HBsAg ELISA

Pemeriksaan HBsAg metode ELISA Hari/tanggal

: Kamis,

September 2019

I. Tujuan Untuk menentukan secara kuantitatif adanya Hepatitis B Surface Antigen (HBSAg) di dalam serum atau plasma pasien II. Metode Metode yang digunakan yaitu ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay) III.Prinsip Antibody ganda “sandwich” imunosai yang menggunakan antibodi anti-HBsAg spesifik: antibodi monklonal HBsAg yang berada di dasar sumur mikrotiter dan antibodi poliklonal HBsAg ditambahkan dengan Horseradish Peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugat. Selama pemeriksaan, adanya HBsAg dalam spesimen akan bereaksi dengan antibodi-antibodi tersebut untuk membentuk kompleks imun

“antibodi-HBsAg-

antibodi- HRP”. Setelah materi yang tidak terikat tercuci selama pemeriksaan, substrat ditambahkan untuk menunjukkan hasil tes. Munculnya warna biru di sumur mikrotiter mengindikasikan HBsAg reaktif. Tidak adanya warna menunjukkan hasil non reaktif di spesimen. IV. Dasar teori Penyakit hepatitis B disebabkan oleh infeksi virus hepatitis B (VHB). Virus ini menyerang sel hati dengan melekat pada reseptor spesifik di membran hepatosit dan melakukan penetrasi ke dalam sitoplasma hepar. Perjalanan klinis dan diagnosis infeksi VHB ditandai dengan pemeriksaan serologi terhadap antigen dan antibodi yang terbentuk dan beredar di sirkulasi. Penanda serologi yang pertama kali dapat dideteksi yaitu HBsAg yang muncul 2 minggu sebelum timbul gejala. (Rina, dkk., 2006) Deteksi HBsAg dapat dilakukan dengan beberapa metode pemeriksaan, yaitu serologi dan Polymerase Chain Reaction(PCR). Uji serologi antara lain menggunakan

metode Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme Linked Immunoassay (ELISA), Enzyme Linked Flouroscent Assay (ELFA), Immunochromatography Test (ICT) atau rapid test, Radio Immunoassay (RIA), dan Chemiluminescent Microparticle Immunoassay (CMIA). Sedangkan untuk mendeteksi DNA virus dapat digunakan PCR. (Rina, dkk., 2006) ELISA adalah suatu singkatan bahasa Inggris yang disebut dengan : (Enzymelinked immunosorbent assay) atau penetapan kadar immunosorben taut-enzim yang merupakan suatu uji serologis. Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Menggunakan teknik ELISA dalam bidang imunologi untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/signal. Selanjutnya digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi/antigen dengan menggunakan antibodi/antigen spesifik. Teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar

antibodi/antigen

spektrofotometer

dan

yang dengan

diuji cara

dengan

menggunakan

menentukan

jumlah

alat

bantu

penambahan

berupa kadar

antibodi/antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standard antara kadar antibody atau antigen yang dapat dihitung berdasarkan absorbansinya.( Ichwan, 2014) ELISA dianggap pemeriksaan yang memiliki spesifitas dan sensitifitas yang tinggi yang mampu menunjang diagnosa klinis hepatitis B. ELISA ( EIA ) dibagi menjadi dua macam yaitu homogenous EIA dan heterogenous EIA. Homogenous EIA berguna untuk pemeriksaan bahan obat-obatan, hormon dan lain-lain. Sedangkan heterogenous EIA berguna untuk pemeriksaan bahan yang memiliki berat molekul besar misalnya antigen dan antibodi. Pemeriksaan parameter petanda serologis hepatitis B termasuk dalam kelompok kedua yaitu heterogenous EIA. Ada tiga tahapan penting dalam uji ELISA yaitu : 1. Pelapisan ( coating ) dengan antigen atau antibodi pada plate ( Phase padat ). Pelapisan dengan dengan antigen untuk penentuan antibodi untuk penentuan antigen. 2. Penambahan bahan yang ditentukan ( diperiksa ), misalnya serum, plasma, saliva dan cairan tubuh yang lain.

3. Penambahan detektor yang berfungsi untuk mendeteksi ikatan Ag – Ab yang terjadi. Ada dua detektor yang digunakan yaitu : a. Penambahan

konjugat

yaitu

antigen

atau

antibodi

berlabel enzim, misalnya Horse Radish Peroxidase

yang

( HRPO). Alkaline

Phosphatase,Urease,Glukose-Oxidase(GOP) dan lain-lain. b. Penambahan warna

pada

substrat reaksi.

yang Misalnya

berfungsi TMB

memberi

(Tetra

perubahan

Methyl Benzidine, O-

Toluidine, OPD, ABTS dan lain-lain. ELISA sendiri terdiri dari beberapa macam metode diantaranya ELISA kompetitif, ELISA double sandwich antigen atau antibodi dan indirect ELISA yang ketiganya memiliki prinsip dasar reaksi yang sama yaitu reaksi Ag - Ab. (Faizal, 2011) V.

Alat dan bahan

a. Alat 1. Sumur mikrotiter 2. Mikropipet 3. Tip 4. Inkubator 5. Elisa reader 6. Elisa washer b. Sampel 1. Sampel serum pasien

c. Reagen 1. Enzym Conjugate 2. Positif Control 3. Negatif Control 4. Sampel dilluent 5. Color A dan B 6. Stop Solution 7. Wash Buffer

VI. Cara Kerja a. Pembuatan Wash Buffer 1. Wash buffer pekat dicampurkan dengan aquadest perbandingan (1:19) 2. Campuran yang sudah jadi disimpan pada suhu ruang selama seminggu b. Prosedur Pemeriksaan 1. Semua reagen dan specimen dikondisikan pada suhu ruang 2. Siapkan nomor yang dibutuhkan untuk sumur, yang terdiri dari 1 sumur blanko, 2 sumur control positif, 2 sumur untuk control negatif dan 1 sumur untuk setiap specimen. Tulis nomor seri untuk control dan specimen pada kolom. 3. Spesimen diluents ditambahkan sebanyak 20µl pada masing-masing sumur 4. Spesimen, control negative, control positif ditambahkan sebanyak 100µl sesuai 5. 6. 7. 8.

dengan kolom data. (sediakan 1 sumur untuk blanko) Kemudian dihomogenkan Plate diinkubasi pada incubator suhu 37o C ± 1 jam Enzym conjugate ditambahkan pada setiap sumur ± 50µl Plate diinkubasi pada incubator suhu 37o C ± 30 menit

9. Setiap sumur dicuci dengan wash buffer dengan prosedur :  Pencucian yang dilakukan harus sesuai dengan petunjuk apabila ada 

pencucian yang tidak sempurna maka akan mempengaruhi hasil. Semua isi sumur dimasukkan pada labu cuci. Kemudian ditambhakan wash

buffer 350/lebih.  Pastikan tidak ada cairan di dalam tip dan setelah pemipetan terakhir. 10. Color A & B dimasukkan pada setiap sumur sebanyak 50µl 11. Plate diinkubasi pada waterbath/incubator 37o ± 30 menit 12. Hentikan reaksi dengan penambahan 50µl stopping solotion disetiap sumur 13. Absorbansi setiap sumur dibaca pada λ 450nm & λ 630nm 14. Perhitungan  Single wave length (λ450nm) OD = OD450 – ODBC450 = sampel – control 

Dual wave length (λ630nm) OD = OD450/630 VII. Interpretasi hasil Hasil pemeriksaan valid jika : 1. Nilai OD blanko kurang dari 0.100 ( sumur dari kontrol blanko hanya berisi kromogen dan stop solution) 2. Nilai OD kontro negatif harus sama atau kurang dari () 0.100. Dieliminasi kontrol negatif dengan nilai OD lebih besar dari () 0.100. Jika 2 nilai keluar dari batas, pemeriksaan invalid dan harus di ulangi. 3. Nilai OD kontrol positif sama atau lebih besar () 0.500. Jika nilai OD kurang dari 0.500, pemeriksaan invalid dan harus di ulangi. Perhitungan kontrol : Nilai cut-off : CO= NCx . 2,1 NCx : nilai absorbansi rata-rata kontrol negative (jika NCx  0.05 , NCx harus dihitung 0.05) Interpretasi hasil : 1. Spesimen dengan absorbansi kurang dari (