1, que interagem com ligandos presentes em tecidos extra-linfóides terciários (como a pele e a mucosa epitelial) e em locais de inflamação, permitindo que as células efectoras e de memória entrem nesses locais. Como as células naive não apresentam as moléculas de adesão celular correspondentes, não se alojam nestes locais. O endotélio inflamado expressa um numero de moléculas de adesão, incluindo E- e P-selectinas e VCAM-1 e ICAM-1, que ligam a receptores expressos em altos niveis em células de memória e efectoras. Ao contrário dos linfócitos naive, subgrupos de populações de células de memória e efectoras exibem comportamento tecido-selectivo. Tal especificidade tecidular é devido não a um unico receptor de adesão mas sim a diferentes combinações de moléculas de adesão: 



Subgrupo de alojamento nas mucosas – as células efectoras/de memória deste subgrupo expressam altos niveis de integrinas LPAM-1 (βα4β7) e LFA-1 (αLb2), que ligam MAdCAM e vários ICAMs nas vénulas da lamina própria intestinal. No entanto, estas células evitam a direcção para tecidos linfóides secundários porque apresentam baixos niveis de L-selectina que facilitaria a sua entrada nos tecidos linfóides secundários; Subgrupo de alojamento na pele – este subgrupo também expressa baixos niveis de L-selectina mas apresenta altos niveis de antigénio linfocitário cutâneo (CLA) e LFA-1, que ligam E-selectinas e ICAMs nas vénulas dermais da pele.

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No entanto, apesar das células efectoras e de memória que expressam niveis reduzidos de L-selectinas não tenderem a alojar-se através das HEVs nos nódulos linfáticos periféricos, elas são capazes de entrar nos nódulos linfáticos através dos vasos linfáticos aferentes. Interacções entre Moléculas de Adesão A extravasão de linfócitos para tecidos linfóides secundários ou regiões de inflamação é um processo com multiplos passos envolvendo uma cascata de interacções entre moléculas de adesão semelhante à envolvida na emigração de neutrófilos da corrente sanguinea:

1. O primeiro passo é normalmente uma interacção selectina-carboidrato semelhante à observada na adesão de neutrófilos. Linfócitos naive inicialmente ligam-se a HEVs pela Lselectina, que serve como um receptor de alojamento que dirige os linfócitos para um tecido particular expressando a adesina mucin-like correspondente, como CD34 ou GlyCAM-1. A rolagem ds linfócitos é menos pronuncida que a dos neutrófilos. Apesar das interacções iniciais selectina-carboidrato ser relativamente fraca, a velocidade baixa da corrente sanguinea nas vénulas pós-capilares , particularmente nas regiões das HEVs, reduz a probabilidade da força da corrente desprenda o linfócito; 2. No segundo passo, um estimulo activador das integrinas é mediado por quimiocinas que estão tanto localizadas na superficie endotelial como são secretadas localmente. O espesso glicocálice que reveste as HEVs funcionará para reter estes factores quimio-atractores soluveis nas HEVs. A possivel secreção nas HEVs de quimio-atarctores especificos dos linfócitos explicará porque é os neutrófilos não extravasam para os nódulos linfáticos nas HEVs apesar de expressarem Lselectinas. A ligação das quimiocinas aos receptores acoplados a proteinas G nos linfócitos leva à activação de moléculas de integrina na membrana; 3. Quando activadas, as moléculas de integrinas interagem com ICAMs, de modo que os linfócitos aderem firmemente ao endotélio; 4. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos no passo final, a migração trans-endotelial, são pouco conhecidos. Joana Maria Soares Pereira

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O Processo Inflamatório A inflamação é uma resposta fisiológica a uma variedade de estimulos como infecções e dano tecidular:  



Em geral, uma resposta inflamatória aguda tem um inicio rápido e dura pouco tempo; A inflamação aguda é geralmente acompanhada por uma reacção sistémica conhecida como resposta de fase aguda, que é caracterizada por uma rápida alteração dos niveis de várias proteinas plasmáticas; Em algumas doenças, a activação imune persistente pode resultar na inflamação crónica, que normalmente leva a consequências patológicas.

Papel dos Neutrófilos Nas primeiras etapas da resposta inflamatória, o tipo celular predominante que se infiltra para os tecidos são os neutrófilos. A infiltração de neutrófilos para os tecidos alcança um pico nas primeiras 6h após a inflamação, com a produção de neutrófilos na medula óssea a aumentar para alcançar esta necessidade:  

  

Os neutrófilos deixam a medula óssea a circulam no sangue; Em resposta a mediadores da inflamação aguda, as células endoteliais vasculares aumentam a sua expressão de E- e P-selectinas, com a trombina e a histamina a induzirem a expressão de Pselectinas e citocinas como IL-1 e TNF-α a induzirem a expressão de E-selectinas; Os neutrófilos circulantes expressam mucinas como PSGL-1 ou tetrassacarideos “sialylated”, que ligam as E- e P-selectinas; Esta ligação medeia a ligação de neutrófilos ao endotélio vascular, permitindo que as células rolem na direcção da corrent sanguinea; Durante este tempo, quimiocinas como IL-8 ou outras moléculas quimioatractoras actuam nos neutrófilos, desencadeando sinais activadores que levam à aletração conformacional das integrinas, resultando na adesão e subsequente migração trans-endotelial dos neutrófilos.

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Quando nos tecidos, os neutrófilos activados também expressam niveis aumentadps de recepores de quimio-atractores e, consequentemente, exibem quimiotaxia, migrando a favor de um gradiente de moléculas quimioatractoras: 



Quimiocinas, produtos da quebra do complemento (C3am C5a e C5b67), fibrinopéptidos, prostaglandinas e leucotrienos são mediadores inflamatórios envolvidos na inflamação que são quimiotácticos; Moléculas libertadas por microorganismos, como péptidos formil metionil, são também quimiotácticos para os neutrófilos.

Para além disso, os neutrófilos activados expressam niveis aumentados de recepores Fc para anticorpos e receptores do complemento, permitindo que estas células ligem mais eficientemente a patogénios revestidos por anticorpos ou pelo complemento, aumentando assim a fagocitose. Os sinais activadores também estimulam vias metabólicas para uma explosão respiratória, o que produz intermediários reactivos de oxigénio e intermediários reactivos de azoto: 



A libertação de alguns destes intermediários reactivos e a libertação de mediadores dos grânulos primários e secundários dos neutrófilos (proteases, fosfolipases, elastases e colagenases) desempenha um papel importantes na morte de vários patogénios; Estas substâncias também contribuem para o dano tecidular que pode resultar de uma resposta inflamatória.

A acumulação de células mortas e microorganismos, em conjunto com fluidos acumulados e várias proteinas, forma o que é conhecido com pus. Respostas Inflamatórias Locais e Sistémicas A infecção ou o dano tecidular induzem uma cascata complexa de eventos não-especificos, conhecidos como resposta inflamatória, que fornece uma protecção inicial restringindo o dano tecidulars ao local de infecção ou dano tecidular. A resposta inflamatória aguda envolve:  

Respostas localizadas; Respostas sistémicas.

As marcas da resposta inflamatória localizada aguda são:     

Inchaço (tumor); Vermelhidão (rubor); Dor (dolor); Calor (calor); Perda de função.

Poucos minutos após o dano tecidular, existe um aumento no diâmetro vascular (vasodilatação), resultando num aumento do volume de sangue na área e uma redução do fluxo sanguineo. O aumento do volume de sangue aquece o tecido e faz com que este fique vermelho. A permiamilidade vascular também aumenta, levando à perda de fluido dos vasos sanguineos, particularmente nas vénulas póscapilares. Isto resulta na acumulação de fluido (edema) nos tecidos e, em alguns casos, a extravasão de leucócitos, contribuindo para o inchaço e para a vermelhidão da área. Muitas das alterações vasculares que ocorrem inicialmente numa resposta local são devidas a : Joana Maria Soares Pereira

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Efeitos directos de mediadores enzimáticos plasmáticos, como bradiquinina e fibrinopéptidos, que induzem a vasodilatação e a permiabilidade vascular aumentada; Efeitos indirectos das anafilotoxinas do complemento (C3a, C4a e C5a), que induzem a desgranulação local dos mastócios com libertação de histamina. A histamina é um potente meidador da inflamação, causando vasodilatação e contracção do musculo liso; As prostaglandinas são também capazes de contrinuir para a vasodilatação e permiabiliade vascular aumentada associada com a resposta inflamatória aguda.

Algumas horas após estas alterações vasculares, os neutrófilos aderem às células endoteliais e migram do sangue para os espaços tecidulares. Estes neutrófilos fagocitam patogénios invasores e libertam mediadores que contribuem para a resposta inflamatória, sendo os mais importantes as proteinas inflamatórias dos macrofagos (MIP-1α e MIP-β), quimiocinas que atraem macrófagos para o local de inflamação. Os macrófagos chegam 5-6h após o inicio da resposta inflamatória. Estes macrófagos são células activadas que ixibem fagocitose aumentada e libertação aumentada de mediadores e citocinas que contribuem para a resposta inflamatória.

Os macrófagos activados nos tecidos secretam três citocinas que induzem muita da resposta localizada:  

IL-1, IL-6 e TNF-α actuam localmente, induzindo a coagulação e um aumento da permeabilidade vascular; TNF-α e IL-1 induzem a expressão aumentada de moléculas de adesão nas células endoteliais vasculares, pois o TNF-α estimula a expressaõ de E-selectinas e a IL-1 induz o aumento da expressão de ICAM-1 e VCAM-1, estas duas ultimas ligando-se a integrinas em linfócitos e monócitos, pemitindo a extravasão de neutrófilos, monócitos e linfócitos;

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TNF-α e IL-1 também actuam nos macrófagos e nas células endoteliais para induzir a produção de quimiocinas que contribuem para o influxo de neutrófilos aumentandp a sua adesão às céulas endoteliais vasculares e funcionando como fortes moléculas quimio-atractoras; TNF-α e IL-1 activam macrófagos e neutrófilos, promovendo a actividade fagocitica aumentada e o aumento da libertação de enzimas liticas nos espaços intersticiais.

A resposta inflamatória local aguda pode ocorrer sem o envolvimento ostetantivo do sistema imune. Contudo, muitas vezes as citocinas libertadas nos locais de infecção facilitam tanto a aderência de células do sistema imune a células endoteliais vasculares tal como a sua migração atarvés da parede dos vasos para os tecidos. O resultado é um influxo de linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e mastócitos para o local de dano tecidular, onde estas células participam na eliminação do antigénio e na cicatrização do tecido. A duração e intensidade da resposta inflamatória local aguda deve ser cuidadosamente regulada para controlar o dano tecidular e facilitar os mecanismos de reparação tecidular que são necessários para a cicatrização. O TGF-β parece ter um papel importante na limitação da resposta inflamatória, e promove a acumulação e proliferação de fibroblastos e a deposição de uma matriz extracelular que é necessária para a reparação tecidular adequeada. A resposta inflamatória local é acompanhada por uma resposta sistémica conhecida como resposta de fase aguda, marcada por:    

Indução de febre, pois o aumento de temperatura corporal inibe o crescimento de um numero de patogénios e parece aumentar a resposta imune contra o patogénio; Sintese aumentada de hormonas como ACTH e hidrocortisona; Produção aumentada de leucócitos: Produção de um grande numero de proteinas de fase aguda no figado.

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Muitos efeitos sistémicos de fase aguda devem-se a acções combinadas de IL-1, TNF-α e IL-6:  

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Cada uma destas citocinas actua no hipotálamo para induzir febre; 12 a 24h após o inicio de uma resposta inflamatória de fase aguda, niveis aumentados de IL-1, TNF-α e IL-6 (tal como de factor inibitório de leucemai (LIF) e oncostatina M (OSM)) induzem a produção de proteinas por hepatócitos; O TNF-α também actua nas células endoteliais vasculares e nos macrófagos para induzir a secreção de factores estimulantes de colónias (M-CSF, G-CSF e GM-CSF), que estimulam a hematopoiese resultando num aumento transiente do numero de leucócitos necessários para desencadear a infecção.

SISTEMA DO COMPLEMENTO

O Sistema do Complemento O sistema do complemento é o principal efector do ramo humoral do sistema imune. A investigação do complemento começou nos anos 1890s quando Jules Bordet no Instituto Pasteur em Paris mostrou que antisoro de ovelha para a bactéria Vibrio cholerae causava lise das bactéria e que o aquecimento do antisoro destruia a actividade bacteriolitica. Supreendentemente, a habilidade de lisar as bactérias foi restaurada neste soro aquecido adicionando soro fresco que não continha anticorpos dirigidos contra a bactéria e não era capaz de matar a bactéria por si só. Border correctamente colocou a hipótese da actividade bacteriolitica requerer duas substâncias diferentes: 1. Os anticorpos antibacterianos especificos, que sobrevivem ao processo de aquecimento; 2. Um componente sensivel ao calor responsável pela actividade litica. Paul Ehrlich em Berlim desenvolveu um trabalho semelhante independente e atribui o termo complemento, definido-o como “a actividade do soro sanguineo completar a acção dos anticorpos”. Em anos seguintes, os investigadores descobriram que a acção do complemento era resultado de interacções de um grande e complexo grupo de proteinas.

Funções do Complemento O complemento inclui mais de 30 moléculas soluveis e proteinas ligadas a células. As actividades biológicas deste sistema afectam tanto a imunidade inata com a adquirida e vão mais além das observações originais de lise bacteriana mediada por anticorpos. Comparações estruturais das proteinas envolvidas nas vias do complemento colocam a origem deste sistema em organismos primitivos que possuiam sistemas imunes inatos rudimentares. Por contraste, o facto de interacções de receptores celular com proteinas do complemento controlarem as actividades das células B atribui a este sistema um papel no sistema imune adquirido altamente desenvolvido. Assim, temos um sistema que atravessa a imunidade inata e a imunidade adquirida, contribuindo para cada uma numa variedade de modos.

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Após a activação inicial, os vários componentes do complemento interagem, numa cascata altamente regulada, para desempenharem um numero de funções básicas, incluindo:   



Lise de células, bactérias e virus; Opsonização, que promove a fagocitose de antigénios particulares; Ligação a receptores de complemento especificos em células do sistema imune, desencadeando funções celulares especificas, inflamação e secreção de moléculas imunorreguladoras, como os linfócitos B, pois estes apresentam um receptor de complemento no seu complexo BCR; Clearance imune, que remove complexos imunes da circulação e os deposita no baço e no figado, sendo esta a função mais importante do sistema do complemento, devido ao facto de impedir a acumulação de complexos imunes.

Componentes do Complemento As proteinas e glicoproteinas que compoem o sistema do complemento são sintetizadas principalmente pelos hepatócitos, apesar de quantidades significantes serem também produzidas por monócitos no sangue, macrófagos e células epiteliais dos tractos gastrointestinal e genito-urinário: 

Estes componentes constituem 5% (em peso) da fracção globulina do soro;

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A maior parte circula no soro em formas funcionalmente inactivas como pro-enzimas, ou zimogénios, que se encontram inactivos até clivagem proteolitica, que remove um fragmento inibitório e expoem o local activo; A sequência de reacções do complemento começa com uma cascata de enzimas.

A designação dos componentes do complemento é feita por numeros (C1-C9), por letras (e.g, factor D) ou pro nomes triviais (e.g, factor de restrição homóloga): 



Fragmentos peptidicos formados pela activação de um componente são denotados por pequenas letras. Na maior parte dos casos, o fragmento mais pequeno resultante da clivagem é designado “a” e o maior é designado “b” (e.g, C3a, C3b). no entanto, podem haver excepções; Os fragmentos do complemento interagem com um outro para formar complexos funcionais. Estes complexos que apresentam actividade enzimática são designados por uma barra por cima do numero ou simbolo (e.g., C̅̅̅̅̅̅̅, C̅̅̅̅̅̅̅).

Activação do Complemento A activação do complemento é um processo complexo e os primeiros passo, que culminam na formação de C5b, podem ocorrer por três vias diferentes:   

Via clássica; Via alternativa; Via da lectina.

No entanto, os passos finais que levam ao ataque membranar são os membros em todas as vias.

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Apesar do nome o indicar parcialmente, a via clássica não é a filogeneticamente mais antiga mas sim a primeira identificada. A via alternativa e a via da lectina foram posteriormente identificadas mas são aquelas filogeneticamente mais antiga, pois a sua activação é feita por sistemas mais simples e da imunidade inata. Via Clássica A via clássica é iniciada pela ligação da proteina C1 do complemento aos dominios CH2 das IgG ou aos dominios CH3 das moléculas de IgM que se encontram ligadas a antigénios:  





A C1 é um complexo multimérico grande composto por subunidades C1q, C1r e C1s; A subunidade C1q é feita de uma matriz radial semelhante a um guarda-chuva de seis subunidades ligadas por um braço colagénio-like a uma haste central; Este haxemero desenpenha a função de reconhecimento da molécula e liga-se especificamente a regiões Fc de algumas cadeias pesadas μ e γ; Cada região Ig Fc apresenta um unico local de ligação ao C1q e cada moléculas C1q deve ligar pelo menos duas cadeias pesadas Ig para ser activada.

O ultimo ponto explica porque é que os anticorpos ligados a antigénio, e não os anticorpos que circulam livremente, são capazes de iniciar a activação da via clássica: 



Como cada molécula IgG apresenta apenas uma região Fc, multiplas moléculas de IgG devem estar próximas antes do C1q se poder ligar, e multiplos anticorpos IgG são aproximados apenas quando ligam um antigénio multivalente; Apesar da IgM circulante ser pentamérica, ela não é capaz de se ligar a C1q porque as regiões Fc da IgM pentamérica livre estão na forma planar que é inacessivel ao C1q. A ligação da IgM a um antigénio induz uma alteração conformacional que expoem os locais de ligação ao C1q nas regiões Fc e permite a ligação do C1q.

Assim, devido à sua estrutura pentamérica, uma unica molécula de IgM é capaz de ligar duas moléculas C1q e esta é uma das razões pelas quais a IgM é uma molécula de activação do complemento mais eficiente que os anticorpos IgG.

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C1r e C1s são serinas proteases que formam um tetramero contendo duas moléculas de cada proteina. A ligação de duas ou mais cabeças globulares de C1q às regiões Fc de IgG ou IgM leva à activação enzimática da C1r associada, que cliva e activa a C1s, desencadeando uma cascata de reacções: 1. A C1s activada cliva a próxima proteina na cascata, C4, para gerar C4b, sendo o fragmento mais pequeno, C4a, libertado; 2. A C4 é homóloga da C3 e o C4b contem uma ligação tioester interna que forma ligações covalentes amida ou ester com o complexo antigénio anticorpo ou com a superficie adjacente da célula à qual o antigénio está ligado. Esta ligação da C4b assegura que a activação da via clássica ocorre numa superficie celular ou num complexo imune; 3. A próxima proteina do complemento, C2, complexa com o C4b e é clivada por uma molécula C1s vizinha para gerar um fragmento C2a soluvel de importância desconhecida e um frgamento C2b maior que fica fisicamente associado com o C4b na superficie celular; 4. O complexo C4b2b resultante é a convertase C3 da via clássica pois apresenta a habilidade de ligar e clivar proteoliticamente C3, sendo que a ligação ao C3 é mediada pelo componente C4b e a proteolise catalizada pelo C2b; 5. A clivagem da C3 resulta na remoção do fragmento C3a pequeno e o C3b é capaz de formal ligações covalentes com as superficies celulares ou com o anticorpo onde a activação do complemento foi iniciada; 6. Assim que o C3b é depositado, ele é capaz de ligar factor B e gerar mais C3 convertase pela via alternativa; 7. Algumas moléculas de C3b geradas pela C3 convertase da via clássica ligam a convertase e fomam um complexo C4b2b3b. Este complexo funciona como convertase C5 da via clássica clivando C5 e iniciando os passos finais da activação do complemento. O efeito final dos multiplos passos enzimáticos e de amplificação é que um unica molécula de C3 convertase é capaz de levar à deposição de centenas ou milhares de moléculas de C3b na superficie celular onde o complemento é activado. Assim, resumidamente, as moléculas da via clássica de activação do complemento são:

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Proteina C1 (C1qr2s2) C1q C1r C1s

Estrutura 750 kD 460 kD; hexamero de três pares de cadeias (22, 23, 24 kD) 85 kD dimero 85 kD dimero

Concentração sérica (μg/mL)

75-150 50 50

C4

210 kD, trimero de cadeias de 97, 75 e 33 kD

300-600

C2

102 kD monómero

20

C3

185 kD (subunidade α 110 kD; subunidade β 75 kD)

1000-2000

Imunologia Função Inicia a via clássica Liga a porção Fc do anticorpo que ligou antigénio, a células apoptóticas e a superficies catiónicas Serina protease, cliva C1s para a activar Serina protase, cliva C4 e C2 C4b liga covalentemente à superficie da célula do micróbio, onde o anticorpo está ligado e o complemento foi activado C4b liga C2 para clivagem por C1s C4a estimula a inflamação (anafilotoxina) C2a é uma serina protease q funciona como enzima activa das C3 e C5 convertases para clivar C3 e C5 C3b liga à superficie do micróbio, onde funciona como opsonina e como um componente das C3 e C5 convertases C3a estimula a inflamação (anafilotoxina)

Uma variante não usual independente de anticorpos da via clássica foi descrita no contexto de infecções pneumococais: 



Macrófagos das zonas marginais do baço expressam um lectina de tipo-C na superficie celular designada SIGN-R1 que é capaz de reconhecer os polissacarideos pneumococais e ligar também C1q; A ligação multivalente de toda a bactéria ou polissacarideo ao SIGN-R1 activa via clássica e permite o eventual revestimento, de um modo dependentes de C4, do polissacarideo pneumococal com C3b.

Via Alternativa A via alternativa de activação do complemento resulta na proteolise de C3 e a ligação estável do seu produto de quebra C3b a superficies microbianas, sem a presença de anticorpos:    



A proteina C3 contem uma ligação tioéster reactiva que está enterrada num dominio relativamente grande conhecido como dominio tioéster; Quando a C3 é clivada, a proteina C3b sofre uma alteração conformacional importante e o dominio tioéster expoem a ligação tioéster alteriormente escondida; Normalmente, no plasma a C3 é continuadamente clivada a baixas taxas para gerar C3b por um processo de C3 tickover; Uma pequena quantidade de C3b fica covalentemente ligada à superficie de células, incluindo micróbios, via a ligação tioéster que reage com grupos amino ou hidroxilo de proteinas membranares ou polissacarideos para formar ligações amida ou éster; Se estas ligações não forem formadas, a C3b fica na fase fluida e a ligação tioéster reactiva e exposta é rapidamente hidrolizada, inactivando a proteina. Como resultado, a activação do complemento não pode seguir.

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Quando a C3b sofre a sua alteração conformacional pós-clivagem expondo o dominio tioéster, um local de ligação para uma proteina plasmática designada factor B é também exposto na proteina C3b que está agora covalentemente ligada à superficie de uma células microbiana ou do hospedeiro. Apartir daqui, a cascata de reacções segue do seguinte modo: 1. O factor B agora ligado é por sua vez clivado por uma serina protease plasmática designada factor D, libertando um pequeno fragmento designado Ba e gerando um fragmento maior designado Bb que fica ligado ao C3b; 2. O complexo C3Bb é a C3 convertase da via alternativa e cliva mais moléculas C3, amplificando a sequência. No entanto, mesmo que C3b é gerado pela via clássica, esta é capaz de formar um complexo com Bb e este complexo é capaz de clivar mais C3; 3. Quando C3 é clivado e o C3b fica ligado às células, C3a é libertado e apresenta várias actividades biológicas; 4. Algumas das moléculas de C3b geradas pela C3 convertase da via alternativa ligam à convertase e isto resulta na formação de um complexo que contem uma unidade Bb e duas moléculas C3b, que consiste na C5 convertase da via alternativa que clivará C5 e inicia os passos finais da activação do complemento. A activação estável da via alternativa ocorre na superficie das células microbianas e não nas células dos mamífero. Se um complexo C3bBb é formado numa célula mamifera, ele é rapidamente degradado e a reacção é terminada pela acção de várias proteinas regulatórias presentes nestas células. A ausência de proteinas regulatória nas células microbianas permite a ligação e a activação da C3 convertase da via alternativa. Para além disso, outra proteina da via alternativa, designada properdina, é capaz de ligar e estabilizar o complexo C3bBb e a ligação da properdina á favorecida nos micróbios em oposição às células do hospedeiro. Joana Maria Soares Pereira

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Assim, resumidamente, as moléculas da via alternativa de activação do complemento são: Proteina

Estrutura

Concentração sérica (μg/mL)

C3

185 kD (subunidade α 110 kD; subunidade β 75 kD)

1000-2000

Factor B

93 kD monómero

200

Factor D

25 kD monómero

1-2

Properdina

Composta por quatro subunidades de 56 kD

25

Função C3b liga à superficie do micróbio, onde funciona como opsonina e como um componente das C3 e C5 convertases C3a estimula a inflamação (anafilotoxina) Bb é uma serina protease e a enzima activa das C3 e C5 convertases Serina protease plasmática, cliva o factor B quando este está ligadp a C3b Estabiliza a C3 convertase (C3bBb) nas superficies microbianas

Para além disso, os principais iniciadores da via alternativa da activação do complemento são: Patogénios e particulas de origem microbiana

Não patogénios

Várias estirpes de bactérias gram-negativo LPS de bactérias gram-negativo Várias estirpes de bactérias gram-positivo Ácido teicóico de paredes celulares gram-positivo Paredes celulares de fungos e leveduras (zymosan) Alguns virus e células infectadas por virus Células tumorais (Raji) Parasitas (tripanossomas)

Complexos IgG, IgA e IgE humanos Complexos IgG de coelho Factor venom cobra Eritrócitos heterólogos (coelho, ratinho, galinha) Polimeros aniónicos Carboidratos puros (agarose, inulina)

Via da Lectina A via da lectina da activação do complemento é desencadeada na ausência de anticorpos pela ligação de polissacarideos microbianos a lectinas circulantes, como:  

Lectina de ligação a manose plasmática (MBL); Lectinas de reconhecimento de N-acetilglucosaminas conhecidas como ficolinas.

Estas lectinas soluveis são membros da familia das colectinas e semelhantes estruturalmente à C1q. A MBL liga-se a residuos de manose em polissacarideos e liga também serinas proteases associadas a MBL (MASPs) como MASP-1, MASP-2 e MASP-3:  

Oligomeros de MBL associam-se tipicamente com MASP-2 e MASP-3; Estas duas proteases formam um complexo tetramérico semelhante ao formado pelas C1r e C1s e a MASP-2 cliva C4 e C2.

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Apartir da clivagem de C4 e C2, os eventos subsequentes nesta via são idênticos aos que ocorrem na via clássica. A MBL é uma proteina de fase aguda produzida na resposta inflamatória. A sua função na activação do complemento é semelhante à C1q. Este meio de activação dos componentes C2-C4 para formar C5 convertase sem a necessidade de anticorpos especificos representa um mecanismo de defesa inata importante comparada com a via alternativa, mas utilizando elementos da via clássica excepto proteinas C1. Formação do Complexo de Ataque à Membrana A sequência terminal da activação do complemento envolve C5b, C6, C7, C8 e C9, que interagem sequencialmente para formar uma estrutura macromolecular designada complexo de ataque à membrana (MAC): 

Este complexo forma um grande canal através da membrana da célula alvo, permitindo a difusão livre de iões e pequenas moléculas através da membrana.

O resultado final das vias clássica, alternativa ou da lectina é a produção de uma C5 convertase activa:  





Esta enzima cliva C5, que contem duas cadeias cadeias proteicas, α e β; Após ligação do C5 ao componente C3b não enzimático da convertase, a região N-terminal da cadeia α é clivada; Isto gera o fragmento C5a pequeno, que difunde, e o fragmento maior C5b, que liga à superficie da célula alvo e fornece um local de ligação para os componentes subsequentes do complexo de ataque à membrana; O componente C5b é extremamente lábil e fica inactico em 2 minutos a não ser que C6 se ligue a ele e o estabilize.

Neste ponto, todas as reacções do complemento ocorrem na superficie hidrofóbica da membrana ou em complexos imunes em fase fluida: 

 

Quando C5b6 se liga a C7, o complexo resultante sofre uma transição estrutural hidrofilicaanfifilica que expoem regiões hidrofóbicas, que servem como locais de ligação a fosfolipidos membranares; Se a reacção ocorrer na membrana de uma célula alvo, os locais de ligação hidrofóbicos permitem que o complexo C5b67 se insira na bicamada fosfolipidica; Se a reacção ocorrer num complexo imune ou noutra superficie não celular, os locais de ligação hidrofóbicos não são capazes de ancorar no complexo e este é libertado;

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A ligação de C8 e C5b67 membranares induz um alteração conformacional em C8 de modo que esta proteina também sofre transição conformacional hidrofilica-anfifilica, expondo uma região hidrofóbica, que interage com a membrana plasmática; O complexo C5b678 cria um pequeno poro de 10 angstroms em diâmetro sendo que a formação deste poro é capaz de levar à lise de eritrócitos mas não de células nucleadas; A ligação e polimerização de C9 ao complexo C5b678 é o ultimo passo. Esta é uma molécula porforin-like. Cerca de 10-17 moléculas de C9 são capazes de ligar e polimerizar num unico complexo C5b678. Durante a polimerização, as moléculas C9 sofrem uma transição hidrofilicaanfifilica de modo que conseguem ser inseridas na membrana.

O MAC completo apresenta uma forma tubular, um diâmetro de 70-100 angstroms e consiste num complexo de C5b678 rodeado por um complexo poli-C9. Como iões e pequenas moléculas são capazes de difundir livremente através do canal central do MAC, a célula não é cpaz de manter a sua estabilidade osmótica e é morta por um influxo de água e perda de electrólitos.

Os complexos C5b67 libertados de complexos imunes são capazes de se inserir na membrana de células vizinhas e mediar a lise de “células inocentes”. Normalmente, proteinas regulatórias previnem este acontecimento mas, em algumas doenças, danos tecidulares podem ocorrer por este meio.

Regulação do Sistema do Complemento A activação da cascata do complemento e a estabilidade das proteinas do complemento activas são altamente reguladas para prevenir a activação do complemento em células do hospedeiro normais e para limitar a duração da activação do complemento mesmo em complexos de células microbianas e antigénio-anticorpo. Os principais mecanismos regulatórios que restringem a actividade do complemento podem ser: 

Um mecanismo geral de regulação de todas as vias é a inclusão de componentes altamente lábeis que sofrem inactivação espontânea se não forem estabilizados por reacção com outros componentes;

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Uma série de proteinas regulatórias são capazes de inactivar vários componentes do complemento.

A regulação do complemento é mediada prinicpalmente por várias proteinas regulatórias, que podem ser circulantes ou membranares. Muitas destas proteinas, tal como várias proteinas das vias clássica e alternativa, pertencem a uma familia designada reguladores da actividade do complemento (RCA) e são codificadas por genes homólogos que estão localizados adjecente uns aos outros no genoma: Proteina

Tipo de proteina

Via afectada

Função Inibidor de serina proteases: leva à dissociação de C1r2s2 de C1q Bloqueia a formação de C3 convertase pela ligação a C4b; cofactor para a clivagem do C4b pelo factor I Bloqueia a formação de C3 convertase pela ligação a C3b; cofactor para a clivagem do C3b pelo factor I

Inibidor de C1 (C1Inh)

Solúvel

Clássica

C4b-binding protein (C4bBP)

Solúvel

Clássica e da lectina

Factor H

Solúvel

Alternativa

Receptor do complemento tipo-1 (CR1) Proteina co-factora da membrana (MCP)

Membranar

Clássica, alternativa e da lectina

Bloqueia a formação de C3 convertase pela ligação a C4b ou C3b; cofactor para a clivagem do C3b C3bBb ou C4b pelo factor I

Decay-accelerating factor (DAF ou CD55)

Membranar

Factor I

Solúvel

Clássica, alternativa e da lectina Clássica, alternativa e da lectina

Acelera a dissociação de C4b2a e C3bBb (C3 convertases da via clássica e da via alternativa Serina protease: cliva C4b ou C3b usando C4bBP, CR1, factor H, DAE ou MCP como cofactor

Factor de restrição homóloga (HRF) Inibidor membranar de lise reactiva (MIRL ou CD59)

Membranar

Terminal

Liga C5b678 nas células autologas bloqueando a ligação de C9

Proteina S

Solúvel

Terminal

Inactivador da anafilotoxina

Solúvel

Efectora

Liga C5b67 soluvel e previne a sua inserção na membrana celular Inactiva a actividade anafilotoxina da C3a, C4a e C5a pela remoção de Arg C-terminal por N carboxipeptidase

A activação do complemento tem de ser regulada por duas razões: 1. Normalmente, ocorre activação do complemento a baixos niveis espontâneamente e, se tal activação for capaz de prosseguir, o resultado por ser o dano de células e tecidos normais; 2. Mesmo quando o complemento está activado onde necessário, como nas células microbianas ou em complexos antigénio-anticorpo, ele precisa de ser controlado porque produtos de degradação das proteinas do complemento são capazes de difundir para células adjacentes e danifica-las. A actividade proteolitica das C1r e C1s é inibida por uma proteina plasmática designada inibidor de C1 (C1Inh) que é um inibidor de serina proteases que mimetiza os substratos normais de C1r e C1s: 

Se C1q se liga a um anticorpo e começa o processo de activação do complemento, a C1Inh torna-se um alvo da actividade enzimática do C1r2C1s2 ligados;

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C1Inh é clivado e liga-se covalentemento a estas proteinas e, como resultado, o tetramero C1r2C1s2 dissocia-se de C1q, parando a activação da via clássica; Deste modo, a C1Inh previne a acumulação de C1r2C1s2 enzimaticamente activas no plasma e limita o tempo pelo qual C1r2C1s2 activo está disponivel para activação subsequente dos passos seguintes do complemento.

A seguir a este passos, a montagem dos componentes das C3 e C5 convertases pode ser inibida pela ligação de proteinas reguladoras a C3b e C4b depositidas nas superficies celulares:   

Se C3b está depositado na superficie de células normais do hospediro, ele pode ser ligado a várias proteinas membranares, incluindo MCP, CR1 e DAF e à proteina plasmática factor H; O C4b depositado nas superficies ceulares é também ligado de modo semelhante a DAF, CR1 e a outra poteina plasmática designada C4bBP; Por ligarem a C3b ou C4b, estas proteinas inibem competitivamente a ligação de outros componentes da C3 conevertase, como Bb da via alternativa e C2b da via clássica, bloqueando a progressão da cascata do complemento.

MCP, CR1 e DAF são produzidas por células mamiferas mas não pelos micróbios. Assim, estes reguladores inibem selectivamente a activação do complemento nas células do hospedeiro e permitem que a activação prossiga nos micróbios. Para além disso, superficies celulares ricas em ácido siálico favorecem a ligação da proteina reguladora factor H relativamente à proteina factor B da via alternativa. As células dos mamiferos expressam altos niveis de ácido siálico relativamente aos micróbios, o que previne a activação do complemento nas células do hospedeiro mas permite nos micróbios. A reacção catalizada pelas enzimas C3 convertase das vias clássica, da lectina e alternativa é o principal passo de amplificação na activação do complemento, gerando centenas de moléculas de C3b. o C3b gerado por estas enzimas apresenta o potencial de se ligar a células vizinhas, mediando o dano de células saudáveis causando a opsonização por células fagociticas com receptores para C3b ou induzindo o complexo de ataque membranar. O dano de células do hospedeiro normal é prevendio porque C3b sofre hidrólise espontânea antes de ser capaz de se difundir, não se podendo ligar a células alvo. No entanto, a C3b associada a células é proteoliticamente degradada por uma serina protease designada factor I, que é activa apenas na presença de proteinas regulatórias: Joana Maria Soares Pereira

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MCP, factor H, C4bBP e CR1 funcionam todos como co-factores para a clivagem de C3b mediada pelo factor I, sendo que estas proteinas reguladoras nas células do hospedeiro promovem a degradação proteolitica de proteinas do complemento; A clivagem de C3b mediada por factor I gera fragmento designados iC3b, C3d e C3dg, que não participam na activação do complemento mas são reconhecidos por receptores nos fagócitos e nos linfócitos B.

Por ultimo, existe também regulação na via terminal da activação do complemento, isto é, existe também regulação da formação do complexo de ataque membranar, o que pode ocorrer de dois modos: 1. A formação de MAC é inibida por uma proteina membranar designada CD59, que é uma proteina ligada a glicofosfatidilinositol expressa em muitos tipos de células. Esta proteina incorpora-se nos MACs em montagem antes da inserção membranar de C5b678, inibindo a adição subsequente de moléculas C9. A CD59 está presente em células normais do hospedeiro, onde limita a formação do MAC, mas não está presente nos micróbios; 2. A formação de MAC é também inibida pos proteinas plasmáticas como proteina S que se liga a complexos C5b67 soluveis e previne, assim, a sua inserção em membranas celulares próximas do local onde a cascata do complemento foi iniciada.

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MACs em crescimento são capazes de se inserir em qualquer membrana celular vizinha para além das membrana onde foram gerados. Assim, os inibidores de MACs no plasma e nas membranas das células do hospedeiro asseguram que a lise de células inocentes não ocorrerá próximo do local de activação do complemento. Assim, resumidamente, os principais mecanismos de regulação da activação do sistema do complemento são:

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No entanto, a fagocitose e o dano de células normais mediados pelo complemento são mecanismos patogénicos importantes em várias doenças imunológicas. Nestas doenças, grandes quantidade de anticorpos podem ser depositados nas células do hospedeiro, gerando tantas proteinas do complemento activas que as moléculas reguladoras são incapazes de controlar a activação do complemento.

Consequências Biológicas da Activação do Complemento O complemento serve como um importante mediador da resposta humoral amplificando a resposta e convertendo-a num eficiente mecanismo de defesa para a destruição de microorganismos:     

O MAC medeia a lise celular; Outros componentes ou produtos participam na resposta inflamatória; Outros componentes ou produtos participam na opsonização de antigénios; Outros componentes ou produtos participam na neutralização viral; Outros componentes ou produtos participam na clearance de complexos imunes

Para além disso, produtos de degradação do complemento são capazes de activar linfócitos B pois o complexo receptor destas células apresenta um co-receptor que reconhece C3d. Efeito Lise celular Resposta inflamatória Desgranulação de mastócitos e basófilos Desgranulação de eosinófilos Extravasão e quimiotaxia de leucócitos nos locais de inflamação Agregação de plaquetas Inibição da migração de monócitos/macrófagos e indução do seu espalhamento Libertação de neutrófilos da medula óssea Libertação de enzimas hidroliticas pelos neutrófilos Expressão aumentada de receptores do complemento do tipo 1 e 3 (CR1 e CR3) em neutrófilos Opsonização de antigénios particulares, aumentanto a sua fagocitose Neutralização viral Solubilizadão e clearande de complexos imunes Activação de linfócitos B

Produto do complemento mediador C5b6789, MAC C3a, C4a e C5a (anafilotoxinas) C3a, C5a C3a, C5a, C5b67 C3a, C5a Bb C3c C5a C5a C3b, C4b, iC3b C3b, C5b6789 (MAC) C3b C3d

Muitas das actividade biológicas do sistema do complemento dependem da ligação de fragmentos do complemento a receptores do complemento, que são expressos por várias células: 

Alguns receptores do complemento têm papel importante na regulação da actividade do complemento ligando componentes do complemento biologicamente activos e degradando-os em produtos inactivos.

Existem vários receptores do complemento sendo que cada um apresenta um ligando principal. Estes ligandos incluem vários componentes do complemento e produtos da sua quebra proteolitica:

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FCUP/ICBAS Receptor

2009/2010 Principais ligandos

CR1 (CD35)

C3b, C4b

CR2 (CD21)

C3d, C3dg, iC3b

CR3 (CD11b/18) CR4 (CD11c/18)

iC3b

Receptor de C3a/C4a

C3a, C4a

Receptor de C5a

C5a

Actividade Bloqueia a formação de C3 convertase; liga complexos imunes a células Parte do co-receptor das células B; liga complexos imunes a células Liga moléculas de adesão celular nos neutrófilos, facilitando a sua extravasão; liga complexos imunes, aumentanto a sua fagocitose Induz a desgranulação dos monócitos e basófilos Induz a desgranulação dos monócitos e basófilos

Imunologia Distribuição celular Eritrócitos, neutrófilos, monócitos, macrófagos, eosinófilos, células dendriticas foliculares, células B, algumas células T Células B, células dendriticas foliculares, algumas células T Monócitos, macrófagos, neutrófilos, células NK, algumas células T Mastócitos, basófilos, granulócitos Mastócitos, basófilos, granulócitos, monócitos, macrófagós, células endoteliais

Lise Celular Os complexos de ataque à membrana formados pela activação do complemento são capazes de lisar bactérias gram-negativo, parasitas, virus, eritrócitos e células nucleadas: 



Como as vias alternativa e da lectina geralmente ocorrem sem uma interacção inicial antigénioanticorpo, estas vias servem como importantes defesas da imunidade inata contra microorganismos infecciosos; A necessidade de uma reacção inicial antigénio-anticorpo na via clássica suplementa as defesas não-especificas com um mecanismo de defesa mais especifico. Em alguns casos, a necessidade de anticorpos no evento de activação pode ser fornecida por anticopros naturais, que são produzidos contra componentes comuns de micróbios.

A lise de vários patogénios mediada pelos complexos de ataque à membrana é feita de vários modos dependendo do patogénio e pode ser impedida por estes de vários modos também: 1. Virus – anticorpos e complemento têm um papel importante na defesa do hospedeiro contra virus e são muitas vezes cruciais na contenção da infecção viral durante a infecção aguda e na protecção de re-infecções. A maior parte dos virus com invólucro são susceptiveis a lise mediada pelo complemento. O invólucro viral é derivado da membrana plasmática de células infectadas e, assim, é susceptivel à formação de poros pelos MACs. Ex: herpesvirus, orthomyxovirus, paramyxovirus e retrovirus; 2. Bactérias gram-negativo – são geralmente lisadas eficientemente pelo sistema do complemento. Contudo, algumas bactérias gram-negativo e a maior parte das gram-positivo Joana Maria Soares Pereira

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apresentam mecanismos de escape ao dano mediado pelo complemento. Algumas bactérias gram-negativo são capazes de desenvolver resistência à lise mediada pelo complemento o que se correlaciona com a sua virulência, mas a maior parte das bactérias gram-negativo são susceptiveis à lise mediada pelo complemento; 3. Bactérias gram-positivo – estas bactérias são normalmente resistentes à lise mediada pelo complemento, porque a espessa camada de peptidoglicano na sua membrana previne a inserção de MAC na membrana interna; 4. Células nucleadas - sua lise requer a formaçãp de multiplos MACs, enquanto um unico MAC é capaz de lisar eritrócitos. Muitas células nucleadas, incluindo a maior parte das células cancerigenas, são capazes de endocitar MACs. Se o complexo for removido cedo, a célula é capaz de repara qualquer dano membranar e restaurar a sua estabilidade osmótica. Um probelma deste facto é a dificuldade de destruição de células cancerigenas por este meio. Assim, os principais mecanismos de escape à lise mediada pelo complemento de muitos tipos de células e patogénios são so seguintes: Componente microbiano Bactérias gram-negativo Longas cadeias de polissacarideos no LPS das paredes celulares Proteinas da membrana externa Elastase

Mecanismo de escape As cadeias laterais previnem a inserção de MACs na membrana bacteriana MAC interage com proteinas membranares e não é capaz de se inserir na membrana bacteriana Anafilotoxinas C3a e C5a são inactivadas pela elastase microbiana

Exemplos Estirpes resistentes de E. coli e Salmonella Estirpes resistentes de Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa

Bactérias gram-positivo Camada de peptidoglicano na perede celular Cápsula bacteriana Outros micróbios Proteinas que mimetizam as proteinas reguladoras do complemento

Inserção de MAC na membrana bacteriana é prevenida pela espessa camada de peptidoglicano A cápsula fornece uma barreira fisica entre o C3b depositado na membrana bacteriana e o CR1 nas células fagociticas Proteinas presentes em várias bactérias, virus, fungos e protozoários inibem a cascata do complemento

Streptococcus

Streptococcus pneumoniae

Vaccinia virus, herpes simplex, Epstein-Barr virus, Trypanosoma cruzi, Candida albicans

Indução de Respostas Inflamatórias A cascata do complemento é muitas vezes vista como importante na lise celular, mas vários péptidos gerados durante a formação de MACs desempenham um papel decisivo no desenvolvimento de uma resposta inflamatória efectiva. Os fragmentos mais pequenos resultantes da clivagem do complemento, C3a, C4a e C5a, designados anafilotoxinas, são importantes neste processo: 

Ligam a receptores nos mastócitos e basófilos e induzem a desgranulação, que liberta histamina e outros mediadores farmacologicamente activos;

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

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Induzem contracções no musculo liso e aumenta a permeabilidade vascular.

A activação do sistema do complemento resulta no influxo de fluidos que carregam anticorpos e células fagociticas para o local de entrada do antigénio.

As actividades destas anafilotoxinas altamente reactivas são reguladas por uma protease sérica designadas carboxipeptidase N, que cliva um residuo de Arg do C-terminal das moléculas. As moléculas formadas no fim da proteólise de C3a e C4a estão completamente inactivas mas o produto de C5a retem cerca de 10% da sua actividade quimiotáctica e 1% da sua habilidade de provocar contracções do musculo liso. Para além disso, C3a, C5a e C5b67 são capazes de induzir monócitos e neutrófilos a aderirem a células endoteliais vasculares, extravasarem através do capilar e migrar para o local de activação do complemento nos tecidos. O C5a é mais potente neste processo, sendo necessário a qunatidades da ordem dos picomolares. Opsonização e Fagocitose O C3b é a principal opsonina do sistema do complemento, apser de C4b e iC3b apresentarem actividade opsonizante:   

A amplificação que ocorre com a activação de C3 resulta num revestimento por C3b de complexos imunes e particulas antigénicas; Células fagociticas, tal como outras célulasm expressam receptores do complemento (CR1, CR3 e CR4) que ligam C3b, C4b ou iC3b; Antigénios revestidos por C3b ligam-se a células com CR1 e se a célula for um fagócito (e.g., um neutrófilo, monócito ou macrófago) a fagocitose é aumentada.

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A activação de células fagociticas por vários agentes, incluindo a anafilotoxina C5a, aumenta o numero de CR1s de 5000 em fagócitos não activados para 50.000 em células activadas, facilitando altamente a fagocitose de antigénios revestidos por C3b. Para além disso, o fragmento C3b á capaz de actuar como adjuvante quando acoplado com proteinas antigénicas pois marca os antigénios directamente para a fagocitose, aumentando a inicianção do processamento de antigénios e acelerando a produção de anticorpos especificos. Eliminação de Complexos Imunes A importância do sistema do complemento na eliminação de complexos imunes é observada em pacientes com a doença autoimune lupus eritromatosa sistémica (SLE): 



Estes individuos produzem grandes quantidades de complexos imunes e sofrem dano tecidular como resultado da lise mediada pelo complemento e indução de hipersensibilidades do tipo II e III; De facto, deficiências em C1, C2, C4 e CR1 predispoem um individuo a SLE, pois deficiências no complemento intereferem com a eficiência da solubilização e eliminação de complexos imunes, sendo que estes complexos permanecem e provocam danos nos tecidos.

O processo de eliminação de complexos imunes é assim de elevada importância e ocorre do seguinte modo: 

O revestimento de complexos imunes com C3b facilita a sua ligação a CR1 em eritrócitos. Apesar dos eritrócitos expressarem niveis de CR1 mais baixos que os granulócitos, existem cerca de 103 eritrócitos para cada leucócito, fazendo com que os eritrócitos constituam cerca de 90% do CR1 no sangue;



Assim, os eritrócitos desempenham um papel importante na ligação de complexos imunes revestidos por C3b e carregam-nos para o figado e para o baço;



Nestes órgãos, os complexos imunes são desligados dos eritrócitos e são fagocitados, prevenindo a sua deposição nos tecidos.

Em pacientes com SLE, deficiências em C1, C2 e C4 contribuem para niveis reduzidos de C3b em complexos imunes e, assim, inibem a sua eliminação. Os baixos niveis de CR1 expressos nos eritrócitos dos pacientes com SLE também intereferem com a ligação adequada de eliminação de complexos imunes. Joana Maria Soares Pereira

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Neutralização da Infectividade Viral Para a maior parte dos virus, a ligação de anticorpos séricos às subunidades repetidas das proteinas estrutirais viricas cria complexos imunes particulares ideais para a activação da via clássica do complemento. No entanto, alguns virus (e.g., retrovirus, Epstein-Barr virus, Newcastle disease virus e rubella virus) são capazes de activar a via alternativa, da lectina e até a clássica na ausência de anticorpos. O sistema do complemento medeia a neutralização viral por um numero de mecanismos:   



Algum grau de neutralização é alcançado através da formação de agregados virais maiores, simplesmente porque estes agregados reduzem o numero de particulas virais infecciosas; A ligação de anticorpos e/ou complemento à superficie de particulas virais bloqueia a ligação dos virus a células do hospedeiro susceptiveis; Depositos de anticorpos e complemento em particulas virais facilita a ligação da particula viral a células que possuem receptores Fc ou tipo-1 do complemento. No caso das células fagociticas, tal ligação pode ser seguida de fagocitose e destruição intracelular da particula ingerida; O complemento é efeciente na lise da maior parte dos virus com envólucro, resultando na fragmentação do envólucro e desintegração do nucleocápside.

Activação de Linfócitos B A proteina C3d gerada a partir de C3 liga-se ao receptor CR2 nas células B e facilita a activação de células B e a iniciação das respostas imunes humorais: 

 

C3d é gerado quando o complemento é activado por um antigénio, tanto directamente (e.g., quando o antigénio é um polissacarideo microbiano) ou após ligação a um anticorpo; A activação do complemento resulta na ligação covalente do C3b e do seu produto de clivagem C3d ao antigénio; Os linfócitos B são capazes de ligar o antigénio atarvés dos seus receptores Ig e ligam simultaneamente o C3d ligado através de CR2, o co-receptor do receptor de antigénios da célula B, aumentando assim a sinalização induzida pelo antigénio nas células B.

Para além disso, antigénios opsonizados encontram-se também ligados a células dendriticas foliculares nos centros germinativos. As células dendriticas foliculares apresentam antigénios a células B nos centros germinativos e, assim, este processo é importante para a selecção de células B de alta afinidade. A importância do complemento nas respostas imunes humorais é ilustrada pela deficiência acentuada na produção de anticorpos e na formação de centros germinativos em ratinhos KO para C3, C4 ou CR2.

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ÍNDICE INTRODUÇÃO AO SISTEMA IMUNITÁRIO......................................................... 1 Visão Geral da Resposta Imune ...................................................................................................... 1 Imunidade ............................................................................................................................................. 1 Perspectiva Histórica ............................................................................................................................ 1 Imunidade Inata e Adaptativa .............................................................................................................. 3 Imunidade Inata ............................................................................................................................... 4 Imunidade Adaptativa ..................................................................................................................... 5 Tipos de Respostas Imunitárias Adaptativas ........................................................................................ 5 Principais Caracteristicas da Resposta Imunitária Adaptativa ............................................................. 7 Componentes Celulares do Sistema Imunitário Adaptativo ................................................................ 8 Disfunção Imunitária e suas Consequências ...................................................................................... 10 Alergia e Asma ............................................................................................................................... 11 Resposta a Transplantes ................................................................................................................ 11 Doença Auto-imune ....................................................................................................................... 12 Imunodeficiência ............................................................................................................................ 12 Imunidade Inata........................................................................................................................... 13 Imunidade Inata ................................................................................................................................. 13 Caracteristicas do Reconhecimento Imune Inato .............................................................................. 13 Receptores de Reconhecimento de Padrões .................................................................................. 16 Componentes do Sistema Imune Inato .............................................................................................. 18 Barreiras Epiteliais ......................................................................................................................... 19 Fagócitos e Resposta Inflamatória................................................................................................. 20 Células Naturalmente Assassinas (NK cells) .................................................................................. 34 Papel da Imunidade Inata na Estimulação da Resposta Imune Adaptativa ....................................... 37

RECONHECIMENTO DE ANTIGÉNIOS .............................................................. 39 O Complexo Principal de Histocompatibilidade ............................................................................. 39 O Complexo Principal de Histocompatibilidade ................................................................................. 39 Descoberta do MHC ........................................................................................................................... 40 Organização Geral e Herança do MHC ............................................................................................... 41 Formas Alélicas do MHC ................................................................................................................ 43 Moléculas MHC .................................................................................................................................. 45 Estrutura das Moléculas MHC Classe I ........................................................................................... 46 Estrutura das Moléculas MHC Classe II .......................................................................................... 48 Joana Maria Soares Pereira

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Relação Exão/Estrutura dos Genes e Proteinas MHC .................................................................... 49 Ligação de Péptidos a Moléculas MHC ............................................................................................... 50 Base Estrutural da Ligação de Péptidos a Moléculas MHC............................................................ 52 Diversiade de Moléculas MHC entre Animais .................................................................................... 54 Desiquilibrio de Ligação ................................................................................................................. 55 Relevância Funcional do Polimorfismo .......................................................................................... 55 Organização Genómica do MHC ......................................................................................................... 56 Expressão de Moléculas MHC ............................................................................................................ 58 Processamento de Antigénios e sua Apresentação aos Linfócitos T ............................................... 60 Reconhecimento de Antigénios pelos Linfócitos T............................................................................. 60 Células Apresentadoras de Antigénios ............................................................................................... 63 Papel das Células Dendriticas na Iniciação das Respostas das Células T ....................................... 66 Apresentação de Antigénios a Linfócitos T Efectores Diferenciados ............................................. 69 Processamento de Antigénios ............................................................................................................ 70 Via MHC Classe II ........................................................................................................................... 72 Via MHC Classe I ............................................................................................................................ 78 Significado Fisiológico da Apresentação de Antigénios via MHC ....................................................... 82 Apresentação de Lipidos Antigénicos por Moléculas CD1 ................................................................. 84 MHC e Susceptibilidade a Doença ...................................................................................................... 85 Receptores de Antigénios e Moléculas Acessórias nas Células T .................................................... 87 Recepção de Antigénios pelas Células T............................................................................................. 87 TCR αβ para Péptidos Antigénicos Associados a MHC ....................................................................... 88 Papel do TCR αβ no Reconhecimento de Péptidos Antigénicos Associados a MHC ...................... 90 Proteinas CD3 e ξ dos Complexos TCR ............................................................................................... 91 Funções das Proteinas CD3 e ξ ....................................................................................................... 93 Co-receptores e Receptores de Co-estimuladores nas Células T ....................................................... 94 CD4 e CD8: Co-receptores Envolvidos na Activação das Células T Restritas a MHC ...................... 94 Anticorpos e Antigénios ............................................................................................................... 96 Os Anticorpos ..................................................................................................................................... 96 Estrutura Básica dos Anticorpos ......................................................................................................... 97 Estrutura Aprofundada das Imunoglobulinas .................................................................................... 99 Enrolamento Imunoglobulina ...................................................................................................... 100 Dominios da Região Variável e Ligação ao Antigénio ................................................................. 102 Dominios da Região Constante .................................................................................................... 104 Funções Efectoras Mediadas por Anticorpos ................................................................................... 107 Classes e Actividades Biológicas dos Anticorpos .............................................................................. 108 Imunoglobulina G (IgG) ................................................................................................................ 109 Imunoglobulina M (IgM) .............................................................................................................. 109 Imunoglobulina A (IgA) ................................................................................................................ 110 Joana Maria Soares Pereira

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ImunoglobulinaE (IgE) .................................................................................................................. 112 Imunoglobulina D (IgD) ................................................................................................................ 113 Determinantes Antigénicos nas Imunoglobulinas............................................................................ 113 Receptor da Célula B (BCR)............................................................................................................... 114 A Superfamilia Imunoglobulina ........................................................................................................ 115

MATURAÇÃO, ACTIVAÇÃO E REGULAÇÃO DOS LINFÓCITOS ........................ 117 Organização e Expressão de Genes Imunoglobulinas................................................................... 117 Diversidade de Imunoglobulinas ...................................................................................................... 117 Modelo Genético Compativel com a Estrutura das Imunoglobulinas ............................................. 118 Organização dos Genes das Imunoglobulinas .................................................................................. 119 Familia de Multigenes das Cadeias λ ........................................................................................... 119 Familia de Multigenes das Cadeias κ ........................................................................................... 120 Familia de Multigenes das Cadeias Pesadas................................................................................ 120 Rearranjos dos Genes das Regiões Variáveis ................................................................................... 121 Rearranjos V-J das Cadeias Leves ................................................................................................ 121 Rearranjos V-D-J das Cadeias Pesadas ........................................................................................ 122 Mecanismos de Rearranjos de DNA das Regiões Variáveis ............................................................. 123 Junção Flexivel dos Segmentos .................................................................................................... 126 Exclusão Alélica ............................................................................................................................ 127 Produção da Diversidade de Anticorpos .......................................................................................... 128 Segmentos de Multiplos Genes da Linha Germinativa ................................................................ 128 Junção Combinatória V-(D)-J........................................................................................................ 128 Flexibilidade Juncional ................................................................................................................. 129 Adição P ....................................................................................................................................... 130 Adição N ....................................................................................................................................... 130 Hipermutação Somática .............................................................................................................. 130 Associação Combinatória de Cadeias Leves e Pesadas................................................................ 132 Class Switching entre Genes da Região Constante .......................................................................... 132 Expressão de Genes Ig ...................................................................................................................... 133 Expressão de Imunoglobulinas Secretadas e Membranares ....................................................... 134 Expressão Simultânea de IgM e IgG............................................................................................. 135 Organização e Rearranjo dos Genes TCR ......................................................................................... 136 Mecanismo de Rearranjo do DNA do TCR.................................................................................... 138 Exclusão Alélica dos Genes TCR ................................................................................................... 139 Estrutura Geral dos Genes TCR Rearranjados .............................................................................. 139 Diversidade de TCRs ..................................................................................................................... 140 Visão Geral do Desenvolvimento dos Linfócitos .......................................................................... 142 Visão Geral do Desenvolvimento dos Linfócitos .............................................................................. 142 Joana Maria Soares Pereira

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Entrada das Células Progenitoras na Linhagem das Células B e T ................................................... 143 Rearranjo e Expressão de Genes de Receptores de Antigénios ....................................................... 144 Eventos de Selecção ......................................................................................................................... 144 Geração de Subgrupos de Linfócitos ................................................................................................ 146 Maturação, Diferenciação e Activação das Células B ................................................................... 147 Maturação dos Linfócitos B .............................................................................................................. 147 Células Progenitoras na Medula Óssea ....................................................................................... 147 Rearranjo de Genes Ig .................................................................................................................. 148 Receptor da Célula pré-B.............................................................................................................. 149 Factores de Transcrição e Defeitos no Desenvolvimento das Células B ...................................... 150 Marcadores de Superficie ............................................................................................................ 152 Subgrupos de Células B ................................................................................................................ 152 Selecção do Reportório de Células B Maduras............................................................................. 155 Activação e Proliferação das Células B ............................................................................................. 157 Tradução de SInais de Activação.................................................................................................. 158 Complexo Co-receptor da Célula B ............................................................................................... 160 Papel das Células TH ..................................................................................................................... 161 Resposta Humoral ............................................................................................................................ 162 Papel das Células TH na Resposta Humoral a Haptenos .............................................................. 164 Locais in vivo para a Indução da Resposta Humoral ........................................................................ 165 Centros Germinativos e Diferenciação de Células B Induzida por Antigénio .................................. 166 Maturação da Afinidade .............................................................................................................. 167 Células de Memória e Plasmócitos .............................................................................................. 170 Maturação, Diferenciação e Activação das Células T ................................................................... 171 Maturação dos Linfócitos T .............................................................................................................. 171 Papel do Timo na Maturação das Células T ................................................................................. 171 Inicio da Maturação das Células T no Timo ................................................................................. 173 Receptor da Célula pré-T .............................................................................................................. 174 Produção de Timócitos Efectores e Expressão do TCR ................................................................. 175 Marcadores de Superficie ............................................................................................................ 177 Processos de Selecção Durante a Maturação das Célula T αβ ......................................................... 178 Selecção Positiva de Timócitos: Desenvolvimento da Restrição MHC ......................................... 179 Selecção Negativa de Timócitos: Tolerância Central ................................................................... 182 Linfócitos T γδ ................................................................................................................................... 183 Linfócitos T Naturalmente Assassinos (NK-T Cells) .......................................................................... 184 Activação dos Linfócitos T ................................................................................................................ 185 Activação dos Linfócitos T CD4+ ....................................................................................................... 187 Activação dos Linfócitos T CD8+ ....................................................................................................... 188 Papel dos Co-estimuladores na Activação das Células T .................................................................. 190 Joana Maria Soares Pereira

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Imunologia

Tradução do Sinal pelo Complexo TCR ............................................................................................. 193 Formação da Sinapse Imunológica .............................................................................................. 194

MECANISMOS EFECTORES DAS RESPOSTAS IMUNES ................................... 197 As Citocinas ............................................................................................................................... 197 As Citocinas....................................................................................................................................... 197 Propriedades Gerais das Citocinas ................................................................................................... 197 Categorias Funcionais das Citocinas ............................................................................................ 201 Receptores das Citocinas e Sinalização ........................................................................................ 202 Antagonistas de Citocinas ............................................................................................................ 204 Citocinas que Medeiam e Regulam a Imunidade Inata.................................................................... 206 Tumor Necrosis Factor (TNF)........................................................................................................ 207 Interleucina-1 (IL-1) ...................................................................................................................... 212 Quimiocinas ................................................................................................................................. 214 Interleucina-12 (IL-12) .................................................................................................................. 218 Interferões do Tipo I (IFNs) ........................................................................................................... 221 Interleucina-10 (IL-10) .................................................................................................................. 224 Outras Citocinas da Imunidade Inata .......................................................................................... 225 Papeis das Citocinas na Imunidade Inata e na Inflamação ......................................................... 227 Citocinas que Medeiam e Regulam a Imunidade Adaptativa .......................................................... 228 Interleucina-2 (IL-2) ...................................................................................................................... 230 Interleucina-4 (IL-4) ...................................................................................................................... 232 Interleucina-5 (IL-5) ...................................................................................................................... 234 Interleucina-13 (IL-13) .................................................................................................................. 234 Interferão-γ (IFN-γ) ...................................................................................................................... 236 Transforming Growth Factor β (TGF-β) ....................................................................................... 239 Outras Citocinas da Imunidade Adaptativa ................................................................................. 240 Papel das Citocinas nas Respostas Imunes Adaptativas Especializadas...................................... 241 Citocinas que Estimulam a Hematopoiese ....................................................................................... 242 Stem Cell Factor (c-Kit Ligand) ..................................................................................................... 243 Interleucina-7 (IL-7) ...................................................................................................................... 243 Interleucina-3 (IL-3) ...................................................................................................................... 244 Outras Citocinas Hematopoiéticas ............................................................................................... 244 Respostas Efectoras Mediadas por Células.................................................................................. 245 Imunidade Humoral e Mediada por Células..................................................................................... 245 Tipos de Reacções Mediadas por Células ......................................................................................... 246 Células T CD4+ Efectoras ................................................................................................................... 249 Células TH1 e TH2 .......................................................................................................................... 249 Respostas Imunes Mediadas por TH1 ........................................................................................... 254 Joana Maria Soares Pereira

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Imunologia

Respostas Imunes Mediadas por TH2 ........................................................................................... 256 Células TH1 e TH2 na Doença ........................................................................................................ 258 Células TH17 ................................................................................................................................. 259 Respostas Imunes Mediadas por TH17 ......................................................................................... 264 Papel das TH17 na Autoimunidade............................................................................................... 264 Células T Reguladoras ....................................................................................................................... 265 Mecanismos de Acção das Células T Reguladoras ....................................................................... 266 Indução de Células T Reguladoras na Periferia e Manutenção ................................................... 268 Acção das Células T Reguladoras na Diferenciação de Diferentes Subgrupos de Células T CD4 + 268 Células T CD8+ Citotóxicas ................................................................................................................ 269 Activação e Diferenciação em CTLs Efectoras.............................................................................. 270 Fase Efectora da Imunidade Mediada por CTLs ........................................................................... 272 Células Naturalmente Assassinas ..................................................................................................... 276 Desenvolvimento e Caracteristicas das Células Naturalmente Assassinas.................................. 277 Funções Citotóxicas das Células Naturalmente Assassinas ......................................................... 279 Receptores de Activação e de Inibição ......................................................................................... 281 Citotoxicidade Mediada por Células Dependente de Anticorpor .................................................... 282 Células Dendriticas ........................................................................................................................... 283 Origem e Desenvolvimento das Células Dendriticas .................................................................... 285 Células Dendriticas Convecionais ................................................................................................. 287 Células Dendriticas Plasmacitoides .............................................................................................. 289 Outras Populações de Células Dendriticas nos Nódulos Linfáticos .............................................. 291 Superantigénios ................................................................................................................................ 292 Migração Leucocitária e Inflamação............................................................................................ 294 Migração Leucocitária e Inflamação................................................................................................. 294 Recirculação de Linfócitos ................................................................................................................ 294 Moléculas de Adesão Celular ........................................................................................................... 295 Integrinas ..................................................................................................................................... 297 Extravasão de Neutrófilos ................................................................................................................ 298 Extravasão de Linfócitos ................................................................................................................... 299 Vénulas de Endotélio Alto ............................................................................................................ 300 Alojamento de Linfócitos ............................................................................................................. 302 Recirculação de Linfócitos Naive .................................................................................................. 302 Recirculação de Linfócitos Efectores e de Memória .................................................................... 303 Interacções entre Moléculas de Adesão ...................................................................................... 304 O Processo Inflamatório ................................................................................................................... 305 Papel dos Neutrófilos ................................................................................................................... 305 Respostas Inflamatórias Locais e Sistémicas ............................................................................... 306 Sistema do Complemento .......................................................................................................... 309 Joana Maria Soares Pereira

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O Sistema do Complemento............................................................................................................. 309 Funções do Complemento ............................................................................................................... 309 Componentes do Complemento ...................................................................................................... 310 Activação do Complemento ............................................................................................................. 311 Via Clássica................................................................................................................................... 312 Via Alternativa ............................................................................................................................. 314 Via da Lectina ............................................................................................................................... 316 Formação do Complexo de Ataque à Membrana ........................................................................ 317 Regulação do Sistema do Complemento ......................................................................................... 318 Consequências Biológicas da Activação do Complemento .............................................................. 323 Lise Celular ................................................................................................................................... 324 Indução de Respostas Inflamatórias ............................................................................................ 325 Opsonização e Fagocitose ............................................................................................................ 326 Eliminação de Complexos Imunes ................................................................................................ 327 Neutralização da Infectividade Viral ............................................................................................ 328 Activação de Linfócitos B ............................................................................................................. 328

BIBLIOGRAFIA.............................................................................................. 329 ÍNDICE ......................................................................................................... 331

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