Hematologi Rutin

 

P em ema antapa pan n Mu Muttu P emer i k s aan He H ematol olog og i Rutin

Irnawastu awusi

 

PEMANT ANTAP APAN AN MUT MUTU U PEM DALAM PENETAPAN KADAR HEMOGLOBIN DAN PEMBUATAN KURVA STANDAR

 

Terdapat beberapa metode pemeriksaan untuk mengukur kadar hemoglobin (Hb), diantaranya dengan cara mengukur intensitas warnanya, mengukur kemampuan mengikat oksigen dan mengukur kadar besi yang dikandungnya. Penetapan kadar Hb dengan cara mengukur  intensitas warna yang umum dilakukan di laboratorium adalah : 1.

Metode Sianmethemo Sianmethemoglobin globin

2. 3.

Metode Oksihemoglob Oksihemoglobin in Metode lain

 

1. Metode Sianmethemoglobin Pengukuran kadar hemoglobin berdasarkan metode sianmethemoglobin merupakan cara yang dianjurkan oleh International for Standardization in Haematology (ICSH). Cara ini mudah dilakukan dan mempunyai bahan standar yang stabil. Semua bentuk Hb yang umum dijumpai dalam darah manusia kecuali sulfhemoglobin sulfhemoglobi n dapat diperiksa dengan cara ini.

 

Prinsip Pemeriksaan : Hemoglobin akan diubah oleh Kalium Ferisianida (K3Fe(CN)6) menjadi methemoglobin, yang kemudian diubah menjadi hemiglobin sianida (HiCN) oleh Kalium Sianida (KCN). Alat : -Spektrofotometer atau fotometer dengan -Spektrofotometer filter 540 nm -Tabung reaksi -Pipet 20 ml (Pipet Hb Sahli)

 

Pipet volumetrik 5 ml Reagen : - La Laru ruta tan n Dr Drab abki kin n K3Fe(CN)6 KCN

200 mg 50 mg

KH2PO4

140 mg

Non ionic detergent 1 ml  Aquades ad 1000 ml pH 7.0  – 7.4 - Larut Larutan an Sianm Sianmethe ethemoglo moglobin bin stand standar  ar 

Bahan pemeriksaan :

-Darah vena yang sudah diberi antikoagulan EDTA -Darah kapiler 

 

Cara Kerja 1. Ke da dala lam m ta tabu bung ng re reak aksi si / bo boto toll ke keci cil, l, dimasukkan tepat 5 ml larutan Drabkin 2. Hi Hisa sapl plah ah da dara rah h ven vena a (ED (EDT TA) ata atau u dar darah ah kapiler sebanyak 20 ml dengan pipet Sahli atau pipet otomatik 3. Ha Hapu pusl slah ah ke kele lebi biha han n dar darah ah ya yang ng me mene nemp mpel el pada bagian luar pipet dengan kertas pembersih 4. Masu Masukk kkan an da dara rah h da dala lam m pi pipe pett ke ta tabu bung ng reaksi yang berisi larutan Drabkin

 

5. Pi Pipe pett dib dibililas as seb seban anya yak k 3 kal kalii den denga gan n laru laruta tan n Drabkin tersebut (jangan melewati batas volume) 6. Ca Camp mpur ur la laru ruta tan n ba baik ik-b -bai aik k de deng ngan an ca cara ra menggoyangkan tabung secaradan perlahanlahan hingga larutan homogen biarkan selama 3 menit 7. Baca dengan fo fotometer pa pada l 540 nm, sebagai blanko digunakan larutan Drabkin

 

Pembuatan kurva standar Hb 1. Hit itun ung g leb lebih ih da dahu hulu lu kad adar ar he hemo mog glo lob bin dal ala am larutan standar yang akan digunakan. Karena pada pengukuran kadar Hb digunakan 20 ml darah dan ditambah larutan Drabkin 5 ml, berarti darah diencerkan 251 kali, maka kadar Hb standar yang tercantum pada ampul harus dikalikan dengan 251. 2. Laru Laruta tan n sta stand ndar ar Hi HiCN CN ya yang ng di dipi pililih h den denga gan n kadar 55  – 85 mg/dl. Misal dipilih larutan standar HiCN 57,2 mg/dl berarti larutan ini sesuai dengan kadar Hb 251 x 57,2 mg/dl = 14,4 g/dl

 

3. Buat Buat pa paliling ng se sedi diki kitt 3 ma maca cam m lar larut utan an ya yang ng mempunyai kadar Hb berbeda dengan cara mengencerkan standar larutan Drabkin,larutan misalnya 25%,dengan 50%, 75% dan 100%. Usahakan diperoleh larutan yang mempunyai kadar Hb tinggi, sedang dan rendah yang biasa ditemukan di klinik. 4. Se Sera rapa pan n laru laruta tann-la laru ruta tan n ters terseb ebut ut diu diuku kurr pada pada l 540 nm, sebagai blanko digunakan larutan Drabkin.

 

5. Pa Pada da ker kerta tas s graf grafik ik,, gamb gambar arka kan n titi titik-t k-tit itik ik yan yang g diperoleh dengan kadar Hb pada absis dan nilai serapan larutan pada ordinat. Setelah titik-titik tersebut dihubungi akan diperoleh satu garis lurus. 6. Hit itun ung g fa fakt ktor or ku kurv rva a in ini den denga gan n car cara a membagi seluruh kadar Hb larutan standar dengan seluruh nilai serapan dari larutan yang diperoleh.

 

Tabung Pengen Kadar Larutan Larutan Serapan No.

ceran %

g/dl

Standar Drabkin HiCN ml ml (A)

0

-

2.0

1

0

2

25

3.6

0.5

1.5

0.098

3 4

50 75

7.2 10.8

1.0 1.5

1.0 0.5

0.196 0.294

5

100

14.4

2.0

-

0.392

Jumlah

36

Faktor (F) = 36 / 0.980 = 36.8

0

0.980

 

Kurva standar Hb cara sianmethemoglobin s

0.400

e r

0.300

a p

0.200

a n

0.100 0 0

5

10 15 Kadar hemoglobin (g/dl)

 

Perhitungan Kadar Hb dapat dibaca pada kurva standar atau dihitung dengan menggunakan faktor (F). Kadar Hemoglobin = A x F  A = serapan F = Faktor 

Nilai Normal Laki La ki-l -lak akii dewas dewasa a : 13.0 13.0  – 18.0 g/dl Wanita dewasa : 11.5  – 16.5 g/dl Wanita hamil

: 11.0  – 16.5 g/dl

Balita

: 12.0  – 14.0 g/dl

Bayi

: 13.5  – 19.5 g/dl

 

Sumber Kesalahan I.

Tahap Pra-analitik

1.

Pe Pem mbe beri rian an id iden enttit itas as spe pesi sime men n sa sala lah h at atau au tertukar 

2.

Kes Ke sal alah ahan an pad ada a ta tah hap pe peng ngam amb bil ilan an dar ara ah : - Peng Pengambil ambilan an darah darah kapiler kapiler,, ujung ujung jari terlalu ditekan-tekan, sehingga cairan  jaringan ikut keluar dan akibatnya kadar Hb menjadi lebih rendah. - Peng Pengambil ambilan an darah darah vena, bendu bendungan ngan terlalu lama sehingga darah menjadi lebih kental. - Antik Antikoagu oagulan lan yang yang digunaka digunakan n kurang kurang sehingga darah membeku.

 

3.

Spesimen ti tidak homogen Pada penundaan pemeriksaan sering lupa untuk mencampur dengan menggoyangkan darah terlebih dahulu pada saat akan diambil sampel darah tersebut.

4.

Persiapan pasien kurang : - Darah lipem lipemik ik sehingg sehingga a kadar kadar Hb lebih tinggi dari seharusnya. -sehingga Adanya Adany a lekositos leko sitosis berat (> 50.000 berat 50.000//ml) kadar Hbismeninggi.

 

II.

Tahap Analitik

1.

Alat uku Ala ukurr (pi (pipe pett Sa Sahli dan pi pipe pett vol volu ume mettri rik) k) yang digunakan tidak akurat.

2.

Reagen yang digunakan kurang bai aik k kualitasnya. Larutan Drabkin yang baik harus jernih dan serapannya 0 terhadap akuades pada l 540 nm. Larutan Drabkin tidak baik bila dibiarkan lama terkena cahaya.

3.

Fotometer / Spektrofotometer : - l tidak pada puncak serapan. Pada fotometer digunakan filter 540 nm, sedangkan pada spektrofotometer harus dibuat kurva serapan dan kalibrasi panjang

gelombang.  

- Perub Perubahan ahan tegan tegangan gan listri listrik k sehing sehingga ga pembacaan serapan terganggu. - Kuve Kuvett kotor, kotor, isi kurang, kurang, ada ada gelembung gelembung udara dan posisi penempatan tidak benar pada fotometer akan mempengaruhi hasil pembacaan. 4.

Kesalahan pa pada pencampuran : - Teknik pemipet pemipetan an tidak benar  benar  - Tidak mengha menghapus pus darah darah yang yang menempel menempel pada bagian luar pipet Sahli. - Tidak membilas membilas bagian bagian dalam pipet pipet Sahli Sahli - Penc Pencampura ampuran n sampel sampel dan dan reagen reagen tidak benar. Sampel darah harus dimasukkan

setelah reagen.  

5.

Pen Pe nyi yimp mpa ana nan n lar laru uta tan n st sta and nda ar Hb Hb tid idak ak bai aik k ( tidak dalam lemari es) sehingga kadarnya

6.

lebih rendah. Kesalahan perhitungan Perhitungan menggunakan faktor yang diperoleh dari beberapa pemeriksaan larutan standar Hb lebih baik daripada hanya berasal dari 1 pemeriksaan larutan standar saja.

III. Tahap Pascaa-a anali littik 1.

Kesalahan pencatatan.

2.

Kesal Kes alah ahan an ala lama matt pa pasi sien en dan do dokt kte er ya yan ng meminta pemeriksaan.

 

PEMERIKSAAN LAJU ENDAP DARAH (LED)

 

Mengukur kecepatan pengendapan sel darah merah di dalam plasma. Satuan LED adalah mm/jam. Cara yang dianjurkan ICSH adalah cara Westergren.

Bahan pemeriksaan Darah vena dicampur dengan lar. Na Sitrat 0.109 M dengan perbandingan 4 : 1 atau darah EDTA yang diencerkan dengan lar. Na Sitrat atau NaCL 0.9% dengan perbandingan 4:1

Alat Tabung Westergren Rak untuk tabung Westergren

 

Cara Pemeriksaan - Isi tabung tabung We Westergre stergren n dengan dengan darah darah yang yang telah diencerkan sampai garis tanda 0. - Leta Letakkan kkan tabun tabung g pada pada rak dan perhat perhatikan ikan supaya posisinya betul-betul vertikal lurus 0

pa pada da su suhu hu 18getaran. - 25 C. Jauhkan dari cahaya matahari dan - Sete Setelah lah tepat tepat 1 jam, baca baca hasiln hasilnya ya dalam dalam mm/jam.

Nilai Normal LED Laki-laki jam I : 0  – 15 mm Wanita jam I : 0  – 20 mm

 

Sumber kesalahan - Pemer Pemeriksaa iksaan n LED harus dilak dilakukan ukan dalam 0C pemeriksaan waktu 2 jam pertama, darah EDTA disimpan pada suhu 4apabila dapat ditunda selama 6 jam. Makin lama tertunda pemeriksaan makin tinggi LED.

- Penca Pencampura mpuran n dan penge pengencera nceran n darah darah sering sering tidak dikerjakan dengan homogen. - Pencu Pencucian cian tabung tabung We Westergre stergren n tidak tidak boleh boleh memakai bikromat atau deterjen. Gunakan air  mengalir dan dibiarkan kering 1 malam dalam posisi vertikal atau bilas dengan alkohol dan aseton (harus yakin alkohol dan aseton sudah benar-benar kering).

 

Posisi tabung tabung harus harus benar-benar benar-benar vertikal vertikal tega tegak k - Posisi lurus dan tidak boleh ada getaran. Tabung miring dan adanya getaran akan menyebabkan LED lebih tinggi. - Suhu ruang ruangan an tinggi tinggi akan menai menaikkan kkan LED

 

SUMBER KESALAHAN HITUNG SEL

 

Sampel 1. Pemijatan / penekanan daerah tusukan yang berlebihan 2. Perbandingan antikoagulan yang tidak tepat dan pemilihan antikoagulan yang salah 3. Tidak Tidak dikocok dengan benar / tidak homogen Penggumpalan

sel / bekuan darah 4. Hemolisis karena alat basah / kotor 

Alat 1. Kamar hitung yang dipakai garisnya tidak  jelas 2. Alat tidak kering / tidak bersih, basah 3. Volume pipet tidak tepat 4. Kaca penutup kamar hitung bukan yang dianjurkan.

 

Reagen 1. Tidak Tidak disaring sebelum dipakai 2. Sudah kadaluarsa

Kesalahan Teknis 1. Penambahan bahan darah di luar pipet 2. Miniskus pembacaan tidak tepat 3. Pengenceran yang tidak tepat 4. Pencampuran yang kurang homogen 5. Cara mengisi kamar hitung tidak benar  (berlebihan atau mengering) 6. Letak kaca penutup tidak tepat 7. Meja mikroskop tidak horizontal 8. Menghitung sel yang tidak benar 

 

Hal-hal khusus Hitung lekosit 1. Bila jumlah lekosit sedikit (< 3000/ml) pengenceran diperkecil 2. Bila jumlah lekosit sangat banyak (leukemia) pengenceran diperbesar  3. Jika darah tepi mengandung eritrosit berinti maka hitung lekosit harus dikoreksi (bila eritrosit berinti > 10 %) Hitung lekosit = L  –

E

x L

100+E E = pada jumlah eritrosit berinti per 100 sel berinti hitung lekosit

 

Hitung Trombosit 1. Tabung plastik yang digunakan untuk pencampuran amonium oxalat dengan sampel 2. Oleh karena merupakan sel kecil maka memerlukan merluk an waktu waktu ± 5 menit menit untuk untuk mengen mengendap dap 3. sedangkan Larutan Rees-Ecker tidak melisiskan eritrosit larutan amonium oxalat melisiskan eritrosit 4. Pada keadaan trombositopenia, pembanding diperkecil misal 1.9 ml amonium oxalat dengan 0.1 ml darah EDTA 5. Karena trombosit menyerupai partikel yang kecil maka larutan pengencer harus benarbenar bebas partikel

 

Lekosit

Trombosit

Eritrosit

Reagen

Lar. Turk

 Am.Oxalat%

(Vol)

(0.38 ml)

(2 ml)

Formalin Citrat (4 ml)

Sampel

20 ml Darah EDTA

20 ml Darah EDTA

20 ml Darah EDTA

Kamar Hitung

4 bidang besar 

1 bidang besar 

5 bidang kecil

(0.4 ml)

(0.1 ml)

Pembesaran Objektif 

10X

40X

40X

Faktor 

400/20x1/0.4

2000/20x

4000/20 x

Perhitungan

= 50

1/0.1

1/0.02=10000

= 1000

(0.02 ml)

 

Hitung Eritrosit 1.Karena jumlah sangat besar (juta) maka kesalahan penghitungan relatif besar  2.Untuk memperkecil kesalahan, maka jumlah eritrosit yang dihitung harus banyak (minimal 400) 3. Variance perhitungan 2% sehingga bila diperoleh hitung eritrosit 5.106 / ml berarti 4,8  – 5,2. 106 / ml 4. Sebaiknya tidak digunakan untuk menghitung MCV, MCH dan MCHC 5. Karena trombosit menyerupai partikel yang kecil maka larutan pengencer harus benarbenar bebas partikel

 

PENETAPAN NILAI HEMATOKRIT

 

Untuk mengetahui volume eritrosit dalam 100 ml darah  ada tidaknya anemia. Dinyatakan dalam %. Bahan pemeriksaan : Darah EDTA kadar 1 mg Na2EDTA / K2EDTA / ml darah atau darah heparin kadar 15  – 20 IU/ml darah. Pemeriksaan tidak boleh ditunda > 6 jam (suhu 40C) Alat : Pada cara makro : tabung Wintrobe, diameter 2.5  – 3 mm, panjang 110 mm, skala interval 1 mm sepanjang 100 mm, volume 1 ml.

 

Pada cara mikro : pipet kapiler yang panjangnya 75 mm mm dan diame diameter ter 1 mm. Pipet dilap dilapisi isi Na EDTA /Heparin di bagian dalam  darah 2 kapiler. Pipet tanpa antikoagulan darah vena. Cara Pemeriksaan :

 Makk r o  Ma

Darah dicampur dengan seksama hingga homogen. Dengan menggunakan pipet pasteur darah dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe hingga mencapai garis tanda 100, dimulai dari dasar tabung dan hindari terjadinya gelembung udara di dalam tabung. Tabung yang berisi darah dipusing selama 30 menit pada kecepatan 2000  – 2300 g.

 

Hasil Ht dibaca dengan memperhatikan : - Tinggi kolom kolom eritrosit eritrosit yang dibaca dibaca sebagai sebagai nilai nilai Ht (%). - Tebal lapisan lapisan putih putih di atas eritrosit eritrosit yang yang tersusun dari leukosit dan trombosit  Buffy coat. - Warna kunin kuning g lapisa lapisan n plasma plasma  indeks ikterus. Dibandingkan dengan warna larutan Kalium Bikromat yang dinyatakan dalam satuan (S). Satu satuan sesuai warna larutan 1 g Kalium Bikromat dalam 10.000 ml air. Bila Ht > 50%, pusing tabung 30 menit lagi.

 

Kesalahan yang mungkin terjadi - Konsentrasi antikoagulan yang digunakan

tidak sesuai - Baha Bahan n pemeriksa pemeriksaan an tidak tidak dikoco dikocok k hingga hingga homogen - Bahan Bahan pemerik pemeriksaan saan meng mengandun andung g bekuan bekuan - Peme Pemeriksaa riksaan n ditunda ditunda lebih dari 6 jam jam - Pada waktu mengi mengisi si tabung tabung terjadi terjadi gelemb gelembung ung udara didalam tabung - Peng Pengisian isian tabun tabung g Wintrobe Wintrobe tidak tidak menca mencapai pai tanda 100 - Kece Kecepatan patan dan lama lama pemusin pemusingan gan tidak tidak sesuai sesuai - Terjad erjadii hemol hemolisis isis sewaktu sewaktu pemusingan pemusingan - Pem Pembac bacaan aan yan yang g sala salah h

 

 Mi  Mikk r o - Isi pipet pipet kapile kapilerr dengan dengan darah darah yang yang langsung langsung mengalir (darah kapiler) atau darah dengan antikoagulan - Salah satu ujung pipet disum disumbat bat denga dengan n dempul atau dibakar  - Tabung kapiler kapiler dimasukkan dimasukkan ke dalam dalam centrifuge mikrohematokrit dengan bagian yang disumbat mengarah ke luar  - Tabung kapiler kapiler dipusing dipusing selama selama 5 menit dengan kecepatan 16.000 rpm - Hematokrit Hematokrit dibac dibaca a dengan dengan memakai memakai alat baca baca yang telah tersedia

 

Kesalahan yang mungkin terjadi - Bila memakai memakai darah darah kapiler kapiler,, tetes tetes pertama pertama harus dibuang - Peng Penggunaa gunaan n EDTA EDTA lebih dari dari 1.5 mg/ml darah darah berakibat eritrosit mengerut sehingga Ht < - Peme Pemeriksaa riksaan n ditunda ditunda > 6 jam akan akan meny menyeebabkan Ht> - Baha Bahan n pemeriks pemeriksaan aan tidak tidak dicamp dicampur ur homogen homogen - Baha Bahan n pemerik pemeriksaan saan meng mengandun andung g bekuan bekuan darah - Pipet hepar heparin in pada pada daerah daerah panas panas cepat cepat rusak rusak sehingga harus disimpan dalam lemari es

 

- Kecepatan Kecepatan dan lama lama pemusin pemusingan gan tidak tidak sesuai sesuai - Pema Pemakaian kaian centrif centrifuge uge mikro mikro untuk untuk waktu waktu yang yang lama sering menjadi panas sehingga darah menjadi hemolisis - Lisis eritros eritrosit it dapat dapat terjadi terjadi bila salah salah satu satu ujung ujung pipet kaliper disumbat dengan cara dibakar  - Peng Penguapan uapan plasm plasma a dapat dapat terjadi terjadi bila pemus pemusiingan terlalu lama atau pembacaan dibiarkan terlalu lama