Identificacion de Enterobacterias en Comida Rápida de La Ciudad de México

 

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA XOCHIMILCO  División de Ciencias Biológicas y de la Salud Tronco Divisional Procesos Celulares Fundamentales Grupo: BB-51 Investigación modular 

 

Identificación de Enterobacterias en comida rápida de la ciudad de México   Ángel Castillo-Villa1; Iv Iván án L. Ti Tina naje jero ro-L -Lir ira a2; Omar Omar O. Vill Villeg egasas-Vi Vill lleg egas as3; Sarvia B. Cassina-Magallán4  1Estudiantes de las licenciaturas en 1Agronomía, 2, 3 Química Farmacéutica Biológica, Medicina Veterinaria Y Zootecnia de la Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco. 2 3 4

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Resumen Enterobacte Enter obacterias rias son un género de bacilos gramnegati gramnegativos vos no esporulados, esporulados, que tienen como habitad natural el intestino del hombre, así como también en plantas y diversos vegetales, de las cuales cua les las de mayor mayor import importanc ancia ia medica medica son: son: Salm Salmonell onella, a, Shigella, Shigella, Klebsiell Klebsiella, a, Enterobact Enterobacter, er, Serrat Ser ratia, ia, Pr Prote oteus, us, Mor Morgne gnell lla, a, Provid Providenci encia, a, Citob Citobact acter, er, Edward Edwardsi siell ella, a, Cedace Cedacea, a, Kluyve Kluyvera, ra, y  Rahnella. Existe Existen n diversos medios de cultiv cultivo o para enterobacte enterobacterias rias dentro de los cuales los más

destacados son los simples, diferenciadores, selectivos y enriquecidos. Las pruebas bioquímicas más utilizadas para identificar género y especie de enterobacterias son: producción de indol, prueba de rojo de metilo, Voges-Proskauer, utilización de citrato de sodio, producción de acido sulfhídrico, hidrólisis de la urea, producción de enzimas, pruebas de movilidad, hidrólisis de la gelatina, y fermentación de azucares, algunas enterobacterias producen antígenos O, H, K y antíge ant ígenos nos de pilis pilis , sus factores factores de virulen virulencia cia pueden pueden ser las endoto endotoxin xinas, as, las capsula capsulas, s, la variación antigénica, las exotoxinas, exotoxinas, los factores de adherencia, la localización intracelular y las bacteriocinas. El objetivo por el cual se realizo esta investigación, fue para estudiar si realmente la comi comida da qu que e se an anali alizo zo está está cont contam amin inad ada a con con algún algún titipo po de en ente tero robac bacte teri rias as pató patóge genas nas,, evidentemente evidenteme nte se pretendi pretendió ó desde el inicio inicio saber saber qué tipo tipo de enterobact enterobacterias erias son las que que se encuentran en la comida analizada. Se planteo desde el inicio que el segundo puesto de comida de donde se compro compro la muestra numero numero 2 sería sería el más contaminado, contaminado, a diferencia diferencia del primer  pu pues esto to de comi comida da de do dond nde e se obtu obtuvo vo la mues muestr tra a nu nume mero ro 1, ad adem emás ás se plan plante teo o qu que e las las enterobacterias que habitan en los alimentos que se venden en la vía pública de la ciudad de México, son patógenas para el ser humano. Se utilizaron 2 “tortas cubanas” compradas en dos tiendas de comida diferentes como muestra, en total se necesitar necesitaron on 4 días para llevar a cabo esta investigación. En el día uno se realizaron cultivos con las respectivas muestras, en el día d dos os se

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realizaron realiz aron resiembras resiembras de los cultivos cultivos heterogéneos heterogéneos para obtener obtener cultivos puros, en el día tres se llevaron a cabo las siembras de cultivos puros en los juegos de pruebas bioquímicas para enterobacterias, y en el día cuatro se realizo la lectura de las pruebas bioquímicas para identificar  genero y especie de enterobacterias. Mediante la lectura de las pruebas bioquímicas, basándose en algunas reacciones clave, en tablas obtenidas de Koneman y col. 2008, y mediante la metodología utilizada en el laboratorio. Se logro aislar en las muestr muestras as analizadas enterobacterias como: Shig Shigella, ella, providenci providencia, a, y Shigella Shigella sonnei. sonnei. Debido a los resultados y de acuerdo a las hipótesis planteadas, se llego a concluir que efectivamente la muestra numero 2 fue la más contaminada de las dos muestras analizadas. La única diferencia fue que no se logro aislar de las muestras, la cantidad necesaria de bacterias para causar alguna infección sistémica, o de alguna otra clase.

Abstract Enterobacteriaceae are a genus of gram-negative bacilli not sporulated, whose natural habitat, the intestine of man, as well as in plants and various vegetables, of which the most important medicines are: Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteu Pro teus, s, Mor Morgne gnella lla,, Pro Provid videnc ence, e, Cit Citoba obacte cter, r, Edw Edward ardsie siella lla,, Ced Cedace acea, a, Kluyve Kluyvera, ra, and Rahnella. Various culture media for Enterobacteriaceae in which the highlights are the simple, differentiating, selective and enriched. The most commonly used biochemical tests to identify the genus and species of Enterobacteriaceae are: production of indole, methyl red test, Voges-Proskauer, sodium citrate utilization, hydrogen sulphide production, urea hydrolysis, enzyme produc hydrolysis, production, tion, testi testingmob ngmobility ility,, gelat gelatin in hydro hydrolysis lysis,, and fermentati fermentation on of  sugars, some enterobacteria produce antigens O, H, K and pilis antigens, their virulence factors may be the endotoxins, the capsules, antigenic variation, exotoxins, adherence factors, intracellular localization and bacteriocins. The purpose for which was conducted this investigatio investigation n was to study whether the food that was analyzed analyzed is conta contaminat minated ed with some kind of pathogenic enterobacteria, evidently intended from the start what type of  enterobacteria are found in food analysis. It is stated from the outset that the second food Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 3

 

stand where you bought the sample number 2 would be the most polluted, unlike the first food stand where the sample is number 1, also argue that the enterobacteria are living in Food sold on the streets of Mexico City, are pathogenic to humans.We used 2 "Cuban cake" bought in two different grocery stores and shows, in total it took 4 days to carry out this research. On day one were cultured with the respective samples on day two were heterogeneous replanting of crops to obtain pure cultures on day three were performed sowing of pure cultures in the games of biochemical tests for Enterobacteriaceae, and on day four readings were made by biochemical tests to identify genus and species of  Enterobacteriaceae. By reading the biochemical tests, based on some key reactions in tabl tables es obta obtain ined ed fr from om Ko Kone nema man n et al. al. 20 2008 08,, an and d by th the e meth method odol olog ogyy us used ed in th the e laboratory. Was isolated in samples enterobacteria such as Shigella, providence, and Shigella sonnei. Because of the results and according to the hypotheses, it was concluded that indeed the sample number 2 was the most polluted in the two samples. The only difference was that it was isolated from the samples, the amount of bacteria needed to cause systemic infection, or any other class.

Introducción Las Enterobacterias o Enterobacteriaceae son un grupo muy diverso de bacilos o bacterias gramnegativos, que tienen como habitad natural el intestino del hombre y vari varias as especi especies es anima animales les (hosp (hospeder ederos), os), se les ha enc encont ontrado rado en insect insectos os y algunos son patógenos de plantas. Todas estas forman una familia taxonómica que ha sido estudiada y clasificada por Ewing y Edward, ampliada por Brenner y col.,  La fam famili ilia a Enterobacteriaceae est está á fo form rmada ada po porr aprox aproxim imad adam amen ente te 31 géneros y 139 especie especiess y miles de serotipos (Brock 2008). Algunos miemb miembros ros de la familia siempre se asocian a enfermedades cuando se aíslan en el hombre, por  ejemplo: Shigella, Salmonella, Yersinia pestis. Mientras que otros son miembros Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 4

 

de la flor flora a no norm rmal al qu que e prod produc ucen en infe infecc ccio ione ness op opor ortu tuni nist stas as,, po porr ejem ejempl plo: o: Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae, proteus mirrabilis (Romero 2007).

Lass en La ente tero roba bact cter eria iass son son caus causan ante tess de un gr gran an nú núme mero ro de en enfe ferm rmed edad ades es infecciosas en el humano, entre las más comunes se encuentran los síndromes di diar arre reico icoss y di disen senté téri rico coss (M (Murr urray ay 2006), 2006), ca causa usados dos por cep cepas as de E. coli  coli , tifoidea, dea, causada por especi especies es de Salmonella. Se Salmonella Salmon ella y Shigella, la fiebre tifoi tiene casos de neumonía causados por  Klebsiel Klebsiella la pneumoniae pneumoniae, especies del  proteus, E. coli  y varios miembros del grupo Klebsiella enterobacter  se aíslan de heridas traumáticas, contaminadas con tierra o material vegetal o de incisiones abdominales después de una cirugía. El shock endotóxico es una manifestación potencialmente letal de la infección por enterobacterias (Romero 2007, Díaz y col. 2008, Davey 1985). Loss alim Lo alimen ento toss tam también bién se pu pued eden en ve vend nder er en las las ca calllles es,, en fer eria ias, s, o en acontecimientos deportivos o culturales. Los alimentos que se venden en las calles, preparados en pequeña escala, son cosas corrientes en los países no industrializados, especialmente en los centros urbanos. Pueden ser preparados en el punto de venta o bajo techado y ser llevados al punto de venta en carros (Bryan 1993).

Los alimentos contienen microorganismos característicos de los ingredientes de los productos y de los tratamientos a los cuales han sido sometidos (Davey 1985). La micro microflflor ora a exis existe tent nte e en la su super perfifici cie e de lo loss alim alimen ento tos, s, la lass po pobl blaci acion ones es microbianas microb ianas exist existentes entes en los alim alimentos entos rara vez es estática (Mos (Mossel sel y Moreno 2003). ➢

Serratia Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 5

 

Es un género de bacteri bacteria a gramnega gramnegativa tiva,, anaerobio facultativo, basiliforme de la familia Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae.. La especie más común en el género, la Serratia   marcescens, es normalmente el único patógeno y usualmente causa infección infección   nosocomial  (Kagan y col 2002, Weiss 2006). Sin embargo, raramente cepas de Serratia plymuthica plymuthica, Serratia liquefaciens liquefaciens,  Serratia rubidaea, y Serratia odoriferae  odoriferae 

han causado enfermedad por medio de infección. [ Los miembros de este género producen un pigmento rojo característico, la prodigiosina prodigiosina,, y puede ser distinguidas de los otros miembros de la familia Enterobacteriaceae por su única producción de tres enzimas: DNasa, DNasa, lipasa lipasa,, y gelatinasa (Díaz y col. 2008, Turbyfill y Oaks 1990). Las especies de Serratia tienden a colonizar los tractos respiratorios y urinarios, y el tracto gastrointestinal en adultos (Navarro y col. 2010). La infección por Serratia es responsable del 2% de las infecciones nosocomiales del torrente sanguíneo, tracto respiratorio inferior, vías urinarias, heridas quirurgicas, piel y tejidos blancos en pac pacien ientes tes adulto adultos. s. Brot Brotes es de men mening ingiti itiss por  S. marcescens marcescens, infección de heridas, y artritis han sucedido en pabellones de pediatría (Terajima y col. 2003). Toda To dass las las ba bact cter eria iass de dell gé géne nero ro Serratia pre prese sent ntan an res resis iste tenc ncia ia a mu mucho choss antibióticos a causa de la presencia de factores R, los cuales son una tipo de plásmido que codifica enzimas de resistencia a antibióticos. El más importante de estos es el SmaI SmaI.. Por ello, esta bacteria presenta una resistencia primaria a todas las penicilinas, a las cefalosporinas y a la polimixina (Alvarado y col. 2005). El tratamiento para infecciones leves puede realizarse con trimetoprim trimetoprim,, sulfamidas o fluoroquinolona.. Par fluoroquinolona Para a in infe fecc ccion iones es má máss gra grave ves, s, se util utiliz izan an flfluor uoroq oqui uino nolo lona nass (ciprofloxacino ciprofloxacino,,

levofloxacino levofloxacino), ),

carbapenemes

(ertapenem, ertapenem,

imipenem imipenem,,

meropenem), meropenem ), o má máss fr frec ecuen uente teme ment nte e cefalosporinas de te terce rcera ra gener generac ació ión, n,

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generalmente asociado a un aminoglucósido (gentamicina) gentamicina) (Murray 2006, Brock 2008, Romero 2007). ➢

Escherichia coli 

La Escherichia coli  (también conocida por la abreviación de su nombre, E. coli ) es quizás el organismo procariota procariota más estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras (Koneman y col. 2008, Eneca y Bergendal 1955) Fue descrita por primera vez en 1885 por  por Theodore Theodore von Escherich Escherich,, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli . Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli , en honor a su descubridor (Romero 2007). Ésta y otras bacterias

son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, además de producir las vitaminas vitaminas   B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la titinc nció ión n de Gr Gram am (gramnegativo gramnegativo), ), es anaerob anaerobio io facult facultativo ativo,, mó móvi vill po por  r  flagelos  flagelos  peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas esporas,, es capaz de fermentar  la glucosa y la lactosa (Romero 2007, Murray 2006, Brock 2008, Koneman y col. 2008). En su hábitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de los mamíferos mamíferos   sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo digestivo.. En individuos sanos, es decir, si la bacteria no adquiere eleme elementos ntos genéti genéticos cos que codifican factores virulentos, la bacteria actúa como un comensal formando parte de la flora intestinal y ayudando así a la absorción de nutrientes nutrientes.. En humanos, la Escherichia coli  coloniza el tracto gastrointestinal de un neonato adhiriéndose a

las mucosidades del intestino grueso en el plazo de 48 horas después de la prim pr imer era a com comid ida a (Na (Natu ture re 2003) 2003).. Pu Pued ede e cau causa sarr in infe fecc ccio iones nes int intes estitina nale less y extra ext rain inte test stina inales les ge gene nera ralm lment ente e gr grave aves, s, ta tales les como como in infe fecc ccio iones nes de dell aparato aparato   Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 7

 

excretor , cistitis cistitis,, meningitis meningitis,, peritonitis peritonitis,, mastitis mastitis,, septicemia y neumonía (ICMF 2001). Está Es tá di divi vidi dida da po porr sus pro propi pied edad ades es virulentas virulentas,, pu pudi dien endo do caus causar ar diar diarre rea a en humanos y otros animales. Otras cepas causan diarreas hemorrágicas por virtud de su agresividad, patogenicidad y toxicidad. En muchos países ya hubo casos de muerte con esta bacteria. Generalmente les pasa a niños entre 1 año y 8 años, causado generalmente por la contaminación de alimentos, y por la mala cocción de los mismos, es decir, a temperaturas internas y externas menores de 70 °C (Mossel y Moreno 2003, Bryan 1993). ➢

Proteus

género ro de bact bacter eria iass gramnegativas gramnegativas,, que que incl incluy uye e patógenos patógenos   Proteus es un géne responsables de muchas infecciones del tracto urinario. urinario. Las especies de Proteus normalmente no fermentan lactosa por razón de tener una β galactosidasa, pero algunas se han mostrado capaces de hacerlo. Son oxidasa oxidasa-negativas -negativas y ureasa ureasa-positivas. Algunas especies son mótiles. Tienden a ser organismos pleomórficos pleomórficos,, no esporulados ni capsulados y son product productoras oras de fenilalanina desaminasa.  Con la excepción de P. mirabilis, todos los Proteus reaccionan positivos con la prueba prueba   del indol. indol. Es un género de bacterias ubicuas, residentes del tracto intestinal del hombre y algunos animales (Eneca y Bergendal 1955). Crecen en medios corrientes y moderadamente selectivos a temperatura corporal de 37ºC. Crecen formando capas diseminadas por virtud de su gran motilidad. Existen variantes inmóviles que forman colonias lisas. La estructura antigénica está compuesta por  antígeno somático O, flagelar  H y superficial K. El antígeno flagelar H contribuye a la capacidad invasora de las vías urinarias. La variante X del antígeno somático O está presente en algunas cepas de P. mirabilis. Otros grupos antigénicos definidos son el OX2, OX19 y OXK. El grupo OX19 (y a veces Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 8

 

el grupo OX2) da reacciones cruzadas (aglutinación ( aglutinación)) en pacientes con Rickettsia    prowazekii  y ésa es la base de la prueba de Weil Félix (Yvette y col. 2002).

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Salmonella

Este género está formado por un grupo integrado por más de 2 000 serotipos que colonizan el intestino del hombre y de varias especies animales. La especie tipo de infecciones humanas es Salmonella typhi, otras especies Salmonella enteritidis con varios serotipos y Salmonella cholerae-suis (Eneca y Bergendal 1955). Las salmonelosis salmon elosis en el hombre se manifiesta manifiestan n por 3 tipos de cuadros clínicos: fiebre fiebress entéricas (fiebre tifoidea y paratifoidea), enteritis y septicemias (Murray 2006 y Romero 2007). Las enteritis son los cuadros más benignos, se manifiestan por diarrea severa que generalmente se autolimita en menos de una semana. La fiebre tifoidea es un padecimiento que puede manifestarse en forma benigna o en forma grave sobre todo tod o cua cuando ndo se pres present entan an com compli plicac cacione ioness com como o son son:: perf perforac oración ión intest intestina inal,l, hemorragia, colecistitis o abscesos en diferentes órganos. Las paratifoideas son cuadr cu adros os gene general ralme ment nte e ben benig ignos nos y rar rara a vez se mani manififiest estan an com compl plic icaci acion ones es (Martínez y col 2007, Urbanova 1999). La fiebre tifoidea es un padecimiento que se encuentra en todas las latitudes en todos los países del mundo. Es más frecuente en los países en vías de desarrollo, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 9

 

en donde se encuentra en forma endémica con brotes epidémicos. La mayor  incidencia se encuentra en la edad escolar, es poco frecuente antes de los siete años de edad (Turbyfill y Oaks 1990). Los portadores crónicos, sobre todo si manej ma nejan an alim aliment entos, os, son son lo loss res respo ponsa nsabl bles es de la lass ep epid idem emia iass o de lo loss ca casos sos ai aisl slad ados os,, ya qu que e pu pued eden en ex excre creta tarr 1010 po porr gr gram amo o de ma mate teri rias as feca fecale less de salmonellas. Este padecimiento tiene una tendencia estacional, generalmente lo vamos a encontrar con mayor frecuencia frecuencia durante el verano y el otoño ya que son las estaciones más calurosas, y la ingestión de agua contaminada es una de las fuentes de infección (Romero 2007, Koneman y col 2008).

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Shigella

El género Shigella está formado por varias especies de las cuales cuatro se han enco en cont ntra rado do con con ma mayo yorr frec frecue uenc ncia ia en las las infe infecc ccio ione ness hu huma mana nas: s: Shigella Romero 2007, dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei ( Romero Koneman y col 2008, Murray 2006, Nature 2003 ). Al padecimiento, la shigelosis, se le conoce como disentería bacilar, que se manifiesta con fiebre, diarrea primero y después pseudodiarrea con tenesmo rectal. También se observan las formas hiperagudas que son las formas más graves con deshidratación y desequilibrio electrolítico y las formas atenuadas, generalmente muy benignas, autolimitantes, sin complicaciones (Romero 2007). Los bacilos producen pequeños abscesos a nivel de colon y particularmente en el asa asa sigm sigmoi oide dess que que de desp spué uéss ev evol oluc ucio iona nan n a la form formac ació ión n de ulce ulcera ras. s. Es Este te padecimiento se encuentra en todos los países, pero sobre todo en aquellos de Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 10

 

escasos recursos, en donde encontramos la infección en forma endémica. El pico de la prevalencia es la edad escolar, los niños se infectan por agua o alimentos contaminados por portadores que puedan eliminar hasta 108 por g de materias fecales, en nuestro medio la venta de frutas preparadas o aguas frescas en las puertas de las escuelas es una costumbre que favorece mucho estas infecciones, los portadores eliminan el bacilo durante varios meses después del padecimiento o bi bien en las per perso sonas nas in infe fect ctada adass qu que e titien enen en cu cuadr adros os atenu atenuad ados os o in infe fecc ccio ione ne asintomática. El número de casos es muy reducido en los países con sistema eficiente de potabilización del agua para beber y donde sus habitantes observan una higiene aceptable (Koneman y col 2008, Romero 2007). El diagnostico se hace, además de cuadro clínico por la identificación de las espe es peci cies es en el co copr proc ocul ulti tivvo. Deb Debido ido a qu que e ca casi si nu nunc nca a co colo loni niza za teji ejido doss extrai ext rainte ntesti stinal nales, es, sol solo o las mue muestr stras as de materia materiass fec fecales ales son de utilid utilidad. ad. Los factores de patogenicidad son: una endotoxina, la invasividad y una exotoxina (Rivera y col. 2010). ➢

Carac aracte terrís ísti tica cass de las pru prueb ebas as de ide dent ntif ifiicaci cació ón pr pres esun unti tiva va de enterobacterias

En general existen tres tipos de medios para el aislamiento de bacterias: los primer prim eros os per permi mite ten n el creci crecimi mient ento o de cu cual alqu quie ierr micro microorg organ anis ismo mo y se util utiliz izan an generalmente para un aislamiento primario. Los segundos como su nombre lo indica sirven para el crecimiento selectivo de uno o varios tipos de baterías. Los de enriqu enriquecimi ecimiento ento contienen suplement suplementos os que permiten aumentar el número de un tipo de bacteri bacterias as e inhib inhibir ir el crecim crecimiento iento de otras. Para recuperar recuperar las bacterias bacterias de inter nterés és a pa part rtir ir de una mue uest stra ra qu que e pu pued ede e co cont nte ene nerr una una me mezc zclla de microorganismos, deben utilizarse medios de cultivo selectivos. Se debe conocer  la composición composición de cada formula. La concentració concentración n relativa relativa y el propósito de cada Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 11

 

comp compue uest sto o qu que e se incl incluy uye. e. Po Porr ejem ejempl plo, o, el ag agar  ar  Salmonella-Shigella (SS); contiene alrededor de cinco veces la concentración de sales biliares del agar  MacConkey por lo que es más inhibitorio para E. coli  y más selectivo para la recuperación de especies de Salmonella (Rivera y col . 2010). Se dispo ispone ne de tres tres tipos ipos ge gene nerrales ales de me medi dios os para para la re recu cupe pera raci ción ón de enterob ent erobact acteri erias as a par partir tir de mue muestr stras as que pot potenci encialm alment ente e alo alojan jan mez mezcla class de bact ba cter erias ias.. Me Medi dio o no se sele lect ctiv ivo o pa para ra aisl aislam amien iento to pr prim imar ario io (po (porr ejemp ejemplo, lo, ag agar  ar  sangr sa ngre). e). Agar Agar sel selec ectitivo vo y di dife feren renci cial al (p (por or ej ejem empl plo, o, aga agarr MacC MacConk onkey ey y aga agar  r  salmonella-Shigella ). Cal Caldos dos de enri enriquec quecimi imient ento o (po (porr ejempl ejemplo: o: caldo caldo sel selenit enito) o)

(Rivera y col. 2010). ➢

Medios de aislamiento selectivos para enterobacterias

En 1905 1905 MacCon MacConkey key desc descubri ubrió ó por pri primera mera vez un medio medio diferen diferencia ciall sel select ectivo ivo (aga (agarr ro rojo jo ne neut utro ro-s -sal ales es bili biliar ares es)) qu que e util utiliz izo o pa para ra aisl aislar ar ba baci cilo loss en enté téri rico coss gramnegativos de muestras que contenían muestras de especies bacterianas. Inco Incorp rpor oro o lact lactos osa a y el indi indica cado dorr ro rojo jo ne neut utro ro en este este me medi dio o con con el fin fin de propo pr oporc rcio ionar nar el me medi dio o vi visua suall par para a det detec ecta tarr la ut utililiz izaci ación ón de lac lacto tosa sa por el microorganismo de prueba. En ese momento, todos los bacilos gramnegativos no esporulados esporul ados se denomi denominaban naban aun microo microorganism rganismos os entéri entéricos; cos; sin embargo embargo,, los microbiólogoss avían reconocido que algunas microbiólogo algunas especie especiess eran mas patóge patógenas nas para el ser humano que otras. Los patrones de utilización de hidratos de carbono de varias var ias espec especies ies de ba bact cter eria iass ya se con conoc ocía ían n a pr prin inci cipi pios os del si sigl glo o xx y la fe ferm rmen enta tació ción n de la lact ctosa osa,, en pa part rticu icula lar, r, fu fue e rec recon onoc ocid ida a co como mo un ma marca rcador  dor  importante para diferenciar ciertos patógenos entéricos. Holt-Harris y Teague, descubrieron en 1916 un medio con eosina y azul de metileno como indicadores para diferenciar entre colonias fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de lactosa. Se incluyo en el medio sacarosa para detectar a los grupos del grupo Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 12

 

coliforme que fermentan la sacarosa más fácilmente que la lactosa (Romero 2007, Koneman y col 2008). Los agares MacConkey y eosina-azul de metileno, son solo moderadamente inhibidores y están ideados para evitar el crecimiento de las bacter bac terias ias gramposi grampositiv tivas as en los cultiv cultivos os mix mixtos tos.. Se inh inhibe iben n tam tambié bién n muc muchas has especies especi es de microorganism microorganismos os gramneg gramnegativos ativos con requeri requerimient mientos os nutrici nutricionales onales especiales, sin embargo, todas las enterobacterias crecen bien. Hace poco, los inve invest stig igad ador ores es de dell Be Bect cton on-D -Dic icki kins nson on crea crearo ron n un una a nu nuev eva a form formul ula a de agar  agar  MacCon Mac Conkey key,, MacCon MacConkey key 3, para para mej mejorar orar la recu recupera peració ción n de ent entero erobact bacteria eriass sensibles al CO2. En un estudio se demostró que el medio de MacCkonkey 3 proporciona una mejor recuperación y un mayor tamaño de colonias, tanto cuando se incuban con aire como con dióxido de carbono en comparación con el agar  MacConkey; contiene rojo neutro como indicador de potencial de hidrogeno y en consecuencia, las colonias metabolisadoras de lactosa aparecen rosadas por la producción de ácidos mixtos. Las bacterias productoras de ácidos fuertes como E. coli, forman colonias rojo profundo con un precipitado rosado difuso en el agar  que rodea las coloni colonias as cau causado sado por la prec precipi ipitac tación ión de las sales bilia biliares res en el medio que ocurre con un potencial de hidrogeno bajo. Las bacterias que producen ácidos mas débiles forman colonias rosa claro o colonias que son mas claras en la periferia y que tienen centros rosados, y el agar que rodea las colonias se mantiene claro. La aparición del brillo, mantiene brillo, causad causado o por la precipitació precipitación n del colorante en las colonias es muy sugestiva de E. coli, aunque otros productores de ácidos fuertes, fuerte s, como Yersin Yersinia ia entero enterolityc lityca, a, pueden tener un aspect aspecto o simil similar ar (Konem (Koneman an y col 2008). medi dio o dife difere renc ncia iall pa para ra el aisl aislam amie ient nto o y de dete tecc cció ión n de Agar EM Agar EMB: B: Es un me enterobacterias o de bacilos coliformes. Contiene colorantes analíticos (eosina y azul az ul de me mettilen ileno) o),, qu que e inhi inhibe ben n a las las ba bact cter eriias gr gram ampo possitiv itivas as y a las las gram gramne nega gatitiva vass exig exigen ente tes. s. Es Esto toss colo colora rant ntes es se comb combin inan an pa para ra form formar ar un Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 13

 

precipitado a un pH acido y de ese modo sirven además como indicadores de la producción de ácido. El medio puede contener solo lactosa como fuente de carbono y da reacciones más en paralelo al agar MacConkey, pero también puede estar adicionado adicionado con sacarosa y néctar ferment fermentadores adores de sacaros sacarosa. a. Las coloni colonias as de bacterias fuertemente fermentadoras de lactosa como E. coli , se ven de un colo co lorr ne negro gro ve verdo rdoso so o co con n bri brillllo o me metá tálilico. co. La Lass fe ferm rmen enta tado doras ras dé débi bile less com como o Klebsiella, Enterobacter , Serratia y Hafnia. Producen colonias purpura. Las no

fermentadoras que incluyen Proteus, Salmonella y Shigella, producen colonias transparentes (Rivera y col 2010). ➢

Medios de aislamiento altamente selectivos para enterobacterias

Los medios se hacen altamente selectivos al agregar sustancias inhibidoras en concentraciones mas altas que en agar MacConkey o EMB. Estos medios son utilizados primariamente para inhibir el crecimiento de E. coli  y otros coliformes, pero permiten el crecimiento de especies de salm salmonel onella la y Shigell Shigella a. Los mas comúnmente usados son el agar  salmonella-Shigella (SS). El agar xilosa-lisinadesóxicolato desóxic olato (XLD) y el agar Hektoe Hektoen n entérico (HE). La decisión decisión respecto de cual de estos medios utilizar para el aislamiento de patógenos entéricos depende de la pref prefer eren enci cial al pe pers rson onal al y de las las espe especi cies es que que van van a ser ser sele selecc ccio iona nada das. s. A continuación se describen éstos medios (Rivera y col. 2010). Agar SS: Es un medio altamente selectivo formulado para inhibir el crecimiento de la mayoría de las bacterias coliformes y permitir el desarrollo de salmonella y  Shigella. Contiene altas concentraciones de sales biliares y citrato de sodio que

inhiben a todas las bacterias grampositivas y muchas gramnegativas incluyendo las colifo coliformes rmes.. La lact lactosa osa es la única fuen fuente te de carbon carbono o y el rojo neut neutro ro es el indicador para la detección de ácido. Presenta Tiosulfato de sodio como fuente de azufre, cualquier bacteria que produce un H2S se detecta por un precipitado Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 14

 

negro formado con citrato férrico. Las colonias fermentadoras de lactosa aparecen de color rojo, como cepas poco frecuentes de salmonella arizone. Las colonias de salmonella aparecen sin color con centro negro, debido a la producción de H2S.

Las especies de Shigella mue muestr stran an col coloni onias as sin col color or y sin enn ennegre egrecim cimien iento to (Koneman y col. 2008, Rivera y col. 2010).

Agar HE: Incrementa el rendimiento de especies de Salmonella o Shigella a partir  de flora flora norm normal al num numeros erosa, a, cont contien iene e alta alta conc concent entraci ración ón de sales sales biliare biliaress que inhiben el crecimiento de todas las bacterias grampositivas y retarda el de muchas cepas coliformes. Las bacterias producen ácidos a partir de lactosa y sacarosa, y la fucsina ácida al reaccionar con azul de timol, produce un color amarillo a pH bajo. Contiene Contiene Tiosulfat Tiosulfato o de sodio como fuent fuente e de azufre y la producción de H2S se detect detecta a med mediant iante e citrat citrato o fér férrico rico de amo amonio nio.. Las bac bacter terias ias fermen fermentad tadoras oras rapidas de lactosa. Como E. coli, son inhibi inhibidoras doras modera moderadament damente e y producen colonias naranja brillantes a rosado salmón. Las colonias de Salmonella son azulVerdosas con centros de H2S. Shigella parecen más verde que Salmonella y las colonias palidecen hacia la periferia. Las cepas de Proteus son inhibidas en cierta forma y las coloni colonias as que desarrol desarrollan lan son pequeñas y transpar transparentes entes (Rivera y col. 2010).

Agar XLD: Es un medio inhibidor de bacilos coliformes que el agar HE y fue diseñado para detec diseñado detectar  tar  Shigella en heces después del enriquecimiento en caldo para gramneg gramnegativos ativos.. Contie Contiene ne sales biliares en concent concentración ración relativame relativamente nte baja que hace que el medio sea menos selectivo que el SS y que el HE. Contiene tres carbohidratos para la producción de ácidos y el indicador de pH es el rojo fenol. Las bacterias lisina positiva, como especies de S almonella, producen colonias inicialmente amarillas por la utilización de xilosa y colonias rojas retardadas por la descarboxilacion de la lisina. La detección de H2S es similar al del agar HE. E  Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 15

 

Espec pecie iess de Klebsiel produce ucen n col coloni onias as coli. Es Klebsiella la enterobacter  enterobacter  y de proteus prod amarillas. amaril las. La mayorí mayoría a de las especies de s almonella producen colonias colonias rojas con centros negros. Shigella, providencia y muchas especies de proteus no utilizan ningún carbohidrato y producen colonias transparentes. Las colonias de citobacter  son amarillas con centro negro (Rivera y col. 2010). ➢

Medios de enriquecimiento para enterobacterias

Esto Es toss me medi dios os se ut utililiz izan an par para a fa favor vorec ecer er el creci crecimi mient ento o de ci ciert ertas as esp especi ecies es bacterianas al mismo tiempo que inhibe el desarrollo de microorganismos no deseados. Los caldos de enriquecimiento se emplean principalmente para la recuperación de especies de salmonella y Shigella de muestras donde el número de bacteri bacterias as se enc encuent uentran ran en un número número rela relativ tivame amente nte baj bajo. o. Est Estos os med medios ios funcionan bajo el principio de que E. coli y otras bacterias gramnegativas se mant ma ntie iene nen n en un una a fa fase se de re reta tardo rdo prol prolon ongad gado o po porr lo loss in inhi hibi bido dores res quí quími mico coss presentes en el caldo. Las especies salmonella y Shigella se inhiben mucho menos, Entran en una fase exponencial de crecimiento y son recuperadas mucho más rápido de las muestras. Sin embargo, después de varias horas, el medio de enriquec eciimiento

dej eja a de supr supriimir el cre reccimiento de E. col coli y otro ross

microor mic roorgan ganism ismos os entéri entéricos cos,, los cuale cualess en ultima ultima inst instanci ancia a sobr sobrecr ecrecen ecen en el cultivo por lo tanto, para la recuperación de especies de salmonella y Shigella, se recomienda recomi enda que el caldo de enri enriquecim quecimiento iento se subcult subcultive ive antes de las 8 horas. Los dos medios de enriquecimiento más comunes son el caldo selenito y el caldo gramnegativo (GN) (Rivera y col. 2010, Koneman y col. 2008).

Caldo selenito: Se recomienda recomienda para el aisla aislamient miento o de salmon salmonellas ellas de mues muestras tras que tienen altas concentraciones de bacterias mixtas como heces, orina o aguas cloacales, que tienen altas concentraciones de bacterias mixtas. El selenito de sodio inhibe E. coli y otros bacilos coliformes, incluyendo muchas cepas de Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 16

 

Shigella. El medio funciona mejor en condiciones anaerobias. Se recomienda el subcultivo dentro de las 8-12 horas en agar SS (Rivera y col. 2010).

Caldo GN: Sirve para la recuperación de especies de salmonella y Shigella cuan cuando do está están n en ba bajo jo nume numero ro en las las mu mues estr tras as feca fecale les. s. Co Cont ntie iene nen n baja baja concentración de desoxicolato por lo que es menos inhibidor para e coli y otros coliformes. colif ormes. La mayoría de las cepas de Shigel Shigella la crecen bien. El desoxic desoxicolato olato y el citrato que contiene el caldo, son inhibidores de bacterias grampositivas. Contiene una concentración elevada de manitol. Por lo que inhibe el crecimiento de proteus y a su vez apoya el crecimiento de salmonella y Shigella, ya que ambas son capaces de fermentar manitol. El caldo puede volverse turbio dentro de las 4-6 horas después de la inoculación. Se recomienda el subcultivo en agar HE o XLD dentro de este lapso (Koneman y col 2008, Rivera y col. 2010). ➢

Pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias

A pesar de que los medios de aislamiento primarios se basan en reacciones bioquímicas bioquí micas que realizan las bacterias bacterias en el medio, se requier requiere e de otros métodos para la identificación de la especie. Estos métodos son las pruebas bioquímicas, que se basa en la determinación de las características fenotípicas adicionales que reflejan el genotipo y por lo tanto, la identidad única de los microorganismos que se analizan. Existen una gran cantidad de pruebas y numerosos esquemas disponibles para la identificación final de especies de enterobacterias (Martínez y col. 2007, Rivera y col. 2010, Koneman y col. 2008). Las pruebas pruebas que gen genera eralme lmente nte se utiliz utilizan an para ide identi ntific ficar ar las cara caracte cterís rístic ticas as meta me taból bólic icas as de la lass en ente tero roba bact cteri erias as so son: n: Uti Utili lizaci zación ón de carboh carbohidr idratos atos: se determina el tipo de azucares que pueden fermentar las bacterias, normalmente se util utiliz iza a el ag agar ar hi hierr erro o tr trip iple le azúc azúcar ar (T (TSI SI)) o me medi dio o Kl Klig iger. er. Produ Producción cción de Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 17

 

catalasa: se detecta si la bacteria presenta la enzima catalasa, se requiere de peróxido peróxi do de hidrogeno hidrogeno Producción indol: sirve para comprobar la presencia de la enzima triptofanasa, se utiliza el reactivo de kovac o el de Ehrlich. Rojo de metilo: identifica las especies de bacterias que producen ácidos fuertes a partir  de glu glucosa cosa,, se requie requiere re del medio medio Vog Voges-P es-Prosk roskauer auer/roj /rojo o de met metilo ilo (VP (VP-RM -RM))

Prueba de Vog Prueba Voges-P es-Pros roskau kauer  er : mide mide la co conve nversi rsión ón de ace acetitil-m l-met etilil-c -carb arboni onill o acetoina en diacetilo, se necesita el medio VP. Utilización de citrato: detecta la capacidad de un microorganismo para utilizar citrato de sodio como única fuente de carbono, se requiere el medio citrato de Simmons Producción de ureasa: determina si la bacteria produce la enzima ureasa. Se utiliza caldo de urea. Producción Prod ucción de acido sulfu sulfurhídr rhídrico: ico: se identifica si la bacteria es capaz de liliber berar ar az azuf ufre re en fo form rma a de acid acido o su sulflfur urhí hídri drico co a pa part rtir ir de am amin inoá oáci cido doss qu que e contienen azufre u otro compuesto que contenga azufre, esto se puede observar  en el medio SIM o TSI. Movilidad: se determina si la bacteria presenta flagelos, se puede utilizar el medio SIM o MIO Act Activi ividad dad de o-nitr o-nitrofe ofenil nil-β-D -β-D-galactopiranosido: con esta prueba se detecta la presencia de la enzima- βgalactosidasa, se conoce como prueba de ONPG. Descarboxilacion de lisina, ornitina y arginina: se utiliza para determinar si las bacterias contienen enzimas para pa ra de desc scarb arbox oxililar ar am amin inoác oácid idos os espe especí cífificos cos,, es esto to se ob obser serva va con con el cal caldo do descarboxilar de Moeller. Producción de fenilalanina desaminasa: se detecta la pres presen enci cia a de la enzi enzima ma resp respon onsa sabl ble e de la desa desami mina naci cion on oxid oxidat ativ iva a de la fenilalanina, se utiliza el agar urea de Chistensen. Reducción de nitratos: se comprueba si la bacteria puede reducir los nitratos en nitritos, se requiere el caldo nitrato o agar de nitrato (Rivera y col 2010, Koneman y Col. 2008). ➢

Prueba del rojo de metilo

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Las bacterias que siguen fundamen fundamentalme talmente nte la vía de fermen fermentación tación acida mixta producen a menudo el acido suficiente como para mantener el pH por debajo de 4.4 (el valor critico de color de acido del indicador de rojo de metilo). La prueba del ro rojo jo de me metitilo lo pro propo porci rcion ona a una car caract acterí eríst stic ica a útil útil pa para ra id ident entifific icar ar esp especi ecias as bacterianas bacter ianas que producen ácidos fuertes a partir de glucosa. La prueba según su descripción original, requiere 48 a 72 hrs de incubación antes de obtener un result res ultado ado va valilido do,, titiem empo po in inac acept eptab able le pa para ra la ma mayor yoría ía de lo loss la labor borat atori orios os de microbiología. Se utiliza una muestra alícuota de 0.5ml de caldo con un inoculo relativamente importante del microorganismo de prueba. Se agregan 1 a 2 gotas de reactivo de rojo de metilo después de 18-24 horas de incubación a 35°C y la aparición del color rojo indica prueba positiva (Koneman y col. 2008).

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Prueba de Voges-Proskauer 

Los detalles de la prueba se basan en la conversión del acetil metilcarbinol (acetoina) en diacetilo atraves de la acción de hidróxido de sodio y oxigeno diatomico. El diacetilo se convierte en un complejo rojo bajo la acción catalítica de α-naftol y creatina. Obsérvese que la formación de acetoina y butilenglicol es una vía alternativa para el metabolismo del acido pirúvico. Las bacterias que utilizan esta vía como ciertas cepas dentro del grupo Klebsiell Klebsiella a enterobacter, enterobacter, Serratia Serratia-Hafnia, Haf nia, produc producen en sol solo o pequ pequeñas eñas cantidades cantidades de áci ácidos dos mix mixtos tos que pue pueden den ser  insuficientes para descender el pH del medio de rojo de metilo lo suficiente como para producir un cambio de color. En consecuencia, la mayoría de las especies de enterobacterias Voges-Proskauer positivas, con raras excepciones, son rojo de metilo negativas y viceversa (Koneman y col. 2008). Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 19

 

➢

Producción de indol

El indol es uno de los productos de degrada degradación ción del metab metabolism olismo o del aminoácid aminoácido o triptófano. Las bacterias que tiene la enzima triptofanasa pueden catalizar el trip triptó tófa fano no y prod produc ucir ir así así indo indol,l, acid acido o pirú pirúvi vico co y am amon onia iaco co.. El indo indoll pu pued ede e detectarse en el medio de prueba del triptófano observado el desarrollo de un color

rojo

después

de

agregar

una

solución

que

contiene

p-

dimetilaminobenzaleido (reactivo de Herlich o de kovac) (Koneman y col. 2008). La elección entre los reactivos de Herlich y de Kovac depende de la preferencia persona per sonal.l. El rea reacti ctivo vo de Herlic Herlich h es más sensible sensible y es el pref preferi erido do cua cuando ndo se devalúan bacilos no fermentadores y anaerobios en los cuales la producción de indol ind ol es mín mínim ima. a. Com Como o el ind indol ol es soluble soluble en com compues puestos tos orgáni orgánicos cos se debe agregar xileno o cloroformo al medio de prueba antes de agregar el reactivo de Herlic Her lich, h, est este e pas paso o de ext extracc racción ión es men menos os crí crític tico o para el reacti reactivo vo de Kovac porque se utiliza alcohol amílico como diluyente (Koneman y col. 2008, Calzadilla 2003).

➢

Utilización del citrato

El principio de la prueba de utilización del citrato, es determinar la capacidad de un organismo para utilizar utilizar citrato de sodio como única fuent fuente e de carbono para metabolismo y crecimiento. La formula original, descrita por koser en 1923, era un medio med io de cal caldo do que conten contenía ía fos fosfat fato o amónico amónico sódi sódico, co, fos fosfat fato o mono mono pot potási ásico, co, sulfuro sulfu ro de magnesio y citrato de sodio. Se omi omitieron tieron las proteínas proteínas y los hidrato hidratoss de carbono como fuentes de carbono y nitrógeno. El parámetro parámetro de evaluación evaluación de Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 20

 

la prueba de joser era la presencia o ausencia de turbidez visible después de la incubación incuba ción del microor microorganism ganismo o de prueba: este parámetro en realid realidad ad era una medida de la capacidad del microorganismo para utilizar carbono a partir del citrato de sodio para producir el crecimiento suficiente como para volverse visible. Sin embargo, pronto se reconoció que podría ocurrir una turbidez inespecífica inespecífica en el medio de koser Simmons resolvió este problema agregando agar y azul de bromotimol a la formula de koser, lo que proporciono un parámetro de color mas sensib sen sible. le. Se vie vierte rte en un tubo de ensa ensayo yo e inc inclin lina a el medio de aga agarr citrat citrato o de Simmons. Se siembra en estría un pequeño inoculo de una colonia de crecimiento del microorganismo microorganismo de prueba en la superfici superficie e de la porción inclinad inclinada a de agar. Cuando el inoculo es demasiado grande., los compuestos orgánicos preformados dent de ntro ro de las par pared edes es ce celu lula lares res de la lass ba bact cteri erias as mo mori ribun bunda dass pued pueden en lilibe berar  rar  suficiente carbono y nitrógeno como para producir un resultado falso positivo en la prueba. Cuando se ino inocula cula una seri serie e de tubos de medio medioss de cultivo dife diferencial rencial con un microor microorganismo ganismo desconoc desconocido, ido, es import importante ante sembrar en estría primero el medio de citrato para evitar el traspaso de proteínas o hidratos de carbono desde los otros medios. La producción producción de un color azul en el medio de prueba después de 24 horas de incubación a 35 grados indica la presencia de productos alcalinos y un result resultado ado positivo en la prueba de utili u tilización zación de citrato. Si se utili utiliza za carbono del citrato de sodio, también se extrae hidrogeno del fosfato de amonio contenido en el medio y se libera amoniaco. En ocasiones, se detecta un crecimiento crecimiento visible a lo largo de la línea de siembra en estría antes de la conversión del medio a un color col or azu azul.l. Est Este e crec crecimi imient ento o visibl visible e tam tambié bién n ind indica ica un resu resulta ltado do posi positiv tivo o de la prueba (Koneman y col. 2008). ➢

Producción de ureasa

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Los microorganismos que tienen la enzima ureasa hidrolizan la urea, liberan amoniaco y producen un cambio de color rojo rosado en el medio (Calzadilla 2003). Se deb deben en señalar señalar impo importa rtante ntess diferen diferencia ciass entre entre el cal caldo do de urea de Stuart Stuart y el agar, aga r, ure urea a de chí chíste stense nse.. El caldo de Stu Stuart art tiene mucho muchoss buf buffer ferss de sales de fosf fosfat ato o y tien tienen en un pH de 6,8. 6,8. El micr microo oorg rgan anis ismo mo de pr prue ueba ba de debe be form formar  ar  cantidades bastante grandes de amoniaco antes de que el sistema buffer se vea superado y el pH del medio se eleve por encima de 8.08 para producir un cambio de color en el indicador. Por lo tanto es un caldo casi selectivo para especies de Proteus Prot eus.. El agar urea de Chi Chiste stense nsen n tie tiene ne men menos os buf buffer ferss que el cal caldo do urea urea de Stuart y cont Stuart contien iene e pep pepton tonas as y glu glucos cosa a (Mu (Murci rcia a 2004). 2004). Est Este e medio medio enr enrique iquecid cido o fa favo vore rece ce el cr creci ecimi mien ento to de muc mucha hass espe especi cies es de bact bacter erias ias qu que e no pu pueden eden desarrollarse en el caldo de Stuart y la menor capacidad de amortiguación permite la det detecc ección ión de cant cantida idades des meno menores res de amon amoniaco iaco.. Los mic microor roorgani ganismo smoss que producen menos urea como ciertas especies de Klebsiella, brucella y bordetella, puede pu eden n se serr ev eval alua uado doss co con n ag agar ar ure urea a de Chis Chiste tens nsen en par para a much muchas as de esta estass especies, una reacción de urea positiva se detecta primero como un cambio de color rosa o rojo en la Proción inclinada del agar. El pico de flauta vira al principio al rojo por que la reacción alcalina que resulta del desdoblamiento de pequeñas cantidade cantid adess de urea urea,, aument aumenta a por las ami aminas nas formadas formadas por la des descarb carboxil oxilaci acion on oxidativa de los aminoácidos en la porción expuesta al aire del medio (Koneman y col. 2008).

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Producción de sulfuro de hidrogeno

La ca capac pacid idad ad de ci cier erta tass es espec pecie iess ba bact cteri erian anas as pa para ra liliber berar ar azufr azufre e de lo loss aminoácidos que contienen azufre u otros compuestos en forma de H2S es una característica importante para su identificación. Los medios mas utilizados para la detección de H2S y las fuentes de azufr azufre e y los indicad indicadores ores de sulfur sulfuro o y detec detección ción de H2S. Las diferenc diferencias ias para d detecta etectarr la produc producción ción de H2S en los diferentes medios son el resultado de una alteración en una mas de estas condiciones. El H2S detectado en un medio puede no ser detectado en otro, y es necesario

conocer con ocer el sist sistema ema de prue prueba ba utiliz utilizado ado cuan cuando do se interpr interpreta etan n prot protocol ocolos os de identificación. El medio SIM es mas sensible que el KIA para la detección de H2S, debido talvez a la consistencia semisólida de KIA, la ausencia de hidratos de carbono para suprimir la formación de H2S y el uso de hierro peptonizado como indicador. Por otro lado, el KIA es más sensible que el agar hierro triple azúcar  porq po rque ue se cre cree qu que e la sacar acaros osa a su supr prim ime e los los me meca can nism ismos enz nzim imát átic icos os responsables de la producción de H2S. El acetato de plomo es el indicador mas sensible y debe emplearse siempre que se evalúen bacterias que producen solo pequeñas cantidades de H2S. Lamentablemente, cuando se incorpora acetarto de plomo en medios de cultivo también inhiben el crecimiento de muchas bacterias con requerimientos nutricionales especiales, sobre todo las que pueden requerir  un sistema de detección sensible. Estos microorganismos pueden se evaluados para la producción de H2S colocando una tira de papel filtro impregnada en acetato de plomo debajo de la tapa de un tubo de cultivo con medio KIA. Así, es posible utilizar la extrema sensibilidad del indicador de acetato de plomo sin incorporarlo en forma directa en el medio. Con todos los sistemas de detección de H2S, el parámetro es un sulfuro insoluble de un metal pesado, que produce un

precipitado negro en el medio o en la tira de papel de filtro. Como debe haber  iones hidrogeno disponibles para la formación de H2S el emblanquecim emblanquecimiento iento se Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 23

 

observa primero primero en los medios de prueba en los cuales la formación de acido es máxi má xima ma,, es de deci cir, r, a lo larg largo o de la lí líne nea a de inoc inocul ulac aciión ón,, dent dentro ro de las profundidades de los medios de agar inclinado o en los centros de las colonias que crecen sobre las superficies de agar (Koneman y col. 2008). ➢

Motilidad

La motilidad bacteriana es otro determinante im importante portante para la identificación final de una especie. Las bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo número y locali loc alizaci zación ón varí varían an ent entre re las espe especie cies. s. Exi Existe sten n tin tincio ciones nes flagel flagelares ares par para a esta esta determinación (Koneman y col. 2008). La motilidad bacteriana se puede observar colocando una gota de medio de caldo de cultivo cultivo en un portao portaobjetos bjetos micros microscópico cópico y observánd observándola ola directamente directamente con un microsc mic roscopi opio, o, existen existen cám cámaras aras col colgan gantes tes para got gotas as dond donde e es posi posible ble ver el preparado con mayor aumento sin el peligro de descender los ovejitos sobre la gota contaminada. Esta técnica se utiliza sobre toso para detectar la motilidad de las especies de bacterias que no crecen bien en medios de agar semisólido, sin embargo,, las enterob embargo enterobacteria acteriass crecen bien y se util utilizan izan mas comúnm comúnmente ente tubos que contienen agar semisólido (Koneman y col. 2008, Rivera 2010). Los medios para motilidad tienen concentraciones de agar de 0.4% o menores. Con concentraciones mayores, el gel es demasiado firme como para permitir que los microorganismos microorganismos se dispers dispersen en con libertad. Los medio medioss combi combinados, nados, como el SIM o el agar MIO MIO,, tiene tienen n un uso ampli amplio o en los lab laborat oratorio orioss de micro microbio biologí logía a clínica por que se tiende a medir más de una característica en el mismo tubo. S Se e debe interpretar primero la prueba de motilidad por que el agregado de un reactivo de indol puede oscurecer los resultados. Como el medio SIM y el agar MIO tienen un fondo ligeramente turbio, las interpretaciones pueden ser difíciles con especies Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 24

 

bact ba cter eria iana nass qu que e crec crecen en lent lentam amen ente te en esto estoss me medi dios os.. En esto estoss caso casoss se recomienda un medio para prueba de motilidad, por que sostiene el crecimiento de la mayoría de las bacterias con requerimientos nutricionales especiales y tiene un aspecto claro como el cristal cristal la prueba de motilidad se interpreta interpreta hacie haciendo ndo un examen macroscópico del medio para una zona difusa de crecimiento que se propa pr opaga ga de desde sde la lílínea nea de in inoc ocul ulac ació ión. n. Se han rec recom omend endad ado o la lass sa sale less de tetrazolio en un medio para motilidad como auxiliar para la detención visual del creci cre cimi mien ento to ba bact cteri erian ano. o. Es Esta tass sa sales les so son n in incol colora orass per pero o son son co conve nvert rtid idas as en comple com plejos jos de for formaz mazan an roj rojo o ins insolu oluble bless por las prop propied iedade adess redu reducto ctoras ras de las bacter bac terias ias en crec crecimi imient ento. o. En un med medio io de prue prueba ba para motilida motilidad d que con contie tiene ne tetrazolio, tetraz olio, la aparición del color rojo ayuda a rastrea rastrearr la propagación propagación de bacteri bacterias as desde la línea de inoculación. Sin embargo, estas sales pueden inhibir ciertas bacterias con requerimientos nutricionales especiales y no se pueden utilizar en todos tod os los cazo cazos. s. Ent Entre re las ent entero erobact bacteri erias, as, alg algunas unas esp especi ecies es de Shi Shigell gella a y  Klebsiella son uniformemente inmóviles. La mayoría de las especies móviles de

ente en tero robac bacte teri rias as pu pued eden en det detect ectars arse e a 35 gra grados dos ce cent ntíg ígra rados dos;; sin sin em embar bargo, go, Yersinia, en el cual las proteínas flagelares se desarrollan más rápidamente a

temperaturas inferiores, es móvil a 22 grados centígrados (temperatura ambiente) pero no a 35 grados centígrados. Listeria es otra especie bacteriana que requiere in incu cuba baci ción ón a te temp mper erat atura ura am ambi bient ente e an ante tess de que de desar sarrol rolla la mo motitililidad dad,, la lass pseudomonas, un microorganismo que solo crece bien en presencia de oxigeno, produce una película de propagación sobre la superficie de agar para motilid motilidad ad y no muestra la extensión en abanico característica desde la línea de inoculación por que no crece en las porciones más profundas deficientes de oxigeno del tubo (Koneman y col 2008, Rivera 2010). ➢

Uso del agar hierro triple azúcar  Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 25

 

En la práctica, los microorganismos capaces de fermentare la glucosa se detectan observando las reacciones que producen cuando crecen en agar hierro triple azúcar (TSI azúcar (TSI). ). Cuan Cuando do un microo microorgan rganism ismo o no puede puede fer fermen mentar tar la lac lactos tosa, a, se observa obs erva una reac reacció ción n alcali alcalina-i na-incl nclina inado-a do-alca lcalin lina-i a-infe nferior rior (si (sin n cambio cambios), s), lo que indica la ausencia de producción de ácido y la incapacidad del microorganismo de prueba para fermentar cualquier azúcar presente. Esta sola razón es suficiente para excluir a un microorganismo de las enterobacterias. La formula del agar  hierro triple azúcar se muestra en la siguiente tabla (Tabla 1).

Tabla 1. Tabla de los reactivos químicos de los que se compone el agar hierro triple azúcar (TSI). Formula del agar hierro triple azúcar  Extracto de vacuno, 3g

Cloruro de sodio, 5g

Extracto de levadura, 3g

Tiosulfato de sodio, 0.3g

Peptona, 15g

Agar, 12g

Peptona de proteosa, 5g Lactosa, 10g

Rojo fenol, 0.024g Agua destilada hasta

igualar 1L glucosa, 1g

pH final, 7.4

Sulfato ferroso, 0.2g Sacarosa, 10g

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En esta tabla se puede observar cualitativa y cuantitativamente que tipos de re react activ ivos os qu quím ímic icos os so son n con lo loss qu que e se pr prepa epara ra el aga agarr hierr hierro o tr tripl iple e azú azúca car  r  (Koneman y col. 2008).

Son importantes varias observaciones cuando se estudian las formulas del agar  hierro triple azúcar. La incorporación de cuatro derivados proteicos: extracto de carne car ne de vaca, vaca, extract extracto o de levadur levadura, a, pep pepton tona a y pep pepton tona a prot proteos eosa a enr enriqu iquece ece mucho desde el punto de vista nutricional al agar hierro triple azúcar. La ausencia de inh inhibi ibidor dores es per permit mite e el crec crecimi imient ento o de todas todas las esp especi ecies es de bacteri bacterias as rara rarass excepto aquellas con requerimientos nutricionales muy especiales (excluidas las anaerob ana erobias ias estrict estrictas). as). Por lo tan tanto, to, sol solo o pue pueden den utiliz utilizarse arse cua cuando ndo se eva evalúa lúan n especies bacterianas seleccionadas a partir de una colonia única recuperada en placas de agar primarias o selectivas. La glucosa, la lactosa y la sacarosa están distribuidas distri buidas de manera uniform uniforme e tanto en la porción inclinada como en la porción in infe ferio riorr (p (pro rofu fund nda) a) de dell tu tubo. bo. Sin Sin em emba bargo rgo,, la la lact ctosa osa es está tá pre prese sent nte e en una concentración diez veces la de la glucosa, asimismo la relación de la sacarosa con la glucosa es de 10:1. Esta relación 10:1 es importante para comprender los principios princi pios bioqu bioquímicos ímicos qu que e se explican mas adel adelante. ante. El sulf sulfato ato ferros ferroso o como detector de sulfuro de hidrogeno es algo menos sensible que otras sales férricas o ferrosas; ferros as; por consig consiguiente uiente debe haber discrepancias en las lectur lecturas as de sulfur sulfuro o de hidrogeno entre el agar hierro triple azúcar y otros medios de prueba. El indicador  rojo fenol es amarillo por debajo de un pH de 6.8. Como el pH del medio uninoc uni nocula ulado do está está amo amorti rtiguad guado o a un pH de 7,4, 7,4, las cant cantida idades des relati relativam vament ente e peque pe queñas ñas de pro produ ducci cción ón de ac acid ido o co condu nduce cen n a un ca camb mbio io visi visibl ble e de co color  lor  (Koneman y col. 2008). ➢

Juegos de pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 27

 

Un juego de bioquímicas consiste en: un tubo con medios semisólidos de SIM de color ámbar, dos tubos con caldo VP-RM de color ámbar, un tubo con medio inclinado de citrato de Simmons de color verde, un tubo con medio inclinado de agar hierro triple azúcar de color naranja y un tubo con caldo urea de color rosa pálido. Uno de los juegos de bioquímicas corresponde a los controles negativos o te test stig igos os de la lass pr prueb uebas. as. Est Estos os co cont ntrol roles es se pr prep epara aran n introd introduci ucien endo do el asa bacteriológica estéril y fría, sin una muestra. Incuba estos tubos sin sembrar junto con los tubos inoculados a 37 grados centígrados durante 24 horas (Rivera 2010). ➢

Como hacer las siembras en los juegos de bioquímicas

Evidentemente para llevar acabo esta investigación, se tuvo que conocer una metodología para hacer los inóculos correctamente en los juegos de pruebas bioquímicas, ya que de no hacerlos correctamente como se indican, se pudo haber conducido a esta investigación a unos resultados no deseados (Rivera 2010, Koneman y col. 2008). ➢

Prueba Voges-Proskauer y Rojo de metilo

Con el asa bacteriológica se debe tomar un inoculo denso de un cultivo puro y resuspenderlo en ambos tubos (un inoculo por tubo a la vez), posteriormente dejar  incubar los tubos a 36 grados centígrados por 24 horas (Koneman y col. 2008).

➢

Citrato de Simmons

Con el asa bacteriológica se debe tomar un inoculo ligero del cultivo puro y sembrarlo en forma de una estría abierta sobre el área inclinada del medio Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 28

 

inclinado de citrato de Simmons. Es importante que no se puncione la capa profunda del medio puesto que sirve de control de color, posteriormente dejar  incubar el tubo a 37 grados centígrados por 24 horas (Koneman y col. 2008). ➢

Indol

Con el asa bacteriológica recta, se debe colectar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y se debe sembrar por picadura en el medio SIM introdu introduciendo ciendo dicho inoculo por el centro y a 3mm del fondo del tubo y extrae el asa siguiendo la estría formada al picar el medio. Posteriormente se debe incubar el tubo a 37 grados centígrados por 24 horas (Koneman y col. 2008). ➢

Caldo urea

Con el asa bacteriológica se debe colectar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y se debe sembrar en el caldo urea, posteriormente se debe dejar  incubar el tubo a 37 grados centígrados (Koneman y col. 2008). ➢

Agar hierro triple azúcar (TSI)

Con el asa bacteriológica recta, colecta un inoculo poco denso del cultivo de bacterias y se debe sembrar por picadura en el fondo y en forma de estría en la superf sup erfici icie. e. Poster Posterior iormen mente te se deb debe e inc incubar ubar el tub tubo o a 37 grad grados os cen centí tígrad grados os durante 24 horas (Koneman y col. 2008).

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➢

Planteamiento del Problema

En los disti distintos ntos aliment alimentos os que consum consume e el hombre diaria diariamente mente existen grandes cant ca ntid idad ades es de en ente terob robact acteri erias as,, de desd sde e

lu lueg ego o est esto o dep depen ende de de qu que e titipo po de

alimento alime nto estemo estemoss tratando, éstas puede pueden n ser patógenas, se sabe que todos los alimentos contienen una microflora normal en sus superficies y que los mismos pueden ser un foco de diversos microorganismos en el caso que los alimentos no estén est én sie siendo ndo elabor elaborados ados con altas altas medidas medidas de hig higien iene, e, por ende al no ten tener  er  diversass medidas de higiene en los alime diversa alimentos ntos que se venden en la vía publica de la ciud ciudad ad de Méx Méxic ico, o, est esto o sobr sobre e todo todo

al mom momen ento to de su pr prep epar arac ació ión, n, la

concentración de enterobacterias y microorganismos diversos, aumenta en su concentración, produciendo así graves daños en la salud. ➢

Objetivos

El obj objeti etivo vo gen general eral de esta esta inv invest estiga igació ción n es Comprob Comprobar, ar, que efe efecti ctivam vament ente e se pued pu edan an aisl aislar ar en ente tero roba bact cter eria iass pres presen ente tess en los los alim alimen ento toss ad adqu quir irid idos os en estab est able leci cimi mient entos os de ven venta ta de com comid ida a ráp rápida ida en ví vía a pú públi blica ca de la Ciuda Ciudad d de México. Para ello se tendrá que:  Realizar diferentes muestreos de alimentos de establecimi establ ecimientos entos d de e vent venta a de comi comida da rápi rápida da en la vía pú pública blica d de e la ci ciudad udad de México, co, realizar cu culltivos de las muestras ras en medios es esp pec ecííficos cos para enterobact enterob acteri erias as y así medi mediant ante e la aplic aplicaci ación ón de prue pruebas bas bioq bioquím uímica icass pod poder  er  identificar identi ficar el género y especie de las enterob enterobacteria acteriass que estarán presentes en estos est os alimen alimentos tos.. Y por ultimo ultimo,, Com Comprob probar ar la exis existen tencia cia de enterob enterobact acteri erias as patógenas en los alimentos adquiridos en establecimientos de venta de comida rápida en vía pública de dos establecimientos diferentes específicos.

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➢

Hipótesis

Evident Evi denteme emente nte se cre cree e que Los alimen alimentos tos adqu adquirid iridos os en est establ ableci ecimie miento ntoss de venta de este tipo de comida rápida en la vía pública, causa un gran daño por la presenc pre sencia ia de ent enterob erobact acteria eriass u otr otro o tipo tipo de mic microor roorgan ganism ismos os difere diferente ntess que evidentemente son patógenos para la salud, esto depende desde luego a que tipo de alim aliment ento o no noss estem estemos os re refifiri rien endo do (A (ANI NITO TOX X 20 2009) 09),, se sa sabe be qu que e to todo doss los alimen alimentos tos con contie tienen nen una cie cierta rta cant cantida idad d de microor microorgani ganismo smoss esp especí ecífic ficos os que habitan habita n dentro de la flora aliment alimentaria aria normal (ICM (ICMF F 2001), desde luego, exist existen en diversas variables que provocan que este tipo de alimentos que se venden diariamente en la ciudad de México, en la vía publica. Sean los causantes de diversas infecciones sistémicas o de otro tipo, esto desde luego al alterar la concentración superficial de los microorganismos diversos que habitan en los alimen alimentos tos,, dentro dentro de los cual cuales es existe existen n las enter enterobac obacter terias ias que habit habitan an en la microflora microf lora normal alimenta alimentaria. ria. Se cree que los lugares donde se venden este tipo de alimentos, que ciertamente son establecimientos de la vía publica, son los que están más contaminados a diferencia diferencia de la comida que consumi consumimos mos diariament diariamente e en nuestras casas, y esto se atribuye a que no se toman las medidas higiénicas adecuadas al momento de su elaboración. En la presente investigación se le esta dando dan do énfasis énfasis a est este e pro problem blema, a, y para llev llevarl arla a aca acabo bo se esta basa basando ndo en dos establecimi establ ecimientos entos espe específic cíficos os de donde vend venden en este tipo de com comida ida rápida rápida,, al realizar cultivos de dichos alimentos, se obtendrán colonias de enterobacterias patógenas las cuales podrán ser identificadas mediante la aplicación de pruebas bioquímicas. Para finalizar esta idea se estima que el segundo establecimiento de comida analizado (de donde se adquirió la muestra 2, la denominada súper torta). Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 31

 

Será en el que se logre identificar una cantidad mayor de enterobacterias, a diferencia del primer establecimiento de donde se compro la muestra numero 1 (la denominada muertorta), los resultados que se pretenden obtener son los de lograr  aislar en la muestra 2 especies de shigella, proteus, salmonella, salmonella, providencia, providencia, Klebsiella, Serratia y algunas otras más de importancia media. Así pues se llega a

pensar esto, debido a que existe la evidencia suficiente de que en el segundo establecimiento, es el que contiene en su respectivo tipo de alimento que venden, una cantidad de bacterias que son capaces de causar infección, a diferencia del primer establecimiento. Sin más que agregar se esta llllegando egando a un pu punto nto crucial en es esta ta in inves vestitiga gaci ción, ón, que es el de co comp mprob robar ar po porr medi medio o de me meto todol dologí ogías as aplicadas específicamente a estos alimentos, si es verdad la la hipótesis planteada. ➢

Materiales y Métodos

Para realizar esta investigación, se opto por hacer las pruebas bioquímicas para identificación de enterobacterias en un tipo de comida mexicana llamada “torta” evidentemente esta comida fue comprada en la ciudad de México, se tomaron como muestra dos tiendas que venden tortas cubanas, ya que las tortas cubanas tienen una gran variedad de ingredientes, tales como: jamón, pierna de cerdo, salc sa lchi hich cha, a, ques queso o am amar arilillo lo,, qu queso eso bla blanco nco,, milan milanesa esa de re res, s, hu huevo evo,, ch chor oriz izo, o,  jitomate,  jitomate, aguacate aguacate,, cebolla cebolla,, mayones mayonesa, a, chiles jalapeños y chiles chipotle chipotless (figura (figura 1). La for forma ma en que se prep prepara aran n estas estas tort tortas as y el amb ambie ient nte e en el que las preparan, fue motivo especial por el cual se creyó que estos alimentos seria capaces de portar una gran cantidad de enterobacterias. En total fueron dos tortas la lass qu que e se co comp mprar raron on pa para ra el anál anális isis is,, la pr prim imera era se co comp mpro ro en un una a to tort rteri eria a ubicada en la calzada de Acoxpa, esquina con canal de Miramontes, delegación Tlalpan (figura 2). La segunda se compro en una torteria ubicada sobre la calzada de las bombas, deleg delegación ación Coyoacán Coyoacán,, a un costado de la Universida Universidad d Autónoma Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 32

 

Metropolitana Xochimilco, las cuales fueron transportadas envueltas en una bolsa de papel estraza, posteriormente después de comprar las muestras a analizar, se trasportaron de inmediato al laboratorio, en donde se realizo el análisis en 4 días. En el primer día, se realiz realizaron aron los cultivos de las dos muestras, la torta numero 1 fue la denominada muertorta, y la torta numero 2 fue la denominada súper torta, de esta estass mu mues estr tras as se real realiz izar aron on 4 cult cultiv ivos os dife difere rent ntes es en 2 caja cajass de ag agar  ar  MacConkey (figura 6), dos cultivos de la torta 1, uno concentrado y otro diluido, y de igual forma forma para la ttorta orta nume numero ro 2. Para homogen homogenizar izar la tort torta a numero 1 se tuvo que licuar licuar 150 g de torta con 125 ml de una soluci solución ón salina por 5 minut minutos os (figura (figur a 3), se vació el conten contenido ido en un vaso de precipi precipitado tado de 500 ml, y se hizo la siembr sie mbra a por est estria riado do cruzad cruzado. o. Para Para la muestr muestra a dilui diluida da se agre agregaro garon n 50g de la muestra concentrada y 80 ml de solución salina, se disolvió y se hizo la siembra por estriado estriado cruz cruzado. ado. Para la tor torta ta numero numero 2, se hizo hizo exactam exactament ente e lo mis mismo, mo, posteriormente se guardaron las cajas de agar MacConkey en una estufa a 36 grados Celsius, durante 24 horas. Al día siguiente, día 2. Se obtuvo un cultivo casi nulo de las muestras, ya que fueron muy pocas bacterias las que crecieron (grafica 1), de esas pocas bacterias se hizo la resiembra en tres cajas más de agar MacConkey, con la finalidad de obtener cultivos puros, así, se hicieron 4 resiembras diferentes, uno con la muestra 1 concentrada y 1 diluida, y otro de la muestra muest ra 2 co conc ncent entrad rada a y el ulti ultimo mo con la mu mues estr tra a 2 dilu diluida ida,, se guard guardaro aron n nuevamente en la misma estufa las 5 cajas de agar MacConkey. Al tercer día el crecimiento crecim iento bacteri bacteriano ano fue sufic suficiente iente (grafica 1), de tal modo que la muestra uno concentrada fue fermentadora intensa de lactosa, la muestra 2 concentrada fue fermentadora ligera, la muestra 2 diluida no fue fermentadora, y la muestra 1 diluida dilui da fue fermentadora intensa. Posteriorment Posteriormente, e, se hicieron las siembras de los cultivos puros en 4 juegos de pruebas bioquímicas (figura 4), el primer juego fue el de la muestra 1 concentrada, el juego numero 2 fue el de la muestra 2 Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 33

 

concentrada, el juego numero 3 fue el de la muestra 2 diluida y el juego numero 4 fue el de la muestra 1 diluida, se hizo el inócoluo y posteriormente se guardaron todos los juegos de bioquímicas en la estufa, junto con los agares MacConkey. Al cuart cu arto o dí día, a, el creci crecimi mient ento o en los tu tubo boss de la lass pr prueb uebas as bioq bioquí uími micas cas fu fue e el adecuado para realizar las lecturas indicadas (tabla 2) para identificar el género y especie de las enterobacterias que se obtuvieron.

Tabla 2. Tabla de las lecturas de las pruebas bioquímicas fundamentales para la identificación de enterobacterias más comunes.

Prueba bioquímica

Citrato de Simmons

Modo de hacer la prueba

Hacer la siembra por estriado

Lectura de la prueba bioquímica

Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en la zona inclinada del pico de flauta. Prueba negativa: no se observa crecimiento de cambio ni color en el medio.

Pico de flauta rojo/profundidad amarilla: medio alcalino/acido / (Alc / Ac). Glucosa fermentadora; lactosa o sacarosa no fermentadora Pico de flauta amarillo/ profundidad amarilla: medio Acido / Acido

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(Ac/AC). Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada. Agar hi hier erro ro tripl riple ea azú zúccar

Pre revvio semb sembrrad ado oe en ne ell me medio dio ssol olid ido o

Pico de flauta rojo/ profundidad roja: medio alcalino/ alcalino (Alc/Alc). Reacción negativa, no hay fermentación de ninguno de los carbohidratos.

TSI.

Prueba positiva: color rosa fuerte (rosa mexicano), en el caldo. Prueba negativa: color amarillo o sin cambio en el caldo urea. Caldo urea

Previa inoculación en el caldo urea Adicionar al tubo del caldo VogesProskauer los siguientes reactivos en el orden indicado. Para evitar la contaminación de los reactivos en la prueba de Voges-Proskauer, utilizar  una pipeta de 1mL en cada uno de

Voges-Proskauer 

ellos. a) 0.6mL de la solución etílica de αnaftol al 5% b) 0.2mL de la solución de KOH al 40% c) agitar el tubo y dejarlo en reposo de 10 a 15 minutos.

Prueba positiva: color rojo en el medio (presencia de acetoina).

Prueba negativa: color amarillo o cobrizo en el medio.

metilo al otro tubo de caldo Voges-

Prueba positiva: color rojo en el medio. Reacción retardada: color anaranjado

Proskauer, y agitar.

Prueba negativa: Color amarillo en el medio.

Adicionar 2 gotas del indicador rojo de Rojo de metilo

Prueba positiva: el medio de SIM debe encontrarse turbio. Prueba negativa: solo debe existir crecimiento a lo largo de la picadura. Movilidad

Previo sembrado en el medio SIM

Prueba positiva: color negro en la picadura o en todo el tubo. prueba negativa: ausencia de color negro en el tubo Producción de H2S

Previo sembrado en el medio SIM

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En esta tabla se puede mostrar como fue que se hicieron las lecturas de las pruebas bioquímicas, bioquímicas, y así mismo como se tuvie tuvieron ron que haber echo las mismas, mismas, para la identificación de las enterobacterias que se obtuvieron al final.

Grafica 1: Grafica del crecimiento bacteriano en el agar de MacConkey, a lo largo de los 4 días de investigación.

En esta grafica se puede observar que el crecimiento bacteriano de cada una de las muestras muestras tomadas (en porcent porcentaje aje total) total),, esta en función del tiempo (96 % de crecimien to

horas), para realizar esta grafica se necesito conocer el área total del agar  MacC Ma cCon onke key, y, pa para ra po post ster erio iorr me ment nte e ha hace cerr el calc calcul ulo o de dell cr crec ecim imie ient nto o bacteriano en una determinada área inoculada a lo largo de 96 horas.

➢

Resultados

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identificaro identi ficaron n las bacteri bacterias as de las muest muestras ras por medio de pruebas pruebas bioqu bioquímicas ímicas aplicadas a las muestras (tabla 4). Después de 4 días de análisis se llego a los result res ultado adoss de que que en la Mu Mues estr tra a 1 co conc ncent entrad rada a se ob obtu tuvi vier eron on bact bacter eria iass del del género: Shigella o Providencia, estos resultados los obtuvimos basándonos solo en reacciones clave (tabla 3) y en las lecturas de las pruebas bioquímicas (tabla 2). Por otra parte para la Muestr Muestra a 1 dilui diluida, da, se obtuvo el aislami aislamiento ento de bacterias del género: Shigella o Providencia, de igual forma basándonos solo en reacciones clave cla ve y las lect lecturas uras de las prueb pruebas as bio bioquí químic micas. as. El resu resulta ltado do de la Mue Muestr stra a 2 concentrada, fue el deseado, ya que desde un principio se planteo que seria la muestra más contaminada a diferencia de la primer muestra, en esta muestra se logro el aislam aislamiento iento de bacter bacterias ias del genero shigella shigella,, específicam específicamente ente Shigella sonnei,, evidentemen sonnei evidentemente te para la muestra 2 diluid diluida a se obtuvo el mismo resultado ya que es por lógica que era una muestra más diluida que la anterior, así se obtuvo de ig igua uall fo form rma a Sh Shig igel ella la so sonn nnei, ei, evi evide dent ntem ement ente e en un una a co conc ncent entrac ración ión má máss pequeña que la muestra 2 concentrada (ver grafica 1). De esta forma el resultado fue satisfactorio, ya que se encontró lo que se buscaba. Resumiendo estos hechos, en la tabla numero 4, se presentan los resultados de las lecturas de las pruebas bioquímicas para identificación de enterobacterias que se obtuvieron de los respectivos juegos (figura 5).

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Tabla 3: tabla de los hechos o reacciones clave de las pruebas bioquímicas para la identificación especifica de los géneros de enterobacterias.

Sulfuro de hidrogeno positivas Edwardsiella tarda vulgaris Especies de Salmonella mirabilis Citobacter freundii

Proteus Proteus

Voges-Proskauer positivas Especies de Klebsiella de Pantoea Especies de Enterobacter Serratia Especies de Hafnia

Especies Especies de

Fenilalanina desaminasa positivas Especies de Proteus de Providencia

Especies

Especies de Morganella Inmóviles a 36 grados C. Especies de Shigella Klebsiella Especies de Yersinia (móviles a 22 grados C.)

Especies de

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En esta tabla se puede observar algunas de las reacciones que fueron claves para la identificación de las enterobacterias que se obtuvieron al final de la investigación (tabla tomada de Koneman y col. 2008 pág. 227).

Tabla 4: pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias en el laboratorio de la Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco.    Juego de  pruebas bioquímicas

TSI

Gas

H2S

R M

V  P

IND

CIT

URE  A

MOV 

OH-H3O+ -

-

+

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

1 OH-H3O+

2

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

OH-H3O+

3

4

H3O+H3O +

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En esta tabla se puede observar los resultados de las pruebas bioquímicas para la iden identitififica caci ción ón de ente entero roba bact cter eria ias, s, de do dond nde e po post ster erio iorm rmen ente te se pa paso so a la conclusión de la deducción en base a estos resultados, del tipo de enterobacterias que estuvieron presentes presentes en las muestras analizad analizadas as (Cuadro modif modificado icado por los autores de ésta investigación, tomado en base a Koneman y col. 2008).

Tabla 5: Tabla de las características más comunes en las pruebas bioquímicas para la identificación del género y especies más comunes de enterobacterias patógenas para el ser  humano.

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En esta tabla se muestran las reacciones reaccione s más importantes de las pruebas bioquímicas para p ara la identificación de las enterobacterias patógenas más comunes, dicha tabla fue en la que se vaso esta investigación, TSI= agar hierro triple azúcar, H2S = ácido sulfhídrico, RM = rojo de metilo, VP = Voges-Proskauer, IND = indol, CIT = citrato de Simmons, Simmons, URE = ureasa, MOV = movilidad (modificado de Koneman y col. 2008, pág. 226). ➢ Conclusión Como conclusión final se puede decir, que las hipótesis planteadas de esta investigación fueron un tanto correctas. De acuerdo a los resultados obtenidos, se logra comprobar que efectivamente como lo indica la grafica 1, la muestra de la que qu e se logr logro o aisl aislar ar ma mayo yorr cant cantid idad ad de ente entero roba bact cter eria iass fue fue la mu mues estr tra a 2, específicamente la muestra 2 concentrada. También se puede observar que de acue acuerd rdo o a los los resu resultltad ados os ob obte teni nido doss de las las pr prue ueba bass bioq bioquí uími mica cass pa para ra la identificación de enterobacterias (tabla 4), se logro aislar especies de  providencia y shigella sonnei , así pues, se puede afirmar que las hipótesis planteadas, las cuales nos mencionan que se obtendrían especies de shigella,  providencia,  proteus, salmonella, Klebsiella, Serratia y algún otro tipo de enterobacterias fueron Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Página 41

 

un tanto ciertas. Ya que como lo indican los resultados se lograron aislar especies de sh shig igel ella la,, com como o lo so son n sh shig igel ella la son sonnei nei,, y pr prov ovid idenc encia ia De ci ciert erto o modo modo se concluye que en la comida rápida analizada, si existe la posibilidad de que se encuentren encuent ren habitando habitando especies bacteri bacterianas anas del genero enterobact enterobacteriacae eriacae.. Y que de cierta forma son capaces de causar patogenias especificas en los seres humanos al ingerir este tipo de alime alimentos ntos vendidos en la vía publica de la ciudad de México preparados con escases higiénica, y por último se puede decir que la comi comida da está está cont contam amin inad ada, a, pe pero ro,, no exis existe ten n cant cantid idad ades es sufi sufici cien ente tess de microorganismos como para causar una infección severa, así, se puede decir  vulgarmente que no ocurre daño alguno al momento de consumir estos alimentos.

➢

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tar arge getts

viru virule lenc nce e

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of 

 

 Anexos

Figura 1. Esta es una imagen de la denominada muertorta, En esta imagen se muestra como está preparada la comida que se analizó, se puede ver que la estuf est ufa a en la qu que e se pre prepa para ra no est está á lilimp mpia ia o en co cond ndic icio ione ness para para prepa preparar  rar  alimentos, así también se puede observar la gran cantidad alimentos, cantidad de ingred ingredientes ientes que contiene; los cuales no se sabe cual haya sido su desinfección previa.

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Figura 2. En esta imagen se puede observa el puesto de comida, se puede ver  tambié tam bién n que está en la vía pública, pública, esta esta image imagen n fue toma tomada da a las 3:0 3:00 0 de la mañana ya que es la hora en la que más se vende este tipo de alimentos.

Figura 3. Aquí se muestra el método que se utilizo para la homogenización de las muestras, se utilizaron utilizaron 125 ml de solución salina para posteriormente licuar por 5 minutos 150 g de muestra.

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Figura 4. En esta imagen se muestra como se hicieron los inóculos de los cultivos puros en los juegos de pruebas bioquímicas.

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Figura 5: en esta imagen se muestran los resultados obtenidos de los cultivos en los juegos de pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias.

Figura 6: en esta imagen se muestran los tres cultivos puros de las primeras muestras.

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