HPLC 2014

HPLC- CROMATOGRAFIA DE LIQUID LIQ UIDOS OS DE ALT ALTA RESOLUCIÓ RESOLUCIÓN N (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)-

Cromatografía. Escribir

en

Colores ,

porque cuando fue desarrollada (1906) los componentes separados eran colorantes.

La cromatografía es un método físicoquímico de separación, en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.

Cromatografía en capa fina. Cromatografía en papel Cromatografía en Columna Cromatografía Cromatografía de gases

gas- líquido gas-sólido

Cromatografía líquida

- de reparto - de adsorción - de exclusión - de intercambio iónico

Cromatografía de intercambio iónico La fase estacionaría presenta en su superficie especies ionizadas capaces de retener selectivamente a iones con signo contrario que circulan en la fase móvil. Los puntos activos más comunes en las resinas de intercambio catiónico son: los grupos del ácido sulfónico -SO3 -H+, un ácido fuerte -grupos de ácido carboxílico –COO- H+, un ácido débil. Los intercambiadores aniónicos - grupos de amina cuaternaria –N(CH3)3 +OH base fuerte grupos de amina ternaria primaria  –NH3 + OH- base débil.

Cromatografía de exclusión por tamaños (cromatografía en geles permeables o de filtración en geles)

La fase estacionaria actúa como un tamiz, dejando penetrar a las partículas más pequeñas mientras que las de mayor tamaño son arrastradas rápidamente por la fase móvil.

= Partícula de gel = Partícula de menos tamaño que los poros del gel = Partícula de mayor tamaño que los poros del gel

masa molecular mayor a 3000 g/mol

Cromatografía de adsorción La fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsoción-desorción

Cromatografía de reparto Se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria en base a la solubilidad de los componentes de la muestra.

la mayoría de las aplicaciones se han referido a compuestos polares no iónicos de baja a moderada masa molecular < 3000). Pueden ser en fase normal o fase reversa

Fase normal la fase estacionaria tiene grupos polares Fase reversa la fase estacionaria tiene grupos no polares

Aplicaciones de HPLC •Purificación de:

Control de Calidad •Análisis de

medicamentos terminados, principios activos y materias primas. •Análisis “de orígen”

•Productos Naturales • Productos de Síntesis

Orgánicas

•Análisis de crudos

de petróleo

de alimentos •Separar

edulcorantes, bebidas • Falsificación de

patentes

•Estudio de procesos dinámicos •Cinética de Reacciones •Cuantificación de

componentes de la muestra

Al preparar las muestras Es necesario: Fase móvil

filtrar y desgasificar los disolventes tipo HPLC

Existen dos métodos de programación del solvente en de la fase móvil Elución Isocrática Elución con Gradiente

Fase estacionaria Elección de la columna adecuada para la separación Tamaño del diámetro interno longitud de la columna Analítica estandar

Ahorradora de solvente

Narrow Bore

Diámetro interno

4.6 mm

3.0 mm

2.1 mm

Uso actual de solvente

100 mL

40 mL

20 mL

--

60 %

80 %

% de reducción en uso del solvente

aumenta la sensibilidad se reduce la cantidad de solvente Muestra: tamaño carga, polaridad

Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.

Los componentes básicos de un cromatógrafo son:

Sistema de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado) Sistema de inyección Columna Detector y procesador

Sistemas de bombeo Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo: •Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. •Mantener el flujo libre de pulsaciones •Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min) •Control y reproducibilidad del flujo de solvente •Componentes de la bomba resistentes a la corrosión se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en: •Mecánicas • Recíprocantes producen un flujo con pulsaciones • De desplazamiento contínuo •Neumáticas

Columnas Es donde se realiza la separación Las más utilizadas son las de relleno, las cuales consisten de un tubo de acero relleno de una fase estacionaria de acuerdo al tipo de separación que se desea realizar.

El gel de sílice

Dioxido de silicio

Gel de polímero

Polystylene (copolímero de estirenodivinilbenceno) Polimetacrilato Polyhydroxymethacrylate  Alcohol polivinílico

sustancias naturales 

celulosa agarosa dextrina quitosano

columnas analíticas

con diámetro de la columna interior (ID) de 4,6 ~ 8,0 mm. mayor cantidad de muestra longitud de 5 y 30 cm. tamaños de las partículas de los rellenos 3, 5 y 10 μm

Columnas preparativas

con diámetro de la columna interior (ID) de 10 mm.

Base material: Particle size (mean): Pore size (mean): Functional group: pH stability: Calibration range:

Silica 5μm 250Å Diol 2.5-7.5 10,000-500,000 Da (globular proteins)

Columna C-18 fase reversa

Sistemas de inyección Método de introducción de la muestra en el cromatógrafo. Existen dos tipos de inyectores:

de jeringa la muestra se introduce con ayuda de una  jeringa cuya aguja se introduce a una membrana o “septum” colocando la muestra en la cabeza de la columna. de válvula la inyección se realiza en una válvula de seis vías, dos de las cuales están conectadas entre si por medio de una espira “loop” con el objetivo de contener la muestra antes de efectuarse la inyección.

Detectores Un detector es un dispositivo que permite medir, a la salida de a columna una propiedad física del eluyente. Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos: Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, El índice de refracción La constante dieléctrica La densidad Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto: absorbancia UV fluorescencia intensidad de difusión Infrarojo

Cromatógrama. Es el registro gráfico de los componentes de una muestra, así como la concentración en que están presentes como respuesta del detector y trazada por un registrador o procesador.

Separación con HPLC

La columna de alto Rendimiento proporcionará picos más estrechos y la columnas de bajo rendimiento proporcionara un pico más ancho

cuanto mayor sea el NPT, mejor será la columna. NPT es directamente proporcional a la longitud de la columna

Separación de dos componentes en la muestra

esto puede resolverse  Cambiando

las condiciones analíticas (la fase móvil, alargando los tiempos de retención). utilizar

diferentes tipos de columna

Resolución cromatografica y separación Es una medida de la distancia entre dos picos adyacentes.

Factores de la Resolución

Parámetro de la Capacidad Es una medida de la retención de la molécula en la columna.

K’ =

t r  - t0 t0

K’ = factor de capacidad (que tan afín es la muestra a la fase estacionaría o móvil) t r  = tiempo de retención t r  = tiempo vacío de la columna

Selectividad La capacidad del sistema cromatográfico para distinguir entre dos o mas compuestos. Es la medida de la distancia entre el máximo de dos picos que deben resolverse. α=

K’B K’ A

α = selectividad K’B K’ A = factor de capacidad

Eficacia o número de platos Es una medida del ensanchamiento del pico a medida que pasa a través de la columna durante la separación.

Cálculo de Eficacia o número de platos

N = eficacia, número de platos t r  = tiempo de retención h p = altura del pico  A = área del pico WB = ancho en la base de B W1/2 = ancho a la mitad de la altura del pico