HPLC

Laboratoire de Chimie Analytique PharmaceutiquePharmaceutique- Genève

La chromatographie en phase liquide LC / HPLC

LC-MS: processus analytique L’analyse de composés dans des matrices complexes nécessite une préparation de l’échantillon, une séparation, une détection et un traitement des données. Préparation d’échantillon

Séparation

Détection

Analyse des données

Sélectivité -Simplification et accélération de la préparation de l’échantillon -Réduction du temps d’analyse -Automatisation plus facile

Chromatographies Liquide classique et micro-LC HPLC / CPL

Supercritique SFC / CPS

Partage

Exclusion

Polaires

Paires d'ions

Echanges de ligandes

Apolaires

Papier

Adsorption

Couche mince

Echanges d'ions

Autres...

Chirale

Electrophorèse capillaire CE / EC CZE

Diagramme des phases P = f (T) Etat supercritique

P Etat solide

Gazeuse GC / CG

Etat liquide

Gaz - Liquide Gaz - Solide

MEKC Chirale

Chirale

Chirale

Etat gazeux

T

Choix du système chromatographique Analyte

Phase stationnaire

Phase mobile

Propriétés physico-chimiques Chromatographie: partition phase stationnaire – phase mobile En fonction des propriétés PHYSICO-CHIMIQUES des molécules et surtout, en LC … - Volatilité / Polarité - Solubilité - Hydrophobe / Hydrophile - Acide / Base

Choix du type de LC Echantillon

MODE

Chrom. d’exclusion

Hydrophiles (protéines, sucres)

Chrom. adsorption/partage

Lipophiles (polymères)

Chrom. d’échange d’ions

polymère Support rigide poreux

phase normale X+

Chrom. chirale Isomères Enantiomères phase chirale

Lipophiles (sucres, phénols, ac. ac. carboxyliques)

(acides aminés)

colonne cationique

X(nombreuses substances pharmaceutiques)

Hydrophiles (80% des séparations chromatographiques) chromatographiques)

colonne anionique phase inverse

Chromatographie liquide haute performance La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est basée sur le partage de l’analyte entre une phase liquide mobile et une phase stationnaire solide très finement divisée. Pour obtenir une débit satisfaisant, il faut appliquer de très fortes pressions (> 100 bars). Suivant la nature des analytes à séparer, diverses phases stationnaires solides peuvent être utilisées: 1- chromatographie par échange d’ions 2- chromatographie d’exclusion 3- chromatographie de partage 4- chromatographie d’affinité

Chromatographie liquide haute performance 1- Chromatographie par échange d’ions: la phase stationnaire est ionique, l’analyte ionique (ionisable) interagit avec les groupes de charges opposées de la phase stationnaire. La phase mobile est une solution aqueuse de force ionique donnée.

2- Chromatographie d’exclusion: la phase stationnaire est un tamis moléculaire, les analytes sont séparés en fonction de leur taille (masse moléculaire > 10’000 g.mol-1).

Chromatographie liquide haute performance 3- Chromatographie de partage: a. la phase stationnaire est polaire (mode normal) et la phase mobile est un solvant non polaire. b. la phase stationnaire est apolaire (mode inversé) et la phase mobile est un solvant polaire.

4- Chromatographie d’affinité: la phase stationnaire contient un groupement pour lequel l’analyte a une affinité très prononcée. La phase mobile est une solution aqueuse.

Appareillage Injecteur

Pompes

Phase Mobile

Colonne

Réservoir de phase mobile

Four

Phase Stationnaire

Particules de silice

Détecteur

Intégrateur Informatique

En détail… INJECTEUR Volumes injectés entre 10 et 100 μl POMPE Pompes à haute pression (de 50 à 350 bars) COLONNE Longueur et diamètre de la colonne PHASE STATIONNAIRE Phase normale ou phase inverse PHASE MOBILE Nature, polarité ⇒ force éluante DETECTEUR UV, RI, fluorimétrie, électrochimie, réfractométrie, spectrométrie de masse (MS), … CHROMMATOGRAPHIE Procédé: exclusion stérique, adsorption, partage, échange d’ions Mode isocratique ou mode gradient

Injecteur

Vanne de commutation 6 voies

Pompes - Matériaux de fabrication chimiquement résistants aux phases mobiles employées - Capacité de travailler à haute pression - Pas / peu de pulsations (amortisseur de pulsations) - Débit de 0 → 3 ml / min ( →10 ml / min : CLHP-préparative) - Reproductibilité