Guias Microbiologia de Alimentos Unicordoba

Elaborado por: Mónica María Simanca Sotelo. Ingeniera de Alimentos. Alba Manuela Durango Villadiego. MSc.

TABLA DE CONTENIDO Pàgina 1. INTRODUCCIÓN 2. GUÍA Nº 1: Técnica Ecométrica. 3. GUÍA Nº 2: Estudio microbiológico a manipuladores, utensilios y medio superficies, ambiente. 4. GUÍA Nº 3: Cuantificación de microorganismos por el método de recuento en placa. 5. GUÍA Nº 4: Técnica del número más probable (NMP). 6. GUÍA Nº 5: Recuento de mesófilos aerobios y facultativos viables. 7. GUÍA Nº 6: NMP de coliformes totales y fecales en alimentos de origen animal o vegetal. 8. GUÍA Nº 7: Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 9. GUÍA Nº 8: Recuento de Mohos y levaduras. 10. GUÍA Nº 9: Investigación de Salmonella en alimentos. 11. GUÍA Nº 10: Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor. 12. GUÍA Nº 11: Recuento de Bacillus cereus. 13. GUÍA Nº 12: Investigación de Listeria monocytogenes. 14. GUÍA Nº 13: Investigación de Vibrio parahaemolytico. 15. GUÍA Nº 14: Control microbiológico de conservas no alteradas. 16. GUÍA Nº 15: Recolección de muestras de agua para Análisis acteriológico. 17. GUÍA Nº 16: Cuantificación de microorganismos por el método de filtración por membrana. 18. GUÍA Nº 17: Número más probable de Pseudomona aeruginosa. 19. GUÍA Nº 18: Presencia-ausencia de coliformes en muestras de agua (método del sustrato definido). 20. GUÍA Nº 19: Prueba del tiempo de reducción del azul de metileno (T.R.A.M.). 21. GUÍA Nº 20: Microbiología de leche y derivados. 22. GUÍA Nº 21: Microbiología de cárnicos. 23. GUÍA Nº 22: Microbiología de ovoproductos. 24. GUÍA Nº 23: Microbiología de pescados y mariscos. 25. GUÍA Nº 24: Microbiología de frutas y hortalizas. 26. GUÍA Nº 25: Microbiología de cereales y panificación. 27. GUÍA Nº 26: Microbiología de bebidas. 28. GUÍA Nº 27: Microbiología de aguas. 29. ANEXOS

I

1 2 7 14 22 31 33 36 39 41 44 47 50 53 56 59 63 67 69 71 73 76 79 82 85 88 91 94 96

LISTA DE TABLAS Pàgina 1. TABLA No.1: Tabla de NMP y límites de confianza cuando se usan 5 tubos con 10 ml de muestra. 2. TABLA No. 2 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras puras. 3. TABLA No. 3 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras diluidas.

ii

26 26 27

LISTAS DE FIGURAS Pàgina 1. 2. 3. 4. 5.

Figura No. 1: Técnica Ecométrica. Figura No. 2 Diluciones decimales. Figura No. 3: Siembra en Profundidad. Figura No. 4: Siembra en Superficie. Figura No. 5: Técnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras líquidas) 6. Figura No. 6: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras líquidas). 7. Figura No. 7: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas líquidas o sólidas)

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5 19 20 21 28. 29 30

LISTA DE ANEXOS Pàgina Anexo A: División laboratorio de alimentos y bebidas alcohólicasLaboratorio de Microbiología de Alimentos INVIMA. Anexo B: Normatividad relacionada con alimentos.

iv

96 97

INTRODUCCION La calidad de los alimentos está constituida por tres áreas de estudio, las cuales son: calidad microbiológica, calidad fìsico-química y calidad sensorial. Entre estas áreas la que revista mayor importancia es la calidad microbiológica, puesto que a través de esta se puede determinar la inocuidad de los alimentos, es decir, su capacidad de no producir daño (enfermedad) a las personas que lo consumen. Para llevar a cabo el análisis microbiológico de los alimentos es necesario disponer de un laboratorio especializado donde solo se manipulen materias primas y aditivos alimentarios, productos procesados, materiales de insumo (envases, empaques) y muestras provenientes de la instalaciones de la empresas de alimentos (manipuladores, superficies y ambiente). En el laboratorio de Microbiología de Alimentos se deben contar con una dotación mínima de equipos, entre los cuales cabe mencionar incubadoras, baños termostatados, autoclave, microscopios, balanzas, centrifuga, pHmetro; con una dotación de medios de cultivo y reactivos, los cuales se deben encontrar en óptimas condiciones de uso y con suficiente cantidad de material de vidriería. El laboratorio además debe contar con un sistema de calidad en el cual se contemplen los procedimientos de preparación de medios de cultivo y reactivos, los procedimientos de limpieza y desinfección de materiales, equipos y áreas y se debe definir el personal de apoyo que labore en el mismo, el cual debe contar con una formación en el área donde se desempeñará. En el presente manual se muestran los procedimientos para llevar a cabo el análisis microbiológico de los alimentos.

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 1: TECNICA ECOMETRICA 1. INTRODUCCIÓN En el laboratorio de Microbiología de Alimentos se debe realizar una evaluación sistemática de los medios de cultivo no selectivos y selectivos preparados en el laboratorio y aún los comerciales, ya que éstos varían ampliamente según su composición, modo de preparación, etc. Es muy importante el control que se tenga sobre los medios de cultivo, porque de ellos depende la exactitud de los resultados. Para establecer la calidad de los medios de cultivo se ha desarrollado una técnica sencilla y confiable, cuyo fundamento es comprobar el crecimiento efectivo en los medios de cultivo, de los microorganismos buscados y la inhibición de la flora acompañante. Esta técnica se ha denominado ecométrica porque evalúa la susceptibilidad de los medios de cultivo a la colonización por cepas interferentes. Esta técnica implica una siembra por estría con ayuda de un asa bacteriológica, obteniéndose Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en número decreciente, como sucede en la siembra por agotamiento. En la figura Nº 1 se ilustra muy bien como se debe realizar la siembra. Todos los microorganismos que se suponen crecen en el medio de cultivo deben desarrollar colonias visibles, aún en la estría central. En cambio los microorganismos que se suponen son inhibidos en el medio de cultivo ensayado no deben formar colonias mas allá del primer cuadrante, a lo sumo en el segundo cuadrante (Ver figura 1). 2. OBJETIVO Evaluar la selectividad de los diferentes medios de cultivo selectivos mediante la técnica ecométrica. 3. MATERIALES Medios de cultivo 6 cajas de agar selectivo ( EMB, hektoen, BPLS, salado manita, Baird Parker)

Reactivos y cepas 3 suspensiones de cepas de microorganismos que deben crecer en el medio de cultivo 3 suspensiones de cepas de microorganismos que no deben crecer en el medio de cultivo

* Algodón y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO

Materiales* asas bacteriológicas incubadora Mecheros Cinta enmascarar

de

1. Tomar 6 cajas del medio a analizar. 2. Dividir con el asa bien caliente cada caja en cuatro cuadrantes, como se observa en la figura 1. 3. Marcar tres cajas con el nombre de los microorganismos que supuestamente crecen y forman colonias en ese medio de cultivo. 4. Marcar las tres cajas restantes con el nombre de los microorganismos que supuestamente no deben crecer en ese medio de cultivo. 5. Sembrar cada caja con el microorganismo correspondiente, haciendo 5 estrías en cada cuadrante y una estría central (Ver figura 1), sin quemar el asa y tomando inóculo sólo una vez. 6. Incubar a 37ºC por 24-48 horas. 5. RESULTADOS 1. Se procede a observar el crecimiento o no de cada uno de los cuadrantes de cada caja. 2. El resultado se expresa como un número de 6 cifras. Se anota un número de 0 a 5 según el crecimiento en cada cuadrante, incluyendo la estría central considerada como la quinta. 3. Se debe anotar cada uno de los resultados de cada cuadrante, igualmente el microorganismo utilizado. 4. Al final se informará un número de 6 cifras. 6. INTERPRETACIÓN Y REPORTE Las tres primeras cifras indican los sectores positivos de los microorganismos que deben crecer y las tres últimas cifras los sectores positivos de crecimiento por parte de las cepas cuyo desarrollo no debe producirse. Así un medio selectivo perfecto daría un resultado de 555000, pero en la práctica se acepta la fórmula 55001 o aún otra más desfavorable. Se reporta según las indicaciones de la hoja de informe. 7. BIBLIOGRAFÍA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Manual de Bioseguridad. Editorial Ginebra. 2ª edición, 1994. 4. MOSSEL, A. y MORENO, B. Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de los alimentos. Editorial Acribia. 5. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994. 3 8. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO

Todos los grupos deben traer:    

Fósforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar Marcador.

4

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO TÉCNICA ECOMETRICA INFORME

1. Nombre del medio de cultivo:____________________________________ 2. Fundamento del medio de cultivo:________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ No de caja 1 2 3 4 5 6

Sectores positivos _______________ _______________ _______________ _______________ _______________ _______________

Microorganismo ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________

La fórmula final obtenida será: _____________________________________ Conclusión: ____________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

5

Figura No. 1: Técnica Ecométrica

Microorganismos que SI crecen

Microorganismos que NO crecen

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 2: ESTUDIO MICROBIOLOGICO A MANIPULADORES, SUPERFICIES, UTENSILIOS Y MEDIO AMBIENTE. 1. INTRODUCCIÓN Para asegurar la calidad de los alimentos debe prestarse atención tanto a los microorganismos patógenos como a los alterantes, que pudieran llagar a las materias primas o al alimento terminado, a partir del hombre (manipulador), de los equipos, tuberías, superficies, aire, etc. Según el Ministerio de la Protección Social se denomina manipulador a toda persona que trabaje a cualquier título y aunque sea ocasionalmente, en un local o establecimiento o en el comercio ambulante donde se produzcan, procesen, almacenen, distribuyan, transportan o expendan alimentos o materias primas para alimentos. En una planta procesadora de alimentos, el manipulador juega un papel importante en la fabricación de sus productos, ya que se puede convertir en una fuente de contaminación. Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, los sitios de importancia donde residen los microorganismos saprófitos y que se constituyen en una fuente de contaminación para manipuladores de alimentos son la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe). El microorganismo mas importante a analizar a partir de la piel, es el Staphylococus aureus, este microorganismo reside también en las fosas, tracto nasofaríngeo y la mayoría de las veces se encuentra asociado a furúnculos, heridas y lesiones de la piel. Debido a sus condiciones metabólicas, esta bacteria puede crecer y/o reproducirse en condiciones adversas; esto hace factible que contamine los alimentos y por su facilidad de aislarse en el laboratorio, ha sido utilizado como indicador de contaminación por manipuladores. La presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en los alimentos procesados indica contaminación a partir de piel, boca o nariz de los manipuladores. La importancia de identificar este microorganismo, radica en la propiedad que tiene de liberar una toxina termoestable en los alimentos y causar intoxicaciones alimentarias; Staphylococcus aureus coagulasa positiva es el agente bacteriano que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicación alimentaria, es por esto que el manipulador de alimentos se puede convertir en una fuente de contaminación. Otros microorganismos no pertenecientes a la flora normal de la piel, pueden transferirse al alimento debido a una pobre higiene corporal, un ejemplo son los coliformes totales y fecales, provenientes del tracto gastrointestinal, específicamente de la región anal, la presencia de estos también se investiga en las manos dedos y uñas de los manipuladores e indican contaminación de origen fecal. 7

Un manipulador debe cumplir con los siguientes requisitos: 1. No presentar heridas, ni afecciones cutáneas en brazos o manos. 2. No padecer enfermedades infectocontagiosas. 3. Practicar buena higiene personal. 4. Durante su trabajo debe usar uniforme y gorro, en las áreas de envasado se hace indispensable el uso de mascarilla. 5. Recibir capacitación sobre manejo higiénico de alimentos. Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricación o preparación de alimentos, deben estar diseñados, construidos, instalados y mantenidos de tal forma que se evite la contaminación del alimento y se facilite el proceso de limpieza y desinfección de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiológico del aire (ambiente), ya que este se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar seguro de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado. 2. OBJETIVOS 1. Detectar la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en fosas nasales y zona faríngea de los manipuladores, mediante la realización de frotis y cultivos. 2. Establecer la eficacia del lavado de manos, mediante la comparación del número de UFC antes y después del lavado. 3. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales a partir de las manos, dedos y uñas de los manipuladores, mediante frotis y cultivos. 4. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en utensilios, equipos y las superficies. 5. Evaluar la contaminación del ambiente. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos A. Baird Parker / A.S.M. Colorantes Gram A. Ogy Aceite de inmersión A. Plate count Plasma fresco A. EMB Reactivo de Kovacs A. Púrpura Bromocresol Caldo BHI Caldo Brilla Caldo Indol Caldo lactosado * Algodón y alcohol al 70%

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Materiales* Escobillones estéril Baja lengua estéril Gasa estéril Portaobjetos estériles Microscopio Incubadora Baño serológico Tubo taparosca estéril Asa bacteriológica

4. PROCEDIMIENTO 4.1.

MANIPULADOR

4.1.1. Fosas nasales y Faringe 1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestra faríngea y nasal respectivamente. 2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua. 3. Frotar con un escobillón los pilares amigdalianos, realizar un frotis y sembrar en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 4. Introducir un escobillón en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las paredes, realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 5. Incubar por 24-48 horas a 37ºC. 6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar colonias negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros que contrastan con el medio (Colonias puntiformes amarillas con halos amarillos). 7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de interés y colorearlos con Gram, se deben observar cocos grampositivos agrupados en racimos. 8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusión cerebro corazón (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales y faringe. 9. Incubar por 24 horas a 37ºC. 10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml de plasma fresco, incubar a 37ºC en baño serológico por 4 horas observando cada hora la formación de coagulo. 4.1.2. Manos 4.1.2.1. 1. 2. 3. 4. 5.

Evaluación del método de desinfección

Colocar la mano del manipulador en una caja con Agar Púrpura de Bromocresol. solicitar al manipulador que lave las manos como siempre lo hace. Colocar la otra mano del manipulador en otra caja con Agar Púrpura de Bromocresol. Incubar ambas cajas a 37ºC por 24-48 horas. Observar y contar el número de UFC en las cajas de Agar Púrpura de Bromocresol, antes y después del lavado.

4.1.2.2.

Evaluación de contaminación fecal

1. Frotar un escobillón humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uñas del manipulador. 2. Introducir el escobillón dentro de un tubo que contiene caldo brilla con tubo durham.

9 3. Tapar bien el tubo. 4. Incubar a 37ºC por 24-48 horas. 5. Realizar la lectura (turbidez y producción de gas indican presencia de coliformes totales). 6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de Agar EMB. 7. Incubar a 37ºC durante 24 horas. 8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas de coliformes Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metálico). 9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubo durham) y a uno con caldo indol. 10. Incubar en baño serológico a 45ºC por 24-48 horas, asegurándose de que el nivel del agua cubra el medio de cultivo. 11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con caldo indol, para la determinación de indol. 12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la producción de indol en el caldo indol, indican la presncia de coliformes fecales). Recuerde que solo la positividad de ambos tubos, indican la presencia de Coliformes fecales. 4.2.

ESTUDIO MICROBIOLÓGICO SUPERFICIES.

A

UTENSILIOS,

EQUIPOS

Y

Procedimiento de la esponja o gasa estéril. 1. Con la ayuda de una bolsa de plástico, a manera de guante, tomar la esponja estéril, evitando posibles contaminaciones. 2. Verter unos mililitros de caldo lactosado a la esponja y muestrear el utensilio, equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda el área. 3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operación y agregar el resto del caldo lactosado. 4. Cerrar y marcar la bolsa. 5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente. 6. Incubar la bolsa con la espoja a 37ºC durante 24 horas. 7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con caldo brilla. 8. Incubar a 37ºC durante 24 a 48 horas. 9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez. 10. Continuar como en el inciso 6 del numeral 4.1.2.2. 4.3.

ESTUDIO MICROBIOLOGICO AL AMBIENTE.

4.3.1. Evaluación de la Contaminación Bacteriana. 1. Abrir una caja de Agar Plate Count por 10 minutos. 2. Cerrar la caja e incubar a 37ºC por 24-48 horas. 3. Contar y reportar el número de colonias.

10 4.3.2. Evaluación de la Contaminación Fúngica. 4. Abrir una caja de Agar Ogy por 10 minutos. 5. Cerrar la caja e incubar por 3 a 5 días a 22ºC. 6. Contar y reportar el número de microorganismos. 5. INTERPRETACIÓN Y REPORTE 5.1. Fosas nasales y zona faringea La determinación del Staphylococcus aureus en estos casos es considerada una prueba de presencia o ausencia, se reporta como prueba positiva o negativa para Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 5.2. Manos Evaluación del método de desinfección. Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos en manipuladores y se reporta la diferencia entre las UFC antes y después del lavado. Evaluación de la contaminación fecal. La determinación de coliformes totales y fecales, en este caso es una prueba de presencia o ausencia, se reporta como presencia de coliformes totales o fecales; indican que el proceso de sanitización no es el ideal o contaminación de origen fecal. 5.3. Estudio microbiológico a utensilios, equipos o superficies. La presencia de coliformes totales o fecales, indican que el proceso de limpieza y desinfección no es el adecuado o contaminación de origen fecal. 5.4. Evaluación microbiológica al ambiente. Se reporta el número de colonias, que no debe ser mayor de 10 en 10 minutos, si es mayor indica que el ambiente está contaminado y se debe repetir el proceso de desinfección o esterilización del ambiente. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.

11 4. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer:   

Fósforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 3: CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE RECUENTO EN PLACA. 1. INTRODUCCIÓN El recuento en placa es el método más utilizado y más recomendado por la Comisión Internacional sobre especificaciones Microbiológicas en los alimentos (ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificación de la población microbiana presente en los alimentos sólidos o líquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayoría de los alimentos no son estériles, sino que contienen una población microbiana, que varía ampliamente en número, dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificación, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir, presentarían un recuento tan alto que sería imposible realizar su conteo. Para eso se utilizan las diluciones logarítmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilución, que es el inverso de la dilución. La dilución inicial siempre será 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parámetros que existan, pero lo importante que se guarde la relación: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente. 2. OBJETIVOS 1. Preparar correctamente homogenizados a partir de muestras de alimentos sólidos o líquidos. 2. Realizar diluciones logarítmicas en base 10 a partir de los homogenizados. 3. Sembrar en profundidad 1ml de las diferentes diluciones con agar plate count. 4. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar correspondiente. 5. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la calidad de los controles y de las diluciones. 6. Informar el número de UFC/g ó ml de alimento. 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Plate count Agar leche Agar EMB Agar Tributirina

* Algodón y alcohol al 70%

Reactivos

Materiales* Homogenizador Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Contador de colonias Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Cajas petri estériles

4. PROCEDIMIENTO 4.4.

PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES

1. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, debe guardarse en refrigeración a 4ºC por un tiempo máximos de 24 horas. 2. Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento. 3. En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla como dilución 10-1. 4. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilución 10-2 y dilución 10-3, adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%. 5. Agitar unas 25 veces las muestras líquidas, formando un arco con el antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si el recipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra y tomar una parte representativa del producto. Para muestras sólidas pesar 10g de la muestra, tratando de tomar porciones de varias partes. 6. Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco que contiene los 90 ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta más de 10 veces, hasta homogenizar la mezcla; así se obtiene la dilución 10-1. 7. Tomar 1 ml de la dilución 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml de agua peptonada al 0.1% marcado con la dilución 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilución 10-2. 8. Tomar 1 ml de la dilución 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilución 10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Así se obtiene la dilución 10-3. 9. De esta forma se tienen las diferentes diluciones, el número de ellas va ha depender del alimento y de los parámetros que existan, pero deben sembrarse por lo menos tres (3) diluciones. (Ver figura 2 ) 4.5.

PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD.

1. Tomar 5 cajas de petri estériles y marcarlas en la tapa como dilución 10-1, 10-2, 10-3, control del diluyente y control del medio; además escribir en cada una de ellas el Nº del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y el número de la muestra. 2. Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilución 10-1 y tomar 1ml de la dilución y adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), las diluciones deben sembrarse por duplicado. 3. Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilución 10-2, tomar 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilución 10-2.

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4. Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilución 10-3, pipetear 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilución 10-3. El tiempo transcurrido entre la realización de las diluciones y la siembra en la última caja, no debe ser mayor de 20 minutos. 5. Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como control del diluyente. 6. Adicionar 15ml del agar fundido a 45ºC, a cada una de las cajas, incluyendo las cajas marcadas como control del diluyente y del medio. Según la temperatura de incubación, se obtienen los mesófilos aerobios a 37ºC, los termófilos cuando se incuban las cajas a 55ºC, los psicrófilos a 7ºC por 10 días. La temperatura elegida dependerá del objetivo que se pretenda con la realización del recuento. También dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesófilos aerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelíticos, utilizando agar leche; lipolíticos, utilizando al agar tributirina; coliformes, utilizando agar EMB o VRBD. Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio de cultivo, se pueden detectar loa mesófilos anaerobios y facultativos viables, utilizando agar cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones de anaerobiosis. a. Mesófilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC por 24 a 48 horas. b. Termófilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 55ºC por 24 a 48 horas. c. Psicrótrofos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 7ºC por 10 días. d. Proteolíticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 22ºC por 72 horas. e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.

15 7. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en dirección de las manecillas del reloj y viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obtener una distribución homogénea de la muestra en el medio de cultivo. 8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. 4.6.

PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE.

1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del alimento, fecha, dilución y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del diluyente y otra como control del medio. 4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo. 5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC (ver figura 4). 7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias. 8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilución y por 10. 5. INTERPRETACIÓN Y REPORTE 1. Sacar las cajas de la incubadora. 2. Evaluar las cajas marcadas como control del diluyente y control del medio. 3. Organizar las cajas de la dilución menor a la mayor. 4. Evaluar el crecimiento secuencial y la calidad de las diluciones, el recuento debe ser 10 veces menos a medida que aumenta la dilución. 5. Proceder al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC). 6. INFORMES DE RESULTADOS 1. Se reportan solamente dos dígitos, el primero y el segundo de izquierda a derecha, los otros dígitos deben reemplazarse por ceros. 2. No se reportan cifras decimales, sino que se redondea al mas próximo número si el tercer dígito es 5 o mayor y se quita si es menor de cinco. 3. Los recuentos estimados no se reportan para la aceptación o rechazo de un alimento, porque es útil solo como una aproximación primaria en la calidad bacteriológica de un alimento. 7. REGLAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS

1. Cajas entre 30 -300 UFC

16

Es la caja ideal (para siembras en profundidad), se cuentan las UFC y se multiplican por el inverso del factor de dilución. Ej: Dil: 10-1 >300 UFC Dil: 10-2 > 300 UFC Dil: 10-3 80 UFC -4 Dil: 10 10 UFC Resultado: 80x103 UFC /g o mL. Si las cajas se sembraron por duplicado, se promedia el valor y se multiplican por el factor de dilución. Se reporta Recuento Estándar en placa 80x103 UFC /g o mL Para siembras en superficie se recomienda escoger cajas que contengan entre 20 y 200 UFC, y para el recuento de mohos y levaduras cajas que contengan entre 20 y 100 UFC (Escobar, 1994, p 183 y 199). 2. Diluciones consecutivas entre 30-300 UFC. Se hace el recuento para cada dilución y se promedian los resultados. Ej: a) Si el conteo de una de las cajas es menos del doble del conteo de la otra caja, se informa el promedio de recuento. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC Dil: 10-2 300 UFC Dil: 10-3 38 UFC Dil: 10-4 10 UFC Resultado: 38000/30000= 1,27, lo que indica que el conteo de la dilución mayor es manos del doble de la dilución menor, entonces se reporta el promedio del recuento: (38000 + 30000)/2 = 34000 UFC ó 34x103. Se reporta Recuento Estándar en placa 34x103 UFC /g o mL b) Si el conteo de una de las cajas es el doble o más del conteo de la otra caja, se informa el recuento menor. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC Dil: 10-2 200 UFC Dil: 10-3 60 UFC Dil: 10-4 15 UFC Resultado: 60000/20000= 3, lo que indica que el conteo de la dilución mayor es mas del doble de la dilución menor, entonces se reporta la dilución menor o sea 20000UFC ó 20x103 UFC. Se reporta Recuento Estándar en placa 20x103 UFC/ g ó mL.

17 3. Ninguna caja entre 30 y 300 UFC En estos casos se elige la caja con el recuento más cercano a 300, se multiplica por el factor de dilución y se reporta como Recuento Estimado en Placa. 4. Todas las cajas tienen menos de 30 UFC. Se cuentan las colonias de la caja con menor dilución y se reporta como Recuento Estimado en placa. 5. Ninguna de las cajas presenta crecimiento. Después de estudiar los controles, evaluar que no haya presencia de sustancias inhibidoras en el medio de cultivo, se informa como menos de la dilución mas baja utilizada, menos de 101 UFC /g ó mL. o menos de 10 UFC /g ó mL ( para siembra en profundidad) y menos de 102 UFC /g ó mL o menos de 100 UFC /g ó mL ( para siembra superficial). Se reporta como Recuento Estimado en placa: 16x105 UFC/g ó mL. 7. Presencia de Spreader Es el crecimiento de un microorganismo en forma de película, la cual puede ocupar toda la caja o parte de ella. Si cubre solo la mitad contar las colonias presentes en la otra mitad y reportar como Recuento Estimado en placa. Si cubre toda la caja se tiene que repetir el recuento y reportar presencia de spreader o accidente de laboratorio. 8. INVESTIGAR 1. ¿Cómo se realiza la dilución 10-1 en los alimentos o productos donde la contaminación es esencialmente superficial? 2. ¿Cómo se realiza la dilución 10-1 en los productos grasos y que se hace cuando el contenido graso es mayor del 20%? 3. ¿Qué precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir de alimentos congelados, deshidratados o pasteurizados? 4. ¿Cuál es la importancia y utilidad del recuento en placa?

18 9. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 10. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeño Grupo 4: 100 g de pulpa de fruta o una fruta fresca Grupo 5: 100 g de chorizo. Figura No. 2 Diluciones decimales

10 g

10 ml

90 ml Agua peptona

Dilución 10-1

9 ml Agua Pept.

Dilución 10-2

1ml

1ml 9 ml Agua Pept.

Dilución 10-3

19 Figura No. 3: Siembra en Profundidad

10-1

1 ml

10-1

10-2

10-3

C.D

1 ml

1 ml

1 ml

10-2

10-3

C.D.

C.M.

15 ml

15 ml Agar 45ªC

Mezclar Y Solidificar

Incubar

Figura No. 4: Siembra en Superficie

20

10-1 10-2

10-3

C.D

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10-1

10-2

10-3

C.D.

Agar

Incubar

C.M.

21 UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 4: TECNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) 1. INTRODUCCIÓN Esta técnica sirve para estimar la población de microorganismos viables en una muestra de alimento. En contraste con el recuento estándar en placa, el NMP es un método indirecto y solo da recuentos estimados de la población microbiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata de alimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz en poblaciones bajas porque permite el análisis de muestras de tamaño mas significativo. Se usa principalmente para la determinación de coliformes, pero variando el medio de cultivo también se puede utilizar para la cuantificación de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc. La metodología de la técnica se basa en la siembra de volúmenes secuenciales de base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la diluciones decimales. El número de diluciones dependerá del grado de contaminación del alimento y/o de los estándares microbiológicos establecidos para ese producto: La relación muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio de cultivo. Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivo utilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida de la confirmación de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante o siembra por estría en EMB; el británico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercer método emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristal violeta rojo neutro bilis lactosa. La utilización del método dependerá del tratamiento a que ha sido sometido el alimento. 2. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la técnica del número más probable. 2. Sembrar muestras puras y diluidas por la técnica del NMP utilizando diversas modalidades y medio de cultivo. 3. Leer la positividad de los tubos en las tablas correspondientes. 4. Informar los resultados de la técnica del NMP. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Bilis verde brillante Coloración de gram lactosa con durham

Materiales* Homogenizador

A. EMB Agua peptona 0.1%

* Algodón y alcohol al 70%

Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo

4. PROCEDIMIENTO 4.1.

TECNICA CON 5 TUBOS PARA MUESTRAS LÍQUIDAS PURAS

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo. 2. Marcar 5 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa a doble concentración. 3. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 4. Mezclar muy bien el alimento y adicionar 10mL en cada uno de los tubos (ver figura 5). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parámetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos y buscar en la tabla No. 1, que es una tabla que se usa cuando se utilizan 5 tubos con 10mL de muestra. El resultado del NMP se obtiene en 100mL, si el resultado se tiene que expresar por mL se divide entre 100. 4.2.

TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS LÍQUIDAS PURAS.

1. Desinfectar Con alcohol al 70% toda el área de trabajo. 2. Tomar 9 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa, tres de los cuales están a doble concentración y los 6 restantes a concentración simple. 3. Marcar los tubos anteriores de la siguiente manera: con el número 10 los tres tubos que tienen doble concentración, con el número 1 tres tubos con concentración simple y con el número 0.1 los tres tubos restantes que también tienen una concentración normal o simple. 4. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 5. Mezclar muy bien el alimento y sembrar por triplicado 10mL, 1mL y 0.1 mL en cada uno de los tubos marcados respectivamente (ver figura 6). 6. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 7. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presenten estos parámetros o presente solamente uno de los dos.

23 8. Anotar los tubos positivos y confirmar la presencia del microorganismo a determinar usando pruebas complementarias. 9. Anotar los tubos que resultaron positivos en la prueba confirmatoria. 10. Buscar en la tabla No. 2, que es una tabla que se usa cuando se siembran 10mL de muestra en tres tubos, 1mL en otros tres tubos y 0.1mL de muestra en los últimos tres tubos. El resultado del NMP se da en 100mL, si el resultado se debe expresar por mL se divide entre 100. 4.3.

TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS LÍQUIDAS O SÓLIDAS.

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo. 2. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 3. Mezclar muy bien el alimento y realizar tres diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 4. Sembrar por triplicado 1mL de cada uno de las diluciones en tubos que contengan 10mL de Bilis verde brillante lactosa preparados a concentración simple (ver figura 7). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parámetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos que dieron positivo la prueba confirmatoria (Ver figura 7). 8. Buscar en la tabla No. 3, que se usa cuando se siembra por triplicado 1mL de muestra en cada una de las diluciones. El NMP se expresa por mL. 4.4.

PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS COMPLEMENTARIAS

Estas pruebas se utilizan para comprobar si realmente se ha detectado el microorganismo buscado 4.4.1. Examen microscópico directo: 1. realizar frotis a partir de los tubos positivos. 2. Colorearlos con Gram. 3. Observar los microorganismos al microscopio con objetivo de 100X. Este método no es útil ya que no permite distinguir los microorganismos muertos de los vivos. 4.4.2. Subcultivos: 1. Realizar siembras de los tubos positivos en agar selectivo (EMB, macKonkey ó Endo). 2. Incubar por 24-48 horas a 37ªC. 3. Observar el crecimiento del microorganismo buscado e informar. 24

5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN. Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g ó mL de alimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP = No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un análisis de NMP, están directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una serie de resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando un número dado de organismos están presentes en una muestra de alimentos. En caso de realizar más diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede usar la siguiente fórmula para hallar el NMP por g ó mL: (NMP de la tabla x Factor de dilución intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/g ó mL 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 3. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 4. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche cruda Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeño Grupo 4: 100 mL de jugo preparado en casa Grupo 5: 100 g de chorizo.

25

Cinta para

TABLA No. 1 TABLA DE NMP Y LÍMITES DE CONFIANZA CUANDO SE USAN 5 TUBOS CON 10 ML DE MUESTRA

NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS

0 1 2 3 4 5

NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% Mínimo Máximo

2.2 2.2 5.1 9.2 10.0 16.0

0 0.1 0.5 1.6 3.0 8.0

6.0 12.6 19.2 29.4 52.9 Infinita

TABLA No. 2 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS PURAS

NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS 10mL 1mL 0.1mL

000 001 010 100 101 110 111 120 200 201 210 211 220 221 300 301 302 310 311 312 320 321 322 330 331 332 333

NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% Mínimo Máximo

2400

0.5 0.5 0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150

9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800

26

TABLA NO. 3 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS

NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS 10-1 10-2 10-3

000 010 100 101 110 120 200 201 210 211 220 300 301 310 311 320 321 322 330 331 332 333 Fuente: MAN (1975)

NMP/g ó mL

2400

LIMITES DE CONFIANZA

99%