Guía Práctica 8 Fermentación Alcoholica

PRÁCTICA 8 DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA PARA INGENIEROS UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

PRACTICA Nº 8 FERMENTACION ALCOHOLICA CON LEVADURAS

Objetivo General •

Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentación Batch y en continuo realizada por la levadura de Sacharomyces cerevisiae (Ethanol Red).

Objetivos Específicos • • • •

Estudiar la cinética de crecimiento de un cultivo Batch con células libres Determinar y comparar los rendimientos a partir del crecimiento, el consumo de sustrato y la formación de producto, para dos fuentes de carbono (jarabe glucosado y glucosa) Evaluar los efectos de dos sustratos (glucosa y el jarabe glucosado) sobre la producción de etanol Comparar los rendimientos en formación de producto al utilizar un reactor de tanque agitado en operación batch y un reactor de lecho empacado en operación continua

Marco Teórico La variedad de materias primas usadas en la manufactura de etanol vía fermentación son clasificadas en tres tipos principalmente: azúcares, almidones y materiales celulósicos. Los azúcares (de caña de azúcar, remolacha de azúcar, melazas y frutas) pueden ser convertidos a etanol directamente. Los almidones (de maíz, yuca, papas y raíces de plantas) deben ser primero hidrolizados a azúcares fermentables por tratamiento con ácidos o por la acción de enzimas. La celulosa (de madera, residuos agroindustriales, desechos de licor de sulfito de pulpa de las industrias de papel) debe ser igualmente convertida a azúcares fermentables, por la acción de ácidos o de enzimas. Una vez los azúcares simples son formados, los microorganismos pueden rápidamente fermentarlos a etanol. La fermentación de etanol es un proceso metabólico de carácter anaeróbico en el cual los azúcares simples (glucosa, sacarosa, xilosa, etc.) son parcialmente oxidados a compuestos como etanol y CO2. En este proceso los compuestos intermedios actúan como aceptores finales de electrones. La Fermentación alcohólica de define como el proceso bioquímico por el cual las levaduras transforman los azúcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la fermentación se realice de manera eficiente, el mosto debe hallarse en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se

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consiguen 1g de levadura por cada 4g de azúcar consumidos, pero los productos obtenidos son muy poco etanol, agua y CO2. En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentación; es decir degradan los azúcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energía. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por cada 100g de azúcares consumidos. Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la producción de etanol. Saccharomyces cerevisiae es la levadura más comúnmente utilizada. El Etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es crítica para obtener rendimientos altos En la actualidad, ha surgido un interés creciente en la inmovilización de células para la producción de alcohol, debido principalmente a las numerosas ventajas que ofrece. La inmovilización celular permite el aumento en la productividad, la factibilidad del proceso en continuo, la estabilidad celular y los bajos costos de recuperación y reciclo en los procesos de separación. Sin embargo, su implementación en los procesos industriales es aun limitada y su aplicación dependerá de los futuros desarrollos en los procedimientos de inmovilización que puedan ser fácilmente escalables. Una de las tecnologías contemporáneas que son más promisorias para la fermentación de etanol, es la fermentación en continuo usando células de levaduras inmovilizadas. Los sistemas de fermentación en continuo con células inmovilizadas aunque inicialmente exitosos, fueron condenados a fallar por varias razones. Estas incluyen problemas de ingeniería (como biomasa en exceso, problemas con la remoción de CO2, optimización de las condiciones de operación, obstrucciones y generación de canales de flujo en el biorreactor), inalcanzables costos (en los precios de los soportes) y desventajas (en operación inestable y procesos complejos). Sin embargo, recientes desarrollos en el diseño de biorreactores y la comprensión de la fisiología de las células inmovilizadas, junto con la aplicación de materiales de soporte novedosos, proporcionan un nuevo estímulo en la investigación y la aplicación de esta promisoria tecnología. La mayor parte del etanol es producido mediante fermentaciones por lotes. La concentración de sustrato al inicio del proceso es de 15-25% (p/v) y el pH se ajusta a un valor de 4-5 para disminuir los riesgos de infección. El proceso se lleva a cabo a 30-35ºC. Generalmente el rendimiento es del 90% del máximo teórico. El resto de sustrato es convertido en biomasa y otros metabolitos. La concentración de etanol al término de la fermentación es de 80-100 g/L. En la mayoría de las destilerías, el tiempo de fermentación es de 24 horas, aumentándose 6 horas para la sedimentación de las levaduras en los tanques. Los procesos por lotes tienen mayores costos del biorreactor, mayores requerimientos de mantenimiento y operación, bajo control del proceso y menores productividades que los procesos continuos. Sin embargo, a nivel industrial, aunque la productividad es importante, es más relevante la conversión de sustrato considerando que la mayor parte de los costos de producción corresponden a la materia prima.

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Factores que influyen en la fermentación alcohólica. Existen factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso de la fermentación alcohólica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentación. Los más relevantes son los siguientes: Temperatura: A mayor temperatura la fermentación transcurre más rápidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y más cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30°C tienen su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de 35°C la actividad disminuye rápidamente y mueren antes de 45°C. Oxigeno: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico, las levaduras mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxígeno disuelto en el mosto. Nutrientes: Los azúcares son fuente de energía para las levaduras. PROCEDIMIENTO INMOVILIZACION DE CELULAS DE LEVADURA (Este procedimiento es previamente realizado por los monitores del laboratorio) 1. Preparación de inoculo Activar la levadura S. cerevisiae (Ethanol Red), incubándola en medio de cultivo (Tabla 1) a una concentración de 3 g/L, a 30ºC y 150 rpm por 30 minutos. Tabla 1. Medio de cultivo Componente Cantidad por litro Fuente de carbono 50.0 g KH2PO4 2.0 g (NH4)2SO4 3.0 g MgSO4· 7 H2O 1.0 g Extracto de Levadura 4.0 g Peptona Universal 3.6 g Agua destilada 1.0 L Realizar centrifugación (10 minutos a 5000 rpm) para obtener la biomasa para la inmovilización. 2. Soluciones para la inmovilización Para realizar la inmovilización de las células de S. cerevisiae se emplean soluciones estériles de: 200 ml de solución isotónica al 0.9% (p/v) (solución acuosa de NaCl) 200 ml de solución acuosa de alginato de sodio al 3% (p/v) 400 ml de solución acuosa de CaCl2 al 2% (p/v)

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3. Materiales para la inmovilización Jeringa estéril de 5-10 ml 4. Inmovilización de células de S. cerevisiae en alginato de sodio como membrana porosa Después de tener una cantidad suficiente de células para inmovilizar, se descarta el sobrenadante del medio de cultivo en el que han crecido. Las células que quedan se centrifugan para obtener la biomasa libres de medio de cultivo y se re suspende en una solución de NaCl al 0.9% estéril (solución isotónica). La inmovilización se realiza mezclando una suspensión de levaduras al 1% en 25 ml de solución isotónica estéril con una solución estéril al 3 % de Alginato de sodio. Se hace gotear esta mezcla con una jeringa estéril (sin aguja) sobre una solución previamente esterilizada de CaCl2 al 2 %. Con una altura de goteo de 1-3 cm se pueden obtener esferas homogéneas de menos de 0.5 cm de diámetro. FERMENTACION ALCOHOLICA EN MODO BATCH Y CONTINUO REACTIVOS • Agua destilada • 3 gr de Levadura Saccharomyces cerevisiae Ethanol RED MATERIALES Y EQUIPOS • 1 baño de maría • Centrifuga y accesorios • 2 Beakers estériles de 400 mL • 2 Erlenmeyer estériles de 500 mL Medio de cultivo para realización de las fermentaciones Para las fermentaciones se empleó el siguiente medio (valores por litro): 50g o 30 g de azúcares totales reductores (ATR) (glucosa o jarabe glucosado de almidón de maíz), 1g de MgSO4.7H2O, 2g de KH2PO4, 3g de (NH4)2SO4, 4g de extracto de levadura y 3,6g de peptona. Se ajusta pH a 5 y se esteriliza durante 15 minutos a 15 psi (121ºC). Montaje para el cultivo en Batch. Esterilizar dos erlenmeyers de 500 mL, para las fermentaciones. Esterilizar el medio de cultivo y realizar el montaje en Batch en erlenmeyers de 500 mL con un volumen de fermentación de 400 mL, se adiciona 380 mL de medio de cultivo y 20 mL de biomasa libre de levadura. Incubar los erlenmeyers a 30ºC y 150 rpm durante 8 - 10 horas. Fermentación 1: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentración: 50 g/L

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Fermentación 2: Fuente de carbono: Glucosa Concentración: 50 g/L Fermentación 3: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentración: 30 g/L Fermentación 4: Fuente de carbono: Glucosa Concentración: 30 g/L Montaje para la determinación de etanol La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO2 liberado durante la fermentación, apoyados en la relación estequiométrica:

La cantidad de CO2 que se libera no sólo proviene de la reacción de fermentación sino también de la reproducción del microorganismo gracias al oxígeno disponible inicialmente en el reactor. Debido a que la cantidad de oxígeno es relativamente baja comparada con la cantidad de azúcares presentes en el medio, puede suponerse que la liberación de CO2 es proporcional a la concentración de alcohol en el medio. Así, tras una medición en el cambio de peso en intervalos sucesivos durante el proceso fermentativo, se puede establecer el perfil de concentración de etanol en el medio como una función del tiempo. El equipo utilizado para tal fin, “fermentómetro”, consiste en un sistema de vidrio que es conectado al reactor por medio de un tapón que evita el intercambio de aire con los alrededores. Este dispositivo se llena con una cantidad de agua para evitar el ingreso de otras sustancias hacia el medio de fermentación y permitir sólo el escape de CO2 al ambiente. Además, luego de consumirse la cantidad de oxígeno disponible en el medio durante el crecimiento del microorganismo, se garantizan condiciones anaeróbicas favorables para la producción de etanol. Figura 1. Fermentómetro (Trampa de agua)

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Mediante la relación estequiométrica de la reacción de fermentación se sabe que por cada mol de CO2 (44,01g) que se libera, se produce 1 mol de etanol (46,07g); lo que permite determinar la cantidad de etanol equivalente (g/L), conociendo el volumen de líquido en el interior del reactor, así:

Donde:

Concentración de etanol equivalente en el reactor en g/L Cantidad en gramos de CO2 liberado Volumen de líquido en el reactor en litros Figura 2. Montaje de fermentometro con reactor para fermentación alcohólica

Fermentación 1: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentración: 50 g/L Fermentación 2: Fuente de carbono: Glucosa Concentración: 50 g/L Fermentación 3: Fuente de carbono: Jarabe Glucosado Concentración: 30 g/L Fermentación 4: Fuente de carbono: Glucosa Concentración: 30 g/L Toma de muestra Se debe tomar muestra cada hora, en los cuales se realizará el siguiente procedimiento: 1. Tomar el cultivo del agitador y llevarlo a la cámara de flujo laminar. 2. Tomar dos muestras de 1 ml cada una con una micro pipeta. 3. Tomar una de la muestras y medir absorbancia a 600 nm para determinar concentración de biomasa (Esta absorbancia se relaciona con la concentración de biomasa según la Figura 1).

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Figura 1. Curva estándar biomasa Con la otra muestra (previa centrifugación) realizar la dilución pertinente y realizarle el procedimiento descrito en el Anexo 1 para determinar la cantidad de azucares reductores. Concentración (g/L) = 0,5948*Absorbancia + 0,0708 5. Al montaje del fermentometro se le registra el peso, con el fin de determinar la cantidad de CO2 producido 4.

Fermentación en Biorreactor Esterilizar el biorreactor de 250 mL, realizar las conexiones de las mangueras para la alimentación y la descarga del medio desgastado y sellar con algodón y aluminio para la esterilización del equipo completo. Después de esterilizar el medio de cultivo y el biorreactor, en la cámara de flujo llenar hasta un 70% del volumen total del reactor con las esferas de levadura inmovilizada. Llenar la columna con el medio de cultivo preparado y mantener durante 8 – 12 horas el proceso en batch, operar el reactor a 30 °C y tomar muestra de 2mL al inicio (tiempo 0, correspondiente al lunes 5:00 pm) del proceso de fermentación y al final (tiempo 6, correspondiente al martes 6:00 am), para realizar análisis de azúcar y determinación de la concentración de etanol. Luego del tiempo 6, poner el reactor en funcionamiento en continuo a una caudal de alimentación de 0.83 mL/min. Hacer seguimiento tomando 2 ml de muestra cada 90 minutos en el puerto de salida para realizar análisis de azúcar y determinación de la concentración de etanol. Nota: La fuente de carbono utilizada será jarabe glucosado.

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ANÁLISIS DE RESULTADOS Para cada conjunto de datos: 1. Grafique el comportamiento en el tiempo de la concentración de sustrato, biomasa y producto. 2. Identifique cada una de las etapas de la curva de crecimiento. 3. Halle: a. Rendimientos de producto y de biomasa. b. Productividad volumétrica. c. Porcentaje de rendimiento con relación al teórico. (C12H22O11+ 4 Pi + 4 ADP+H2O→ 4 CH3-CH2OH + 4CO2 + 4ATP) 4. Compare los resultados obtenidos en las fermentaciones hechas con los datos reportados. Determine posibles causas de error. 5. A partir de los objetivos planteados, cuáles son sus conclusiones?

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ANEXO 1 Procedimiento para determinar el % de azúcares reductores utilizando DNS Reactivos: • • • • •

Ácido 3-5 dinitrosalicílico DNS Tartrato de sodio y potasio tetra hidratado Hidróxido de sodio Agua destilada Hidróxido de potasio

Procedimiento 1. Preparación del reactivo DNS a. En un vaso de precipitado de 200 ml disolver 1,6g de NaOH con 50ml de agua destilada. b. A la solución anterior adicionar 43,8g de tartrato de sodio y potasio tetra hidratado, y disolver perfectamente. c. Adicionar 1g de DNS lentamente agitando hasta disolución total. Esta etapa debe realizarse protegida de la luz. d. Completar a 100ml con agua destilada y guardar en botella ámbar en la oscuridad. e. Se puede utilizar después de 24 horas. Determinación de Glucosa Curva patrón glucosa a. Preparar 100 ml del medio de cultivo sin jarabe glucosado y esterilizarlo en autoclave b. Adicionar 0.1 g de glucosa al medio estéril para obtener una concentración de 1g/l (Stock 1) c. Realizar disoluciones con agua destilada en tubos de ensayo como se ve en la siguiente tabla: 1 0,75 0,5 0,25 0,125 0 Conc. g/l 1 0,75 0,5 0,25 0,125 0 Stock(ml) 0 0,25 0,5 0,75 0,875 1 Agua(ml) d. e. f. g.

Tomar 0,5 ml y adicionar 0,5ml de reactivo DNS. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en baño a ebullición por 5 minutos. Pasar los tubos a un baño de hielo, dejarlo por 5 minutos. Adicionar 5 ml de agua destilada a cada tubo y leer Absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.

Para analizar las muestras problema, seguir el procedimiento anterior desde el literal d., a partir de la muestra centrifugada (5min a 5000 rpm) y diluida, según sea necesario.

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PROGRAMACION PARA MONTAJES Y TOMAS DE MUESTRA LUNES27 DE FEBRERO (2:00 p.m.) Montaje de Biorreactor Tubular, toma de muestra inicial y análisis de muestra 1. 2. 3. 4.

David Ocampo Marcela Zuleta Daniel Hoyos - Laura Elizabeth Gaviria

MARTES 28 DE FEBRERO (8:00 a.m.) 1. Montaje de Inoculo y 4 fermentaciones A. Fermentación 1. Angélica Alzate – Sara Castro B. Fermentación 2. Jaime Arango – Lorena Santa C. Fermentación 3. Daniel Hoyos - Laura D. Fermentación 4. Elizabeth Gaviria 2. Puesta en marcha del continuo y toma de muestra • • 3. Toma de muestra cada 90 minutos y análisis de muestra Hora toma de muestra 10:00 am

11:30 am

1:00 pm

2:30 pm

4:00 pm

Responsables A. Juliana Henao B. Luis Javier C. Carolina Ramirez D. Wilmer Tubular A. David Ocampo B. Santiago Vasquez C. Juan Camilo Tangarife D. Jorge Luis Tubular A. Elizabeth Niño B. Julio C. Maria Isabel D. Erika Tubular A. Juan Guevara B. Karol Yepes C. Leandro Mauricio D. Ana Maria Tubular A. Juan Guevara B. Lucia Velasco C. Juan Daniel

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5:30 pm

8:00 am

9:30 am

D. Marcela Tubular A. Edison Vargas B. Marcela Olarte C. Melissa D. María Claudia - Alvaro Tubular A. Silvana B. Natalia Ballesteros C. Diego Perez D. A. Ana Maria Palacio B. Paula Giraldo C. Camilo D. Ana Maria