Guía Para Validación de Métodos Analíticos-CNQFB 2002
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Descripción: Validación de métodos analíticos para farmaceutica...
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otEGlb'NAGí"tiiAroV QUIMICOS FARMACEUTICOS DIOLOGOS MEXlCO, A.C.
Con Registro ante la DGP F-032
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FE DE ERRATAS Guía de validación de métodos analíticos 1a. Edición Mayo de 2002 1.- Para informar que en la página 37 después del primer párrafo falto incluir la siguiente ecuación a la que se hace referencia
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COMISION DE VALIDACION DE MElODOS ANALITICOS
Ma. Araceli García Evelyn Soberón Myriam Cortés Ramón Rodríguez , José Luis Herrera Alej an dro Alcántara lAMBIEN COLABORARON: Amparo Chárvel Rosalinda Mota Alfredo Garzón
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DE
VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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LA VALIDACiÓN DE MÉTODOS ANALíTICOS es parte fundamental del desarrollo de una nueva formulación y de la técnica de análisis de control de calidad de una forma farmacéutica, ya que es durante esta secuencia de pruebas y análisis, en donde el químico se da cuenta si el estudio, el cual esta siendo evaluado sistemáticamente, cumple con los propósitos para los cuales fue diseñado. De acuerdo a las Buenas Prácticas tanto de Fabricación como de Laboratorio, es necesario que todos los métodos analíticos que empleamos estén validados.
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Bajo este marco y considerando a la validación de métodos analíticos como el proceso por el cual queda establecido, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para las aplicaciones analíticas deseadas, el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México,. A.C. ve con agrado, como uno de sus primeros frutos editoriales, sigue siendo hoy una herramienta útil para el entorno laboral analítico en la industria farmacéutica. Sin embargo, considerando tanto el avance científico y tecnológico de los últimos años, como los valores que nos rigen y nuestra búsqueda constante de la excelencia, han hecho posible nuevamente que presentemos ante ustedes esta versión actualizada de la Guía de Validación de Métodos Analíticos, de manera tal, que satisfaga sus necesidades laborales presentes al día de hoy. El propósito principal es unificar criterios entre los profesionistas y hacer más fácil y productivo el trabajo de todos los que de alguna manera, estamos involucrados en este tipo de actividades. No me resta más que recomendarles ampliamente este trabajo, realizado por un grupo de expertos en el área, quienes de manera honorífica han decidido colaborar y retribuir a su gremio a través de esta publicación. Sin duda alguna, nuestra institución les esta enormemente agradecida por sus valiosas aportaciones. Al día de hoy y ante las perspectivas mundiales, las exigencias de competitividad son muchas, debemos estar preparados para ello, las cuestiones regulatorias y de armonización nos obligan a empatar nuestros conocimientos, en este caso, analíticos en pro de un resultado de calidad. Sirva pues, esta guía para tal objetivo. Atentamente, "Por la Unidad y la Excelencia"
Q.:J'B. José 9vfanuef Cárdenas Presidente Colegio Nacional de Ouimicos Farmacéuticos Biólogos México. A.C. PRÓLOGO
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
PRESEN-.:nCIDN
Colegas:
En el IX Congreso Nacionalde Educación Farmacéutica del año 2000 organizado por el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos AC en la Universidad de Colima, asistí a la ponencia de la colega Amparo Chárvel
Gaos que verso sobre Validación de Métodos Analíticos; donde se planteó la necesidad de revisar la Guía, debido entre otras, a la inquietud de muchos de nuestros colegas en su actualización y a las publicaciones de otros lineamientos y guías en años recientes. Debido a esta propuesta, José Manuel Cárdenas
presidente del colegio me invito a participar en la actualización de la guía y para ello, se formo una comisión especial de Validación de Métodos Analíticos. Gracias al trabajo de varios colegas y a los comentarios vertidos en diversos foros organizados por el colegio; se dio lugar a esta publicación, la cual presentamos
a nuestro gremio para facilitar esta actividad. Es importante resaltar el trabajo de los colegas que participaron en
la elaboración de la guía anterior, ya que no habría sido posible este hecho; así como agradecer a los colegas que colaboraron en la actualización de la guía, por su tiempo, conocimientos, experiencia, esfuerzo y trabajo orientado al beneficio de nuestra comunidad gremial.
Presidente de la Comisión Especial de Validación de .Métodos Analiticos
PRESENTACION
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
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1.
Prólogo (Introducción).
2
2.
Objetivo y campo de aplicación.
4
3.
Justificación.
4
4.
Definiciones.
8
5.
Símbolos y Abreviaturas.
5
6.
Clasificación de Métodos Analíticos
17
7.
Parámetros de Desempeño.
19
8.
Determinaciones, metodología y criterios de aceptación
20
9.
Sustancias de referencia.
40
10. Revalidación
44
11. Comparación de 2 Métodos Analíticos
44
12. Documentación
51
13. Concordancia con Guías Internacionales.
52
14. Bibliografía
53
15. Anexos
55
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VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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EN MUCHAS SITUACIONES, cuando se tiene interés en medir un
componente en una muestra, es necesario contar con una metodología de medición (método analítico). Por ello, las empresas de transformación (principalmente farmacéuticas) requieren de este tipo de metodologías, pudiendo utilizar metodologías farmacopeicas o bien, dedicar tiempo para su desarrollo, partiendo del hecho de que deben cumplir el atributo de confiabilidad. Como en muchas de las actividades de la industria farmacéutica se hace uso del método científico para alcanzar este atributo, es necesario llevar a cabo en la mayoría de las ocasiones estudios experimentales que permitan demostrar la confiabilidad de lo que se está midiendo. Un proceso que permite cumplir este fin, es la validación. Como es bien sabido, todo producto farmacéutico debe reunir atributos de identidad, pureza, concentración, potencia, inocuidad y disponibilidad para cumplir con los aspectos normativos oficiales e internos y no menos importantes, los éticos, por lo que si un método analítico, que finalmente es el medidor de las
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características críticas de calidad del producto, no es confiable, se corre el grave riesgo de afectar al usuario final que es un paciente. Desde este enfoque, la validación de métodos analíticos es un sistema involucrado en los procesos de fabricación en el área de calidad de la empresa y bajo la filosofía de la Validación, las Autoridades Regulatorias verifican que las empresas sustenten estos sistemas con actividades documentadas, como se indica en la NOM-059 SSA1 numerales 5.6.3, 5.7.4, 9.11.3, 9.11.5 Y 9.12.3 Y en otros
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regulatorios internacionales.
El objetivo final de un dictamen de calidad, es la liberación o no liberación de un producto sobre la base de las especificaciones previamente establecidas. Esta decisión es tomada generalmente por el profesional farmacéutico, en gran medida está dada por los resultados obtenidos al aplicar uno o diversos métodos analíticos; si estos no son farmacopeicos y no están I
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validados, su decisión corre el riesgo de ser errónea y afectar al usuario del
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INTRODUCCiÓN
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GUiA
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VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
producto y por ende, a la misma empresa. La validación le proporciona, a quien aplica la metodología, una seguridad de la confiabilidad de dichos métodos y puede tomar la decisión final con certeza. La validación de métodos analíticos también impacta en otras áreas relacionadas a la' calidad de un producto (estabilidad, limpieza de equipos, entre otras). Hasta este momento, las empresas que han implantado esta actividad inicialmente se orientaron con la Guía de Validación de Métodos Analíticos publicada por el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos - México, A.C. y avalada por la Secretaría de Salud hace más de una década. En su momento, esta Guía cubrió las necesidades que por la corriente de Validación habían empezado a surgir en la mayoría de las empresas; con el tiempo, por necesidades propias de la validación de procesos, la validación de métodos se especializó al grado de convertirse en una actividad independientemente regulada. Con los avances tecnológicos, aplicaciones de nuevas técnicas, tratamiento diferente de las muestras, etc., el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos - México, A.C., ha visualizado la necesidad de publicar una nueva edición de esta guía. No se puede pasar por alto el hecho de que el factor más importante durante la validación de todo método analítico es siempre el criterio del profesional, responsable de esta decisión, criterio que es necesario aplicar después de tomar en cuenta todos los factores relacionados con el, o los principios activos, concentraciones, forma farmacéutica, tipo de muestra, método,1e análisis, propósito de la técnica analítica, instrumentación, sustancias retaclonadas, etc., estos requisitos constituyen únicamente una guía para dar al químico un soporte técnico adecuado para resolver cada caso particular. Así mismo, no hay que perder de vista que ésta es únicamente una Guía donde se establecen los requisitos mínimos, que es necesario satisfacer con la Validación y que no limita de ninguna manera el interés que pudiera tener el profesionista para profundizar, de manera particular, en alguno o algunos de los temas involucrados. El C.N.Q.F.B. agradece de manera muy especial a todas las personas que colaboraron en la preparación, modificación y actualización de esta Guía y a la Secretaría de Salud por su apoyo y aceptación de estos Requisitos Mínimos para la Validación de Métodos Analíticos, ya que estamos seguros de que será en beneficio de la comunidad científica del país.
INTRODUCCiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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2. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACiÓN
Establecer lineamientos generales mínimos necesarios para llevar a cabo el proceso de validación de métodos analíticos en aquellos establecimientos dedicados a: a) Fábrica o laboratorio de materias primas para la elaboración de medicamentos o productos biológicos para uso humano, incluyendo fármacos; b) Fábrica o laboratorio de medicamentos o productos biológicos para uso humano; e) Laboratorio de control químico biológico, farmacéutico o de toxicología, para el estudio y experimentación de medicamentos y materias primas, con el objeto de establecer la validez de los métodos analíticos utilizados para el control analítico del producto. d) Laboratorio de control auxiliar de la regulación,
Un método analítico se define como la descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y parámetros que se deben cumplir, para llevar a cabo el análisis de un componente específico de la muestra. Un analito se define como un componente específico en una muestra a medir en un análisis; por lo que un método analítico mide un componente específico (analito) en una muestra y como todo proceso de medición, éste debe ser confiable para ser utilizado con un propósito definido. La validación de métodos analíticos es el proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad det método satisface los requisitos para la aplicacion analítica deseada; es decir cumple con su'propósito. Esta actividad puede ser justificada por los siguientes aspectos: OBJETIVO
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CAMPO
DE
APLICACiÓN
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ANALíTICOS
3.1. Moral y ética. El profesional farmacéutico es el responsable de los procesos farmacéuticos y por lo tanto de la calidad de estos. Todo producto farmacéutico (materias primas, producto intermedio, producto a granel y producto terminado) debe satisfacer requisitos y para ello se utilizan métodos para medir componentes específicos en el producto; lo cual es llevado a cabo con métodos analíticos.
3.2. Aseguramiento de Calidad. Los métodos analíticos están definidos como un sistema crítico en el Aseguramiento de Calidad en una empresa farmacéutica, ya que impactan de manera directa en la calidad de un producto.
3.3. Económica. La carrera de muchas empresas por alcanzar una productividad elevada a costos menores, está determinada, entre otros factores, al dictamen del producto en menor tiempo, utilizando métodos de prueba de menor costo, mantenimiento o tiempo de análisis entre otros.
3.4. Regulatoria. La presente guía está justificada con base en las siguientes referencias: Reglamento de Insumos para la Salud. Publicado en el Diario Oficial el4 de Febrero de 1998 referente a los establecimientos que se destinen a la fabricación de insumos (medicamentos, fármacos, materias primas y aditivos), establece lo siguiente.
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N T E N IDO
Los establecimientos que se destinen a la fabricación de insumas, llevarán el control analítico de estos. Dicho control deberá incluir: 111. La validación de las técnicas empleadas.
Norma Oficial Mexicana NOM-OS.9-SSA1-1993. Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos, establece los siguientes puntos referentes a la Validación de Métodos Analíticos. JUSTIFICACiÓN
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NUMERAL
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DE LA NORMA
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El encargado del área de producción se encargará de realizar las
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siguientes funciones, sin perjuicio de las obligaciones y responsabilidades que correspondan al responsable sanitario, conforme a la Ley General de Salud y al Reglamento de lnsumos para la Salud:
S.6.3
Que se lleven a cabo estudios de validación de los procesos de fabricación y de los sistemas involucrados.
S.7
El encargado del área de calidad se encargará de realizar las siguientes funciones, sin perjuicio de las obligaciones y responsabilidades que correspondan al responsable sanitario, conforme a la Ley General de Salud y al Reglamento de Insumos para la Salud:
S.7.4
Que se lleven a cabo estudios de validación de los procesos de fabricación y de los sistemas involucrados.
9.11.3
Los métodos analíticos deben ser validados, de acuerdo con lo establecido en el apartado 9.12 "control del laboratorio analítico".
9.12.3
Se debe contar con métodos de análisis validados para producto a granel, producto terminado y materia prima en caso de no aparecer en cualquier farmacopea internacional ni en la FEUM.
NORMA Oficial Mexicana NOM-164-SSA1-1998, Buenas prácticas de fabricación para fármacos.
NUMERAL DE LA
C O N T E N I D O
NORMA
16.1
Los controles de laboratorio e inspecciones deben apoyarse en normas, PNO's o manuales que contengan las especificaciones para garantizar la confiabilidad de sus resultados. Tales controles deben
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incluir:
16.1.S
Validación de métodos analíticos utilizados por la farmacopeicos.o farmacopeicos que tengan la farmacopea de referencia.
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JUSTIFICACiÓN
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ANALíTICOS
NORMA Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-1993, Estabilidad de medicamentos.
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NUMERAL DE LA NORMA 5.5
O N T E N IDO
Cuando se cambie el método analítico durante el estudio de estabilidad, se debe demostrar que los dos métodos son equivalentes mediante el proceso de validación.
5.10.2 5.10.2.3
Información general, especificaciones y métodos analíticos: Información de la linealidad, precisión, exactitud, reproducibilidad, repetibilidad y especificidad del método analítico indicativo de estabilidad.
6.
Fármacos Para fines de registro de un medicamento con fármacos nuevos en México, el fabricante del medicamento debe presentar ante la Secretaría de Salud estudios de estabilidad acelerada y/o a largo plazo de tres lotes del (los) fármaco(s) efectuados por el fabricante de los mismos, utilizando métodos analíticos validados.
Las regulaciones anteriores, determinan la obligación de validar métodos analíticos. Estas regulaciones podrían ser modificadas, por lo que es importante estar actualizados.
JUSTIFICACiÓN
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ANALíTICOS
4. D E F IN I e 1'0 N E S
4.1. Adecuabilidad del sistema.- Verificación de que el sistema (instrumento,
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analista, equipo, sustancia de referencia, entre otros) opera con base a criterios preestablecidos, que permitan asegurar la confiabilidad de los resultados de un método analítico.
4.2. Analito.- Componente específico de una muestra, a medir en un análisis. 4.3. Calibración.- Conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones especificadas, la relación entre los valores indicados por un instrumento o sistema de medición, o los valores representados por una medición material y los valores conocidos correspondientes a un patrón de referencia.
4.4. Documentación.- Conjunto de información que sustenta una actividad realizada.
4.5. Especificaciones.- Descripción del material, sustancia o producto, que incluye la definición de sus propiedades y características, con las tolerancias de variación de los parámetros de calidad.
4.6. Especificidad.- Capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la muestra.
4.7. Estudio colaborativo.- Reproducibilidad realizada en distintos laboratorios, por diferentes químicos.
4.8. Exactitud.- Concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el valor de referencia.
4.9. Estabilidad analítica de la muestre» Propiedad de una muestra, preparada para su cuantificación, de conservar su integridad fisicoquímica y la concentración del analito, después de almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas.
4.10.lntervalo.- Concentraciones incluidas entre la concentración superior einf~:;?,;'~fJ'S rior delanalito (incluyendo éstas), para las cuales se ha demostrado que el mét9ct~~~f~1~b~\{ analítico es preciso, exacto y lineal. . .
DEFINICIONES
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MÉTODOS
ANALíTICOS
4.11. Límite de cuantificación.- Concentración mínima del analito, que puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables, bajo las condiciones de operación establecidas.
4.12. Límite de detección.- Concentración mínima del analito en una muestra, que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de operación establecidas.
4.13. Línealidad.- Habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por medio de una transformación matemática definida. son proporcionales a la concentración del analito, dentro de un intervalo determinado.
4.14. Metodología de prueba.- Procedimiento o grupo de procedimientos, para determinar si un producto Ó materia prima cumple con las especificaciones establecidas.
4.15. Método analítico.- Descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y parámetros que se deben cumplir, para llevar a cabo el análisis de un componente específico de la muestra.
4.16. Método analítico desarrollado internamente.- Método desarrollado por el propio laboratorio.
4.17. Método analítico indicativo de estabilidad.- Método cuantitativo capaz de detectar variaciones en las propiedades del material evaluado, debidas a las condiciones de almacenaje.
4.18. Método analítico oficial.- Método que aparece en la literatura oficial reconocida. 4.19. Método analítico no oficial.- Método que no aparece en la literatura oficial reconocida.
4.20. Muestra.- Porción del material a evaluar. 4.21. Muestra analítica.- Porción del material a evaluar de acuerdo al método analítico.
4.22. Muestra adicionada.- Porción representativa del material a evaluar, a la que se le adicionan cantidades conocidas del analito.
4.23. Parámetros de desempeño.- Parámetro específico a estudiar en un protocolo de validación.
DEFINICIONES
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VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
4.24. Placebo analítico.- Muestra que contiene todos los componentes de un producto a excepción del analito. 4.25. Placebo adicionadQ.- Muestra de un placebo analítico al cual se le adiciona una cantidad conocida del analito. 4.26. Precísión.-Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra homogénea del producto o de una referencia. 4.27. Precisión intermedia.- Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia relativa obtenida entre determinaciones independientes realizadas en un mismo laboratorio, por diferentes analistas, en distintos días. 4.28. Proporcionalidad.- Relación establecida por una ecuación matemática entre los resultados obtenidos por dos métodos analíticos. 4.29. Protocolo de validación.- Descripción de pruebas específicas para demostrar que un proceso da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera consistente. 4.30. Recobro.- Cantidad del analito determinada en el placebo adicionado o muestra adicionada, empleando el método analítico. 4.31. Repetibilidad.- Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia obtenida entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, usando los mismos instrumentos y método. 4.32. Reproducibilidad.- Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia entre determinaciones independientes realizadas por diferentes laboratorios. 4.33. Revalidación.- Comprobación de que el método analítico mantiene su desempeño cuando existen cambios en la composición del producto, en el método analítico, o cambios críticos en los procesos de fabricación. 4.34. Robustez.- Capacidad del método analítico de mantener su desempeño al presentarse variaciones pequeñas pero deliberadas, en los parámetros normales de operación del método.
4.35. Sustancia de referencia.- Sustancia de uniformidad reconocida destinada a utilizarse en comprobaciones analíticas físicas, químicas o microbiológicas eR~1
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ANALíTICOS
transcurso de las cuales sus propiedades se comparan con la sustancia en evaluación.
4.36. Sustancia de referencia primaria.- Sustancia quees designada o reconocida por tener la más alta calidad metrológica, cuyas propiedades se aceptan sin referencia a otras sustancias.
4.37. Sustancia de referencia secundaria.- Sustancia cuyas propiedades se asignan por comparación con una sustancia de referencia primaria, o bien, cuando es certificada mediante un procedimiento científicamente reconocido.
4.38. To/erancia.- Reproducibilidad de los resultados analíticos obtenidos, por el análisis de la misma muestra bajo diferentes condiciones normales de operación como pueden ser: equipos, columnas. La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes, ya que el primero se refiere a la influencia de factores internos del método, mientras que la tolerancia, se refiere a factores externos al método.
4.39. Validación del método analítico.- Proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para las aplicacion analítica deseada ..
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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Cuando en esta guía se haga referencia a los siguientes símbolos o abreviaturas. se entenderá:
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Authentic Substance Pendiente. Pendiente del método 1. Pendiente del método 2. Ordenada al origen. Ordenada al origen del método 1. Ordenada al origen del método 2.
BP
British Pharmacopoeia
BPF
Buenas prácticas de fabricación.
CLAR
Cromatografía de líquidos de alta resolución.
COSUFAR
Comité de Sustancias Farmacéuticas de Referencia.
CV
Coeficiente de variación o desviación estándar relativa. Coeficiente de variación de regresión.
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ANALíTICOS
Diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de almacenaje respecto de la me dia aritmética del análisis inicial. Valor de la distribución F de
F0.975,91
Fisher asociado a una confianza del 97.5% ya grados de libertad (gl) establecidos.
F0.05,g/
Valorde la distribución F de Fisher asociado a una confianza del 5% y a grados de libertad (gl) establecidos. Valor de la distribución F de Fisher
F0.025,91
asociado a una confianza del 2.5% y agrados de libertad (gl) establecidos. FCC
Food Chemical Codex
FDA
Food and Drug Administration
FEUM
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos.
g
Gramos.
gl
Grados de libertad. Intervalo de confianza para la pendiente poblacional. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 pendientes poblacionales. Intervalo de confianza para la
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ordenada al origen poblacional Intervalo de confianza para la diferencia de 2 ordenadas al origen poblacionales.
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MÉTODOS
ANALíTICOS
Intervalo de confianza para la media poblacional. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales.
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Factor capacidad.
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Límite de cuantificación.
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Límite de detección.
LGS
Ley General de Salud.
LNSP
Laboratorio Nacional de Salud Pública.
mg
miligramos.
n
Número de mediciones o recobros o blancos o muestras o determinaciones. Número de muestras del análisis inicial
n,
Número de mediciones del método 1. Número de mediciones del método 2.
N
Número de platos teóricos.
NF
National Formulary
NIST
National Institute of Standard and Technology
NOM
Norma Oficial Mexicana.
OMS
Organización Mundial de la Salud
PNO
Procedimiento Normalizado de Operación.
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VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
ppm
Partes por millón.
R
Resolución. Coeficiente de determinación.
Rr
Retención relativa.
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Desviación estándar. Desviación estándar de los blancos. Desviación estándar de la ordenada al origen. Desviación estándar para la diferencia de 2 ordenadas al origen. Desviación estándar de la pendiente. Desviación estándar para la diferencia de 2 pendientes. Varianza. Varianza del método 1 Varianza del método 2 Varianza poblacional. Razón de 2 varianzas poblacionales.
Sref
Sustancia de Referencia
SSA
Secretaría de Salud. Desviación estándar de regresión.
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Factor coleo.
t0.975,91
Valor de la distribución t de Student asociado a una confianza del 95% y
SíMBOLOS
y
ABREVIATURAS
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GUíA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALfTICOS
a grados de libertad (gl) establecidos. USP
United States Pharmacopeia
USPC
United States Pharmacopoeia Committe
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Validación de métodos analíticos.
x
Media aritmética de x.
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Media aritmética de y. Media aritmética del método 1 Media aritmética del método 2 Media aritmética del análisis inicial. Media aritmética de cada condición
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de almacenaje. %
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Porcentaje o por ciento.
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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Para fines de esta guía los métodos se clasifican bajo los siguientes criterios:
1). En función de su estado regulatorio en: a) Métodos farmacopeicos. Todos aquellos métodos que aparecen en cualquier farmacopea (FEUM, USP, SP, Europea, etc.). b) Métodos no farmacopeicos. Aquellos métodos no compendiados en una farmacopea.
2). En función de su apllcaclén (NOM 059 SSA1 y NOM-073-SSA1) en: a) Métodos para producto a granel. b) Métodos para producto terminado. e) Métodos para materia prima. d) Métodos indicadores de estabilidad.
3). En función de la naturaleza de la respuesta analítica en: a) Métodos físico-químicos. Cuando la respuesta es de carácter físico (absorción de luz, emisión de luz, voltaje, etc.) o químico (consumo de iones -OH, consumo de un acomplejante, etc.). b) Métodos biológicos. Cuando la respuesta es de carácter biológico (crecimiento de un microorganismo, protección, muerte, etc.).
4). En función de su propósito analítico en: a) Métodos para cuantificar el analito(contenido o potencia). b) Métodos para establecer la presencia del analito a un límite. e) Métodos para identificar el analito. C
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Esta última clasificación es la que se utiliza para establecer los parámetros de desempeño a estudiar en la validación del método analítico. En el Anexo 1 se presenta una matriz de equivalencia entre esta clasificación y otros métodos con aplicaciones analíticas definidas de otra manera. Cualquier método analítico puede estar constituido por técnicas de separación, extracción, etc., y por técnicas de medición (espectrofotometría, volumetría, colorimetría, potenciometría, etc.) que permiten medir la respuesta del analito en la muestra. A esta última técnica dentro de la guía, se le denomina Sistema de Medición. 5). En funpión de la naturaleza del sistema de medición se clasifican en:
a) Métodos en los cuales el instrumento de medición de la respuesta analítica, permite medir una señal de ruido (cromatógrafo de líquidos, cromatógrafo de gases, espectrofotómetros, etc.).
b) Métodos en los cuales el instrumento de medición no permite medir una señal de ruido (buretas, medidor de halos, potenciómetros. etc.).
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VALIDACiÓN
DE"'MÉTODOS
ANALíTICOS
7.PRRÁMETROS DE DESEMPEÑO
En función de la aplicación analítica de un método, la siguiente tabla indica los parámetros de desempeño a estudiar.
PARAMETRO DE DESEMPEÑO
CONTENIDO I POTENCIAl VALORACION
PRUEBAS DE IMPUREZAS IDENTIFICACION
CONTENIDO I VALORACION
LIMITE
SI
SI
SI'
SI
SI
NO
ESPECIFICIDAD'
SP
SI
SI
SI
EXACTITUD Y REPETIBILlDAD
SI
SI
NO
NO
LINEALIDAD DEL MÉTODO
SI
SI
NO
NO
SI
SI
NO
NO
.~
PRECISiÓN / ADECUABILlDAD
*
DEL SISTEMA
LINEALIDAD DEL SISTEMA
PRECISiÓN DEL MÉTODO O PRECISiÓN INTERMEDIN
\
NO
--
ESTABILIDAD ANALlTICN DE LA MUESTRA
*
*
NO
LíMITE DE DETECCiÓN
NO
NO
SI
NO
SI
NO
NO
ROBUSTEZ
*
*
*
NO
TOLERANCIA
*
*
*
NO
LíMITE DE CUANTIFICACiÓN
NO
NO
* PUEDE SER REQUERIDO DEPENDIENDO DE LA NATURALEZA DEL MÉTODO 1. La falta de especificidad de un método analítico, puede ser compensada por otra alternativa analítica de soporte, como por ejemplo cromatografía de capa fina. 2. También es definido como un estudio de tolerancia. 3. Un método que es exacto y lineal, por definición es específico al placebo analítico o a los otros componentes de la muestra.
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DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
B.DETERMINRCIONES, METODOLOEiíR y CRITERIOS DE RCEPTRCIÓN
8.1. Precisión del Sistema.
8.1.1. Metodología.- Un analista debe preparar por lo menos un sextuplicado de soluciones a la concentración del analito que represente la concentración de la solución de referencia utilizada, o en ciertos casos, la concentración que represente el 100% de la muestra procesada para su medición; preparadas por dilución o por pesadas independientes. Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones. Calcular, S Y CV de la respuesta analítica. Para los sistemas biológicos, se deben cumplir los criterios de validez inherentes al diseño del bioensayo.
8.1.2. Criterio de Aceptación: CV~ 1.5% para métodos físico - químicos.
CV ~ 3% para métodos biológicos. Valores superiores deben ser justificados. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, Se describen en el Anexo 2.
8.2. Adecuabilidad del Sistema (Métodos Cromatográficos)
8.2.1. Metodología.- Inyectar por quintuplicado la solución de adecuabilidad. Reportar la respuesta del analito, calcular el CV y para cada inyección informar cuando proceda:
DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
20
GUíA
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VALI[)ACIÓN
[)E
MÉTO[)OS
ANALíTICOS
factor capacidad (K'). resolución (si procede, R). retención relativa (si procede, Rr). factor de coleo (T). número de platos teóricos (N). 8.2.2. Criterios de Aceptación.CV ~ 2% para la respuesta analítica. Valores superiores deben ser justificados. Para cada inyección se recomienda:
K'
>2.~
R> 2. T y ordenada al origen (b o1 y b o, ) de Ia relación cantidad adicionada -cantidad recuperada, así como la media aritmética (Y1 Y Y2) Y varianza (S21 y S22) del porcentaje de recobro.
11.1.5.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la diferencia de las pendiente de cantidad adicionadacantidad recuperada debe incluir el valor de cero. El intervalo de confianza para la diferencia de las ordenadas al origen de cantidad adicionada-cantidad recuperada debe incluir el valor de cero. El intervalo de confianza para la diferencia de las medias poblacionales del porcentaje de recobro, debe incluir el valor de cero. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. El análisis estadístico de los resultados del porcentaje de recobro, presenta 2 situaciones: a) Los métodos tienen la misma repetibilidad (varianzas iguales) b) Los métodos tienen diferente repetibilidad (varianzas diferentes) por lo tanto para llevar a cabo el análisis es necesario realizar el estudio de comparación de repetibilidad de ambos métodos. (11.1.3) Las fórmulas y el procedimiento de cálculos con un ejemplo para la situación de
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MÉTODOS
ANALíTICOS
igual repetibilidad, se describen en el Anexo 16. Para el caso de diferente repetibilidad, con base en el porcentaje de recobro se describe en el anexo 15.
11.1.6. Precisión del Método. 11.1.6.1. Metodología: De los datos de precisión del método, utilizar la información del contenido / potencia / valoración del analito de cada método. Calcular las varianzas. (S21 y S22).
11.1.6.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo,se describen en el Anexo 17.
11.2. Estudio de Correlación. Estos estudios se aplican a métodos de contenido / valoración / potencia y los parámetros a evaluar en este tipo de estudio son: * ProPorcionalidad. Es importante establecer que estos estudios no necesariamente
establecen equivalencia de resultados, sino proporcionalidad; ya que en muchas ocasiones la respuesta analítica es diferente. * Precisión. Es deseable que el método no oficial tenga una precisión igual o
mejor que el método oficial, o que su precisión sea aceptable para la aplicación analítica deseada. Inicialmente se debe establecer el método de referencia y el método a comparar
11.2.1. Proporcionalidad:
A. Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo analítico.
11.2.1.1. Metodología: Un analista debe preparar una cantidad suficiente de placebo analítico con el tipo de componentes que comúnmente están presentes en la muestra, de tal manera que pueda ser analizado por ambos métodos en tres diferentes nivele del analito, que incluya la especiñcación. C o
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MÉTODOS
ANALíTICOS
Del placebo analítico preparado tomar una cantidad suficiente para adicionarle analito al nivel inferior. Fraccionar en tres muestras y analizar cada muestra con ambos métodos bajo las mismas condiciones analíticas de cada método, para determinar el contenido I valoración I potencia. Es importante que cada muestra
I
este identificada. Repetir este procedimiento con el nivel del 100% Y superior.
¡'
Reportar la relación contenido I valoración I potencia de cada método en cada
1
muestra del método a comparar (y) - método de referencia (x). Calcular el valor de la pendiente (b.), la ordenada en el origen (b.), el coeficiente de determinación (r2 ) , el intervalo de confianza para la pendiente (1c(f31) ) , y el coeficiente de variación de regresión (CVy,.). B. No se conocen los componentes de la muestra.
11.2.1.2. Metodología: El analista debe seleccionar por lo menos 9 muestras del producto, cuyo nivel de analito cumpla con la especificación. El analista debe fijar una etapa de los métodos analíticos, en los cuales transfiera una mayor o menor cantidad de la muestra con el objeto de poder variar el nivel del analito, como puede ser al pesar la muestra, al transferir un volumen. al efectuar una dilución, entre otras. Es conveniente que 3 muestras tengan un nivel bajo. 3 el nivel correspondiente al 100% de la especificación y 3 un nivel alto de analito. Las 9 muestras deben ser identificadas y analizadas por ambos método. bajo las mismas condiciones analíticas de cada método. Determinar el contenido I valoración
I potencia de cada muestra. Reportar la relación contenido I valoración I potencia del método a comparar (y) método de referencia (x). Calcular el valor de la pendiente (b.), la ordenada en el origen (be), el coeficiente de determinación (r2 ) , el intervalo de confianza para la pendiente (1c(f31)) , y el coeficiente de variación de regresión (CV y,.).
11.2.1.3. Criterios de aceptación: El 1C(f31) no debe incluir el cero.
l
l
r
Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado.
i
Las fórmulas. el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 18. 11.2.2. Precisión.
11.2.2.1. Metodología: Por lo menos 2 analistas. en por lo menos2 días, deben C o
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MÉTODOS
ANALíTICOS
analizar por triplicado muestras independientes (pesadas o alícuotas) de un lote homogéneo de producto, cuyo nivel de analito esté incluido dentro de la especificación; tanto con el método de referencia como con el método a comparar. Reportar el contenido I potencia I valoración del analito de todas las muestras en %, para ambos métodos. 11.2.2.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza unilateral inferior, para la razón de varianzas del método a comparar respecto del método de referencia, no debe exceder el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 19.
COMPARACiÓN
DE
2
MIOTOÓOS
ANALITICOS
•
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DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
.2.DDCUMENTACláN
. Las actividades de la validación de un método analítico, deben ser sustentadas por los siguientes documentos. A. Protocolo. El contenido sugerido que debe tener un protocolo es: 1. Título. 2. Propósito u Objetivo. 3. Responsabilidades. 4. Plan de prueba. En éste, se deben describir los parámetros de desempeño que permitan verificar la aplicación analítica deseada. 5. Criterios de aceptación para cada parámetro. 6. Formatos de registro de resultados. B. Reporte, cuyo contenido mínimo debe ser: 1. Título. 2. Resultados. 3. Análisis de resultados. 4. Confrontación contra los criterios de aceptación. 5. Conclusión. Es crítico documentar los registros analíticos. La documentación debe estar ordenada y disponible, bajo la responsabilidad del área de calidad.
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GUíA
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VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
1 :a.CONCORDANCIA CON GUIAS INTERNACIONALES
Esta guía es equivalente a: Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures. ICH-Q2A, March 1995 Guideline on the Validation of Analytical Procedures; Methodology; Availability; Notice ICHQ2B. USP24. Validation of Compendial Methods. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods. CDER. November 1994, CMC 3
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52
GUíA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
t 4.BIBLIDORRFiR
14.1. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 7a. Ed. México (2000).
14.2. Métodos Analíticos, Validación. Guías Generales de Validación de la DGCIS, SSA(1989).
14.3. Ley General de Salud (1997).
14.4. NMX-CC-1-1990 Sistemas de Calidad Vocabulario.
14.5. NMX-CC-2-1990 Sistemas de Calidad-Gestión de Calidad. Guía para la Selección, el Uso de Normas de Aseguramiento de Calidad.
14.6. Reglamento de Insumos para la Salud (1998).
14.7. NORMA Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-1993, Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos.
14.8. NOM- 177 SSA1 1998 "Que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable"
14.9. Guidance for Industry Bioanalytical methods Validation for Human Studies. December 1998 FDA.
14.10. Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures.
ICH-Q2A, March 1995 B
I B
L
I
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F
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A
53.
GUiA
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VALIDACiÓN
DE
METODOS
ANALíTICOS
14.11. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods. CDER. November 1994, CMC 3
14.12. Guideline for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation.
August 2000. FDA
14.13. Guideline for submiUing Samples and Analytical Data for Methods Validation. February 1987. FDA
14.14. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation Analytical Procedures: Methodology. 6 Nov 1996.
14.15. ICH Guideline on the Validation of Analytical Procedures; Methodology; ICHQ2B, November 1996.
14.16. USP24. Validation of Compendial Methods.
14.17. NORMA Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-1993, Estabilidad de medicamentos.
14.18. Diseño y Análisis de Experimentos, Montgomery D. C.. Grupo Editorial Iberoamérica. 38 Ed. México (1991).
BIBLIOGRAFIA
54
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GUíA
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VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
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GUiA
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MÉTODOS
ANALíTICOS
15. ANEXOS
CONTENIDO
NUMERO
1 2
MATRIZ DE EQUIVALENCIA DE MÉTODOS ANALíTICOS FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL SISTEMA
3 4
FÓRMULASY PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ADECUABILlDAD DEL SISTEMA
5
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA EXACTITUD Y
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA
REPETIBILlDAD DEL MÉTODO.
6 7
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE .CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL MÉTODO (PRECISiÓN INTERMEDIA).
8
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ESTABILIDAD ANALíTICA DE LA MUESTRA.
9 10 11 12
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LIMITE DE DETECCiÓN.
13
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARALíMITE DE CUANTIFICACiÓN. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ROBUSTEZ. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA TOLERANCIA.
Y EXACTITUD PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
14
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
15
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN EXACTITUD PARA. COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
16
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
17
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN PRECISiÓN DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTQDOS ANALlTICOS.
18
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PROPORCIONALIDAD DE MÉTODOS EN ESTUDIOS DE CORRELACiÓN PARACOMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
19
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL MÉTODO EN ESTUDIOS DE CORRELACiÓN PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALlTICOS.
20 21 22
TABLA ESTADíSTICA DE LA DISTRIBUCiÓN t DE STUDENT. TABLAS ESTADISTICA DE LA DISTRIBUCiÓN F DE FISHER. COMENTARIOS RESPECTO A LOS CÁLCULOS Y REGLAS DE REDONDEO.
ANEXOS'
55
GUíA
ANEXO 1.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
MATRIZ DE EQUIVALENCIA DE MÉTODOS ANAlÍTICOS.
EQUIVALENTE
PROPÓSITO
USO
CONTENIDO O POTENCIA
CUANTIFICA ALANALlTO
Métodos para producto a granel. Métodos para producto terminado. Métodos para materia prima. Métodos indicadores de estabilidad. Métodos para fármacos. Métodos para cuantificar el analito en la prueba de disolución. Valoración. Ensayos de cuantificación. Determinación del principio activo liberado. Sustancias relacionadas. Titulación. Uniformidad de dosis.
LíMITE
ESTABLECE LA PRESENCIA DEL ANALlTO A UN LíMITE
IDENTIFICACiÓN
IDENTIFICA AL ANALlTO
Métodos límite de impurezas. Métodos límite de residuos. Métodos para determinar el nivel de limpieza. Prueba límite. Sustancias relacionadas. Ensayo de identidad.
.
-
.di' GUiA
ANEXO 2.
DE
VALIDACiÓN
DE
METODOS
ANALITICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL SISTEMA A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
_ LY
y=-
n
DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(L l)-(L y)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
cv = y~*lOO n = número de mediciones. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: PROPIEDAD MEDIDA (ABSORBANCIA) .DE LA SOLUCiÓN DE REFERENCIA (y) 1.0520 1.0462 1.0566 1.0568 1.0554 1.0498 2) Calcular ~y, ~y2 Y determinar n. ~y,= 1.0520 + 1.0462 ~y2
=
1.05202
+...+ 1.0498 = 6.3168
+ 1.0462 2 +...+ 1.04982 = 6.650417
n=6 3) Calcular y y S:
y = 6.3168 = 1.0528 6
s ==
2
6 x 6.650417 - 6.3168 == 0.004252 6x(6-1)
4) Calcular el CV:
cv
== 0.004252 x lOO == 0.4039% 1.0528 .
El CV no excede el 1.5%. ANEXOS'
57
GUiA
ANEXO 3.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ADECUABILlDAD DEL SISTEMA. A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
-
¿y
y=-
n
DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
\
\
n(L/)-(2:y)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = ~*lOO y n = número de mediciones. Para la fórmulas de factor capacidad (K'), resolución (R), retención' relativa (Rr), factor de coleo (T) y número de platos teóricos (N), referirse a la FEUM 7a Edición. Páginas 229 a
231. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1) Tabular los resultados: RESPUESTAANALlTICA (ÁREA DE PICO) DE LAS INYECCIONES DE LA SOLUCiÓN DE REFERENCIA.
Inyección Área (mAu*s)
1131.6
1 2 3 4
1134.1 1162.8 1132.9
5
1136.2
2) Calcular ~y, ~y2 Y determinar n. ~y =1131.6 + 1134.1+...+ 1136.2 =5697.6 ~y2 = 1131.62 + 1134.1 2 +...+ 1136.22 = 6493218.06 n=5 3) Calcular
y y S.
y= 5697.6 = 1139.52 5 2
s= 5x6493218.06-5697.6 = 5x(5-1)
13.124
.'''.,
4) Calcular el CV.
cv = 13.124 x100= 1.15% 1139.52 El CV no excede el 1.5%. ANEXOS'
58
..
.~
..... - ..
GUiA
ANEXO 4.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA.
A) FÓRMULAS PENDIENTE
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica).
ORDENADA AL ORIGEN
COEFicIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(Ixy)-(¿x)(Iy))2 r = (n(Ix 2)-(Ix)2)(n(Ii)-(Iy)2) 2
'0
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
/C(PI) = b¡± (O.975,n-2 Sbl
Sylx-t o.975,n-2
~'2>2
-b¡¿",-b,¿y n-2
=Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
8) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. Estos datos se utilizan únicamente para ejemplificar los cálculos. 1) Tabular los resultados: CONCENTRACiÓN - PROPIEDAD MEDlpA SOLUCiÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9
x (ppm)
y (absorbancia)
80 80 80 100 100 100 120 120 120
0.5194 0.5172 0.5147 0.7800 0.7846 0.8063 1.5917 1.5844 1.5837
GUiA
DE
2) Calcular LX,
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
LY, LX2 , L y2 , Lxy Y determinar n:
LX = 80 + 80 + ... + 120 = 900 LY = 0.5194 + 0.5172 + + 1.5837 = 8.682 L x2 = 802 + 80 2 + + 1202 = 92400.00 'L y2 = 0.51942 + 0.51722 + ... + 1.5837 2 = 10.228243 LXY 80*0.5194 + 80·0.5172 + ... + 120*1.5837 932.37 oo.
oo.
=
=
n=9 3) Calcular b., bo y r2.
b ::: 9 x 932.37 - 900 x 8.682 = 0.026738
9 x 92400- 9002
I
b = 8.682-0.026738x900 = -1.709083 o 9 r2 =
(9 x 932.37 -900x8.682)2 =0.925925 2) (9 x 92400 - 900 2) x (9 x 10.228243 - 8.682
El valor es menor de 0.98 4) Calcular Sytx y
Sbl
10.228243-0.026738x932.37 -(-1.709083)x8.682 = 0.140031 9.,...2
S bl = 0.140031
1 = 0.002858 2 92400- 900 9
5) Determinar en el Anexo 20 to.975,n-2 y calcular 1C({3,), /0.975,7 =
2.365
JCCPl) = 0.026738 ± 2.365 x 0.002858 = 0.019979,0.033496 El intervalo no incluye el cero. GRÁFICA X vs Y 2.0000 , - - - 1.5000
---,
y = 0.0267x - 1.7091 2
r ~
o
=0.9259
1.0000 0.5000 0.0000 +--~--.,.---~--..,__-_..,..--..,__-----l 8060 70 90 100 110 130 120
x
ANEXOS'
60
GUiA
ANEXOS.
, 1
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA EXACTITUD Y REPETIBILlDAD DEL MÉTODO A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
_ LY
y=-
n
DESVIACION ESTÁNDAR:
n(Ly 2)-(Ly)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN: S
CV = _*100 Y INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA MEDIA POBLACIONAL:
-
Je(p) = y± [0.975,1l-1
tO.975.n-1
n
S
.¡;;
Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
=número de recobros.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA- CANTIDAD RECUPERADA - % DE RECOBRO PARA UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO.
PLACEBO ANALlTICO ADICIONADO 1 2 3 4 5 6
CANTIDAD ADICIONADA (mg) 50.00 50.10 50.00 49.90 50.00 50~OO--
......
---
CANTIDAD RECUPERADA (mg)
%DE RECOBRO (y)
50.04 50.39 50.11 49.89 50.23
100.08 100.58 100.22 99.98 100.46 -- 99.86--
- --49~93--
-
----------------
y = Es el cociente porcentual de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada.
ANEXOS'
61
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
2) Calcular ¿Y. ¿y2 Y determinar n. ¿y = 100.08 + 100.58 + ¿y2
=100.082 + 100.58
2
o ••
+ 99.86
= 601.1788
+...+ 99.86 2 = 60236.3819
n=6
3) Calcular y Y S:
y= 601.1788 =100.1965 6
s=
6 x 60236.3 819 - 60 I.l788 6x(6-1)
2
= 0.2792
4) Calcular el CV:
cv =
0.2792 x l 00 100.1965
=0.28 %
El CV no es mayor de 2%.
5) Determinar en el Anexo 20
..
(o 9755 =
to.975.n-1 y calcular
IC(Il).
2.571
/C(.u) = IOO.1965±2.57Ix
0.2792
¡¿
==99.90,100.49
El intervalo incluye el valor de 100%.
ANEXOS'
62
ANALíTICOS
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ANEXOG.
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N A LiT I
e o s
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO.
6.1 CANTIDAD ADICIONADA VS CANTIDAD RECUPERADA
A) FÓRMULAS PENDIENTE
n¿xy-¿X¿y l
"2" 2
b = nLJx -(LJ X )
n = número de mediciones (cantidad adicionada - cantidad recuperada). ORDENADA AL ORIGEN
¿y-bl¿x
b¿ = ='-----=n COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(L xy )-(¿ X )(2: y))2
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
lC(PI)=b l
±IO.975,n-2 Sbl
t O.975,n-2 Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA ORDENADAAL ORIGEN lC(Po) = bo ±IO.975,n-2 SbO
_LX
x=--
n
COEFICIENTE DE VARIACiÓN DE REGRESiÓN.
S
CVy/x =~xl00
y ANEXOS'
63
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - CANTIDAD RECUPERADA (y) DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO
PLACEBO ANALíTICO ADICIONADO
1 2 3 4 5 6 7 8 9
x (mg/mL)
y(mg I mL)
1.860 1.860 1.860 2.479 2.479 2.479 3.099 3.099 3.099
1.857 1.885 1.861 2.482 2.485 2.491 3.126 3.115 3.122
j'
2) Calcular ~x, ~y, ~X2, ~y2. ~xy y determinar n:
=1.860 + 1.860 + oo. + 3.099 =22.314 =1.857 + 1.885 + ... + 3.122 =22.424 ~X2 = 1.860 2 + 1.860 2 + oo. + 3.099 2 =57.62653 ~ y2 =1.857 + 1.885 2 + oo. + 3.122 2 =58.22761 ~xy =1.860*1.857 + 1.860*1.885 + ... + 3.099*3.122 =57.9259 ~x
~Y
2
n=9 Calcular b., be y r2.
3)
b = 9x57.9259-22.314x22.424 = 1.01157 I 9x57.62653-22.3142 b = 22.424-1.01157x22.314 =-0.01647 o
2.
r =
9 (9x 57.9259-22.314 x 22.424)2 =0.99971 2 (9x57.62653- 22.314 2)x(9x 58.22761-22.424 )
El valor excede a 0.98
ANEXOS'
64
.~
,
GUíA
DE
4) Calcular Sy/x y
s
= yl x
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
s;
58.22761-1.01157x57.9259-(-0.01647)x22.424 =0.00989 9-2 1
= 0.00989
2 = 0.00652 57.62653- 22.314 9 5) Determinar en el Anexo 20 tO.975.n-2 y calcular 1C(/3,). Sbl
(0.975.7
= 2.365
[CC.8I) = 1.01157 ±2.365 xO.00652 = 0.99615, 1.02699 El intervalo incluye la unidad. 6) Calcular x y
ss,
x= 22.314 = 2.47933 9
1
= 0.00989 "9 +
SbO
2.47933 2 = 0.0165 223142 5762653 - - ' 9- .
7) Calcular lC(b o)'
[CCPo) = -0.01647 ± 2.365 xO.0165 = -0.05548,0.02254 El intervalo incluye el cero. 8) Calcular el CVy/ x :
y = 22.424 = 2.49156 9
CV y/x
= 0.00989 x 100= 0.397% 2.49156
El valor no excede el 2%.
YvsX 4.00 3.00
>-
2.00 y= 1.0116x - 0.0165 (2 = 0.9997
1.00 0.00 1.50
2.00
2.50
3.00
X
ANEXOS'
65
3.50
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
6.2 PORCENTAJE DE RECOBRO. A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
- ¿y y=-
n
DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(¿/)-(¿y)2
s=
n(n -1)
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = ~*lOO y
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA MEDIA POBLACIONAL.
_
S
/C(¡.L) = y± t O.975,n- 1
f;¡
tO.975,n-1 Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. n = número de recobros. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA - CANTIDAD RECUPERADA - % DE RECOBRO DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO PLACEBO ANALiTICO ADICIONADO 1 2 3 4 5 6 7 8 9
RECUPERADA (mg I mL)
/
%DE
CANTIDAD ADICIONADA (mg I mL)
RECOBRO
1.857 1.885 1.861 2.482 2.485 2.491 3.126 3.115 3.122
99.84 101.34 100.05 100.12 100.24 100.48 100.87 100.52 100.74
1.860 1.860 1.860 2.479 2.479 2.479 3.099 3.099 3.099
(y)
y =Es el cociente porcentual de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada. 2) Calcular 1:y, 1:y2 y determinar n.
1:y =99.84 + 101.34 + + 100.74 =904.21339 1:y2 =99.84 2 + 101.34 2 + + 100.742 =90846.39831 n=9
ANEXOS'
66
GuiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
3) Calcular y y S: y
= 904.21339 = 100.46815 9
s=
9x90846.39831-904.21339 9x(9-1)
2
= 0.4673
4) Calcular el CV:
_ 0.4673 x100 =0.465% CV - 100.46815
I
El valor no excede el 2%. 5) Determinar en el Anexo 20 lo 975 8 =
IC(Jl)
t o.975 ,n- 1 y calcular 1C(J..l).
2.306
= 100.46815 ±2.306x
0.4673
J9 = 100.11,100.83
El intervalo no incluye el valor de 100 .
.\NE2)_(¿y)2 n(n -1)
n =número de blancos C) FÓRMULA PARA EL líMITE DE DETECCIÓN.
3.3 x s, LD=-b¡--"-
D) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACiÓN. 1) Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANAlíTICA (y)
MUESTRA
1 2 3 4 5 6 7 8
x (ppm)
y (absorbancia)
0,963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
2)
Calcular ~x, ~y, LX2, Ly2, LXY y determinar n:
~x
= 0.963 + 0.963 +.. oo + 1.926 = 11.556
~Y
=0.315 + 0.314 + oo. + 0.629'= 3,765
L x2 = 0.963 2 + 0.9632 +
... +
1.926 2 = 17.72305
~ y2 =
0.3152 + 0.314 2 + oo' + 0.629 2 = 1.88164
~xy =
0.963*0.315 + 0.963*0.314 +oo. + 1.926*0.629 = 5.77479
n=8 ANEXOS'
72
GUiA
3)
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
Calcular b, y r2.
q = 8x5.77479-11.556x3.765 =0.32632 8 x 17.72305 -11.556 2
r2 =
(8x5.77479-11.556x3.765)2 2 =0.99989 (8x 17.72305 -11.5562)x (8 x 1.88164 -3.765 )
El valor es mayor de 0.98 4)
Calcular bo'
Sy/x
y
Sbl:
b = 3.765 - 0.32632 x 11.556 =-0.00075 o 8
Sylx =
Sbl =
_1.88164 - 0.32632x 5.77479 - (-Q.00075)x 3.765 =0.00143 8-2
0.00143
1
11.5562 17.72305 8
5) Determinar en el Anexo 20
= 0.00141
tO.975.n'2
y calcular IC(f31)'
tO.975,6 = 2.447 IC(PI) = 0.32632 ± 2.447 x 0.00141 = 0.32288,0.32977 El intervalo no incluye el cero. E) PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LOS BLANCOS.
1) Tabular los resultados:
BLANCOS
Y (Absorbancia)
1 2 3 4 5
0.003 0.004 0.006 0.002 0.004
2) Calcular 1:y, 1:y2y determinar n:
=0.003 + 0.004 + .,. + 0.004 =0.019 1: y2 =0.003 2 + 0.004 2 + + 0.004 2 = 0.00008 1: y
oo.
n=5 ANEXOS'
73
GUíA
3) Calcular
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
s; 2
Sb =
5 x 0.00008 - 0.019 =0.00148 5(5 -1)
F) CÁLCULO DEL LIMITE DE DETECCiÓN.
= 3.3xO.00148 =0.015ppm
LD
0.32632
9.3 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADA EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE REGRESiÓN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n¿xy-¿X¿'y b¡ = nL,¿x "'" 2 -(L,¿X) "'" 2
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica ).
COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(LXY)-(LX)(LY)/ r = (n(Lx 2)-(Lx)2)(n(Li)-(Ly)2) 2
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
tO.975 ,n.2 =Referirse al Anexo 20,
para determinar el valor de la t de Student.
LíMITE DE DETECCiÓN.
3.3 xS y 1x
LD=--b¡~-
ANEXOS'
74
I, i I
.
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
t
¡¡
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTAANALiTICA (y)
f MUESTRA
1 2 3 4 5 6 7 8 2) Calcular Lx, Ly, Lx2 ,
Lx = 0.963 + 0.963 + L Y =0.315 + 0.314 +
Lx = 2
2
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
Ly2 , LXY y determinar n: + 1.926 = 11.556 + 0.629
2
0.963 + 0.963 +
=3.765
+ 1.9262 = 17.72305
L y2 =0.315 2 + 0.314 2 + + 0.629 2 = 1.88164 LXY = 0.963*0.315 + 0.963*0.314 + ... + 1.926*0.629 = 5.77479 n=8 3) Calcular b, y r2 •
b¡ = ~~_5:~~~22..=-_!J~~56x2·??~'i_ = 0.32632 8x 17.72305-11.556"2 r2 =
2 (8x 5.:.?2.~79-11.556x 3.765) _= 0.99989 2) 2)x (8x 17.72305-11.556 (8x 1.88164- 3.765
El valor es mayor de 0.98 4) Calcular bo' Sy/x y Sbl:
b = 3.765-0.32632xI1.556 =-0.00075 a 8
I.88164-0.32632x5.77479 -(-0.00075)x3.765 = 0.00143 8-2 Sbl
= 0.00143
2
=0.00141
17.72305 _ L1.556 8
ANEXOS·
75_
GUiA
DE
VALIDACiÓN
IC(P.)
MÉTODOS
ANALíTICOS
tO.975,n-2 y calcular 1C(f3,).
5) Determinar en el Anexo 20 (0.975,6
DE
=2.447 = 0.32632± 2.447 x 0.00141 = 0.32288,0.32977
El intervalo no incluye el cero. 6) Calcular el límite de detección.
m
LD = 3.3xO.00143 = 0.014 0.32632
PP
9.4 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
nLxy- LxLy b¡ = nI>2 -CLX)2
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica ).
COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
I
S" =S,¡,
1
~LX2 _ (L nX)2
L y -b¡LXy-boLY
_ I SYIX-~ b
o
2
n-2
L>-b¡Lx
==--~-
n
tO.975,n-2 = Referirse al Anexo 20, para
determinar el valor de la t de Student.
DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN.
ANEXOS'
76
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
- ¿>
X=--
n LíMITE DE DETECCiÓN.
LD=
3.3xSb
o
b, B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANALíTICA (y)
MUESTRA
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
1 2 3 4 5 6 7 8
L.X, L.y, L.X2, L.y2, L.xy y determinar n:
2)
Calcular
L.X
=0.963 + 0.963 +
+ 1.926
=11.556
L. y = 0.315 + 0.314 + + 0.629 = 3.765 L. x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + + 1.9262 =17.72305 L. y2 = 0.315 2 + 0.314 2 + + 0.629 2 = 1.88164 L.xy = 0.963*0.315 + 0.963*0.314 + ... + 1.926*0.629 = 5.77479 n=8 3)
Calcular b, y r 2•
b = 8x5.77479-11.556x3.765 =0.32632 1 8 x 17.72305-11.556 2
r2 =
(8x5.77479-11.556 x 3.765)2 =0.99989 (8 x 17.72305-11.556 2) x (8 x 1.88164 -3.765 2)
El valor es mayor de 0.98 4)
Calcular bo'
Sy/x
y Sb1
b¿ = 3.765-0.32632x11.556 =-0.00075 8 ANEXOS·
77
GUíA
S Y/ J:
S61
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
1.88164-0.32632 x 5.77479 - (-0.00075) x 3.765 8-2
=:
=:
DE
0.00143
1 =0.00141 2 17.72305 _ 11.556 8
5) Determinar en el Anexo 20 (0975,6
=
IC(j3I)
tO.97S.n-2
=y calcular IC({3J
2.447
=:
0.32632± 2.447xO.00141 =: 0.32288,0.32977
El intervalo no incluye el cero.
6) Calcular
x
=:
x y s,
o
11.556 =1.4445 8 2
5 60 =0.00143
1. 1.4445 8'+-----=0.00210 2 17.72305- 11.556 8
7) Calcular el límite de detección.
LD = 3.3xO.0021O =0.021 m 0.32632 PP
ANEXOS'
78
=:
ANALíTICOS
0.00143
GUíA
ANEXO 10.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA liMITE DE CUANTIFICACiÓN
10.1 SEÑAL RUIDO 1)
Tabular los resultados:
SEÑAL MUESTRA
ANALlT/CA pA*seg
PLACEBOANALITICO (BLANCO O RUIDO) 10" RUIDO ANALlTO ppm
3525 35250
5 10 15 20 25
15228 26250 37145 42180 59624
El LC se estima en 15 ppm, que es la cantidad del analito, inmediatamente posterior a 10 veces el ruido.
10.2 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS. A) FÓRMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACiÓN PENDIENTE
n = número de mediciones (concentración - respuesta analítica ). COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(¿xy)-(¿x)(¿y»2 r = (n(¿x 2)_(¿x)2)(n(¿y2)-(¿y)2) 2
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
leefi¡)=b 1 ±IO.975,n-2 S b¡
~.
ANEXOS'
79
GUiA
tO.975.n-2
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
B) FÓRMULA PARA LOS BLANCOS DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS:
n(¿y2)_(¿»2
= .I--=~----"'=--
Sb
n(n-l)
n = número de blancos C) FÓRMULA PARA EL LIMITE DE CUANTIFICACiÓN.
Le = IOxSb b) D) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACiÓN. 1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTAANALlTICA (y)
PLACEBO ANAL\nco
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
ADICIONADO 1 2 3 4 5 6 7 8 2)
Calcular LX, LY, LX2 , Ly2 ,LXY determinar n:
LX
= 0.963 + 0.963 +.oo + 1.926
=11.556
L y = 0.315 + 0.314 + oo. + 0.629 = 3.765 L x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + oo. + 1.926 2 =17.72305 L y 2 =0.315 2 + 0.314 2 + oo. + 0.629 2 =1.88164 LXY
=0.963*0.315 + 0.963*0.314
+ oo. + 1.926*0.629
=5.77479
n=8 Calcular b, y r2 •
3)
= 8x5.77479-11.556x3.765 = 0.32632
b
) r2 =
8x 17.72305-11.556 2 2
(8x5.77479-11.556 x3.765) 2 =0.99989 (8 x 17.72305-11.556 2 ) x (8 x 1.88164 -3.765 )
ANEXOS'
80
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
M.ÉTODOS
ANALíTICOS
El valor excede 0.98 4) Calcular ba, Sytx y Sb'
ha = 3.765-0.32632xl1.556 = -0.00075 8 1.88164- 0.32632x 5.77479 - (-0.00075) X 3.765 = 0.00143 8-2 Sbl
= 0.00143
1
17.72305_ 11.556 8
2
=0.00141
5) Determinar en el Anexo 20 tO.975.n-2 y calcular 1C({3,). 10.975,6
= 2.447
IC(Pl)= 0.32632±2.447xO.00141 = 0.32288,0.32977 El intervalo no incluye el cero. E) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA LOS BLANCOS. 1)
Tabular los resultados: PLACEBO ANALíTICO (BLANCOS) Y (Absorbancia)
2)
PLACEBO ANALiTICO (BLANCOS)
y (Absorbancia)
1
0.003
2
0.004
3
0.006
4
0.002
5
0.004
Calcular "iy, "iy2 y determinar n:
"i y =0.003 + 0.004 + ... + 0.004 =0.019 "i y2 = 0.003 2 + 0.004 2 + ... + 0.004 2 =0.00008 n=5 3)
Calcular
Sb =
s;
5xO.00008-0.019 5(5-1)
2
=0.00148
F) CÁLCULO DEL LíMITE DE CUANTIFICACiÓN.
Le = 10xO.00148 0.32632
m
= 0.045 PP
ANEXOS'
81
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
10.3 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADA EN LA DESVIACfóN ESTÁNDAR DE REGRESiÓN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n = número de mediciones (concentración - respuesta analítica ). COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN 2
(n(¿xy)-(¿x)(¿y))2 - (n(¿x 2)_(¿x)2)(n(¿y2)-(¿y)2)
r -
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
tO.975.n-2
=Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
LíMITE DE CUANTIFICACiÓN.
lOxS y t x LC=---
bl
ANEXOS'
82
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
8) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANAlíTICA (y)
PLACEBO ANAlÍTICO
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
ADICIONADO
1 2 3 4 5 6 7 8 2)
Calcular
LX, LY, LX2 , Ly 2 , LXY y determinar n:
LX = 0.963 + 0.963 +
+ 1.926 = 11.556
L Y =0.315 + 0.314 + + 0.629 =3.765 L x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + + 1.926 2 =17.72305 L y2 = 0.315 2 + 0.314 2 + + 0.629 2 = 1.88164
LXY =0.963*0.315 + 0.963*0.314 + ... + 1.926*0.629 =5.77479 n=8 Calcular b, y r2 •
3)
b - 8x5.77479-11.556x3.765 =0.32632 1-
8xI7.72305-11.5562 2
(8x5.77479-11.556 x3.765) =0.99989 r 2 - (8 xI7.72305-11.556 2)x(8 x1.88164-3.765 ) 2
El valor excede 0.98 4)
Calcular b a, Sy/x y Sbl
b = 3.765 - 0.32632 x 11.556 = -0.00075
8
o
1.88164-0.32632x5.77479-(-0.00075) x3.765 = 0.00143 8-2 Sbl
= 0.00143 17.72305_
11.5;6
5) Determinar en el Anexo 20,
2 =0.00141
tO.975,n-2 y calcular 1C(f31) .
t 0.975,6 = 2.441
JCCPI) = 0.32632 ± 2.447 x 0.00141 = 0.32288 , 0.32977
ANEXOS'
83
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
El intervalo no incluye el cero. 6) Calcular el límite de cuantificación.
LC = 10xO.00143 = 0.044 ppm 0.32632 10.4 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n = número de mediciones ,..:oncentracíón - respuesta analítica ). COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
s = f¿y2 -b¡¿xy-bo¿y yIx
~
n-2
bo ==¿=-y_-_b---,¡¿=--X n t O.975,n-2= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN.
- LX
X=--
n LIMITE DE CUANTIFICACiÓN.
LC=
10xSb
b¡
o
ANEXOS'
84
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANALíTICA (y)
PLACEBO ANALíTICO
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
ADICIONADO
1 2 3 .» 4 5 6 7 8 2) Calcular
L.X, L.y, L.X2 , L.y2, L.xy y determinar n:
L.X =0.963 + 0.963 + + 1.926 =11.556 L. Y = 0.315 + 0.314 + + 0.629 = 3.765 L. x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + oo. + 1.9262 = 17.72305 L.y2 = 0.315 2 + 0.314 2 + oo. + 0.629 2 = 1.88164 L.xy = 0.963*0.315 + 0.963*0.314 + .oo + 1.926*0.629 = 5.77479 n=8 3) Calcular b, y r2 .
_ 8x5.77479-11.556 x3.765 =0.32632 b 8 x 17.72305 -11.556 2 l
2
(8x5.77479-11.556x3.765) =0.99989 2 2 r = (8x 17.72305-11.556 ) x (8 x 1.88164- 3.765 ) 2
El valor es mayor de 0.98 4) Calcular b o'
Sy/x
y
Sbl:
b = 3.765 - 0.32632 x 11.556 o 8
Sylx
Sbl
=
=-0.00075
1.88164 0.32632x 5.77479 -(-0.00075)x3.765 = 0.00143 8-2
= 0.00143
1 - - - - - - - - ; ;2-
11.556 17.72305 8
=0.00141
ANEXOS'
85
·
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTO(')OS
5) Determinar en el Anexo 20, to.975,n-2 y calcular 1C(f3J (0975,6 =
JC(P.)
2.447
= 0.32632± 2.447 x 0.00141 = 0.32288,0.32977
El intervalo no incluye el cero. 6) Calcular
xy Sbo
X = 11.556 = 1.4445 8 SbO =
1 1.4445 2 0.00143 - + =0.00210 2 8 17.72305 _ 11.556 8
7) Calcular el límite de cuantificación.
0064 ppm Le =.10xO.00210 =. 0.32632
ANEXOS'
86
ANALíTICOS
GUíA
ANEXO 11.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ROBUSTEZ. A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA DE LA CONDICiÓN NORMAL DE OPERACiÓN
- ¿Yo Yo=-no
no
=número de muestras de la condición normal de operación.
MEDIA ARITMÉTICA DEL ANÁLISIS DE CADA CONDICiÓN DE OPERACiÓN. DIFERENTE A LA CONDICiÓN NORMAL
ni = número demuestras de la i-ésima condición de operación. DIFERENCIAABSOLurA DE LA MEDIAARITMÉTICA DE CADA CONDICiÓN RESPECTO DE LA MEDIA ARITMÉTICA DE LA CONDICiÓN NORMAL
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: . VALORACiÓN (%) DELANALlTO ROBUSTEZ AL % DE UN COMPONENTE DE LA FASE MÓVIL DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO
CONDICION 0.31%
0.34%
0.37%
BAJA
NORMAL
ALTA
(Y,)
(Yo)
(Y2)
1
101.88
100.55
B9.QO
2
101.88
100.22
98.74
3
101.37
103.63
99.33
MUESTRA
2) Calcular LYo'
LY" LY2 Y determinar. no' n, Y n2 • LYo = 100.55 + 100.22 + 103.63 = 304.40 LY, =101.88 + 101.88+ 101.37 =305.13 LY2 = 99.00 + 98.74+ 99.33 = 297.07 no
=3 =3
n, =3 n2
ANEXOS'
87
GUíA
3) Calcular
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
Yo, y32 :
Yo = 304.4 = 101.4667 3
YI = 305.13 = 101.71 3
Y2 = 297.07 = 99.0233 3
4) Calcular 1dil:
¡dll =
/YI-., =1101.71-101.46671 = 0.2433
El valor no excede el 2%.
El valor excede el 2%.
ANEXOS'
88
ANALíTICOS
GUíA
ANEXO 12.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA TOLERANCIA.
A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
-
¿y n
y=DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(¿/)-(¿y)2
s=
n(n-l)
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = :'*100 y n
=número de muestras de contenido I potencia I valoración.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: VALORACiÓN DEL ANALlTO TOLERANCIA DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO A EQUIPOS
2) Calcular LY,
Ly =98.69
MUESTRA
CLAR 1
CLAR2
1
98.69
97.9
2
98.51
97.5
3
98.35
98.11
Li y determinar n.
+ 98.51 + oo. + 98.11
=589.06
L y2 = 98.69 + 98.51 +oo.+ 98.112 = 57832.8908 n=6 2
2
3) Calcular y y S :
y= 589.06 =98.1767 6
S
=
I
/6 x 57832.8908 - 589.06 ~ 6x(6-1)
2
= 0.4344
4) Calcular el CV:
CV = 0.4344 X 100-044°/ -. /0 98.1767 El valor no es mayor de 2%.
EXOS .
89
GUíA
ANEXO 13.
DE
VALIDACiÓN
DE
MéTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD EN EXACTITUD PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
A) FÓRMULAS VARIANZA
Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer:
S,2 =varianza menor. S/
=varianza mayor.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS 2 2 S2 < a 2 . < ...-LxF, S2 r:" 2 x rO.025,n 2 -l,n,-l 2 - S2 O.975,n2- 1,nl-1 ~
al
1
FO.025,llrl,Il,-1 y FO.975,1l2_1,1l,.1=Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. nz-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n 1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
n, =número de recobros del método de varianza menor. nz
=número de recobros del método de varianza mayor.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1)
Tabular los resultados:
% DE RECOBRO PLACEBO ANALÍTICO
METODOA
METODO B
101.22 99.56 100.39 99.11 100.19 100.95
100.08 100.59 100.22 99.97 100.47 99.85
ADICIONADO 1 2 3 4 5
6
ANEXOS'
90
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2) Calcular ~y, ~y2 Y determinar n, para cada método analítico: % DE RECOBRO
MÉTODO B
MÉTODO A ~y ~y2
101.22 + 99.56 + ... + 100.95 =601.42
100.08 + 100.59 + ... + 99.85 =601.18 2 2 2 101.22 + 99.56 + ... + 100.95 =60287.5648 100.082 + 100.59 2 + ... + 99.852 =60236.6472
n
6
6 3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
s2
==
6 x 60287.5648 - 60 1.42 6x(6-1)
2
== 0.6457
Método B:
S2 === 6x60236.6472-601.18 6x(6-1)
2
==0.0830
4) Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S,2)
s? == 0.0830 si == 0.B457 5) Determinar en el Anexo 21
F0.025.0
2,1.0,,1
YF0.975.02,1.0,,1'.
FO.025.S.S = 0.14 F097SSS=7.15 6) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas: 2
0.6457 xO.14S~S 0.6457 x7.15 0.0830 0'¡2 0.0830
El intervalo de confianza no incluye el valor de 1.
ANEXOS'
91
GUiA
:0 14.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
A) FÓRMULAS VARIANZA
:¿y2 _(¿_~_)_~ ., (n -1) Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: S/ varianza menor. S/ varianza mayor. INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS
y Fo.975.n2-I.n,-¡= Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados eje libertad del numerador; y n,-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
Fo.025.n2.1.n,-1
n¡
=número de recobros del método de varianza menor.
n2 =número de recobros del método de varianza mayor.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: MÉTODO A CANTIDAD ADICIONADA (mg/g)
400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00
MÉTODO B
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
CANTIDAD ADICIONADA (mg/g)
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
392.88 389.88 397.72 393.76 513.65 497.20 494.00 489.00 543.02 535.15 545.82 534.38
400.00 400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 '500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00 550.00
407.72 409.24 398.36 405.60 398.36 493.95 511.90 493.85 393.80 497.20 534.49 545.10 550.17 551.93 535.21
ANEXOS'
92
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2) Calcular el porcentaje de recobro de cada muestra en cada método (y), al obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje.
% DE RECOBRO MÉTODO A
(392.88/400.00)*100
MÉTODO B
=98.22
{407.72/400.00)*100
97.47
102.31
99.43 98.44
99.56 101.40
102.73 99.44
99.59
=101.93
98.79 102.38 98.77
98.80 97.80 98.73
98.76 99.44
97.30 99.24
97.18 99.11 100.03
97.16
100.35 97.31 3) Calcular Sy, Sy2 y determinar n, para cada método analítico:
MÉTODO B
MÉTODO A "Ly
98.22 + 97.47 +
"Ly2
98.22 2 + 97.47 2 +
oo'
oo.
+ 97.16 = 1184.7609 + 97.16 2 = 116996.0999
101.93 + 102.31 + + 97.31 = 1496.9118 101.932 + 102.31 2 + + 97.31 2 = 149420.3404 oo.
15
12
n
oo.
4) Calcular la varianza de cada método: Método A: 2
S2 = 12x116996.0999-1184.7609 =2.2332 12x(l2-1) Método B:
2 S2 == 15x149420.3404-1496.9118 =2.6672 15x(l5-1) 5) Determinar la varianza mayor (S/) y la varianza menor ( S/)
s; =2.2332 si = 2.6672
ANEXOS'
93
GUíA
DE
VALIDACiÓN
6) Determinar en el Anexo 21 F0025.14,11
F0975.14,11
DE
MÉTODOS
F0.0_5.n,-1.n ~ YF0.975.n ,-I.n ,-1\ ,-1
= 0.32 = 3.36
7) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas:
2.6673 - - - x0.32 2.2332
0.39
~
0-; 2 0-,
~
2.6673 ------x3.36 2.2332
~ o-~ ~ 4.01
0-,
El intervalo de confianza incluye el valor de 1.
ANEXOS'
94
ANALíTICOS
GUiA
ANEXO 15.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALiTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN EXACTITUD PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANAlÍTICOS. 1.0 COMPARACiÓN DE REPETIBILlDAD DE AMBOS MÉTODOS A) FÓRMULAS VARIANZA 2
n 2:>2
-el> )2
S = ~=----'=--n (n -1) Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: S/ S/
varianza menor. varianza mayor.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS 2
~1.2 x F,O.025,n, -l,n¡-l S1
2 :;;(J'2
2
s
2 S2 x F, S2 O.975,n, -I,n,-l
(J'I
I
=
FO.o:!5.n, . (,n ' . 1 y Fo.975,n2. l. n , . 1 Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. nz-1 sangrados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n 1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador. n 1 = número de recobros del método de varianza menor. n 2 =número de recobros del método de varianza mayor. Las varianzas son iguales si en el intervalo de confianza incluye la unidad. 2.0 IGUAL REPETIBILlDAD (VARIANZAS EQUIVALENTES). A) FÓRMULAS. MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
¿Y2
Y2 = - - n2 VARIANZA DEL MÉTODO 1
'L>l -
2 ni (¿YI)2 SI = ---'=---==-ni (ni -1)
VARIANZA DEL MÉTODO 2 2
n2 ¿Y~ _(¿Y2)2 n2(n2 - l)
S2 =..
ANEXOS'
95
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALITICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES.
to.975.n, +n,-2
= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
n, = número de rec-obros del método 1. n2 = número de recobros del método 2. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: % DE RECOBRO
PLACEBO ANALíTICO
MÉTODO A
MÉTODO B
98.22 101.58 98.44 99.44 100.25 97.16
101.93 99.56 101.40 98.79 102.38 99.11
ADICIONADO 1 2 3 4 5 6
2) Calcular "i.y, "i.y2 y determinar n, para cada método analítico: MÉTODO A
MÉTODO B
= =
"i.y2
98.22 + 101.58 +oo. + 97.16 595.09 98.22 2 + 101.58 2 + .oo + 97.16 2 59034.5401
n
6
"i.y
6
3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
52 ,
2
= 6~~?O~,!:5401- 59?09 = 2.5044 6x(6-1)
Método B:
52
= .6:\ y\=-nI
MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
- ¿Y2
)') =---
n2
VARIANZA DEL MÉTODO 1
2 SI
/1¡:¿>? _(¿YI)2
= ---------.ni
(/11 -1)
VARIANZA DEL MÉTODO 2
/12¿Y2 2 " " 2 -(¿Y2) "" 2 S1 =. ----------. -- -. /12 (n2 -1) INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES_
t 0 975 . gl =Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. nl = número de recobros del método 1.
m = número derecobros del método 2. gl =.
[ ~12 +~i]2 /11
n2
2
fS{Jl : 111 'e.. _ . ,__.. 111 +
1
+
rI ~l.l
2 -
2
/12
h..__~_
/1 2 + 1
El valor de gl, debe ser redondeado al entero inmediato anterior.
n, = número de recobros del método 1. n 2 = número de recobros del método 2. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados:
% DE RECOBRO
PLACEBO ANAlÍTICO ADICIONADO
MÉTODO 1
MÉTOOO2
1
102.15
100.93
2
98.26
99.56
3
100.65
100.40
4 5 6
98.51 103.66 99.15
99.79 100.37
ANEXOS'
100
99.11
-
GUiA
ANEXO 16.
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS. 16.1 CANTIDAD ADICIONADA (x) VS CANTIDAD RECUPERADA (y) A)
FÓRMULAS.
SUMATORIAS. MÉTODO 1
MÉTODO 2
Lx, LX,2
Lx, LX22 LY2 Ly/ LXY2
LY, Ly,2 LXYl
El subíndice, indica la sumatoria del método respectivo. PENDIENTE DEL MÉTODO 1.
n, = número de mediciones (cantidad adicionada - cantidad recuperada) del método 1. PENDIENTE DEL MÉTODO 2.
n2 = número de mediciones (cantidad adicionada - cantidad recuperada) del método 2. ORDENADA AL ORIGEN DEL MÉTODO 1.
ORDEtIADAAL ORIGEN DEL MÉTODO 2.
DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE REGRESiÓN.
¿yl-b¡¡¿xy¡ -bo¡¿y¡ + ¿y~ -b¡2¿XY2 -b02¿Y2 SVlx =
n¡ +n2-4
ANEXOS·
101
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA 8E LAS 2 PENDIENTES
Donde:
t 0.975.n 1 + n,·-I = Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE LAS ORDENADAS AL ORIGEN
¡C(Po I
-
P02 ) = (b oI
-
b02) ± t 0.975'//1 +//2 -4 SbOl -b"2
Donde:
B) PROCEDIMIENTO DE CALCULO. 1)
Tabular los resultados: MÉTODO A CANTIDAD ADICIONADA
(mg/g)
400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00
MÉTODO B
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
CANTIDAD ADICIONADA (mg/g)
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
392.88 389.88 397.72 393.76 513.65 497.20 494.00 489.00 543.02 535.15 545.82 534.38
400.00 400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00 550.00
407.72 409.24 398.36 405.60 398.36 493.95 511.90 493.85 393.80 497.20 534.49 545.10 550.17 551.93 535.21
ANEXOS'
102
GUíA
2) Calcular
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2 ¿XI' ¿X,2 , ¿X1 , ¿YI ' ¿y¡2 , ¿xy¡ , ¿X2 ' ¿>~ '¿Y2' ¿y~, ¿xy
determinar n, y n2 . METODO 1
¿ x, = 400.00 + 400.00 + + 550.00 = 5800.0000 ¿ x; = 400.002+ 400.002+ + 550.002= 2850000.0000 oo.
oO.
¿YI = 392.88 + 389.88 + ... + 534.38 = 5726.4600 ¿y¡2 = 392.882 + 389.882 +
I
Oo.
+ 534.382 = 2778528.1070
xy¡ = 400.00*392.88 + 400.00*389.88 +
oo.
+ 550.00*534.38 = 28137245000
n,=12 METODO 2
¿ x = 400.00 + 400.00 + ... + 550.00 = 7250.0000 I x ~ = 400.002+ 400.002+ + 550.00 = 3562500.0000 I Y2 = 407.72 + 409.24 + '" + 535.21 = 7226.7600 I y~ = 40772 + 409.24 + ... + 535.212 = 3533049.5062 2
2
'Oo
2
2
") Xl', J-J
•
.
=:
400.00*407.72
+
40000*409.24
+ 55000*535.21
+.
= 354730900C;'~'
n 2= 15 3) Calcular b ll , b,2' bOl Y b o2 :
hl l
12x 2813724.5000 - 5800.0000x 5726.4600 '=
.•.- -
12x 2850000.0000 - (5800.0000) 2
b¡2
'=
bOl '=
15x3547309.0000-=-J??Q:OOOOx7~26:7600 =0.9321 15 x 3562500.0000 - (7250.0000)2
57?6:460~ -~-?~~~~.~8.9Q.~000 = 1 4445 12
b02
=09843
.
= 72~6:7~?g~.~·.2~~J~2?50.:~0~0
= 31.2483
15
4) Calcular SlÚY y Sb ll " b'2: Sylx
'=
i 2 778528.-107()::'O~8¡3~ 28-1372'4.5'000'- 1'.4445'~ 5726.4600 +'3533049.5062 - Ó. 93 2 I x 3S473OY GOnO - :;1.24X.' .,J.------. .--..---.. - -.. - --..-.----.. . -- . -·-···.. -··.. ----2-3---··.. . ..-....- ...
SxIy = 7.3540
S
-7 3540 bll-bl2
-.
_.
r=_·.====.-_~__._=~_=~-=-_==··.~:·~:~~=~T=·~-.··-_~ ~.· ==0.0457
(5800.0000)2 '\ 2850000.0000 .' ~ 12 l'
ANEXOS'
(7250.0000)2 3562500.0000 - ----- .. ----15
103
GUiA
I
DE
VALIDACiÓN
5) Determinar en el Anexo 20 (0.975,23
(0975.23
DE
MÉTODOS
ANALITICOS
Y calcular IC( f3, 1-(3 12 ) :
= 2.069
IC(PII -
P12 ) = (0.9843 -
0.9321) ± 2.069 x 0.0457 = -0.0423 , 0.1467
El intervalo incluye el cero. 6) Calcular
.. x 1
x~
-
x" x"
y S bo,-b o2
5800.0000 = -----.-.
= 483.3333
12
=
7~~~.:~00~ = 483.3333 15
: l' Sb o l-b02
"1'- -.---.
(4li"J.3333)2
= 7.354 ¡12 +"i"s +-·-·-·----·--(5-800.0000)2 2850000.0000 -- --" .. -----12
-1;
o
(483.3333)2 + ._' _.... -_._.--._..----_ ..- ._- _. (7250.0000)2 3562500.0000 - --.-.-----15
SbOl -b o, = 22.2581 7) Calcular IC(f301-f30 ) .·
= (1.4445 -
[CCPOI - P02)
31.2483) ± 2.069 x 22.2581 = ·75.8482 , 16.2406
El intervalo incluye el cero. 16.2 PORCENTAJE DE RECOBRO. 1.0 COMPARACiÓN DE REPETIBILlDAD DE AMBOS MÉTODOS A) FÓRMULAS VARIANZA
S
2
=
n ¿y2
-(L> )2
n (n
._-
-1)
Nota: Calcular fa varianza de cada método y para fines de calculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: S,2 varianza menor. S22 varianza mayor. INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS
si
0";
si
- 2 x F0.025,/12 -1,/1,-1 < -=-2 --< S2 x Fo.975 ,/1, --¡,11 1 1SI 0"1 I o
Fo.025.n,.I,n .1 Y F O.975.n,.I,nl.¡=Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. n2 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n,-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
-1
n, = número de recobros del método de varianza menor. n2 =número de recobros del método de varianza mayor. Las varianzas son iguales si en el intervalo de confianza incluye la unidad. Si las varianzas son iguales desarrolle el punto 2. Si las varianzas no son equivalentes desarrolle el punto 3.
ANEXOS'
104
,
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2.0 IGUAL REPETIBILlDAD (VARIANZAS EQUIVALENTES). A) FÓRMULAS. _ MEDIAARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
LY2 Y2=-n2 VARIANZA DEL MÉTODO 1
VARIANZA DEL MÉTODO 2
2
n2¿>ª _(LY2)2
SJ = -..--_ .... -. .----- ---n2(n 2 -1)
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES.
tÓ:975.n¡+ n,.~=
Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
n, = número de recobros del método 1. n2 = número de recobros del método 2. 3.0 DIFERENTE REPETIBILlDAD (VARIANZAS DIFERENTES). "-
FÓRMULAS, MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
LYI YI = - - n¡ MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
VARIANZA DEL MÉTODO 1 2 _
S) -
nlL>l-(LY¡~~ n¡ (ni -1)
VARIANZA DEL MÉTODO 2
2 n2Lyi -(LY2)2 82 = -=---==--n2(n2 -1)
ANEXOS'
105
·
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES. I-
-
-
¡ S2I
'
/C(J.Ll - J.L2) = (YI - Y2) ± t o975,gl \: "
,C'~ .),
+-
Y nI
(:>9',,,,
/12
= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
.d ··
(Y
ce qt. debe ser redondeado al entero inmediato anterior. .le recobros del método 1.
"
'''·cONOS del método 2.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA - CANTIDAD RECUPERADA - % DE RECOBRO EN AMBOS MÉTODOS
-
---MÉTODOA CANTIDAD ADICIONADA
(mg/g)
! I
,I
400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g) 392.88 389.88 397.72 393.76 513.65 497.20 494.00 489.00 543.02 535.15 545.82 534.38
MÉTODO B %DE RECOBRO (y)
98.22 97.47 99.43 98.44 102.73 99.44 98.80 97.80 98.73 97.30 99.24 97.16
CANTIDAD ADICIONADA (mg/g) 400.00 400.00 400.00 400.00' 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00 550.00
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g) 407.72 409.24 398.36 405.60 398.36 493.95 511.90 493.85 393.80 497.20 534.49 545.10 550.17 551.93 535.21
y = Es el cociente porcentual de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada.
2)
Calcular LY, Ly2 y determinar n, para cada método analítico:
ANEXOS'
106
%DE RECOBRO (y)
101.93 102.31 99.56 101.40 99.59 98.79 102.38 98.77 98.76 99.44 97.18 99.11 100.03 100.35 97.31
I
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
MÉTODO B
MÉTODO A "Ly
"Ly2
=1184.7609
98.22 + 97.47 + ... + 97.16 2
98.22 +
97.47 2
+ ... + 97.16
n
ANALíTICOS
2
=
101.93 + 102.31+ ... + 97.31
116996.0999
101.93 2 + 102.312 + ... + 97.31 2
=1496.9118 = 149420.3404
15
12
3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
S ~ = 12 x 116996.0999 -1 184.7609 12x(l2-1)
2
= 2.2332
Método B:
15x149420.3404-1496.9118 SR = 15x(l5-1) 2
2
=26672
4) Determinar la varianza mayor ( S/ ) y la varianza menor ( S/)
S? = 2.2332
si = 2.6672 5) Determinar en el Anexo 21
Fo.025.n,ol.n,ol
y Fo.~ _(¿::»)2
SI = - - n)(nl -1)
n, = número de muestras analizadas utilizando el método oficial.
n2 = número de muestras analizadas utilizando el método no oficial. LíMITE UNILATERAL INFFRIOR DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS 2
0"2 2 0"1
2
S2 S2 1
--~-xF.
0.05,/1, -1,11,-1
FO.05.n , - l. n, . 1 = Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. n2-1
son grados de libertad de la varianza del método no oficial, que corresponden a los grados de libertad del numerador y n 1-1 son los grados de libertad del método oficial, que corresponden a los grados de libertad del denominador. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados (datos primarios): PORCENTAJE MÉTODO NO OFICIAL
MÉTODO OFICIAL
ANALISTA
ANALISTA
1
-c O 2
1
2
1
103.95
98.25
101.44
97.80
98.91
99.21
99.06
100.65
102.64
101.26
102.56
103.15
102.75
98.27
97.92
98.54
98.41 101.67
99.72 100.26
1 ~
o
2
2) Calcular ¿Y" ¿Y/' ¿Y2' ¿y} Y determinar
n, Y n2·
¿Yl = 103.95 + 98.91 + ... + 100.26 =-1200.74 ¿Y/ = 103.952 + 98.91 2 + ... + 100.26 2 = 120188.9554 ¿Y 2 = 101.44 + 99.06 + ... + 104.32 = 1217.09 ¿y} = 101.442 + 99.06 2 + ... + 104.32 2 = 123504.7041
ANEXOS'
115
2
104.40
103.56
99.13
104.32
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
3) Calcular la varianza del método oficial y del método no oficial. 2
S2 _ ~.~~_!2ü188.9554-12üü.7~_
= 3.7191
12x(l2-1)
1 -
12x1235ü4.7ü41-1217.ü9 S2 = 12x(l2-1) 2
2
5.6696 o
4) Determinar en el Anexo 21 Fo.05.n, . l. n, . 1 :
FO.05;11.11 = 0.35 5) Calcular el limite unilateral inferior de confianza para la razón de varianzas:
(Ji2 >- 5.6696 x 035 . (JI
3.7191
El límite unilateral inferior de confianza no excede el valor de 1. ANEXO 20. TABLA ESTADISTICA DE LA DISTRIBUCiÓN t DESTUDENT.
GRADOS DE LIBERTAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
t 0975
GRADOS DE LIBERTAD
t 0975
GRADOS DE LIBERTAD
12.706 26 2.056 4.303 27 2.052 3.182 28 2.048 2.n6 29 2.045 2.571 30 2.042 2.447 31 2.040 2.365 ~Lo_._ .__o~'ºªL.. -----2.306 33 2.035 2.262 34 2.032 2.228 35 2.030 2.201 36 2.028 .2.179 37 2.026 2.160 38 2.024 2.145 39 2.023 .. o' 2.131 40 2.021 2.120 41 2.020 2.110 42 2.018 2.101 43 2.017 2.093 44 2.015 2.014 __ _ o. 2.086 45 2.080 46 2.013 ... 2.074 47 2.012 2.069 48 2.011 2.064 49 2.010 2.060 50 .. __ o~·OOL__o
51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
61 62 63 64 65 66
67 68
69 70 71 72 73 74 75
t 0975 2.008 2.007 2.006 2.005 2.004 2.003 2.002 2.002 2.001 2.000 2.000 1.999 1.998 1.998 1.997 1.997 1.996 1.995 1.995 1.994 1.994 1.993 1.993 1.993 1.992
Losgrados delibertad (gl) sefijan con base ala fórmula indicada enel subíndice del slnt>olo dela1de Student.
ANEXOS'
116
ANEXO 21. TABLAS ESTADíSTICAS DE LA DISTRIBUCiÓN F DEFISHER.
FO.975, gln, gld 91 numerador I I denom inador
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 21
28
3
4
5
6
7
8
9
10
15.44 9.98 7.76 6.60 5.89 5.42 5.08 4.83 4.63 4.47 4.35 .4.24 4.15 4.08 4.01 3.95 3.90 3.86 3.82 3.78 3.75 3.72 3.69 3.67 3.65 3.63
15.10 9.60 7.39 6.23 5.52 5.05 4.72 4.47 4.28 4.12 4.00 3.89 3.80 3.73 3.66 3.61 3.56 3.51 3.48 3.44 3.41 3.38 3.35 333 331 329
14.88 9.36 7.15 5.99 5.29 4.82 4.48 4.24 4.04 3.89 3.77 3.66 3.58 3.50 3.44 3.38 3.33 3.29 3.25 3.22 3.18 3.15 3.13 3.10 3.08
14.73 9.20 6.98 5.82 5.12 4.65 4.32 4.07 3.88 3.73 3.60 3.50 3.41 3.34 3.28 3.22 3.17 3.13 3.Q9 3.05 3.02 2.99 2.97
14.62 9.07 6.85 5.70 4.99 4.53 4.20 3.95 3.76 3.61 3.48 3.38 3.29 3.22 3.16 3.10 3.05 3.01 2.97 2.93 2.90 2.87 2.85
294
2.82 280
14.54 8.98 6.76 5.60 4.90 4.43 4.10 3.85 3.66 3.51 3.39 3.29 3.20 3.12 3.06 3.01 2.96 2.91 2.87 2.84 2.81 2.18 2.75 2..13
14.47 8.90 6.68 5.52 4.82 4.36 4.03 3.78 3.59 3.44 3.31 3.21 3.12 3.05 2.98 2.93 2.88 2.84 2.80 2.76 2.73 2.10 2. • 2.65 2.63
14.42 8.84 6.62 5.46 4.76 4.30 3.96 3.72 3.53 3.37 3.25 3.15 3.06 2.99 2.92 2.87 2.82 2.77 2.73 2.70 2.67 2.64 2.61 2.59 2.51 2.55 2.53 2.51 2.50 2.48 2.47 2.45 2.44 2.43 2.42 2.41 2.40 2.39
'a:5t! á.22 33 34 35 36 37 38 39 40
3.54 3.53 3.52 3.50 3.49 3.48 3.47 3.46
292
3.002.84
3'-20 2.98 3.19 . 2.97 3.18 2.96 3.17 2.94 3.16 2.93 3.15 2.92 3.14 2.91 3.13 2.90
2.82 2.81 2.80 2.78 2.77 2.76 2.75 2.74
211
2.69 2..61 a,61 . 2~59 2:65 2.57 2.64 2.56 2.71 2.62 2.54 2.70 - 2.61 2.53 2.69 2.59 2.52 2.68 2.58 2.50 2.66 2.57 2.49 2.65 2.56 2.48 2.64 2.55 2.47 2.63 2.54 2.46 262 253 2.45
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16
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2.32 2.30 2.29 2.28 2.27 2.25 2.25 2.23 2.23 2.21 2.21 2.20 2.20 2.18 2.18 2.16 2.17 2.15 2.15 2.13 2.14 2.12 2.13 2.11 2.12 2.10 2.11 2.09 2.10 ..2.08 2.09 2.07
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(Continuación)
23 31 32 22 24 25 26 27 28 29 30 91 numerador 21 33 34 35 36 gl denominador 14.16 14.14 14.13 14.12 14.12 14.11 14.10 14.09 14.09 14.08 14.07 14.07 14.06 14.06 14.06 14.05 3 4 8.55 8.53 8.52 8.51 8.50 8.49 8.48 8.48 8.47 8.46 8.45 8.45 8.44 8.44 8.43 8.43 5 6.31 6.30 6.29 6.28 6.27 6.26 6.25 6.24 6.23 6.23 6.22 6.21 6.21 6.20 6.20 6.19 5.10 5.09 5.08 5.07 5.07 5.06 5.05 5.05 5.04 5.04 5.03 6 5.15 5.14 5.13 5.12 5.11 7 4.45 4.44 4.43 4.41 4.40 4.39 4.39 4.38 4.37 4.36 4.36 4.35 4.34 4.34 4.33 4.33 8 3.98 3.97 3.96 3.95 3.94 3.93 3.92 3.91 3.90 3.89 3.89 3.88 3.87 3.87 3.86 3.86 9 3.65 3.64 3.63 3.61 3.60 3.59 3.58 3.58 3.57 3.56 3.55 3.55 3.54 3.53 3.53 3.52 3.30 3.30 3.29 3.29 3.28 3.27 10 3.40 3.39 3.38 3.37 3.35 3.34 3.34 3.33 3.32 :>:31 11 3.21 3.20 3.18 3.17 3.16 3.15 3.14 3.13 3.13 3.12 3.11 3.10 3.10 3.09 3.09 3.08 12 3.06 3.04 3.03 3.02 3.01 3.00 2.99 2.98 2.97 2.96 2.96 2.95 2.94 2.94 2.93 2.93 13 2.93 2.92 2.91 2.89 2.88 2.87 2.86 2.85 2.85 2.84 2.83 2.82 2.82 2.81 2.80 2.80 14 2.83 2.81 2.80 2.79 2.78 2.77 2.76 2.75 2.74 2.73 2.72 2.72 2.71 2.71 2.70 2.69 15 2.74 2.73 2.71 2.70 2.69 2.68 2.67 2.66 2.65 2.64 2.64 2.63 2.62 2.62 2.61 2.60 16 2.67 2.65 2.64 2.63 2.61 2.60 2.59 2.58 2.58 2.57 2.56 2.55 2..55 2.54 2.53 2.53 2.47 2.47 2.46 17 2.60 2.59 2.57 2.56 2.55 2.54 2.53 2.52 2.51 2.50 2.49 2.49 Z.48 2.48 2.47 2.46 2.45 2.44 2.44 2.43 2.42 2.42 2.41 2.40 18 2.54 2.53 2.52 2.50 2.49 19 2.49 2.48 2.46 2.45 2.44 2.43 2.42 2.41 2.40 239 2.39 2.38 2.37 2.37 2.36 2.35 20 2.45 2.43 2.42 2.41 2.40 2.39 2.38 2.37 2.36 2.35 2.34 2.33 2.33 2.32 2.31 2.31 21 2.41 2.39 2.38 2.37 2.36 2.34 2.33 2.33 2.32 2.31 2.30 2.29 2.29 2.28 2.27 2.27 22 2.37 2.36 2.34 2.33 2.¡32 2.31 2.30 2.29 2.28 2.27 2.26 2.26 2.25 2.24 2.24 2.23 23 2.34 2.33 2.31 2.30 2.29 2.28 2.27 2.26 2.25 2.24 2.23 2.22 2.22 2.21 2.20 2.20 24 2.31 2.30 2.28 2.27 2.26 2.25 2.24 2.23 2.22 2.21 2.20 2.19 2.19 2.18 2.17 2.17 25 2.28 2.27 2.26 2.24 2.23 2.22 2.21 2.20 2.19 2.18 2.17 2.17 2.16 2.15 2.15 2.14 26 2.26 2.24 2.23 2.22 2.21 2.19 2.18 2.17 2.17 2.16 2.15 2.14 2.13 2.13 2.12 2.11 27 2.24 2.22 2.21 2.19 2.18 2.17 2.16 2.15 2.14 2.13 2.13 2.12 2.11 2.10 2.10 2.09 28 2.22 2.20 2.19 2.17 2.16 2.15 2.14 2.13 2.12 2.11 2.10 2.10 2.09 2.08 2.08 2.07 2.10 2.09 2.08 2.08 2.07 2.06 2.06 2.05 29 2.20 2.18 2.17 2.15 2.14 2.13 2.12 2':11 30 2.18 2.16 2.15 2.14 2.12 2.11 2.10 2.09 2.08 2.07 2.07 2.06 2.05 2.04 2.04 2.03 31 2.16 2.15 2.13 2.12 2.11 2.10 2.08 2.07 2.07 2.06 2.05 2.04 2.03 2.03 2.02 2.01 32 2.15 2.13 2.12 2.10 2.09 2.08 2.07 2.06 2.05 204 2.03 2.02 2.02 2.01 2.00 2.00 33 2.13 2.12 2.10 2.09 2.08 2.06 2.05 2.04 2.03 2.03 2.02 2.01 2.00 2.00 1.99 1.98 2.12 2.10 2.09 2.07 2.06 2.05 2.04 2.03 2.02 2.01 2.00 2.00 1.99 1.98 1.97 1.97 34 35 2.10 2.09 2.07 2.06 2.05 2.04 2.03 2.02 2.01 2.00 1.99 1.98 1.97 1.97 1.96 1.95 2.09 2.08 2.06 2.05 2.04 2.03 2.01 2.00 2.00 1.99 1.98 1.97 1.96 1.96 1.95 1.94 36 1.99 1.98 1.97 1.97 1.96 1.95 1.94 1.94 1.93 37 2.08 2.07 2.05 2.04 2.03 2.01 2.00 1.99 1.98 1.97 1.96 1.95 1.95 1.94 1.93 1.93 1.92 38 2.07 2.05 2.04 2.03 2.01 2.00 1.99 1.98 1.97 1.96 1.95 1.94 1.94 1.93 1.92 1.91 1.91 2.06 2.04 2.03 2.02 2.00 39 40 2.05 2.03 2.02 2.01 1.99 1.98 1.97 1.96 1.95 1.94 1.93 1.93 1.92 1.91 1.90 1.90
37
38
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39
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'14.04 14.04 8.41 8.41 6.18 6.18 5.02 5.01 431 4.31 3.84 3.84 3.51 3.51 3.26 3.26 3.07 3.06 2.91 2.91 2.78 2.78 2.68 2.67 2.59 2.59 2.51 2.51 2.45 2.44 2.39 2.38 2.34 2.33 2.29 2.29 2.25 2.25 2.21 2.21 2.18 2.18 2.15 2.15 2.12 2.12 2.10 2.09 2.07 2.07 2.05 2.05 2.03 2.03 2.01 2.01 2.00 1.99 1.98 1.98 1.97 1.96 1.95 1.95 1.94 1.93 1.92 1.92 1.91 1.91 1.90 1.90 1.89 1.89 1.88 1.88
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