Hromatografija 2 Deo

Hromatografske metode

Apsorpciona hromatografija

Podeona (particiona) hromatografija

Jonoizmenjivačka hromatografija

Adsorpciona hromatografija Zasniva se na adsorpciji komponenata smeš smeše na čvrstom adsorbensu Mehanizam adsorpcije:

V=

Langmuirova

1

Freundlichova adsorpciona izoterma U zavisnosti od agregatnog stanja:

bPVmax 1 + bP

x = kP n m

G-Č i TT-Č

1903 ruski botanič botaničar Cvet je na koloni razdvojio sastojke zelenog liš lišća (razdvojio je hlorofil od drugih pigmenata iz biljnog ekstrakta uz CaCO3 kao adsorbens i petrol-etar/etanol kao mobilnu fazu)

1

Adsorpciona hromatografija

Adsorbat adsorbovan na površ površini stacionarne faze

Adsorpciona hromatografija






Stacionarna faza Nerastvorna u mobilnoj Porozna ili neporozna Polarna ili nepolarna














Mobilna faza Služi za: unošenje analizirane smeše u kolonu razdvajanje komponenata u zone Istiskivanje zona iz kolone Ne reaguje hemijski sa stacionarnom fazom i komponentama smeše Minimalno se adsorbuje

2

Adsorbesi i grupe koje se razdvajaju Nepolarni

aktivni ugalj organske soli

Polarni

peptidi, ugljeni hidrati aminokiseline

AlAl-oksid Mg– Mg–oksid

neorganska jedinjenja, boje

MgMg-silikat

steroli, estri, gliceridi, alkaloidi steroli, aminokiseline

silikailika-gel CaCO3 skrob

karotenoidi, ksantofili enzimi

Particiona - podeona hromatografija G-T, T-T Koeficijent raspodele u podeonoj hromatografiji naziva se PODEONI KOEFICIJENT

α

α=

cs cm

Komponenta rastvorena u teč tečnoj fazi koja je vezana za čvrst nosač nosač PRINCIP Različ Različita rastvorljivost komponenata smeš smeše izmeñu dve teč tečne faze ( dva rastvarač rastvarača koji se ne meš mešaju) I stacionarna faza II mobilna faza

3

Važne veličine u PODEONOJ HROMATOGRAFIJI

Pri HORIZONTALNOM PROTOKU mobilne faze (rastvarača)

RETENCIONI FAKTOR (faktor zadržavanja), Rf vrednost IDENTIFIKACIJA KOMPONENTE

na molekule rastvarača deluju samo kapilarne sile, a ne i sile gravitacije

Rf =

z = (kt)1/ 2 k − konstanta (zavisi od

prirode sistema (σ i η) i T

t − vreme za koje rastvarač preñe put z

a b

a − preñeni put komponente b − preñeni put rastvarača Rf veća, ako se komponenta bolje rastvara u mobilnoj fazi Dobro razdvajanje: ∆Rf>0,05

α=

cs cm

α – podeoni koeficijent

Rf( A) < Rf(B) < Rf (B)

α A > α B > αC Rf =

predjeni put komponente predjeni put rast var aca

4

Tehnike izvoñenja adsorpcione i particione hromatografije




Hromatografija u koloni




Hromatografija na hartiji i tankom sloju

Hromatografija u koloni

5

Izvoñenje adsorpcione i particione hromatografije u koloni








NANOŠENJE UZORKA RAZVIJANJE HROMATOGRAMA kontinuirano propuštanje čistog rastvarača (mobilna faza), razvijač koji potiskuje sastojke smeše DETEKCIJA ZONA (utvrñivanje položaja zona u koloni):  Bezbojni uzorci − bojenom reakcijom, prskanjem odreñenim reagensima  Obojeni uzorci − okom  Fluorescentni uzorci − UV lampe  Radioaktivni uzorci − ureñaji za merenje radioaktivnosti ELUIRANJE ZONA Koristi se jedan ili više eluenata eluat se frakcionim kolektorom sakuplja u niz frakcija istih zapremina i analiziraju komponente KVALITATIVNA I KVANTITATIVNA ANALIZA

Izvoñenje adsorpcione / particione hromatografije na tankom sloju Mobilna faza – rastvarač rastvarač i njegove zasić zasićene pare

---------------------------------------------Mala količ količina smeš smeše (MRLJA)

---------------------------------------------Tanak sloj čvrstog adsorbenta – stacionarna faza Tanak sloj nema ulogu adsorbensa iako se koriste isti materijali kao kod adsorpcione hromatografije zbog porozne strukture i velike protočne moći (kapilarno prodiranje rastvarača).

---------------------------------------------Čvrst nosač nosač – staklena ploč ploča hartija ili tanak sloj čvrste supstance.

6

Tehnike izvoñenja hromatografije na hartiji ili tankom sloju

•jednodimenziona uzlazna silazna horizontalna (kružna) •dvodimenziona

UZLAZNA TEHNIKA

Rastvarač se kreće pod dejstvom kapilarnih sila; zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaustavljanja protoka rastvarača na odreñenoj visini

SILAZNA TEHNIKA

Za razdvajanje komponenata koje imaju male, ili bliske Rf vrednosti Rastojanje koje prelazi front rastvarača reguliše se dužinom podloge i visinom posude

Za razdvajanje komponenata sa relativno velikim razlikama Rf vrednosti

7

HORIZONTALNA (KRUŽNA) TEHNIKA

DVODIMENZIONALNA TEHNIKA

Kod supstancija sa bliskim Rf vrednostima

Izvoñenje podeone hromatografije

1.

Razvijanje hromatograma

2.

Odreñivanje položaja zona – primena hemijskih ili fizičkih procesa – hemijski reagensi, UV lampa, Merenje radioaktivnosti...

3.

Kvalitativna analiza – Rf vrednost i poreñenje sa tabličnim vrednostima

4.

Kvantitativna analiza - direktno odreñivanje u zoni - ekstrakcija pogodnim rastvaračem

8

ANALITIKA LEKOVA: analiza polaznih sirovina, meñuprodukata i finalnog proizvoda; stabilnost lekova, odvajanje i odreñivanje aktivnih principa lekova i njihovih degradacionih proizvoda KOZMETOLOGIJA: analiza boja i mirisa BIOHEMIJA: razdvajanja aminokiselina i šećera u biološkim tečnostima FARMAKOLOGIJA: odreñivanje metaboliti lekova u telesnim tečnostima BROMATOLOGIJA: ostatci pesticida u namirnicama, aditiva (boja) TOKSIKOLOGIJA: insekticidi i pesticidi u različitim materijalima

Jonoizmenjivačka hromatografija




Razdvajanje jonskih vrsta na osnovu njihovog afiniteta ka izmeni sa jonima funkcionalnih grupa.

9

Podela jonoizmenjivača


Neorganski




Organski

prirodni /

prirodni

sintetički

•zeoliti •gline •minerali

•oksidi •kisele soli viševalentnih metala •heteropoli kiseline

sintetički •polistiren

Umrež Umrežavanjem dobija se smola koja na površini mora imati funkcionalne grupe.

Podela jonoizmenjivač jonoizmenjivača katjonski anjonski -SO3H -COOH COOH -SH

-OH -NH2 -NHR NHR -NR2

amfoterni sadrž sadrže i katjonske i anjonske funkcionalne grupe

Funkcionalna grupa se sastoji iz dva dela: 1. Fiksirani jon –kovalentno vezan za matricu smole R 2. Kontrajon – izmenjuje se sa jonima iz rastvora

R-SO3H + NaCl NaCl ⇔ R-SO3Na + HCl R-OH + NaCl NaCl ⇔ RCl + NaOH NaOH

10

Tehnika izvoñenja jonoizmenjivačke hromatografije Suspenzija

izmenjivača u vodi sipa se u kolonu koja je delimično napunjenu vodom (da ne uñe vazduh) višak vode se ispusti ali iznad smole uvek mora postojati sloj tečnosti

 Prečišćavanje izmenjivača  Prevoñenje jonoizmenjivača u željeni jonski oblik

Kapacitet jonoizmenjivača Definicija: - Broj funkcionalnih grupa po jedinici mase suvog jonoizmenjivač jonoizmenjivača - Količ Količina jednovalentnog jona u mmol koju mož može da razmeni 1g suvog izmenjivač č a izmenjiva ≈ ≈

4 mmolg-1 H+ jona - katjonski 4 mmolg-1 OH- jona - anjonski

C=

Vc m

V − zapremina utroš utrošenog titranta c − molarna koncentracija titranta m − odmerena masa smole

11



PREČIŠĆAVANJE VODE “hladnim“ postupkom, bez destilacije

DEJONIZOVANA VODA Postupak se sastoji u propuštanju vode kroz jak katjonski, a zatim jak anjonski izmenjivač i na kraju kolonu sa smešom katjonskog i anjonskog izmenjivača

 PREČIŠĆAVANJE RADIOAKTIVNIH VODA

 KATJONSKI IZMENJIVAČI: razdvajanje aminokiseline, masne kiseline, kiseline od baza (rastvorne u vodi)  ANJONSKI IZMENJIVAČI: razdvajanje alkaloida, hemoglobina, aldehida, ketona, organskih kiselina male molarne mase, itd.  FARMACIJI: dobijanje i prečišćavanje lekova, vitamina, antibiotika , toksina i antitoksina, fermenata, itd.

LITERATURA

1.

M. Aleksić, Teorija hromatografije skripta

2.

www.pharmacy.bg.ac.rs/studije-Integrisane akademske studije /Materijali sa predavanja /instrumentalne_metode/magistar_farmacije/mede nica_udzbenik/Eksperimentalna fizicka hemija/11 Hromatografija.pdf

12