Hidrólisis Enzimática Del Almidón

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

Ingeniería de Alimentos

Laboratorio de Biotecnología

Paula Andrea Loaiza Giraldo Diana Lorena Quintero Henao

UNIVERSIDAD DE CALDAS MANIZALES, CALDAS ABRIL 2015

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

RESULTADOS Tabla 1. Datos obtenidos para la curva de calibración por el método del DNS

ABSORBANCIA 0,056 0,101 0,165 0,293 0,355 0,412

PPM GLUCOSA 100 200 300 700 800 900

Figura 1. Curva de calibración ppm glucosa vs absorbancia

ABS

ABS vs ppm glucosa 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

y = 0,0004x + 0,0198 R² = 0,99

ABS v.s ppm glucosa

0

500 ppm glucosa

Ecuación de la recta Y = mx + b Y = 0,0004x + 0,0198

1000

RESULTADOS OBTENIDOS PARA LA -AMILASA

Tabla 2. α-amilasa lectura espectrofotómetro Tiempo de reacción (min) 0 10 20 30 40 50 60

Absorbancia 0,105 0,352 1,133 1,872 2,329 2,104 1,358

CONCENTRACION GLUCOSA REAL PPM Aplicando la ecuación de la recta y = 0,0004x + 0,0198, se calculó la concentración de glucosa en ppm así: Hallamos Y de la ecuación de la recta obtenida en la gráfica 1. y = 0,0004x + 0,0198

Concentración para T= 0 min (blanco enzimático)

Concentración para T= 10 min

Concentración para T= 20 min

Concentración para T= 30 min

Concentración para T= 40 min

Concentración para T= 50 min

Concentración para T= 60 min

CONCENTRACIÓN AZÚCARES REDUCTORES REAL (

) (

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

CONCENTRACION GLUCOSA REAL (gr/L) (AR reales) AR reales=

CONCENTRACION GLUCOSA (mmol/L) mmol/L= mmol/L AZUCARES REDUCTORES TOTALES. AR totales = 8,305g/L – 2,13g/L = 6,175g/L

AZUCARES REDUCTORES TEÓRICOS La glucosa teórica no se puede determinar por qué las variedades de almidón varían, se utiliza equivalente de dextrosa. EQUIVALENTE DEXTROZA

PORCENTAJE DE HIDROLISIS.

= 75% ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Actividad Enzimática = ml enzima = 0,45 ml U= ) (

U (10 min) = (

)= 3,4306 mmol/L*min

Este procedimiento se realiza para cada uno de los tiempos y así obtener un valor de U promedio para calcular la actividad enzimática. U promedio =

(

Actividad Enzimática =

)

Tabla 3. Datos para la alfa amilasa tiempo (min)

ABS

Concentració n ppm

AR Totales g/L

U mmol/Lmin

0,11

Concentració n gr/L 2,13

(B.E) 0 10 20 30 40 50 60

2130

0

-

0,352 1,133 1,872 2,329 2,104 1,358

8,305 27,83 46,305 57,73 52,105 33,455

8305 27830 46305 57730 52105 33455

6,175 25,700 44,175 55,600 49,975 31,325

3,4306 7,1389 8,1806 7,7222 5,5528 2,9005

% ED g/L

8,33 34,26 58,9 74,13 66,63 41,76

Figura 2. Concentración de glucosa vs tiempo

Glucosa vs Tiempo 70

y = -0,0314x2 + 2,6408x - 5,8194 R² = 0,8851

60

Glucosa g/L

50 40

Concentración

30 20

Polinómica (Concentración )

10 0 -10 0

20

40 60 Tiempo (min)

80

y = - 0,0314x2 + 2,6408x – 5,8194 Derivando la ecuación 1, y evaluando en t=0 se obtiene la velocidad de reacción enzimática (Vrxn) de alfa amilasa. Y’= - 0,0628x + 2,6408 En t = 0 Vrxnα-amilasa = 2,6408

Figura 3. Concentración de azucares reductores reales vs tiempo

AR real vs tiempo AR reales vs tiempo gL

60

y = 0,7553x + 7,7634 R² = 0,5825

50 40

azucar reductor real

30 20

Lineal (azucar reductor real)

10 0 0

20

40

60

80

Tiempo (min)

Figura 4. %equivalente dextrosa vs tiempo de reacción

%ED vs Tiempo 80 70

% ED g/L

60 50 40 30

%ED

20 10 0 0

10

20

30

40

Tiempo (min)

50

60

70

Resultados Glucoamilasa Tabla 5. Glucoamilasa lectura espectrofotómetro Tiempo (min)

ABS

0

0,11

15

2,799

30

3,402

45

3,276

60

3,456

CONCENTRACION GLUCOSA REAL PPM Concentración para T= 15 min

Concentración para T= 30 min

Concentración para T= 45 min

Concentración para T= 60 min

CONCENTRACIÓN AZÚCARES REDUCTORES REALES (

) (

)

(

) (

)

(

)

CONCENTRACION GLUCOSA REAL (gr/L) (AR reales) AR reales=

CONCENTRACION GLUCOSA (mmol/L) Mmol/L= mmol/L

AZUCARES REDUCTORES TOTALES. AR totales = 69,48g/L – 2,13 g/L = 67,35 g/L

AZUCARES REDUCTORES TEÓRICOS La glucosa teórica no se puede determinar por qué las variedades de almidón varían, se utiliza equivalente de dextrosa.

EQUIVALENTE DEXTROZA

PORCENTAJE DE HIDROLISIS.

= 75%

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Actividad Enzimática = ml enzima = 0,45 ml U=

Tabla 6. Datos para la Glucoamilasa Tiemp o (min) 0 15 30 45 60

ABS

Concentración Concentración glucosa glucosa g/L ppm 2,13 2130 69,48 69480 84,555 84555 81,405 81405 85,905 85905

0,11 2,799 3,402 3,276 3,456

AR totales ppm 38155 53230 50080 54580

AR Totales g/L 67,350 82,425 79,275 83,775

U Mmol/min

%ED g/L

2,8263 3,2858 2,6497 2,5269

89,9 109,9 105,7 111,7

Figura 5. Concentración de glucosa vs tiempo

Glucosa g/L

glucosa vs Tiempo 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

y = -0,0457x2 + 3,9379x + 8,2393 R² = 0,9289

glucosa Polinómica (glucosa)

0

20

40

60

80

Tiempo (min)

Y = -0,0457x2 + 3,9379x + 8,2393 Derivando la ecuación 2, y evaluando en t=0 se obtiene la velocidad de reacción enzimática (Vrxn) de glucoamilasa. Y’ = -0,0457x + 3,9379 En t=0 Vrxn glucoamilasa = 3, 9379

Figura 6. Concentración de azucares reductores reales vs tiempo

AR reales vs Tiempo 120 y = 1,1965x + 26,67 R² = 0,6365

100 AR reales g/L

80 60

AR reales

40

Lineal (AR reales)

20 0 0

20

40

60

80

Tiempo (min)

Figura 7. %equivalente dextrosa vs tiempo de reacción

%ED vs Tiempo % Equivalente Dextrosa

120 100 80 60 %ED

40 20 0 0

10

20

30

40

Tiempo (min)

50

60

70

ANALISIS DE RESULTADOS

La velocidad de reacción enzimática para la Glucoamilasa fue menor porque la hidrólisis de amilosa y amilopectina con glucoamilasa provenientes del primer tratamiento poseen múltiples y dispersas ramificaciones. Para obtener los resultados esperados es necesario controlar factores críticos como temperatura y tiempo para que se lleve a cabo la hidrólisis en condiciones óptimas. El almidón está formado por dos polímeros de glucosa de diferente estructura, la amilosa (unidades de D-glucosa formada por enlace α1,4) y amilopectina (unidades de Dglucosa de cadenas ramificadas, en la cadena principal del tipo α-1,4 y con enlaces en los puntos de ramificación del tipo α-1,6), en este proceso se demostró la especificidad de la α-amilasa, ya que esta hidroliza todos los enlaces lineales de la amilosa y la amilopectina, la glucoamilasa hidroliza los enlace α-1,6 de la partes ramificadas a una menor velocidad que los enlaces α-1,4; reduciendo de esta manera la molécula del polisacárido de Dglucosa. En la figura 3 se observa la velocidad de formación de azucares reductores reales de la α -amilasa y en la figura 6 se observa la velocidad de formación de azucares reductores de la glucoamilasa, es evidente que se formó una mayor cantidad de azucares reductores en la acción de la glucoamilasa, esto se debe a que la α -amilasa hidrolizo parcialmente el almidón, y la glucoamilasa trabaja consecutivamente de la α –amilasa por lo que los enlaces de las moléculas más pequeñas que reaccionan con la glucoamilasa, por su tamaño son más fáciles de reducir a su mínima expresión que sería la D- glucosa, por lo tanto la cantidad de azucares reductores y la velocidad son mayores en la glucoamilasa que en la α–amilasa. Se halló las velocidades de las dos reacciones enzimáticas analizadas por el método de velocidades iníciales para la alfa amilasa se obtuvo una velocidad de 2.6408 mmol/L*min, para la gluco- amilasa la velocidad fue de 3.9379 mmol/L*min; siendo esta mayor que la de la otra enzima analizada. La velocidad de reacción aumenta cuando la concentración de la enzima es mayor y se reduce cuando la concentración enzimática es a una temperatura menor a la óptima. Las reacciones catalizadas por enzimas se aceleran cuando la temperatura es óptima, lo que se debe, en parte, al incremento de movimiento de las moléculas que provoca colisiones más frecuentes del sustrato con la enzima.

CONCLUSIONES



Se aplicaron los conceptos básicos de la tecnología enzimática que permitieron procesar almidón usando enzimas comerciales.



Se evidencio porque la α-amilasa es considerada como una enzima licuante ya que tiene capacidad de hidrolizar el almidón rompiendo sus enlaces glucosídicos internos, en el momento en que se adiciono la enzima a la mezcla de fécula con agua empezó a notarse la clarificación de la muestra hasta el punto en que quedo casi transparente.



Si se deseara hidrolizar el almidón en azúcares solubles, la alfa amilasa tendría una mayor efectividad debido a que esta es encargada de cortar los enlaces glucosídicos de tal manera que se formen estos azúcares, es decir, la a- amilasa es apta para la obtención de azúcares reductores y esto se pudo observar durante la práctica donde con esta se obtuvo una mayor concentración de glucosa.



Pudimos observar que el uso de la alfa amilasa es indispensable debido a que es una endoenzima que ataca las moléculas de amilasa y la glucoamilasa por ser una exoenzima que ataca las ramificaciones de la molecula.

CUESTIONARIO 1- Explique en qué consisten los siguiente procesos: 

Gelatinización: Los gránulos de almidón son prácticamente insolubles en agua fría, pero a medida que se incrementa la temperatura cuando estos se encuentran en una solución acuosa, se retiene agua y el gránulo empieza a hincharse aumentando de volumen. Cuando se alcanza una determinada temperatura, el gránulo alcanza su volumen máximo, si se administra más calor, el gránulo hinchado incapacitado para retener el líquido se rompe parcialmente, así la amilosa y la amilopectina se dispersan en el seno de la disolución. La gelatinización transforma los gránulos de almidón insolubles en una solución de las moléculas constituyentes en forma individual. A medida que aumenta el volumen de los gránulos, aumenta la viscosidad de la dispersión acuosa. Cuando los gránulos se rompen, la viscosidad se reduce hasta un valor estable en el que se produce un gel cuyas características físicas y químicas son diferentes en cada almidón. La temperatura de gelatinización es aquella en la cual se alcanza el máximo de viscosidad y se pierden la birrefringencia (índice de refracción de los gránulos) y el patrón de difracción de rayos X. Esta temperatura es realmente un intervalo, porque así los gránulos provengan de la misma fuente botánica, tienen diferente composición y organización, lo que origina que unos sean más resistentes que otros.



Licuefacción: La licuefacción o dextrinización: es el proceso mediante el cual a partir de un almidón gelatinizado se obtiene una rápida disminución de la viscosidad en virtud de una hidrólisis parcial. En esta etapa se producen polisacáridos de longitud intermedia (maltodextrinas con 5 a 10 unidades de glucosa) y pequeñas cantidades de polisacáridos de alto peso molecular, como también algunos de bajo peso molecular (glucosa, maltosa entre otros).



Sacarificación: a partir de las maltodextrinas de la etapa anterior se completa la hidrólisis total del almidón a glucosa. En la digestibilidad de almidones como materia prima, muchos factores como el tamaño de particular, relación de amilosa:amilopectina, extensión de la asociación molecular entre los componentes del almidón, grado de cristalinidad, longitud de la cadena de amilosa y presencia de complejos lípidosamilosa, juegan un papel importante en la degradación hidrolítica

2- Identifique plenamente cuándo se dieron estos tres procesos durante el transcurso de la práctica y analice si se dieron simultáneamente o por separado. El proceso de gelatinización se evidencio desde el momento en el que almidón fue calentado en agua en exceso, cada vez que se aumentaba la temperatura se iba tornando blanco y muy viscoso; esto se debe a la fase de transición donde hay una difusión de agua dentro del granulo y posterior región amorfa, luego hidratación y por ultimo una hinchazón en donde el granulo es incapaz de retener líquido y se rompe dispersando amilosa y amilopectina.

El proceso de licuefacción después de tener el almidón gelatinizado y después de adicionar la enzima α-amilasa se empezó a notar como disminuia la viscosidad,ya que la enzima actua cortando las cadenas de los polímeros amilosa y amilopectina en cadenas de tamaño regular, dando como resultado dextrinas, maltosa, maltotriosa y maltopentosa. El proceso de licuefacción ocurre proceso de gelatinización fue a licuefacción ocurre cuando se desnaturaliza a 80°C por lo tanto disminuyera a 55°C.

por separado de la gelatinización, ya que el una temperatura de 80°C y el proceso de adiciona la enzima α-amilasa y esta se había que esperar hasta que la temperatura

La sacarificación es consecutiva de la licuefacción pero aquí se agrega la enzima glucoamilasa, con el paso del tiempo se veía más liquida la solución, ya que esta enzima tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces α 1,4 de extremos no reductores de polisacáridos para la formación de glucosa. 3- Interprete los datos de la evaluación sensorial: No se realizó evaluación sensorial 4- Proponga, y de ser posible implemente, un método para medir la concentración de sólidos totales en una muestra de almidón hidrolizado. Los sólidos totales de un almidón se pueden medir por refractómetro, donde Un °Brix es igual a un gramo de azúcar en 100 gramos de solución, este procedimiento es rápido, de bajo costo y de buena exactitud o retirando toda la humedad posible de la muestra y finalmente calculando su peso. También hay aparatos más específicos como el sacarómetro, los métodos colorimétricos, o la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). 5- Explique con sus propias palabras el sentido físico del equivalente de dextrosa (ED) y su importancia práctica. Este método se utiliza para la determinación del contenido de azúcares de todos los hidrolizadosde almidón preparados mediante conversión ácida, enzimática o la combinación de ambas. Los azúcares del tipo aldosa tienen acción reductora frente a ciertos grupos metálicos, por loque pueden determinarse mediante una modificación del método de Eynon y Lane, donde lasmoléculas de dextrosa y maltosa presentes en lamuestra reducen el sulfato de cobre en un sistemade tartrato en medio alcalino bajo condicionescontroladas, dando un precipitado rojo de óxidocuproso. El resultado se expresa como dextrosa y se calcula como por ciento de materia seca.

6- Utilizando las diferentes definiciones que se reportan en la literatura sobre el equivalente de dextrosa (ED), analice si se puede calcular este parámetro para las dos reacciones estudiadas. En caso de que no sea posible, explique qué se debe hacer para hallar el ED No es posible hallar ED por el método de fehling porque no se realizó en el laboratorio; pero se podría hallar de la siguiente manera: (

)

En donde los azucares reductores fueron hallados por el método de DNS, donde en la curva de calibración y con la ecuación de la recta se halló las ppm de glucosa y por un factor de conversión se llevaron a g/L siendo estos valores las concentraciones de los azucares reductores y a partir de estos se hallaron los reales mediante la siguiente ecuación: Azucares Reductores Reales=(ARmuestra-ARblanco) g/L 7- Compare los resultados obtenidos de velocidad de las reacciones enzimáticas utilizando los métodos gráfico y analítico. La velocidad de reacción se refiere al cambio en la concentración de reactivos o productos por unidad de tiempo. La velocidad de reacción de la glucoamilasa (Vrxnglucoamilasa=1.4467mmol/L*min) fue mayor que la velocidad de reacción de la alfa amilasa (Vrxnα-amilasa=1.0273 mmol/L*min) esto quiere decir que la hidrolisis del almidón es más rápida en el momento de acción de la enzima sacarificante (glucoamilasa) comparado con la enzima licuefante (alfa amilasa). 8- Argumente que experimentos se deben realizar para obtener la cinética enzimática completa de la hidrólisis del almidón de arroz.

Una alternativa de aplicación industrial que signifique un avance tecnológico es la obtención de derivados de contenido variable de sacáridos a partir de almidón. De

acuerdo con esto, se planteó primero producir malto dextrinas de bajo DE (equivalente de dextrosa) mediante hidrólisis enzimática. Diseño experimental. Se usa un diseño factorial 2 de dos factores a dos niveles con punto central para determinar el efecto de los factores y de sus interacciones en las respuestas, o sea, las condiciones necesarias para extraer y para hidrolizar el almidón. Extracción del almidón. Todas las muestras que se usan se toman del mismo lote de producción; se usa almidón de Harina de arroz y se mezcla con agua para solubilizar la proteína. Se agitó a 100 rpm en vasos de 1L; una centrífuga manual separó dos fases y el almidón obtenido se depositó en bandejas. El almidón aislado se lava con agua hasta pH ligeramente neutro (solución inicial básica); se filtró y se seca (70°C, 3h). La proteína residual se analizó por el método de Kjeldahl. Hidrólisis enzimática. Se hidroliza el almidón obtenido en planta con tres enzimas (BAN 480L, Termamyl 120L y AMG 300L; Novo Enzymes, DK), en el laboratorio y la planta. Usando el mismo diseño experimental, se hidroliza una mezcla de almidón y agua con enzimas hasta obtener el DE propuesto. Se evitó la adhesión de la mezcla a los tubos por su gelatinización. Las enzimas se inactivaron con HCl 0.1N a pH 3 por 5 min a 110°C. Se determinaron los azúcares reductores por el método de Fehling como índice de DE hasta hallar las condiciones óptimas para cada enzima. Cinética química. La enzima BAN (seleccionada para la hidrólisis, se monitorea a 70, 80, 90°C con tiempos de reacción de 0 a 2 h. Se muestrea el hidrolizado cada 15 min a cada temperatura, usando el valor de DE. Almidón + Enzima BAN

Malto dextrina

Caracterización del producto. Las malto dextrinas obtenidas en la planta piloto se analizaron por HPLC según un procedimiento establecido para determinar su grado de depolimerización (DP). También, se toman microfotografías con un microscopio de barrido electrónico (SEM) (JEOL 840 GLS) a diferentes aumentos (nx), recubriendo las muestras con una capa de oro-paladio de 25 nm y examinándolas. 9- Con base en la bibliografía, proponga un procedimiento para realizar la hidrólisis ácida del almidón y poder comparar así las ventajas de la hidrólisis enzimática. El grupo de laboratorio puede concertar con el profesor y previamente a la realización de la práctica, la realización de la hidrólisis de almidón mediante ácidos.

Hidrólisis Acida Agregar 20 ml de almidón al 2% en una fiola, luego agregar 1ml de HCl, mezclar, llevar a un baño de Maria hirviendo (100°C), anotar el tiempo de inicio de la hidrólisis, luego cada 5 minutos hacer una reacción con lugol en una placa de porcelana. Hacer la reacción hasta que ya no haya el color negruzco sino que adquiera el color del lugol que es como café. Anotar el tiempo de la hidrólisis ácida y la fiola siempre debe estar en el baño. La hidrólisis ácida por acción del HCl a 100ºC produce una hidrólisis totaldel almidón y forma glucosa, maltosa, e isomaltosa. La hidrólisis enzimática por acción de la enzima alfa amilasa produce unahidrólisis parcial produciendo maltosa, glucosa y dextrina límite que es unacadena ramificada y para poder romperla se necesita de α-1-6 glucosidasa. La gran ventaja es que las enzimas son cadenas de proteínas y su proveniencia es biológica, por su especificidad no hay riesgo de que se formen compuestos no deseados, con los ácidos nos vemos obligados a obtener los azúcares, pero a realizar procesos posteriores de purificación.

10- Proponga en forma concreta diferentes variaciones al procedimiento descrito en esta práctica de tal forma que se consideren los diferentes factores que influyen sobre la actividad enzimática: pH, temperatura, tiempo de reacción, concentración de sustrato, tipo de almidón, dosificación de enzima, adición o no de cofactores, etc. El procedimiento puede variar de acuerdo a la influencia que tienen factores como el pH, la temperatura, la concentración de sustrato, el tipo de almidón, la dosificación de enzima y la adición de cofactores, es decir: el pH en la actividad enzimática puede cargar los restos de aminoácidos, cambiando la conformación de la enzima, pero hay un pH óptimo, en el cual la actividad catalítica es la más efectiva; la temperatura acelera la velocidad de reacción, pero hay que tener cuidado de no exceder la temperatura sobre 55oC, porque la enzima al ser una proteína se puede desnaturalizar, creando daños en sus sitios catalíticos; la concentración de sustrato mientras mayor sea, mayor es la velocidad que alcanza la enzima, después de alcanzada esa velocidad máxima, un aumento en la concentración de sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción; la dosificación debe hacerse de acuerdo a los niveles de sustrato para que el rendimiento sea óptimo, y los cofactores son necesarios para que la enzima actúe adecuadamente en los sitios activos.

BIBLIOGRAFÍA

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Análisis de la viscosidad de la glucosa cubana- autor: Armando DiazGarcia; técnica experimental para hallar el equivalente dextrosa (ED), pagina 5; internet: http://revistas.mes.edu.cu/greenstone/collect/repo/import/repo/20100120/00418420 232012.pdf



Modelado del proceso de hidrólisis enzimática de almidones gelatinizados del fruto de la planta de banano; autor: Kevin Alonso Cruz Ruiz; internet: http://www.bdigital.unal.edu.co/7435/1/73007073.2012.pdf

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GARCIA, QUINTERO y LÓPEZ, 1998. Biotecnología Alimentaria. Editorial Limusa.

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WISEMAN, A. 1991. Manual de Biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia.

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GACESA, P y AUBBLE. 1990. Tecnología de las enzimas. Editorial Acribia.

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LÓPEZ, A., GARCÍA GARIBAY, M., QUINTERO, R., CANALES, M., 2002. Biotecnología Alimentaria. Páginas 105 – 110. Disponible en http://books.google.com.co/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA577&dq=enzimas+en +la+industria#v=onepage&q=enzimas%20en%20la%20industria&f=false