Guía Práctica 1 de Bioprocesos

FUNDACION UNIVERSIDAD DE AMÉRICA Asignatura: BIOPROCESOS GUÍA DE LABORATORIO PRÁCTICA No. 01: DETERMINACION DE LOS COEFICIENTES DE RENDIMIENTO DE PRODUCTOS Y REACTIVOS EN UN CULTIVO BATCH DE Saccharomyces cerevisiae. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: Determinar los coeficientes de rendimiento de los compuestos que intervienen en la fermentación batch mediante el uso de técnicas experimentales y teóricas. INTRODUCCIÓN La fermentación involucra el crecimiento de los microorganismos en un sustrato orgánico. Los productos de fermentación incluyen, los microorganismos, también como los productos orgánicos reducidos y oxidados. Los azúcares son un buen sustrato para que los microorganismos puedan crecer, ya que a partir de estos, se producen dichos compuestos orgánicos oxidados y reducidos. Los productos de fermentación varían de acuerdo al tipo de microorganismo, tipo de sustrato, y factores ambientales, tales como el pH y la temperatura. La fermentación acido láctica y alcohólica son dos rutas metabólicas comúnmente usadas por las células, para metabolizar azúcares. Las levaduras en mayor proporción la ruta de la fermentación alcohólica (en condiciones anaeróbicas). Una hexosa produce dos moles de CO 2 y dos moles de etanol por gramo de azúcar (glucosa) utilizada. El rendimiento teórico de etanol es 51,1% en peso. El proceso genera dos moléculas de ATP por molécula de azúcar utilizada, el cual puede ser considerado como energía para los microorganismos. Algunos microorganismos, usan el oxígeno molecular, en su metabolismo y crecen aeróbicamente. Este proceso es conocido como respiración. La respiración es mucho más eficiente que el proceso de fermentación anaeróbico, ya que produce 38 moles de ATP por mol de azúcar utilizado. Saccharomyces cereviciae es capaz de crecer ya sea con presencia de oxígeno o sin presencia de este compuesto (Facultativo). Si hay suficiente O 2 disponible, la levadura, preferirá el uso de la ruta metabólica de la respiración (ácidos tricarboxílicos), reduciendo el consumo de azúcares y la producción de etanol. Sin embargo hay una mayor generación de biomasa por unidad de azúcar consumido.

REQUERIMIENTOS Equipos         

pH-metro (2) Espectrofotómetro (con sus respectivas celdas) Balanza analítica (2) Balanza 300 gr a 3 kg (1) Plancha de calentamiento y agitación (2) con 2 agitadores magnéticos Baño Termostatado (1) Centrifuga (1) Shaker o agitador mecánico (1) Microscopio(1)

Reactivos              

Agua destilada NH3 MgSO4*7H2O CaCl2*2H2O K2HPO4 Glucosa Levadura Fresca (estudiantes) Solución de DNS: Acido Dinitrosalicílico 10 g; Sulfito de sodio 0,5 g; Hidroxido de Sodio 0,5g; llevar a un litro. Solución al 40% de tartrato mixto de potasio y sodio KNaC4H4O6·4H2O. Solución del glucosa (15 g/l) Reactivos tinción de gram(lugol, cristal violeta, acetona, safranina) Aceite de inmersión 2 litros solución medio de cultivo: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l y Glucosa 10 g/l. Ajustar pH de la solución a 5. 2 litros solución medio de cultivo: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l y Glucosa 15 g/l. Ajustar pH de la solución a 5.

Materiales 

Gasa (estudiantes)

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Algodón Erlenmeyer de 100 ml (2) Probeta de 100 ml (1) Tijeras (estudiante) AgitadoresMagnéticos (1) Guantes de carnaza Espátulas (1) Vidrios de Reloj (2) Papel o toallas para secar Tubos falcon (4) Micropipetas y puntas 2 Pipetas 10 ml (2) Tubos de ensayo de 20 ml con tapa rosca (5) Vaso de precipitado de 500 ml (2) Tubos de ensayo de 10 ml (6) Porta objetos Mecheros (1) Pipeteador (pera) (1) Pipetas pasteur Microespatulas (1) Gradilla (1)

Las cantidades señaladas frente a cada uno materiales se entienden para un grupo. Trabajarán 4 grupos por práctica. PROCEDIMIENTO Preparación del medio de cultivo. Prepare con la ayuda de una probeta de 100 ml, dossoluciones de 75 ml de medio de cultivo que contenga cada una los siguientes compuestos: NH 3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l. La glucosa se evaluará a dos concentraciones 10 y 15 g/l (de acuerdo al diseño del experimento consultar con el profesor el ensayo que le corresponde).Para tapar cada uno de los frascos haga tapones con la ayuda de gasa y algodón. Mida el pH de la solución y ajuste para dejarlo en un valor de 5. Una vez obtenido los medios (con su respectiva fuente de carbono), esterilizar cada uno en auto clave a 121 °C, 15 psi por 15 minutos. Si no se cuenta con autoclave, disminuya la carga bacteriana calentando el medio hasta ebullición dejando los medios a esa temperatura por 5 minutos. Dejar enfriar los medios a temperatura ambiente. Inoculación

Inocule de acuerdo al diseño del experimento, cada uno de los frascos (consulte con el profesor el ensayo que le corresponde) en una proporción de 0,5 g/l y 1 g/l de levadura. Activar en baño de maría a 38 °C por 20 minutos. Después de esto, secar los frascos. Muestreo y Ensayos Para determinar la concentración inicial de biomasa y glucosa, sacar una muestra de cada uno de los frascos. Para la biomasa tomar 10 ml de muestra, colocarla en un tubo falcon (previamente pesado) y centrifugar a 9000 rpm por 6 minutos. Descartar el sobrenadante y pesar nuevamente. El peso de la biomasa (base húmeda) es la diferencia entre el tubo con el sedimento menos el tubo vacío. Se debe determinar teóricamente el peso seco de la biomasa tomando como base el peso en base húmeda. Para determinar el contenido de glucosa, tomar 3 ml de muestra y 3 ml del reactivo DNS, mezclar. Calentar la muestra (tubos de ensayo con muestra y DNS) en agua hirviendo por 8 minutos. Después, agregar 1 ml de la solución de tartrato mixto de sodio y potasio (Sal de Rochelle). Una vez agregada la solución de Rochelle, dejar enfriar en un baño de agua fría y registrar la absorbancia con el espectrofotómetro a 575 nm. Utilizar antes de la medición, como blanco (cero), agua destilada. Si la absorbancia de la muestra, registra un valor mayor a 0,6; diluir la muestra 5 o 10 veces, de acuerdo a la intensidad del color. Tener en cuenta el factor de dilución en el cálculo de la concentración de la glucosa (factor de dilución = Volumen final/volumen de tomado de la muestra). Se debe multiplicar el factor de dilución a la concentración de glucosa determinada, para hallar el valor real. Utilizar la curva de calibración (correlación concentración de glucosa vs absorbancia) para determinar la concentración del azúcar. Una vez, extraídas lasmuestras iniciales, registrar el peso de cada uno de los medios de cultivo. Esto con el fin de poder calcular la producción de CO 2, mediante la pérdida de peso del medio. Ya que este compuesto sale en forma de gas. Antes de sacar las muestras finales, Agitar vigorosamente y registrar el peso del medio de cultivo. La diferencia de peso al inicio y al final, será la cantidad de CO2 desprendido o producido por la levadura. El medio de cultivo se deja en fermentación durante 3 días. Una vez cumplido este tiempo, pesar el medio para determinar la pérdida de peso, y después sacar las muestras para determinar el contenido de glucosa y biomasa, como se estableció anteriormente. Curva de calibración de glucosa Para la curva de calibración de la glucosa tomar de la solución madre (15 g/l de glucosa) las siguientes alícuotas:

1. 6 ml de la solución concentrada y agregarle 3 ml de agua destilada (10 g/l). 2. 3 ml de la solución concentrada y agregarle 6 ml de agua destilada (5 g/l). 3. 1 ml de la solución concentrada y agregarle 9 ml de agua destilada (1,5 g/l). Una vez preparadas las soluciones, aplicar el procedimiento de determinación de glucosa mediante DNS. Si la lectura sobrepasa el valor de 0,6 diluir y medir nuevamente. No olvidar tener en cuenta al factor de dilución, en el cálculo de las concentraciones.

TALLER (ANTES DE LA PRACTICA)          

Explique el procedimiento que se va a realizar en la práctica mediante un diagrama de flujo Cuál es el fin de esterilizar los medios de cultivos? Cuando una sustancia no se puede esterilizar por medio de calor, que otros mecanismos existen? Defina que es un inóculo. Cuál es el fin de crear un inóculo? Que es un Azúcar Reductor? Cuál es el mecanismo de acción de la solución de DNS en la identificación de azúcares reductores? Explique el mecanismo de identificación de sustancias por medio de espectrofotometría Que otras técnicas experimentales existen para la determinación de azúcares? explique 3 de ellas brevemente. Cómo se elabora una curva de calibración y cuál es su función?, muestre un ejemplo.