I. Seminarios Cinética enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA “SEMINARIOS” 1. Para un enzima que sigue la cinética de Michaelis-Menten, ¿qué valor de velocidad inicial, expresado en función de Vmáx, se obtendría en un ensayo en el que se utilice: a. [S] = ½ de Km, b. [S] = Km, c. [S] = 2 Km y d. [S] = 102 Km a. b. c. d.

[S] = ½ de Km
Vo = 1/3 de Vmáx [S] = Km
Vo = 1/2 de Vmáx [S] = 2 Km
Vo = 2/3 de Vmáx d. [S] = 102 Km
Vo = 102/101 de Vmáx, es decir, el 99% de Vmáx

Por mucho que aumente la concentración de soluto [S], La velocidad inicial Vo nunca alcanzará la Vmáx. La relación entre Vo y [S] no es lineal, sino hiperbólica.

2. La penicilinasa o β-lactamasa, un enzima presente en algunas bacterias, inactiva la penicilina hidrolizándola. La masa molecular de este enzima es de 29.6 kD. Se midió la cantidad de penicilina hidrolizada en 1 minuto en 10 mL de una solución de 10-9g de penicilinasa purificada en función de la concentración de penicilina. En el tiempo de reacción la concentración de penicilina no varió significativamente (es decir, que estamos en condiciones de V0). Resultados del ensayo: a) Representar V0 frente a la [S] y hacer la representación doble recíproca. ¿Presenta la penicilinasa una cinética de Michaelis-Menten? Si es así, calcule gráficamente Km, y Vmáx. Sí, la presenta. Al representar gráficamente y V0 frente a la [S] obtenemos una hipérbola, que vemos en la primera gráfica. Posteriormente calculamos los inversos y representamos la cinética de la penicilinasa (los dobles recíprocos):

Extrapolamos: La pendiente es constante, con lo que la recta es infinita. Extrapolamos y prolongamos la recta, que se cruza con la ordenada, y obtenemos el valor de 1/Vmáx. La recta se cruza además con las abscisas, y el punto de corte se corresponde en este caso con el valor de -1/Km. Nos olvidamos del signo de -1/Km, y tomamos el valor absoluto de esa fracción. • •

Gráficamente, Km = 1/0.19 = 5.2 µM Vmáx = 1/1.46 = 0.084 nmoles/min = 6.84 * 10-10 moles/min.

a) ¿Cuál es el número de recambio de la penicilinasa en estas condiciones experimentales? Suponga un centro activo por molécula El número de recambio es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molécula de enzima cuando esta está saturada de sustrato. La Vmáx revela el número de recambio de una enzima si se conoce la concentración de centros activos [E]T. El número de recambio se obtiene dividiendo la Vmáx entre [E]T. [E]T = 10-9gr * (1mol/29.6 x 103gr) = 3.38 x 10-4 moles, en 10 ml. Considerando el centro activo por molécula de penicilinasa y que el ensayo se realiza en 10ml: Nº de recambio = (6.84) x 10-10 moles/min / 3.38 x 10-4moles) / 60seg/min = 337 s-1 = Vmáx/[E]

b) Las bacterias que posean penicilinasa serán ¿sensibles o resistentes a la penicilina? Las bacterias son resistentes a la penicilina.

3. En general, la sensibilidad de los orientales a las bebidas alcohólicas es mayor que la de los occidentales. La cantidad de etanol necesaria para provocar taquicardia y enrojecimiento facial es muy inferior para algunos asiáticos que para los europeos. Los efectos fisiológicos son provocados por el acetaldehído procedente de la deshidrogenación del alcohol etílico en una reacción catalizada por la alcohol deshidrogenasa del hígado.

CH3-CH2OH + NAD+ ↔ CH3-CHO + H+ + NADH A su vez, el acetaldehído debe se eliminado. a. Explique el proceso fisiológico de eliminación del acetaldehído b. Señale la diferencia metabólica observada en la población caucásica con respecto a la oriental. El acetaldehído es normalmente eliminado por una aldehído deshidrogenasa mitocondrial, que lo convierte en acetato. En algunos asiáticos, la forma normal de la aldehído deshidrogenasa, con una Km para acetaldehído baja, está ausente. Estos individuos poseen únicamente la forma citosólica de Km alta (menor afinidad) del enzima, la cual conlleva un nivel estacionario elevado de acetaldehído en la sangre tras el consumo de alcohol. Esta es la causa del incremento de la sensibilidad al alcohol.

4. Supongamos que la Km de la hexoquinasa (HK) es 0.1mM para la glucosa y que la de la glucoquinasa (GK) es 15mM para el mismo sustrato. Calcule con cada enzima la V0 expresada como % Vmáx para concentraciones de glucosa de 3, 5, 10 y 25mM. ¿Qué repercusión cinética pueden tener los cambios fisiológicos de concentración de glucosa sobre las actividades de los dos enzimas?

• La hexoquinasa (HK) tiene una Km de 0.1mM para la glucosa. • La glucoquinasa (GK) tiene una Km de 15mM para el mismo sustrato. V0 expresada como % Vmáx para concentraciones de glucosa de 3, 5, 10 y 25mM. [Glucosa] =3mM • V0 para la HK: 96,7% de Vmáx. • V0 para la GK: 16,6% de Vmáx.

[Glucosa] =10mM • V0 para la HK: 99% de Vmáx. • V0 para la GK: 40% de Vmáx.

[Glucosa] = 5mM • V0 para la HK: 98% de Vmáx. • V0 para la GK: 25% de Vmáx.

[Glucosa] = 25mM • V0 para la HK: 99,6% de Vmáx. • V0 para la GK: 62,5% de Vmáx.

A partir de los 3mM de glucosa, la HK está permanentemente saturada (su Km es 0,1mM). Para la GK, de las concentraciones de sustrato dadas, tan solo la última supera mínimamente la Km, y trabaja por debajo de su saturación. La HK está saturada desde la primera concentración de glucosa (3mM) dada.

La Glucoquinasa (Hexoquinasa IV) se expresa específicamente en el hígado. Que su Km sea mucho mayor que la de la Hexoquinasa presente en el cerebro por eritrocitos, y que sea menos sensible a la inhibición por la Glucosa 6 Fosfato, posibilita la función hepática de reservorio.

El valor de la glucosa en sangre durante el ayuno entre comidas oscila entre los 70 y los 100 mg/dl. Valores por debajo de 70 son indicadores de una hipoglucemia, y por encima de 125 lo son de una hiperglucemia.

5. Se realizó un experimento de cinética enzimática en el que se midió la velocidad V0 frente a la concentración de sustrato, primero en ausencia de la sustancia A y seguidamente en su presencia. Se obtuvieron los siguientes datos:

¿La sustancia A es un activador o un inhibidor? Si es un inhibidor, indique de qué clase se trata. Calcule Vmáx y Km en ausencia y presencia de A. Tenemos dos reacciones, una de ellas en presencia de A y otra en ausencia de la misma. Debemos obtener la gráfica de los dobles inversos, de todos los valores de la tabla: 1/[S] 0.4 0.3 0.2 0.1

1/V0 (-A) 3.13 2.50 1.92 1.45

1/V0 (+A) 5.0 3.85 2.78 1.79

En ausencia de A: • Km: 7.1 µM • Vmáx: 1.25 µmoles/min.

Ambas rectas tienen común el punto de corte con las ordenadas, que representa 1/V0, con lo que tienen el mismo valor de Vmáx, y Km es mayor en presencia de la sustancia A.

En presencia de A: • Km: 12.5 µM • Vmáx: 1.25 µmoles/min.

Mantiene la Vmáx, pero la Km se ve modificada, de forma que estaremos hablando de una sustancia A inhibidora reversible competitiva. Si aumenta el valor de Km, disminuye la afinidad por el sustrato.

6. Una preparación enzimática tiene una actividad específica de 150 U.I./mg de proteína y contiene 5 mg de proteína/ml. a) Calcule la Vmáx de la reacción en un ensayo en el que se han utilizado 10µL de dicha preparación enzimática. Por acuerdo internacional, se define una unidad de actividad enzimática (U.I. = Unidad Internacional de actividad) como la cantidad de enzima que produce la transformación de 1.0 µmol de sustrato / min. a 25 ºC en condiciones óptimas de reacción y medida. Nº de U.I. = Vmáx expresada en µmol de sustrato/min. La actividad específica es el número de unidades de actividad enzimática por mg de proteína presente en la mezcla de reacción. La actividad específica constituye una medida de la pureza enzimática, ya que aumenta a medida que se va purificando el enzima. Actividad específica: (U.I.)/mg de proteína Actividad específica: 150 U.I. /mg proteína

La preparación enzimática (de 10µL = 0,01 ml) contiene 5mg de proteína por ml. En un ml de solución hay 5gr, por lo que en la preparación enzimática de 0,01 ml habrá 0,05 mg de proteína. Si la actividad específica es de 150 U.I. por mg de proteína, por 0,05 mg de proteína hay 7,5 U.I. (o lo que es lo mismo, 7.5 µmol/min).

b) En otro ensayo en el que se utilizó la misma cantidad de enzima, en presencia de un inhibidor reversible a una concentración final de 2µM, la Vmáx obtenida fue de 3.5 µmoles/min, no modificándose el valor de Km. Indicar qué tipo de inhibidor es y calcular su Ki.

La Km no se ve modificada, pero sí la Velocidad máxima, por lo que estamos ante un inhibidor reversible no competitivo. Vmáx = 7.5 µmol/min V’máx = 3.5 µmoles/min Vmáx > V’máx Km = K’m

3,5 = [1 / 1+ (2/Ki)] * Vmáx Ki = 1,75 µM

7. Cuando se produce un daño severo del tejido hepático se libera a la sangre un isoenzima (E1). Después de un intenso ejercicio se libera a la sangre un isoenzima E2 que cataliza la misma reacción que E1. Los dos isoenzimas E1 y E2 se pueden diferenciar fácilmente porque tienen valores muy distintos de Km sobre el mismo sustrato. La afinidad por el sustrato es mayor para el isoenzima E2 con una Km de 20 µM. Utilizando los siguientes datos experimentales obtenidos de una muestra de sangre de un paciente, que ingresó inconsciente en urgencias, decida cual sería el diagnóstico más probable: ¿sufre el paciente una enfermedad hepática o está extenuado físicamente? Los datos experimentales permiten obtener directamente los valores de Vmáx y Km sin necesidad de representación gráfica. La Vmáx es de 30 µmol/min. Si añadimos sustrato, esta velocidad se mantiene constante. La Km = [S] cuando la velocidad inicial es igual a la mitad de la Vmáx, es decir, cuando es igual a 15 µmol/min. De modo que la E1 tiene una Km de 300, y la E2 una Km de 20. Asumimos pues que en la tabla estamos midiendo E1, luego E2, al tener una Km más baja que E1, muestra una mayor afinidad por el sustrato. Al presentar el paciente E1 en sangre, lo más probable es que el paciente sufra de una enfermedad hepática.

8. En los hematíes de un paciente de gota se hallan niveles anormalmente altos de fosforribosil pirofosfato (PRPP). Por otra parte, los valores de Vmáx y Km para la PRPP sintetasa eran normales. Sabiendo que la PRPP sintetasa es un enzima alostérico y conocido su mecanismo de acción, sugiera dónde puede presentar la anomalía.

La gota puede resultar de una sobreproducción de nucleótidos de purina, lo cual lleva a un exceso de síntesis de ácido úrico. Aumentan los niveles de PRPP sintetasa, y esto es lo que produce la biosíntesis aumentada de nucleótidos de purina y pirimidina, tanto por ser sustrato de las reacciones como por efectos alostéricos. Anormalidades metabólicas son resultado de la baja solubilidad del ácido úrico en un medio acuoso, por eso forma cristales de urato sódico en las articulaciones de las extremidades y en el tejido intersticial renal. La PRPP sintetasa es la que crea el PRPP que después dará lugar a nucleótidos de purina. Esta enzima se inhibe con GMP y AMP. Los niveles aumentados de PRPP y la hiperuricemia son debidos a que los productos formados de la ruta AMP/ADP y GMP/GDP no han sido capaces de inhibir la PRPP uniéndose al centro inhibidor alostérico. Se sugieren dos posibilidades: • •

Mutación en el centro inhibidor, lo que provoca una dificultad de unión con el inhibidor. Mutación en el mecanismo de acoplamiento del centro inhibidor (unido al inhibidor) y al centro catalítico.