IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

TEMA: IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

INTEGRANTES NOEMÍ CHANCUSI CRISTINA GANCHALA ANDREA MEDINA PATRICIA SILVA .

FECHA: 12-02-15

1. CARACTERÍSTICAS GENERALES Este gran grupo de bacilos Gram Negativos No Fermentadores incluyen gérmenes pertenecientes a diferentes familias: Pseudomonas Flavobacterium Alcalìgenes Acinetobacter Acidovorax Agrobacterium Bordetella Burkholderia Chryseomonas Empedobacter Flavimonas Moraxella Roseomonas Shewanella Stenotrophomonas Pero los géneros más importantes son: Pseudomonas Acinetobacter Stenotrophomonas Burkholderia Algunos de ellos desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, no producen enfermedad en el individuo sano pero pueden comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos. Los bacilos Gram negativos No fermentadores son un grupo de microorganismos aerobios estrictos, con flagelos polares, no son esporulados, no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía o los degradan a través de vías metabólicas diferentes de la fermentación, son generalmente oxidasa positiva. Se encuentran en el agua, fango, suelo, plantas, alimentos y material patológico.

2. CARACTERÍSTICAS PARA SU IDENTIFICACIÓN

Crecen en la mayoría de agares

En agar sangre y chocolate crecen como colonias grandes y brillantes En agar MacConkey, SS crecen como colonias grandes, transparentes, porque no fermentan los carbohidratos presentes. Crecen en TSI y LIA, pero no producen ningún cambio de color, no se desarrollan ni acidifican la profundidad de estos medios IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES MAS FRECUENTES 1. 2. 3. 4.

Pseudomonas Acinetobacter Burkholderia Stenotrophomonas

CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS

GÉNERO PSEUDOMONAS  Bacilos Gram negativos.  Ligeramente curvos.  Aerobios estrictos.  Cepas móviles (flagelos polares)  Citocromo Oxidasa positivo.  Utiliza la glucosa y otros hidratos de carbono.  Debido a que Pseudomonas tienen unos requerimientos nutricionales sencillos pueden crecer fácilmente en los medios comunes de aislamiento, como el agar sangre y el agar MacConkey.

a) PSEUDOMONA AERUGINOSA

 Se desarrolla en todos los medios de cultivo.  Colonias grandes, olor a humedad y brillo metálico o azul-verdoso.  Coloración de Gram: Bacilos Gram negativos, alargados  Producción de Oxidasa: ( positivo). Coloración azul  Siembra en agar hierro de Kligler: Imagen alcalina de color rojo en todo el tubo SH2 (-), gas (-).  Motilidad: Crecimiento alrededor del sitio de inoculación  En agar MacConkey: Colonias redondas, incoloras por no utilización de la lactosa.

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Siembra en medios King A y King B para la producción de pigmentos: Producción de pigmentos (piocianina y pioverdina). Siembra en agar Cetrimide : Colonias redondas, lisas, de bordes regulares. Producción de pigmento verde (pioverdina) En Agar sangre las colonias son de color gris y son beta hemolisis (Halo transparente verdoso alrededor de las colonias). OF Glucosa: Oxidativa Produce pigmentación verde relacionada con la síntesis de piocianina azul y fluoresceína amarilla, y un olor dulce característico semejante al de las uvas.

GÉNERO

ACINETOBACTER

 Son bacilos o cocobacilos Gram negativos.  Son aerobios estrictos inmóviles .  Crecen bien en todos los medios de cultivo , siendo su temperatura óptima de crecimiento de 33 a 35º C.  Citocromo oxidasa negativo.  Catalasa positivo.  Son no fermentadores de glucosa  Utilizan una amplia variedad de compuestos orgánicos como fuente de carbono.

b) ACINETOBACTER BAUMANNII  Es el no fermentador encontrado en segundo orden de frecuencia en los laboratorios clínicos.  Es un patógeno oportunista.  Muestran una utilización rápida de la glucosa con producción de ácido.  Son multiresistentes a los antimicrobianos  Cocos o cocobacilos Gram negativo.  En agar MacConkey las colonias pueden tener un tinte ligeramente rosado.  Producen hemólisis en Agar sangre  No crecen en TSI.  Catalasa (positivo)  No reducen los nitratos a nitritos  No descarboxilan la lisina  Citocromo Oxidasa ( negativo).

GÉNERO STENOTROPHOMONAS

 Es un género que consta solo de una especie S. Maltophilia anteriormente Xanthomona Maltophilia.  Buen desarrollo en Agar sangre y MacConkey.  Citocromo Oxidasa Negativa.  microorganismo de baja patogenicidad.  Su hábitat natural es el ambiente acuático.  Bacteria aerobia.  Metabolismo oxidativo.  Se desarrolla en forma rápida en los medios de cultivo c) STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA  El diagnóstico de laboratorio se determina en base al Gram.  Bacilos Gram negativos.  Otras pruebas adicionales incluyen la oxidación de la glucosa y maltosa en medio OF, decarboxilación de la lisina, licuefacción de la gelatina y producción de H2S, evidenciada con papel de acetato de plomo.  Lisina descarboxilasa positiva.  Algunas cepas producen pigmentos amarillos.  Citocromo Oxidasa negativa.  ADNasa positiva (prueba clave debe incubarse 72 horas para evitar falsos negativos)  Colonia café verdosa en Agar sangre, generalmente no hemolítica.  Colonia amarilla verdosa en MacConkey. Agar sangre

ADNasa

Tinción de Gram

ADNasa

GÉNERO  

Antes pertenecían al Pueden sobrevivir en

BURKHOLDERIA género Pseudomonas cepacea. ambientes húmedos.



Patógeno aislado en infecciones respiratorias en pacientes con enfermedad fibroquística.

d) BURKHOLDERIA CEPACIA Bacilo Gram negativo no fermentador de crecimiento muy lento. Oxidasa: positivo débil (93% de las cepas, el otro 7% es oxidasa negativo). Móvil. Pigmento: amarillo claro. Causa septicemias nosocomiales y otras infecciones

3. IMPORTANCIA CLÍNICA Pseudomona aeruginosa , se trata de un grupo de bacilos aeróbicos Gram negativos , no fermentativos, cuyo papel patógeno se encuentra bien establecido . Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el agua, en el suelo e inclusive en el jabón, además de ser parte de la flora saprolitica de piel e intestinos en seres humanos y animales de diversas especies. Son móviles debido a la presencia de un flagelo polar. Poseen cilios que probablemente jueguen un papel importante en la resistencia a la fagocitosis y les permite adherirse a las superficies celulares, han recibido el nombre de bacilos piocianicos por su capacidad de producir pigmentos, no afecta a individuos sanos se comportan como oportunistas en pacientes inmunodeprimidos

La importancia clínica Pseudomonas aeruginosa, es bien conocida ya que es agente causal de otitis media. Oftalmitis, infección de heridas, bacteriuria, neumonía y bacterémia . Causa una alta mortalidad en los pacientes con compromiso inmunológico, quemado, oncológico o aquellos que son cometidos a instrumentación o manipulaciones. En los hospitales, la transmisión de pacientes a pacientes por las manos del personal es más importante que la diseminación aérea. Pseudomona no aeruginosa consideradas como un solo grupo ( especies=sp ), solo ocasionalmente causan infecciones oportunistas aunque puedan observarse con heridas , ulceras delos pies y bacteriuria . Estas especies aunque se aíslan con frecuencia, solo ocasionalmente están implicadas en enfermedades, su susceptibilidad los antibióticos es mayor que las cepas aeuriginosa es superior a las de otras Pseudomonas sp es conveniente considerar: a) Que existe una relación directa entre la relación de piocianina y el potencial patógeno y el potencial patógeno ya , que este pigmento afecta la utilización del oxígeno no por parte de las células infectadas incluidos los leucocitos, los cuales como consecuencia fagocitan inadecuadamente. b) Que Pseudomona aeuriginosa son considerablemente más resistentes a los antibióticos y por lo tanto pueden comportarse como oportunistas con mayor facilidad

4. MEDIOS DE CULTIVO PARA NO FERMENTADORES    AGAR CETRIMIDA USO: Es un medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género. FUNDAMENTO: Su formulación permite el crecimiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y estimula la producción de pigmentos. En este medio muy semejante al King A, en el cual la peptona de gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo microbiano. El cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formación de piocianina, pioverdina, piomelina y fluoresceína de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catiónico que actúa como agente inhibidor, libera el nitrógeno y el fosforo de las células de casi toda la flora acompañante, aunque inhibe también algunas especie Pseudomonas. El agar es el agente gelificante. INSTRUCCIONES

Suspender 45.3 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Dejar reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente hervir durante 1 minuto para disolución total. Distribuir en tubo u otros recipientes apropiaos y esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. CARACTERÍSTICAS Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogéneo, libre deslizamiento. Medio de cultivo preparado: color ámbar claro. PROCEDIMIENTO Siembra En superficie, por inoculación directa de la muestra estriando a partir de un caldo de enriquecimiento por ejemplo cerebro corazón Infusión o Tripteína Soya Caldo. Incubación: En anaerobiosis, a 35-37 ° C durante 24-48 horas. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Observa el crecimiento microbiano, las características de las colonias y la producción de pigmentos. La presencia de un color verde azulado corresponde a producción de piocianina, mientras que un color verde corresponde a la producción de pioverdina y color rosa claro, rojizo marrón oscuro corresponde a la producción de piorrubina. Examinar las placas bajo luz ultravioleta, ya que la producción de fluoresceína se observa de color amarillo verdoso brillante que difunde en el agar a partir del crecimiento microbiano.

   PSEUDOMONA AGAR F USO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas en base a la producción de fluoresceína. Conocido también como medio King B y Flo Agar FUNDAMENTO:

En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la concentración de fosfato dipotásico estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina. El sulfato de magnesio provee los cationes necesarios que incrementan la producción de fluoresceína y e agar es el agente solidificante.

CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO: Medio de cultivo color ámbar claro.

PROCEDIMIENTO: Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospecha la presencia de Pseudomona spp, tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubación: En anaerobiosis, a 35-37C durante 24-48horas. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30C, o dejar a 22C y observar diariamente hasta 7 días. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm. Se considera un resultado positivo la observación de fluoresceína, que es un pigmento de color amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenómenos de difusión.

PSEUDOMONA AGAR P

USO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas en base a la producción de piocianina. Conocido también como medio King A y Tech Agar. FUNDAMENTO: En el medio de cultivo, la peptona de la gelatina aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de piocianina y piorrubina e inhiben la producción de fluoresceína. El agar es el agente solidificante.

INSTRUCCIONES

Suspender 46.4g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Calentar con agitación constante para homogenizar el producto. Llevar a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir en tubos u otros recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Colocar los tubos en posición inclinada para solidificar el medio de cultivo (pico de flauta). También puede distribuirse en cajas Petri estériles. CARACTERÍTICAS DEL PRODUCTO: Medio de cultivo deshidratado: color beige, homogéneo, libre deslizamiento. Medio de cultivo preparado: color ámbar claro. PROCEDIMIENTO: Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp, tomar una colonia y estriar la superficie del medio.

5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS    OXIDASA Los citocromos son hemoproteìnas que contienen hierro y actúan como último eslabón de la cadena de la respiración aerobia, transfiriendo electrones (H 2) al oxígeno. El sistema Citocromo oxidasa se encuentra en microorganismos aerobios o microorganismos aeròfilos y anaerobios facultativos. La prueba para detectar la presencia de oxidasa puede realizar cubriendo las colonias bacterianas en la superficie del agar con el reactivo clorhidrato de tetrametil p-

fenilendiamina al 1%. Una alternativa es frotar una muestra de la colonia bacteriana sobre un papel filtro impregnado con el reactivo. En estado reducido es incoloro pero cuando se oxida vira a purpura.

   OF Glucosa Para la mayoría de las bacterias de importancia clínica implica la utilización de sustratos como hidratos de carbono. Para la identificación de diversas bacterias es importante determinar si la utilización del sustrato es oxidativo o fermentativo. El proceso oxidativo requiere oxigeno el fermentador no. El proceso oxidativo – fermentativo se logra con el medio O-F que contiene concentraciones bajas de peptona y un sustrato con un único hidrato de carbono como glucosa. El microorganismo que se desea identificar se siembra en dos tubos O-F con glucosa uno de los cuales se cubre luego con aceite mineral para impedir el ingreso de Oxigeno. El indicador de pH para la prueba O-F y los cambios de color que sufren en condiciones acidas son azul de bromo timol (que cambia de verde a amarillo). Cuando se determina la producción de ácido en ambos tubos el microorganismo se identifica como fermentadores de la glucosa Porque la fermentación puede producirse con oxígeno o sin él. Si el ácido solo se detecta en el tubo en aerobiosis (abierto) se considera que el microorganismo oxida la glucosa. Algunos microorganismos no utilizan la glucosa como sustrato y no se observa la presencia de ácido en ninguno de los tubos.

   Reducción de Nitratos a Nitritos

La capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos es una característica importante para identificar y diferenciar especies de muchos microorganismos. Los microorganismos que reducen los nitratos pueden extraer oxigeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta por el agregado α- naftilamina y ácido sulfanilico con formación de un color rojo de diazonio – p- sulfobenzenoazo- α- naftilamina.

   Hidrolisis esculina

El medio de esculina sin bilis es útil para diferenciar especies de bacilos no fermentadores. La esculina es un glúcido sustituido que puede ser hidrolizado por ciertas bacterias para producir glucosa y esculetina. La esculina es un compuesto fluorescente bajo la luz UV a 360 nm. Cuando hidrolisa la esculina la fluorescencia se pierde y el medio vira a negro debido a la reacción de esculetina con iones férricos presentes en el medio. Composición: Esculina 1g Citrato férrico 0,5g Agar infusión corazón 4g Agua destilada 1L

PRUEBA DE LICUEFACCION DE LA GELATINA PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan/ hidrolizan la gelatina o muestran cambios característicos debido a los productos de degradación. BIOQUÍMICA

La gelatina, una proteína derivada del colágeno animal, se incorpora a diferentes medios de cultivo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolíticas (proteinasas), detectadas por gestión o licuefacción de la gelatina. Las enzimas capaces de producir gelatinosis se denominan gelatinasas. Estas enzimas proteolíticas a menudo son importantes factores de virulencia de algunos microorganismos. Las proteínas naturales son demasiado grandes para entrar en una célula bacteriana; por ende; para que una célula pueda usar las proteínas, estas primero deben ser catabolizadas a componentes más pequeños. Ciertas bacterias segregan gelatinasas exocelulares para degradar las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. Este catabolismo de las proteínas por parte de las gelatinasas es un proceso de dos pasos, el resultado final es una mezcla de aminoácidos aislados. Gelatinas Proteína + H2O as Proteasa s Gelatinasa Polipéptidos + H2O s Proteasa Medio de Cultivo: Gelatina nutritiva. s

Polipéptidos

Aminoácidos individuales

Composición: a) b) c) d)

Extracto de carne. Peptona. Gelatina. Agua Destilada.

Consistencia del medio: Semisólido. Inoculación: Picadura en posición vertical hasta una profundidad de 2.5 cm, inóculo denso Condiciones de incubación: Tiempo: 18-24 horas. Temperatura: 35-37 ° C

Al término de la incubación se coloca el tubo en un refrigerador o baño de hielo durante dos horas para determinar si se ha producido o no la digestión de la gelatina (licuefacción).

Resultados:

Interpretación: Positivo: Medio licuado (estado líquido) Negativo: Medio sólido. El medio de gelatina nutritiva para punción no es conveniente para las pruebas de rutina de la actividad gelatinasa, dado que muchas especies requieren de una incubación prolongada antes de que aparezcan muestras de licuefacción. En los métodos diagnósticos de rutina para identificar bacterias, la duración de la incubación deberá alcanzar un período razonable. Reporte de resultados: Positivo: (+) Negativo: (-)

BIBLIOGRAFÍA:   

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ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN