Guia Microbiologia 2015 UPSJB

2015

MICROBIOLOGÍA

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS ESCUELA PROFESIONAL ING. ENOLOGIA Y VITICULTURA E ING. AGROINDUSTRIAL FACULTAD DE INGENIERIAS. DOCENTE: DR. BLGO. JUAN CARLOS QUISPE MEJÍA CICLO: IV UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA | SEDE ICA

INDICE Contenido Trabajo Práctico Nº 1............................................................................................................................... 5 Título de la práctica: El Laboratorio de Microbiología. Normas de Bioseguridad. ...................................... 5 Trabajo Práctico Nº 2............................................................................................................................. 19 Título del práctico: Esterilización. Métodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de esterilización.20 Trabajo Práctico Nº 3............................................................................................................................. 35 Título del práctico: Preparación de materiales de uso en el laboratorio de microbiología. Lavado, preparación y esterilización. Medios de cultivo. Definición, clasificación, aplicación y preparación. .................................. 36 Trabajo Práctico Nº 4............................................................................................................................. 46 Título del práctico: Microscopía. Uso del microscopio. Observación de preparados montados ........ 47 Examen microscópico. Examen en fresco. Técnicas de coloración de microorganismos. Coloración de Gram-Nicolle. Otras coloraciones .............................................................................................................................. 47 Trabajo Práctico Nº 6............................................................................................................................. 54 Título del práctico: Marcha microbiológica I. Técnicas de siembra. Siembras en medio líquido y en medio sólido en tubo (a un mismo nivel y en pico de flauta) y en placa (siembra masiva, agotamiento en superficie, agar volcado). .......................................................................................................................................................... 54 Trabajo Práctico Nº 7............................................................................................................................. 62 Título del práctico: Marcha microbiológica II.Lectura e interpretación de los cultivos. Pruebas de identificación. .......................................................................................................................................................... 62 Trabajo Práctico Nº 8............................................................................................................................. 71 Título del práctico: Medición y recuento de microorganismos. Recuento en placa y en cámaras. Técnicas de coloración de microorganismos. Coloración de Gram-Nicolle. Otras coloraciones ..................................... 72 Trabajo Práctico Nº 9............................................................................................................................. 78 Título del práctico: Análisis Microbiológico de agua y bebidas. Técnica de filtración por membrana. Estudio de muestra problema ............................................................................................................................... 79 Trabajo Práctico Nº 11 ........................................................................................................................... 85 Título del práctico: Micología. Técnicas micológicas. Preparación de medios de cultivo. Repiques de hongos levaduriformes y filamentosos para su posterior identificación ................................................................. 86 Trabajo Práctico Nº 12 ........................................................................................................................... 93 Título del práctico: Hongos levaduriformes. Observaciones. Técnicas de identificación. Auxonograma y zimograma. Métodos convencionales y comerciales ................................................................................................ 94 Trabajo Práctico Nº 13 ......................................................................................................................... 100 Título del práctico: Hongos filamentosos. Observaciones. Técnicas de identificación. Colonia gigante. Microcultivos ........................................................................................................................................................ 100 Trabajo Práctico Nº 14 ......................................................................................................................... 113 Título del práctico: Morfología bacteriana. ......................................................................................... 114 Trabajo Práctico Nº 15 ......................................................................................................................... 124 Título del práctico: Tinciones simples y compuestas para bacterias .................................................... 124 Trabajo Práctico Nº 16 ......................................................................................................................... 136 Título del práctico: Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano .................................. 137

PRESENTACIÓN La Microbiología, es una ciencia que viene desarrollándose crecientemente en referencia a otras ramas de la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de las observaciones que en 1669 realizo Robert Hooke, seguidas de un trabajo más explorativo en este contexto por Antonie Van Leeuwenhoek en 1670, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran diversidad de procesos. Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diferentes áreas de investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica. El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales decrecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio. Esta Guía Práctica está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros. Este manual contiene 14 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso TeóricoPráctico de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las carreras de Ingeniería en Enología y Viticultura e Ingeniería Agroindustrial impartidas en la Universidad Privada San Juan Bautista. En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan con figuras y esquemas. Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados en cuadros o esquemas, para que el alumno recopile sus observaciones. También se incluyen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante deberá de resolver consultando con los materiales bibliográficos. Dr. Blgo. Juan Carlos Quispe Mejía

El Laboratorio de Microbiología. Normas de Bioseguridad.

Trabajo Práctico Nº 1 TÍTULO DE LA PRÁCTICA: El Laboratorio de Microbiología. Normas de Bioseguridad. TEMA: Reseña histórica de la microbiología. Definición. Importancia de la microbiología. Microbiología Industrial. Definición. Descubrimiento del mundo de los microbios. Origen del microscopio. Generación espontánea. Tindall, Pasteur, Koch. Conceptos generales de bioquímica y microbiología. Modernas industrias de fermentación. Los procesos en la producción de alimentos. Tratamientos biológicos de residuos. OBJETIVOS A ALCANZAR:  Reconocer las normas de bioseguridad.  Identificar las señalizaciones y los Pictogramas de seguridad.  Diferenciar las Fases R y las Fases S  Conocer los aspectos básicos de bioseguridad y reglas generales de trabajo para el desarrollo de actividades en el laboratorio de microbiología. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Introducción a la Microbiología. INTRODUCCIÓN Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biológica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas). Es importante que los estudiantes que utilizan las estas instalaciones conozcan y apliquen todos los conceptos de bioseguridad. El Objetivo de estas normas es la Protección de los estudiantes en las instalaciones, reduciendo el riesgo en cada una de las etapas del proceso, así como evitar la contaminación de las prácticas desarrolladas, teniendo como propósito básico tener un ambiente de trabajo seguro y ordenado. Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial patogenicidad. La destrucción completa de todos los procedimientos analíticos como la preparación de medios de cultivo y otros materiales. Es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS: 1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.

2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras. Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE SEGURIDAD. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.  Proyector.  Guía Práctica  Señales de Bioseguridad PROCEDIMIENTO Se revisaran ínsitos en el Laboratorio:  Normas de ingreso y permanencia en laboratorio 1.

Es imprescindible el uso de bata de laboratorio, así como el que ingresa a las instalaciones debe responsabilizarse del cumplimiento de las normas de bioseguridad (EPPs).

2.

Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.

3.

Al INICIO y FINAL del procedimiento realizado en el laboratorio, limpie la superficie de trabajo con una solución desinfectante y ubique adecuadamente las sillas y materiales/equipos utilizados.

4.

Las personas con cabello largo deben recogerlo al inicio de las actividades, así como utilizar: bata, cofia, tapabocas, guantes (si es necesario), y los equipos de protección según el nivel de riesgo biológico.

5.

Emplee los equipos según las instrucciones disponibles en el laboratorio, así como, los protocolos o guías correspondientes a las prácticas. No manipule equipos sin la autorización respectiva y menos si no posee las destrezas para hacerlo.

6.

El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).

7.

Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

8.

Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

9.

Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.

10. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común. 11. Todas las áreas deben estar rotuladas con la señal de riesgo biológico y el nivel de contención, y bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. 12. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales. 13. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al Docente. 14. Los libros y demás pertenencias personales deben ser ubicados en el lugar dispuesto para ello dentro del laboratorio. NO coloque sus pertenencias sobre las sillas o mesones de trabajo. 15. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión de laboratorio para evitar el ingreso de agentes contaminantes por las corrientes de aire. 16. Realice el transporte de muestras dentro o entre laboratorios en los contenedores apropiados (cajas herméticas o neveras transportables), con los cuales se eviten salpicaduras y sean de fácil desinfestación. 17. Al final de cada procedimiento, disponga el material contaminado o limpio en sus respectivos lugares pero NO sobre los mesones. 18. Evitar el contacto de la piel con materiales infecciosos o con potencialidad de serlo. El uso de guantes es adecuado para la manipulación de muestras o cultivos de patógenos. Si ha utilizado guantes, deberá desecharlos antes de salir del área de trabajo y NO tocar implementos, puertas, equipos o materiales con ellos puestos. 19. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Coordinador del laboratorio. 20. Se usarán gafas protectoras y máscaras faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. Debe evitarse al máximo la formación de aerosoles durante el trabajo de laboratorio. 21. Cada estudiante o unidad de trabajo dentro del laboratorio debe contar con su equipo básico de trabajo (láminas portaobjetos, láminas cubreobjetos, jabón, tijeras, cinta de enmascarar, lápiz o marcador de vidrio permanente, toallas de papel, algodón, etanol, asas bacteriológicos y/o micológicas, guantes, pipeteador).  Introducción al trabajo en el laboratorio de bioquímica de productos agroindustriales: Pictogramas de Seguridad. La señalización de seguridad es una medida preventiva complementaria a otras a las que no se puede sustituir. Ella sola no existe como tal, y es el último eslabón de una cadena de actuaciones básicas preventivas que empiezan con la identificación y evaluación de riesgos. Los riesgos residuales se evalúan ordenándolos según su importancia y planificando las correspondientes medidas preventivas

SEÑALES DE ADVERTENCIA

SEÑALES DE PROHIBICIÓN

SEÑALES DE PROTECCIÓN

OTRAS SEÑALES

FRASES R Y S. Las frases “R” y “S” se refieren a los consejos de prudencia, relativos a la manipulación de productos peligrosos. La combinación de varias frases “R” o “S”, indican la concurrencia en un mismo producto de diversos riesgos y sus correspondientes consejos de prudencia. A continuación presentamos las frases mencionadas y algunas de sus combinaciones posibles

FRASES S

S26 En caso de contacto con los ojos, lávelos inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico

DESINFECCIÓN Y AGENTES DESINFECTANTES. Desinfección, describe la destrucción de microorganismos presentes en la superficie de implementos, equipos y manipuladores, utilizando sustancias químicas denominadas desinfectantes (o antisépticos de acuerdo al uso). La desinfección no implica esterilización, pues no siempre se eliminan todos los microorganismos y sus estructuras de resistencia. Los desinfectantes son sustancias químicas aplicadas sobre objetos y superficies; los antisépticos son sustancias químicas aplicadas sobre la piel y mucosas. Algunos autores diferencian la desinfección de la desinfestación, de acuerdo al cuerpo a tratar. Todo buen método de desinfección deberá cumplir las siguientes condiciones: (i) Eliminar el mayor número de microorganismos (al menos todos los patógenos), (ii) ser económico (iii) no debe ser corrosivo, tóxico o irritante para los tejidos y (iv) al menos ser soluble en agua. Para el uso en laboratorios de microbiología, existen diferentes moléculas que pueden ser utilizadas con fines de desinfección (Tabla 1).

Agente

Mecanismo de acción

Aplicaciones

- Efecto letal por la combinación rápida con proteínas. - Los clorados reaccionan con el agua para formar ácido hipocloroso que es bactericida. Halógenos: Compuestos clorados: Hipoclorito de sodio (NaOCl)

- Purificación del agua. - Sanitización de utensilios en - Oxidante, corrosivo para metales, de Industrias. Degradación con el tiempo, se recomienda - Microbicida. - En superficies se recomienda almacenarlas en frascos color ámbar, una concentración de 1%, con guardar las soluciones en frascos variaciones entre 1g/L y 10g/L. herméticamente cerrados, protegidos de la luz, el calor y la humedad; preparar la cantidad para uso.

Componentes fenólicos: Fenol

Compuestos con base en Iodo: Tintura de Iodo, Solución Povidona-Iodo.

- Altera la estructura de proteínas e induce su precipitación. Recomendación para la - Surfactante. Desinfección en solución al - Alteración de la membrana celular. 5%. - Irritante y altamente tóxico.

- No se tiene claro el mecanismo de - La tintura de Iodo es acción. Se presume que ocasiona la empleada como antiséptico. - Efectivo contra esporas, precipitación de las proteínas. hongos y virus. - Agente activo de superficies.

Nota. ¿Cómo preparar la solución diaria de hipoclorito de sodio? Ej.: hipoclorito comercial 5% y se desea preparar 1L (1000mL), con una concentración de 0.5% (5000 ppm). Aplique la fórmula: V= CdxVd Cc Donde, Vd: Volumen deseado Cd: Concentración deseada Cc: Concentración conocida. Entonces, V=0.5%x1.000c.c = 100c.c. 5% Usted debe agregar 100mL de hipoclorito de sodio comercial 5%, a 900mL de agua, para un volumen final de 1L (1000mL), de una dilución al 0.5%. Algunas dosis utilizadas para la desinfección de diferentes fuentes son: Agua potable (0.2 ppm); desinfección de manos e instrumental de acero inoxidable (50 ppm); camillas, mesas y camas (200 ppm); desinfección de pisos, mesones en baldosín, ropa, útiles de aseo, material plástico y material contaminado (p.e., V.I.H.) (500 ppm); y para la desinfección de material orgánico (5000 ppm). Para un proceso de desinfección correcta, tenga en cuenta las siguientes recomendaciones: - Prepare la solución desinfectante diariamente para su uso. - No utilice recipientes metálicos. - Mantenga el producto desinfectante en un lugar seco y protegido de la luz. - Emplee la concentración recomendada por la casa comercial. - No mezcle el desinfectante con otras sustancias. - Utilice guantes para su empleo. NIVELES DE CONTENCIÓN O DE SEGURIDAD BIOLÓGICA. El principal objetivo de la bioseguridad, es la contención. Este término se refiere a los métodos que hacen seguro el manejo de agentes infecciosos en el laboratorio, lográndose con esta contención, la disminución de los riesgos en la exposición del personal del laboratorio, de personas externas al laboratorio y del entorno.

De acuerdo a lo anterior, se han descrito cuatro niveles de “contención” o de “seguridad biológica”, los cuales combinan tres elementos de seguridad biológica: La técnica microbiológica, el equipo de seguridad y el diseño de las instalaciones. Nivel de contención 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes que no producen enfermedad en el ser humano o animales. Es el utilizado comúnmente en los laboratorios de prácticas de las universidades o donde se emplean cepas no patogénicas (ej.: microorganismos utilizados en la industria alimentaria). Nivel de contención 2. Es de riesgo individual moderado y riesgo comunitario bajo. Agentes patógenos que pueden causar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la comunidad, los animales o el medio ambiente (ej.: Staphylococcus sp., Salmonella sp., Toxoplasma sp., etc.). Nivel de contención 3. Se debe aplicar este nivel, cuando se trabaja con microorganismos que ocasionan patologías graves, de tratamiento complicado y, que pueden ocasionar la muerte. Las principales medidas en este caso son la manipulación correcta dentro de cabinas de seguridad (ej.: Mycobacterium tuberculosis, Brucella abortus, Coxiella burneti, etc.). En estos casos, los procedimientos solo pueden ser desarrollados personal calificado. Nivel de contención 4. De elevado riesgo individual y comunitario. Es el nivel requerido cuando se procesa o se sospecha de la presencia de un agente patógeno infectocontagioso, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento (o es poco fiable); para microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad (ej.: patógenos humano y animales).

 Estructura Lógica del Informe del Laboratorio. 

Introducción ( 1 pt )



Formulación de la Problemática (1 pt.)



Objetivo (s) (1 pt.)



Hipótesis (1 pt.)



Materiales y Equipos usados en la Práctica (1 pt.)



Metodología (2 pt.)



Resultados (2 pt.)



Análisis (mínimo de 2 o 3 trabajos o referencias científicas citadas) (3 pt.)



Conclusiones (3 pt.)



Referencias Bibliográficas. (1 pt.)



Cuestionario (4 pt.)

 Ejemplo de un Informe de Laboratorio. GENERALIDADES 1. Tamaño de papel

: A4

2. Calidad de Papel

: 80 gr

3. Tipo de letra : Arial 10, para los párrafos Arial 12, para los títulos y subtítulos. 4. Interlineado : 1.5 5. Diseño de Página

: Márgenes

. CARATULA El tamaño y la elección de los formatos son a elección del estudiante, pero ello debe de guardar el siguiente orden.

“Año de la Promoción de la Industria Responsable y Compromiso Climático” UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÌA EN ENOLOGÌA Y VITICULTURA O ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÌA AGROINDUSTRIA ___________________ TITULO DE LA PRÁCTICA DOCENTE: ALUMNO: ICA – PERÚ 2 015

.EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. a)

¿Porque son importantes tomar medidas de Bioseguridad en los Laboratorios?

b)

Describe y cita algunos Pictogramas de Seguridad que identifiques en el Laboratorio

c)

Menciona tres fases R y S que se deban usar en las Industrias Agropecuarias y/o Enológicas.

d)

Liste al menos tres microorganismos representativos para cada uno de los cuatro niveles de contingencia en los laboratorios de microbiología, mencionando la importancia que representa para su área de formación.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Esterilización. Métodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de esterilización.

Trabajo Práctico Nº 2 TÍTULO DEL PRÁCTICO: Esterilización. Métodos. Controles. Uso de la autoclave y de la estufa de esterilización.

TEMA: Principales grupos microbianos. Aspectos taxonómicos moleculares según Carl Woose. Ubicación relativa de los microbios dentro de los seres vivos. División de los seres vivos. Noción de clasificación microbiana. Principales grupos de virus. Bacterias. Levaduras. Mohos. Importancia de los microbios en el equilibrio de la biosfera. Ciclo del nitrógeno y del carbono

OBJETIVOS A ALCANZAR.  Reconocer las metodologías existentes para la desinfección de superficies e implementos del laboratorio.  Aplicar algunos de métodos utilizados para la esterilización de medios de cultivo, materiales y accesorios utilizados en el laboratorio de Microbiología.  Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología. Observará el efecto de control de la contaminación microbiana en el laboratorio.

COMPETENCIAS RELACIONADAS: Introducción a la Microbiología.

INTRODUCCIÓN Se denomina esterilización al proceso validado por medio del cual se obtiene un producto libre de microorganismos viables. El proceso de esterilización debe ser diseñado, validado y llevado a cabo de modo de asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del producto o un desafío más resistente. Como primer medida debemos realizar siempre una descontaminación, por la cual hacemos la remoción mecánica de microorganismo en objetos, dejándolos seguros para su manipulación. Tenemos opciones por las cuales podemos elegir como erradicar en la mejor manera posible, los agentes infecciosos o patógenos: - En la desinfección reducimos 3 a 5 Log la presencia de microorganismos iniciales. - En la esterilización reducimos un mínimo de 6 Log la presencia de microorganismos iniciales. Esta última opción es la más recomendable, cuando el tipo de material lo permite, porque reducimos riesgo de infecciones presentes en superficies, material, sustancia o ambiente. Estos procesos inactivan o destruyen a los microorganismos por daños irreversibles causados a nivel celular.

Recordamos que este es un proceso validado para obtener un producto libre de todo microorganismo en forma latente o activa, causante de enfermedades o infecciones. En la práctica resulta imposible probar la absoluta condición de esterilidad, por ello se asume que un producto está estéril cuando la probabilidad de que un solo microorganismo esté presente en forma viable sea igual o menor que 1 en 1.000.000, coeficiente de seguridad de esterilidad, utilizado a nivel mundial. Debemos partir del conocimiento de la carga microbiana inicial para poder garantizar la eficiencia del procedimiento. La probabilidad de vida celular está en función del Número y tipo de microorganismo y de la letalidad del proceso de esterilización.

MATERIALES Y EQUIPOS  5 cajas Petri.  1 gradilla.  7 tubos de ensayo.  1 autoclave.  5 pipetas de 1mL.  1 horno de aire caliente.  2 erlenmeyer.  1 rollo de cinta de enmascarar.  1 rollo de papel kraft.  1 rollo de gasa.  1 rollo de algodón.  1 asa bacteriológica y una micológica.  1 mechero de Bunsen o de alcohol.  3 hisopos.  1 estufa eléctrica.  3 bajalenguas.  1 Pizeta con agua destilada.

VALIDACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN Existen diversos tipos de controles durante el proceso de esterilización. - Control físico: se controlan los parámetros del equipo, temperatura, humedad, presión y vacío en las distintas etapas del proceso.

- Control químico: se utilizan químicos que viran de color en contacto con agente esterilizante. Pueden ser externos, se colocan por fuera del paquete y distingue de un material procesado de uno que no. Los internos detectan la correcta penetración del agente esterilizante. Ej.: Prueba de Bowie Dick que visualiza la eficacia en la penetración de vapor en textiles. - Control biológico: uso de dispositivos inoculados con bacterias. Las esporas bacterianas presentan una gran resistencia frente a los antimicrobianos físicos y químicos debido a esa propiedad y a la facilidad de cultivar es que se utilizan las esporas de Bacillius, para monitorear y validar los procesos de esterilización de calor seco, húmedo, radiación y agentes químicos.

Incubamos a 65 ºC y leemos a las 24 y 48 hs., se deja el material en cuarentena y se libera una vez que dichos controles biológicos dieron negativos en el laboratorio.

CLASIFICACIÓN

MÉTODOS ESTERILIZACIÓN FÍSICOS CALOR HÚMEDO El Autoclave es el equipo utilizado para este proceso. Funciona por vapor de agua saturado (vapor que está en contacto con el agua que lo genero), a presión superior a la normal. Mecanismo de acción: actúa por consecuencia de la liberación de energía calorífica 540 cal/g. El vapor actúa como transportador del calor, que produce muerte celular por coagulación del protoplasma. La desnaturalización de proteínas y enzimas se acelera con presencia de H2O (como la mayoría de las reacciones químicas). Es un proceso irreversible. Es el método usado por excelencia, el más eficaz y más económico. No tóxico. En la actualidad encontramos en el mercado una amplia disponibilidad de equipos. Posee alto poder de penetración; actúa sobre formas vegetativas y esporas. Depende de dos factores: - Temperatura - Tiempo de exposición A mayor temperatura menos tiempo de exposición necesitamos.

Hay equipos de doble puerta, o de una puerta. Verticales u horizontales, automáticas o semiautomáticas. Construidas en acero inoxidable. Formas de Uso: T° 134° C a 3 atm. x 10 minutos: Para textiles de algodón, viruta. T° 121° C a 2 atm. x 20 minutos: Instrumentos quirúrgicos, acero inoxidable, aluminio. La autoclave realiza distintos ciclos según el material a esterilizar. - Con vacíos, como primer paso, garantizando la extracción de aire de la cámara, alternados con ingreso de vapor, que logre la penetración total en el interior del envoltorio. La cantidad de vacíos depende del material cargado: para textil son tres vacíos y para instrumental uno solo. LA ESTERILIZACIÓN COMIENZA CUANDO LOS PARÁMETROS TEMPERATURA Y PRESION ALCANZAN EL VALOR ESTABLECIDO. - Se produce una descarga por descompresión de la cámara y secado por vacío. Finaliza con ingreso de aire filtrado que nivela la presión interior con la exterior. - Para líquidos se realiza un vacío inicial, controlada por una sonda testigo (termocupla), ubicada dentro de la carga, que censa la temperatura alcanzada en el líquido en la etapa de esterilización y finaliza con una lenta descarga y enfriamiento lento. El material debe quedar seco, sin restos de humedad, que generaran la formación de colonias microbianas. Autoclave CHAMBERLAN: esteriliza a 120° C a 2 atm. o a 134°C a 3 atm. por 20 o 30 minutos, con purga inicial del aire. Está formada por una caldera de cobre, con una camisa metálica externa y en la parte inferior una corona de gas que emite calor. El ciclo comienza con ingreso de vapor de agua en la cámara, este desciende al fondo de la misma y sale mientras ingresa más vapor en la parte superior. Limitaciones: No apto para polvos, líquidos oleosos, material sensible al calor o humedad (dispositivos eléctricos), ni instrumentos cromados. Envoltorios para el instrumental: - Papel: resistencia mecánica e integridad al agua. Gramaje: 60 g. Con permeabilidad selectiva (resistencia a la penetración de microorganismos y polvo) Normas IRAM 3003 para bolsas y papel. - Bolsas: de papel grado médico, fuelle con apertura séptica, cara satinada hacia adentro y testigo químico impreso. Hay de diferentes medidas. Validación: - Control químico: Test Bowie and Dick, Hoja diseñada en papel flexible y porosidad adecuada, impreso con tintas sensibles e indelebles, permite detectar fallas en la penetración del vapor. Norma ISO 11140:1995. Cambio

de color uniforme en toda la superficie de la hoja de prueba para aceptar la validación. - Control biológico: medio de cultivo con Bacillus Sterothermophilus (esporas). Normas ISO 11138:1994 Tiras de Bacillus Stearothermophillus. Tiras de Bacillus Stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado. Tiras de Bacillus Stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado lectura rápida (2hs -4hs) Ampolla de vidrio con suspensión Bacillus stearothermophillus y medio de cultivo (ciclo líquidos exclusivamente) - Registro continuo o gráfico Temperatura - Presión / Tiempo. Se realiza una carga en la que se coloca indicadores biológicos que serán analizados posteriormente al ciclo para verificar la eficacia.

CALOR SECO Utilizamos para este método hornos o estufas, el agente esterilizante es el aire seco. Actúa por coagulación de proteínas y por oxidación de componentes celulares. Es económico, no toxico, no deja residuos. La actividad del calor depende de dos factores: - Temperatura - Tiempo de exposición Y la efectividad depende de la difusión del calor. Se logra a: -140°C por 3 horas. -160°C por 2 horas. -170°C por 1 hora. -180°C por 30 minutos. La penetración del calor es lenta por lo que se requiere mayor tiempo de exposición. Se cuentan los minutos de esterilización a partir de que se alcanza la temperatura adecuada. Para enfriar se ventila con aire filtrado.

Aplicación Sirve para sustancias oleosas o grasas, talco, vidrio, instrumental cromado, objetos que no pueden humedecerse. Limitaciones: Proceso lento con poco margen de seguridad. No se usa para textiles (peligro de incendio), ni para gomas, plásticos o agua. Validación: - Control físico: termómetro de máxima, termocuplas. - Indicadores calorimétricos: son tiras o cintas adhesivas que viran de color a determinada temperatura. - Control biológico: tiras con Bacillus Subtilis (esporas). Normas ISO 11138: 1994.

Esterilización por calor seco Temperatura (°C)

Tiempo (minutos)

121

360

140

180

150

150

160

120

170

60

180

30

Una autoclave es un aparato que cierra herméticamente y que en su interior desarrolla vapor bajo presión, el cual se presuriza y eleva la temperatura, proporcionando que el calor húmedo destruya los microorganismos.

RADIACIONES Se somete el material a dosis predeterminadas de radiaciones. Se utilizan dos tipos de radiaciones para esterilización: -Rayos gama Actúan lesionando los ácidos nucleicos. Es una radiación ionizante con alto poder de penetración, emitida por una fuente de Cobalto 60, bajo estrictas normas de seguridad. No produce radioactividad en los objetos esterilizados. Este proceso se realiza en plantas de radioesterilización. Ventaja. No requiere monitoreo de rutina con controles biológicos. Aplicación: Vacunas, antibióticos. -Rayos ultravioletas Poseen acción germicida; no se considera esterilizante. Interfiere en el metabolismo de los organismos induciendo ionización de los componentes vitales de la célula. Escasa penetración, absorbida a una longitud de onda 240/280 nm por los ácidos nucleicos alterando las bases genéticas. Esta radiación es producida por una lámpara de mercurio de baja presión que posee un tipo de cristales, que permite el paso de un rayo de luz, eliminando los microorganismos expuestos al mismo. Aplicación: Purificación del agua. Elimina el 99% de bacterias presente el agua MÉTODOS ESTERILIZACIÓN QUÍMICOS - líquidos – GLUTARALDHEIDO Es el más ampliamente usado. Actúa por desnaturalización de proteínas y ácidos nucleicos. Uso: Para esterilización actúa por inmersión en una dilución al 2% por 10 horas, con enjuague de agua destilada estéril para eliminar residuos tóxicos. Amplio espectro con alta velocidad de acción: 1 minuto para bacterias, 10 minutos para virus y 3 horas para esporas bacterianas. El personal debe estar provisto de guantes, barbijo, delantal y protector ocular. APLICACIÓN Materiales delicados que no soportan calor, ni procedimientos energéticos. Ej.: endoscopios, broncoscopios, etc. PEROXIDO DE HIDRÓGENO Actúa por inmersión en concentración del 6% por 10 minutos, descompone las catalasas de los tejidos. No deja residuos tóxicos; finalizado el proceso queda H 2 y O2 . Es un desinfectante de alto nivel y se lo considera esterilizante. En la actualidad se utiliza el Plasma de Peróxido de Hidrógenos, que desarrollamos en métodos gaseosos. ÁCIDO PERACÉTICO Actúa por oxidación de proteínas de pared celular. Líquido incoloro, de olor penetrante. Soluble en agua.

Excelente biocida, iguala al glutaraldheido, pero es menos estable. Posee una acción desincrustante del material orgánico. Contiene una porción de surfactante, que remueve y mata el microorganismo. • Esteriliza por inmersión en cubetas en concentraciones del 0.2 al 30% por 10 min. a 55°C / se enchufa y se programa los tiempos de exposición y lavados posteriores, se eliminan los residuos de este agente con 3 lavados posteriores (enjuagues de agua estéril). Todo el ciclo se registra y emite un registro que se guarda en el libro de proceso. Estable 20 ciclos, se usa 24 horas después de preparado. Sustancia corrosiva en un ph neutro, nocivo por inhalación, ingestión y contacto con piel. Los vapores son más pesados que el aire; produce explosión con calor. Aplicación Limitado a endoscopios, se debe lavar posteriormente a la exposición. Se debe hacer uso inmediato del material. Control estricto del agua de enjuague. No permite almacenamiento por no tener envoltorio. Validación - Control Biológico: Tiras de Bacillus stearothermophillus. MÉTODOS ESTERILIZACIÓN QUÍMICOS - gaseosos -OXIDO DE ETILENO – ALTO MARGEN DE SEGURIDAD DE ESTERILIZACIÓN – Es un gas inflamable y explosivo en estado puro. Se utiliza una mezcla del 12% Óxido de Etileno con 88% de Freón 12 o en la actualidad con 90% de Dióxido de Carbono y 10 % Óxido de Etileno, disminuye así la explosividad del Ox. De Etileno. Actúa por alquilación de proteínas y enzimas de virus, esporas o bacterias (sustituye los átomos de hidrógeno lábiles por otros, grupo hidroxilo, carboxilo, etc.) Forma de Uso: Se utilizan cámaras que trabajan a bajas temperaturas, de 37°C a 55°C, con humedad de 33 -75% por 4 horas y una concentración de óxido en la cámara de 400-600 mg/ litro cámara. Luego de la esterilización se necesita un periodo de aireación para eliminar el gas residual, ya que el material poroso puede absorberlo. Se espera unos 40 días para la utilización del material. Posee una excelente capacidad de difusión que amplía el margen de seguridad de la esterilización. Aplicación: para materiales termo sensible, dispositivos y máquinas eléctricas, envases plásticos, prótesis e implantes. No apto para líquidos, ni textil (incluyendo gasas) por la humedad que retienen las tramas de la tela, que en contacto con el óxido de etileno reacciona formando un residuo difícil de resorber. Como envoltorio se puede usar: -Papel Normas IRAM 3106, papel Krafft blanco, puro monolucido peso 60gr/m2. -Fibras de celulosa largas que le dan resistencia a la tracción.

-Doble envoltorio: la externa se quita al ingresar al área aséptica, no es lo mismo doble papel son dos envolturas completas una en un sentido y la otra en sentido contrario. -También puede usarse polipropileno que es una excelente barrera de envoltorio. Limitaciones Riesgo potencial para el personal. La concentración máxima permitida es 1 ppm, durante 8 hs. de exposición, en el ambiente. En el área de trabajo son necesarias 10 renovaciones de aire por hora. Síntomas de toxicidad aguda: irritación de mucosas, cefaleas, vómito, diarrea, alteraciones electrocardiográficas. Puede inducir aberraciones cromosómicas. Tiene poder mutagénico, teratogenico y cancerígeno en humanos. • Ley 19567 modificado por Resolución 444/91 clasifica A2 POSIBLE CANCERÍGENO • Disposición 33/90 de Dirección Higiene y Seguridad: Grupo II b cancerígeno en humanos Tiene un peso específico menor al aire por lo que estratifica en el piso. Desventajas: Alto costo de los equipos e instalación apartada, con construcción antiexplosiva. Requiere tiempos prolongados para el proceso de esterilización y desorción (eliminación del gas absorbido por el material) El material requiere cuarentena. Se exige un control de toxicidad ambiental. ETAPAS DEL PROCESO Equipos hospitalarios: son de doble o simple puerta con distintas capacidades de volumen. Equipos industriales: Hay adicionado un equipo de aireación más una instalación antiexplosiva. Pre acondicionamiento del material con humectación y precalentamiento. Pasos de un ciclo: - Acondicionamiento y humidificación, bajo vacío, ya que permite una penetración más profunda de la humedad, aumentando la dinámica de la difusión. - Ingreso del gas - Exposición al gas - Evacuación - Aireación en cámara separada El equipo funciona a presión negativa (cuando es puro), por lo que el gas nunca sale de la cámara, ante una eventual pérdida de los burletes. En caso de usar mezcla con gases inertes: freón y anhídrido carbónico su utiliza presión positiva, porque hay que introducir más gas, para llegar a lograr la concentración necesaria.

Gráfico de un ciclo ETO puro con inyección de gas inerte

Ejemplo de un ciclo ETO de mezcla Validación y monitoreo del proceso: -Registro gráfico o continuo Temperatura - Presión / Tiempo. -Registro gráfico o continuo Temperatura; RH % / Tiempo de cámara de Pre acondicionamiento (si es aplicable) -Registro gráfico o continuo Temperatura / Tiempo de Cámara de Aireación. -Cálculo de concentración de óxido de etileno. - a) Peso esterilizante empleado / volumen cámara - b) Cálculo indirecto por incremento de presión debido al ingreso de gas en la cámara. -Leak test o prueba de fugas (frecuencia recomendada semanal) -Controles químicos interno y externo en cada paquete. -Controles biológicos en cada ciclo:

- Tiras de esporos Bacillus subtilis var. niger. - Tiras de esporos Bacillus subtilis var. niger.+ Ampolla con medio de cultivo incorporado. FORMALDEHÍDO Actúa por alquilación de las enzimas celulares y proteínas estructurales. No es explosivo, ni inflamable en concentraciones de esterilización. Sí es irritante a bajas temperaturas. Se utiliza en dilución en vapor de agua al 2-3% por 2 a 4 hs. Temperatura constante a 50° C y Humedad 100% son las condiciones necesarias para provocar una esterilización. Se usan cámaras similares a una autoclave de vapor húmedo, pero en este caso, en el vapor está disuelto el formaldehído. ETAPAS DEL CICLO - Vacío previo, con entrada y salida de vapor. Precalentamiento. - Pulsos de formaldehído y vapor (20 pulsos) - Extracción del formaldehído, con vapor hasta eliminar el residual - Vacío de secado - Aireación con aire filtrado. Aplicación Se usa en material termolábil, látex, goma, plásticos. No apto para líquidos ni polvos. Posee una menor capacidad de difusión y penetración. Limitaciones Irritante y alérgeno para el operador. Sustancia tóxica y posiblemente cancerígena. Prohibido en Japón, Canadá y Australia. Empleo de normas de bioseguridad. Límite de exposición 0.75 ppm por 8 hs. de trabajo. Validación -Registro continuo o gráfico Temperatura-Presión / Tiempo. -Controles químicos internos y externos de cada paquete. -Controles biológicos en cada ciclo: - Tiras de esporos Bacillus stearothermophillus. - Tiras de esporos Bacillus stearothermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado. VAPOR DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Se usa como agente esterilizante a bajas temperaturas y presión subatmosférica. Actúa por interacción de radicales libres hidroxilo sobre componentes de membrana, enzimas y ácidos nucleicos.

Recientemente se utiliza el plasma de peróxido de hidrógeno (estado entre líquido y gaseoso): Nube reactiva de electrones, radicales libres, partículas atómicas neutras y partículas cargadas positivamente generada por acción de radio frecuencia sobre vapor de peróxido de hidrógeno. El Agente esterilizante es el PEROXIDO DE HIDROGENO, en estado de plasma. Se utiliza el equipo Sterrad, cámara hermética. Este es un proceso rápido, no requiere aireación, dura 74 minutos, los más modernos tardan 35 minutos y no deja residuos con una concentración en cámara de 6 ppm de peróxido de hidrogeno. Con un nivel de seguridad (SAL) de 10 -6 (cumple nivel requerido: para esterilización). Es seguro: para el paciente y para el personal que lo manipula. El líquido concentrado es irritante en piel y mucosas. El proceso conserva más los materiales a esterilizar, no es agresivo, aumentando la vida media de los mismos. Equipo esterilizador simple puerta y distintas dimensiones de volumen. No requiere instalación separada de otros equipos / procesos. Tiempo total del proceso: 60 - 75 minutos aproximadamente. Trabaja en Temperatura a 42° C y Humedad del 6 y 14%. Etapas de un ciclo Vacío de la cámara, aumento de la temperatura y disminución de presión atmosférica. - Inyección de la solución de peróxido. - Difusión del vapor generado. - Generación del plasma: por ondas electromagnéticas producidas por un generador de radiofrecuencia. Al cesar la emisión de radiofrecuencia, el plasma se recombina para formar agua y oxígeno, sin dejar residuos tóxicos en el material. - Aireación con ingreso de aire filtrado.

Ciclo plasma del Peróxido de Hidrógeno LIMITACIONES No se pueden esterilizar productos que posean celulosa, algodón, líquidos ni polvos. Es el método más caro desarrollado actualmente.

El material debe estar perfectamente seco sino aborta el proceso y se debe envolver en material poroso, bolsas o rollos Tyvek®. Límite de exposición laboral 1 ppm por 8 horas trabajo y 5 ppm por 15 minutos en caso de fuga de la cámara. Validación y Monitoreo Registro continuo Presión / Tiempo. -Cancelación automática del ciclo por: Presencia de humedad / Suciedad ocluida. Retención de Peróxido de hidrógeno por materiales retentivos. -Controles químicos internos y externos en cada paquete. Controles biológicos: Disponible: Tiras de Bacillus Stearthermophillus + Ampolla con medio de cultivo incorporado. MÉTODOS ESTERILIZACIÓN QUÍMICOS - MECÁNICOS FILTRACIÓN Permite la remoción de todos los microorganismos presentes en líquidos o gases, reteniéndolos sobre la superficie de un material. Filtros de membrana: -Acetato de celulosa con poros de determinado diámetro, por ej.: 0,22 a 0.45 µm. -Retiene bacterias. No sirve para virus por su tamaño pequeño. Actualmente se está reemplazando por una membrana hidrofílica fabricada de polietersulfona (PES), que es un polímero con una excepcional estabilidad y una mínima unión inespecífica de proteínas (comparable a las membranas de acetato de celulosa). Estos filtros son desechables. Además de utilizarse en la esterilización de líquidos se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua. Filtros Hepa: Los filtros H.E.P.A (High efficiency Particulate Air) son filtros descartables de medio filtrante seco y extendido que tienen una eficiencia mínima de 99,97 % (es decir una penetración máxima del 0,03 %) en aerosoles. Los filtros U.L.P.A. (Ultra Low Penetration Air) son filtros con características similares a los filtros H.E.P.A. pero tienen una eficiencia mínima de 99,999 % (penetración máxima inferior al 0,001 %) para partículas de un tamaño entre 0,1 y 0,2 micrones. Se utilizan como filtros HEPA finales en sectores como el hospitalario, industria farmacéutica, industria alimenticia, industria química fina, industria veterinaria, cabinas de pintura, etc. ALMACENAMIENTO DEL MATERIAL ESTÉRIL Una vez que un material está estéril puede mantener esta condición si está protegido en la forma apropiada. La duración de la esterilidad de un material no está relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposición al medio ambiente.

Los materiales estériles pierden su esterilidad: -Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o almacenamiento. -Al humedecerse el material de empaque. -No colocarlos sobre superficies mojadas. -Mantener el área de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos. -Controlar la temperatura y la humedad de las áreas de almacenamiento. La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26º C y la humedad relativa entre 30 y 60%. La limpieza del área se realizará diariamente con utensilios propios, además de la limpieza general, una vez por semana, que debe ser estandarizada y evaluada. El material se debe rotar, colocando en la parte posterior el de esterilización reciente, de manera que se utilice primero el que esté próximo a caducar.

CUESTIONARIO 1. Liste al menos tres microorganismos representativos para cada uno de los cuatro niveles de contingencia en los laboratorios de microbiología, mencionando la importancia que representa para su área de formación. 2. ¿Qué medidas podría tomar usted para verificar la efectividad de la esterilización en autoclave? 3. ¿Defina liofilización? 4. ¿Defina sonicación? 5. ¿Qué metodología de esterilización es la adecuada para cada una de las siguientes muestras? (i) Medios de cultivo sólidos contaminados con Salmonella sp., (ii) Muestras de agua residual doméstica, (iii) Hisopos utilizados en muestreo de manipuladores de alimentos, (iv) tejidos de procedencia animal y origen desconocido, (v), suelo, (vi) suelo inoculado con patógenos de plantas y, (vii) antibióticos. BIBLIOGRAFÍA  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Preparación de materiales de uso en el laboratorio. Medios de cultivo

Trabajo Práctico Nº 3 TÍTULO DEL PRÁCTICO: Preparación de materiales de uso en el laboratorio de microbiología. Lavado, preparación y esterilización. Medios de cultivo. Definición, clasificación, aplicación y preparación. TEMA: Nutrición: Tipos de nutrición. Fisiología bacteriana: definición. Metabolismo microbiano, usos. División del metabolismo. Clasificación metabólica de las bacterias. Fermentación. Respiración. Nutrición. Requerimientos nutricionales. Requerimientos de Nitrógeno. Requerimiento de Carbono. requerimiento del azufre OBJETIVOS - Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos, aplicando los conceptos básicos de nutrición y preparación de los mismos. - Desarrollar en los estudiantes competencias en los puntos clave que deben tenerse en cuenta antes, durante y después de la preparación de un medio de cultivo. - Preparar algunos medios de cultivo, líquidos o sólidos, siguiendo las instrucciones proporcionadas. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Introducción a la Microbiología.

INTRODUCCIÓN Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio. Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio, mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales se encuentran disponibles en una gran variedad y los cuales en general aportan a los microorganismos: 1. Una fuente de carbono. El carbono es un componente esencial y central para conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones. Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupo: Autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos (utilizan principalmente dióxido de carbono como carbono inorgánico). Los organismos heterótrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono orgánico (por ejemplo glucosa u otro carbohidrato). 2. Una fuente de Nitrógeno. Elemento esencial para que la célula construya macromoléculas como: proteínas y ácidos nucléicos. Algunos microorganismos usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de

amonio como compuestos inorgánicos, así como, otros requieren compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como los aminoácidos. 3. Elementos no metálicos. Iones no metálicos como el azufre y el fósforo. El azufre puede encontrarse en proteínas, sulfatos o como azufre elemental; mientras el que el fósforo puede encontrarse formando sales. 4. Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3). Llamados también micronutrientes, oligoelementos o elementos traza. Encontrados en sales inorgánicas adicionadas a los medios y los cuales son tomados en bajas concentraciones por los microorganismos. 5. Vitaminas. Los microorganismos pueden tomarlas del medio ya elaboradas o iniciar procesos de síntesis de las mismas. Algunos microorganismos poseen una variedad de vías para sintetizar vitaminas; mientras otros, sintetizan un número muy limitado de ellas a partir de componentes del medio. Otros las requieren como suministro. 6. Agua. 7. Energía. Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, los fotótrofos y los quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar), como única fuente de energía; y los quimiótrofos que, obtienen la energía por oxidación de compuestos químicos orgánicos o inorgánicos. Las necesidades físicas involucran factores, como: Temperatura, pH y gases, los cuales se encuentran en un rango óptimo específico para cada microorganismo; por lo tanto, su variación puede acelerar o disminuir el crecimiento. El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un microorganismo en particular, debe satisfacer sus necesidades nutricionales, con el objetivo de recuperarlo y hacerlo crecer adecuadamente. De manera general, estos medios pueden ser medios artificiales o medios químicamente definidos. Para los químicamente definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos puros que los conforman ya sean de tipo orgánico como inorgánico. Los medios artificiales están compuestos de un número limitado de sustancias complejas, como extractos de plantas o de animales cuya composición química exacta no se conoce. De acuerdo a lo anterior, los microorganismos en general pueden tomar los requerimientos nutricionales de los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para multiplicarse MEDIOS DE CULTIVO Y CLASIFICACIÓN. El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el Laboratorio. Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal o, bien incorporada a un coloide en estado de gel), en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s) (Tabla 1).

Propiedades de los medios de cultivo. - Humedad. Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo. - Fertilidad. Se refieren a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano. - pH. Se refiere a los pH óptimos para el desarrollo bacteriano, indispensable para su aislamiento; variaciones ácidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento. - Transparencia. Permite la observación bacteriológica, evidenciar morfológica y físicamente su crecimiento en medos de cultivo adecuado. La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos. Los medios de cultivo granulados, son medios de cultivo elaborados a partir de materias primas sometidas a molienda, mezclado, pulverización y granulación (aglutinación de la mezcla pulverulenta). Este tipo de medios tienen algunas ventajas frente a los medios tradicionales en polvo, como lo son: - Reduce alergización o respiración de sustancias tóxicas por producción de polvo. - Menor adherencia a las paredes de los recipientes. - Mayor facilidad en el pesaje. - Mejor humectabilidad (grumos fácilmente solubles). - No se produce separación de fases de los componentes del medio de cultivo en almacenamiento prolongado. - Mejor conservación.

Tabla 1. Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico, composición y su propósito Estado/ composición/ Descripción objetivo - Sólidos: 1.5 a 2.0 % de agar –agar. SEGÚN SU ESTADO - Semisólidos: 0.5 % de agar –agar. - Líquidos: No contienen agar –agar. FÍSICO - Bifásico: Contiene fase sólida y fase líquida (listos para utilizar). Utilizados para cultivar microorganismos tal y como se encuentran - Naturales: en la naturaleza. Se usan con base a la experiencia y no a su SEGÚN SU Composición. Ej.: Sangre diluida, leche, jugos vegetales, etc. NATURALEZA O De composición exactamente conocida. Los más utilizados son - Sintéticos: COMPOSICIÓN Los medios comerciales deshidratados. Contienen células u organismos vivos, como las células de - Vivos: riñón de mono o huevos embrionados. Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales o plantas al caldo Medios enriquecidos: o agar, proporcionando sustancias complementaria nutritivas s para el crecimient microorganismo o de s exigentes. Con adición de algunas sustancias que no permiten el desarrollo de un grupo de microorganismos y sin afectar el desarrollo de los grupos de interés. En Medios selectivos*: principio se pueden seleccionar los microorganismos que se desarrollan en Aislamiento de medios orgánicos poco comunes, caso SEGÚN SU microorganismos en el cual se omiten otros compuestos PROPOSITO de carbono. Contienen reactivos químicos que traen como resultado, determinado tipo de crecimiento bacteriano después de la (observació hemólisis Medios diferenciales*: incubación n de , coloraciones de las colonias y otras reacciones indicadoras). Para determinar el tipo de crecimiento Medios para producido por los microorganismos, así identificación: como, la capacidad para producir cambios químicos. Clasificación

* Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas, es decir, permiten aislar microorganismos y revelan una reacción o cambio químico específico de metabolismo como: coloraciones de colonias o cambios de color del medio; es decir, selectivos y diferenciales al mismo tiempo. Almacenamiento y conservación de medios de cultivo.

Los medios de cultivo deshidratados deben ser conservados en lugares secos, protegidos de la luz, a una temperatura entre 15 y 30ºC, en envases bien cerrados y dispuestos preferiblemente de forma horizontal. Después de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos deben cerrarse firmemente. Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos cortos, máximo de una semana y lo más conveniente es almacenarlos a temperatura de refrigeración (máximo 4ºC); aunque algunos medios que contienen tioglicolato, se conservan mejor a temperatura ambiente y protegidos de la luz por un tiempo máximo de 4 días. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento, los medios deshidratados conservan sus cualidades durante el tiempo indicado y hasta la caducidad impresa en la etiqueta del recipiente. A los medio de cultivos se les realiza una prueba de esterilidad, ya sea cuando están deshidratados (Ecométrico), o preparados. En el último caso se toma del lote una muestra no inferior al 5%, incubándose estas muestra a 37ºC/24h. Finalizado el tiempo de incubación se observa si presentan crecimiento microbiano con el fin de descartar los lotes de medios contaminados. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigación microbiológica. Para obtener un producto final bien terminado (medio de cultivo), deberá contarse con la habilidad, destreza, conocimientos básicos en fisicoquímica y microbiología. En términos generales, un medio de cultivo puede ser preparado correctamente siguiendo las indicaciones relacionadas a continuación: 1. Disolución del medio de cultivo deshidratado. Se debe emplear agua limpia, recién destilada o desmineralizada y con pH lo más cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad. Inicialmente se añade la mitad de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; después, se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, pero no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención en su disolución completa, esto se confirma cuando al agitar no se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o de medio y la solución fluye libremente. Si la preparación es de más de 2 litros, se recomienda desleír el medio de cultivo en una décima parte de la cantidad total de agua y dejarla remojar durante 15 min.; simultáneamente, calentar a ebullición el agua restante y agregar ésta agua con constante agitación al medio remojado. Calentar hasta su completa disolución. 2. Esterilización. Antes de su esterilización y después de su completa disolución se debe repartir el medio en los recipientes definitivos o en los que se lleve a cabo el trabajo de investigación, excepto si corresponde a cajas de Petri. La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en autoclave a 121ºC/15 libras de presión/15min. Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (válvula abierta), y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar

los recipientes rápidamente a temperatura de vertido entre 45 y 50º C, así se evitará alterar el medio de cultivo. 3. Vertido en placa. Previamente, remover el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme; verter el medio a las cajas Petri a la temperatura de vertido, evitando la formación de humedad en la tapa de la caja. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan Abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de Bunsen. Recuerde que el proceso de servido de las cajas debe realizarse en un cuarto estéril o en cámara de flujo laminar. 4. Tubos de agar inclinado (bisel o pico de flauta), y sin inclinación. Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se forme una placa de aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones (Agar inclinado, pico de flauta o bisel). En los casos en los cuales se requiere el medio sin inclinar, estos deben dejarse solidificar en posición vertical sobre una gradilla. Posibles defectos en la manipulación y preparación de medios de cultivo. Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservación del medio de cultivo en ambiente exclusivamente húmedo; puede ser la causa de envases abiertos por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de su uso o por último que, el medio de cultivo se encuentra vencido (ver fecha de vencimiento). Se recomienda después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal. Desviación del pH. Causado por utilización de agua no neutra, envases mal cerrados, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o medio pasado de fecha de vencimiento. Turbidez. Precipitación causada por uso de recipientes sucios, sobrecalentamiento del medio, pérdida de agua por evaporación en el medio o por no disolución completa del agar-agar. Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolución del agar-agar e ineficiencia en la agitación. Medios de cultivo contaminados. Por esterilización deficiente o contaminación posterior a su preparación (vidriería no estéril y/o contaminación en etapa de servido de los medios). Colonias inconcretas o desleídas. Causada por superficies húmedas de los medios y/o por demasiado inóculo en la siembra.

CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO. Medios simples. Agar Nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona y agar-agar. Caldo Nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y Cloruro de Sodio al 0.5% (Ej.: Caldo BHI (Brain Heart Infusion/Infusión Cerebro Corazón), Caldo TSB (Caldo de Soya Tripticasa), y Caldo Nutritivo).

Agar Base Sangre: Medio sólido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%; usado para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemolítica. Medios enriquecidos. Agar Sangre: Al medio Agar Sangre se le adiciona sangre de conejo desfibrinada al 7% estéril, cuando este tiene una temperatura de 45ºC y luego de su esterilización (la fuente de sangre debe ser estéril). Agar Chocolate: Consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se lleva a 100º C/1min., (llevar a ebullición); así, se rompen los glóbulos rojos y el medio toma un color café. Se usa para el aislamiento de Haemophilus spp., y Neisseria spp. Medio de Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerantes y anaerobios. Debe conservarse en la oscuridad y en tubos tapa rosca de manera que, la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie del medio. Medios selectivos y diferenciales. Agar MacConkey: Medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa y rojo neutro como indicador de pH (evidencia la fermentación de la lactosa por el cambio de color). Agar SS (Salmonella-Shigella): Contiene peptona, lactosa, bilis de buey desecada, citrato sódico, tiosulfato sódico, citrato de hierro (III) y amonio, verde brillante y como indicador de pH Rojo neutro, que evidencia la fermentación o no de lactosa. Las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. También pueden determinarse microorganismos formadores de H2S, por la formación de un centro negro en la colonia. Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorantes que impiden el crecimiento de bacterias Grampositivas. E. coli crece formando colonias con brillo metálico característico, por la cristalización de la Eosina. Medio de Telurito: Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus y Listeria. El Telurito de potasio al 2%, es reducido por las Corynebacterias reductoras, apareciendo colonias de color gris-negro. Medio de Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento de mohos y levaduras. Contiene dextrosa, peptona o maltosa y con pH entre 5,0 y 5,5, inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos por efectos de la acidez del medio. Medios de transporte. Mantienen viables los microorganismos presentes en una muestra antes que esta se procese; los conserva evitando su multiplicación y muerte.

Medio de Stuart: Se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos muestreados con escobillón estéril (hisopos). Medio de Buffer Glicerinado: Permite el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos. Se ha observado que, mantiene la viabilidad de Shigella. Medios bioquímicos diversos. Son aquellos que revelan las características bioquímicas particulares de las bacterias, como: TSI (Agar Hierro tres azúcares), Citrato de Simmons, SIM (Agar Sulfuro Indol Motilidad), Caldo MR-VP (Rojo de Metilo-Voges Proskauer), Caldo Malonato, Caldo Rojo de Fenol + Carbohidrato, Úrea, LIA (Agar Lisina Hierro), etc. Comercialmente, pueden encontrarse sistemas multipruebas para evaluación bioquímica de microorganismos, con 10 o más parámetros que permiten una rápida y precisa identificación de los rasgos metabólicos del microorganismo y su consiguiente identificación (Sistemas Crystal y API). Materiales y equipos. -

2 cajas Petri estériles.

-

2 tubos de ensayo estériles.

-

2 tubos taparosca estériles.

-

2 pipetas de 10mL estériles.

-

2 erlenmeyer de 50 y 250mL (o dos botellas para preparación de medios de cultivo).

-

1 autoclave.

-

1 rollo de cinta de papel.

-

1 rollo de gasa.

-

1 rollo de algodón.

-

1 pote de medio de cultivo deshidratado (simple, enriquecido, selectivo y diferencial).

-

1 mechero Bunsen.

-

1 estufa eléctrica.

-

1 balanza de precisión.

-

1 espátula.

-

500mL de agua destilada.

-

2 probetas de 50 y 100mL.

-

2 pesasales o recipientes para pesaje.

-

Alcohol 70%.

-

Tollas desechables.

Procedimiento para la preparación de los medios de cultivo. 1.

Realice los cálculos correspondientes para la preparación de los medios asignados, de acuerdo con las indicaciones del profesor y la casa comercial del medio de cultivo (gramos de medio a pesar y mililitros de agua destilada).

2.

Recuerde que todo el procedimiento debe ser llevado en asepsia (material estéril y/o desinfestado).

3.

Pese la cantidad calculada de medio de cultivo, de acuerdo al volumen de agua a utilizar.

4.

Mida el volumen de agua destilada con una probeta según los cálculos.

5.

Mezcle el medio deshidratado con la mitad del agua, agite suficientemente y agregue el agua restante. Lleve a ebullición si es necesario (en el caso de agares, no a los caldos).

6.

Esterilice en autoclave según las indicaciones impresas en la etiqueta del producto.

7.

Finalizada la esterilización, sirva asépticamente aproximadamente 15 o 20 mL de agar en las cajas Petri; evite la condensación de agua sobre la tapa de la caja, por el servido muy caliente del medio. Para los medios que se dispensan en tubos, se recomienda servir la cantidad adecuada de medio de acuerdo al tamaño del mismo, previo a la esterilización (el volumen en los tubos puede oscilar entre 5 y 10mL).

8.

Recuerde inclinar los tubos con agar que deben quedar en bisel o pico de flauta.

9.

Los medio ya esterilizados, no deben ser expuestos al ambiente, para evitar su contaminación. Estos solo deben ser abiertos en condiciones de cámara de flujo laminar en el momento de su uso.

Tenga en cuenta que, -

Los medios sin agar se pueden disolver en agua fría y los que lo contienen, deben ser calentados para conseguir su disolución (la dilución completa de un agar, se relaciona a la apariencia cristalina del medio).

-

Los medios que contienen sustancias que se alteran con altas temperaturas, deben esterilizarse de forma fraccionada (recuerde que no todos los medios se esterilizan por calor).

-

Los medios con pH inferior a 5,0, se deben preparar con cuidado, pues el agar se hidroliza al ser calentado en medio ácido, disminuyendo la estabilidad del gel.

CUESTIONARIO Complete la información del siguiente cuadro y anéxelo al informe de la práctica. Microorganismo (s)

Composición Forma de

Interpretación

objeto

del medio

del medio

Medio de cultivo preparación

Caldo Tetrationato. Agar Bismuto Sulfito. Agar Baird Parker. Caldo LMX- Fluorocult. Agar Chromocult. Caldo BHI (Brain Heart Infusion). Agar TSI (Triple Sugar Iron). Agar LIA (Lysine Iron Agar). Agar Entérico HEKTOEN Agar EMB (Eosin Methylene-blue Lactose). BIBLIOGRAFÍA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Microscopía. Uso del microscopio. Observación de preparados montados. Examen microscópico.

Trabajo Práctico Nº 4 TÍTULO DEL PRÁCTICO: Microscopía. Uso del microscopio. Observación de preparados montados Examen microscópico. Examen en fresco. Técnicas de coloración de microorganismos. Coloración de GramNicolle. Otras coloraciones TEMA: Enzimas; Genética Microbiana: La estructura del ADN y ARN. Genoma procariota y genoma eucariota. División celular. Mecanismo de conservación, transmisión y traducción de la información genética. El código genético. La mutación. Mitosis, meiosis. OBJETIVOS.  Reconocer cada una de las partes que componen el microscopio óptico y la función que cumplen en el equipo.  Desarrollar en los estudiantes habilidades para la utilización correcta del microscopio compuesto, enfatizando en las recomendaciones necesarias para lograr un mayor tiempo de vida útil del equipo.  Preparar a los estudiantes en la observación correcta de las muestras llevadas a microscopía y el reporte adecuado de las mismas.  Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Introducción a la Microbiología. INTRODUCCIÓN Para todos los investigadores, estudiantes y personal interesado en las ciencias biológicas, es fundamental el conocimiento y manejo adecuado de equipos de magnificación como los microscopios simples, compuestos, binoculares, electrónicos y estereoscópicos; ya que estos equipos son parte fundamental en el trabajo de campo y laboratorio de la Microbiología, Biología y ciencias afines. Los dos principios fundamentales de la microscopía son el poder de resolución y el aumento o magnificación. Resolución. La resolución del microscopio, es la capacidad que posee el equipo de separar dos objetos adyacentes; es decir, es la capacidad que tiene un microscopio de poder distinguir dos objetos que se encuentran muy unidos uno al otro. Esto depende de varios aspectos como: La longitud de onda de luz empleada, la densidad del medio circundante y las aperturas numéricas de los lentes empleados en los objetivos (Figura 1) y condensador. Esta apertura numérica, hace

referencia a la capacidad que tienen estos lentes para recibir el cono de luz que pasa a través de la muestra y que es proveniente de la fuente. Tenga en cuenta que, mientras menor sea la distancia que puede medirse entre dos puntos en un campo microscópico, mayor es el poder de resolución. La capacidad de aumento y resolución del microscopio depende del tipo de luz que se emplea. Los microscopios de luz permiten la resolución de objetos de tamaño mayor a la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada, por tanto los microscopios ópticos que utilizan luz visible (La luz visible se encuentra desde el violeta-390nm., al rojo-780nm.), de 500nm., no permiten resolver objetos separados por distancias inferiores a 0,25µ (=250nm.); entre menor sea la longitud de onda de luz empleada, mayor poder de resolución logra un microscopio, entre mayor apertura numérica tenga este mayor poder de resolución tendrá. El ojo humano, en comparación, sólo puede resolver puntos separados por 25-100µ que en promedio daría resoluciones 250 veces menores que el microscopio de óptico.

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de uso más común es el de campo claro, en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso o de una gran cantidad de luz. La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara I haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficies transparente, en la cuál se fijan y tiñen los microorganismos. o De acuerdo al número de soluciones colorantes ya los objetivos de •o estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos car-gados conocidos como cromóforos. Por ejemplo: Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* + ci-(Cromoforo) Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacteriana. La tinción delas bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observación deforma, tamaño y arreglo delas células.

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.  1 Probeta de 100 mL  1 Vaso de precipitados de 100 mL  1 mechero  1 asa de siembra  5 Portaobjetos  Piceta con agua destilada  Microscopio compuesto de campo claro  Azul de metileno alcalino  Alcohol etílico al 70%  Toallas desechables  Fenol al 2%  Aceite de inmersión PROCEDIMIENTO. El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. Y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno. El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación. Preparación de frotis 1.

Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).

2.

Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.

3.

Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.

4.

Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más.

5.

Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.

Fijación del frotis Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas al mechero).

Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. Tinción simple Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua destilada. Dejar secaral aire

Observación al microscopio 1.

Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2.

Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor.

3.

Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

4.

Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

Resultados A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en el cuadro de resultados. B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. 1.

Investigue cuáles son las estructuras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.

2.

¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se deben poner varias veces muestras del cultivo líquido y sólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis?

3.

¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias?

4.

¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?

5.

¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis?

6.

¿Cuál es la utilidad del aceite de inmersión?

7.

¿Qué otros tipos de microscopios (microscopía), se conocen? Mencione sus diferencias.

Bibliografía de consulta.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Técnicas de siembra. Siembras en medio líquido y en medio sólido en tubo

Trabajo Práctico Nº 6 TÍTULO: Técnicas de siembra. Siembras en medio líquido y en medio sólido en tubo (a un mismo nivel y en pico de flauta) y en placa (siembra masiva, agotamiento en superficie, agar volcado). TEMA: Definición de bacteriología. Las bacterias: Forma, tamaño, metabolismo y nutrición principales especies. Estructura de la célula microbiana. Ácidos nucleicos. Núcleo. Citoplasma. Ribosomas. Mitocondrias. Pared celular. Flagelos y pilis. Esporas. Cápsula. Morfología microbiana. OBJETIVOS A ALCANZAR. -

Practicar las diferentes técnicas de siembra para el desarrollo de cultivos y subcultivos de hongos y bacterias, en medios de cultivo dispensados en tubos y cajas Petri, así como, en medios de diferente composición y estado.

-

Desarrollar en los estudiantes la capacidad de selección de una metodología específica, de acuerdo a los criterios proporcionados, para la aplicación correcta de las técnicas de siembra de acuerdo al microorganismo y al objetivo de la prueba.

COMPETENCIAS RELACIONADAS: Bacteriología, virología y protozoología general INTRODUCCIÓN AL TEMA: El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre de siembra; esta operación la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus secreciones, etc.), de análisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras ambientales (agua, suelo, etc.), o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de un cultivo a otro la denominamos subcultivo o repique. Para el estudio de las bacterias y otros microorganismos cultivables, es necesario además, conocer y reconocer la morfología microscópica y macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo. Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos elementos importantes para realizar siembras, como: El mechero (de alcohol o de Bunsen), el asa bacteriológica (asa de argolla), o micológica (asa recta), cámaras de flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones asépticas y los medios de cultivo ya preparados y atemperados a 37°C; esta última observación es importante tenerla en cuenta, ya que los microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras o cultivos, deben evitar ser estresados con cambios bruscos de temperatura o por otros factores (incluida la composición del medio de cultivo).

Contando con estos implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de cultivar o subcultivar muestras o aislamientos previamente obtenidos. TÉCNICAS DE SIEMBRA. La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, hongos y otros cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axénico (o cultivo puro). Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus características en estos medios. Se entiende por cultivo puro, una población de células las cuales todas proceden de una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI. Siembra en cajas de Petri por la Técnica de agotamiento, aislamiento o de estría cruzada. Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias aisladas); mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo. Para su realización: (i) se toma la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un área periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo. (ii) El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no dañarlo); a continuación se realiza una estría partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie del agar. Se debe procurar que en cada sección de la caja, las estrías queden trazadas con mayor separación. (iii) Repita el paso ii, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear y enfriar el asa cada vez que culmine una estría y solo tocar con el asa la estría inmediatamente anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla (Figura 1).

Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros microorganismos emulsionables como las levaduras) Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes. El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan estrías en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriográfico por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inóculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria.

Fig. 2. Técnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estrías realizadas una a continuación de la otra y sin cargar el asa nuevamente Siembras en cajas de Petri por la Técnica de siembra masiva. Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos (incremento de inóculo), en la superficie de un agar. Esta técnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en la superficie de la placa (Figura 3).

Fig. 3. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica masiva, utilizando hisopos estériles y sobre la superficie de un agar en caja Petri Siembras en cajas de Petri por la Técnica de punción. Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo de cepas previamente almacenadas y /o conservadas. Consiste en tomar parte de micelio con un asa micológica (o asa recta), y por una punción suave en el centro de la caja inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo, pueden hacerse múltiples picaduras en el agar (varios puntos de siembra) (Figura 4)

Fig. 4. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica de punción, utilizando asa micológica y sobre la superficie de un agar en caja Petri TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS. La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de interés, por lo tanto se deben tener las siguientes precauciones:

- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de este. - Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar. - Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación. - Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el medio de cultivo). - Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo. - Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo. - Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo. - Siembre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su defecto con mecheros Bunsen. - En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como, utilice asas totalmente rectas. Siembra en tubos por estría simple. Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estrías (Figura 5A). Siembra mixta en tubos. Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo (Figura 5B). Siembra en tubos por picadura. Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura 5C y 5D). Siembra en tubo en medio líquido. Para transferir material a partir de un medio líquido o sólido a otro líquido, puede usarse el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estériles o hisopos. Si Usted utiliza asas bacteriológicas, inocule el microorganismo en el medio líquido haciéndola rotar del mango (Figura 5E).

Fig. 5. Técnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos, donde: (A) Siembra por estría simple, (B) siembra mixta (picadura y estría), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra con asa bacteriológica en medio líquido NOTA: En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas Petri o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y la fecha. Para análisis clínico, marcar siempre las cajas en la base de la caja Petri y para análisis de control de calidad de alimentos u otras materias primas, marcar las cajas en la tapa de la caja Petri. Luego de realizada la siembra, usted debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado caso, un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inóculo no se ha adsorbido, espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa hacia arriba por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el agua de condensación que pueda formarse en la tapa de la caja, caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR 

1 caja Petri con agar PDA.



4 cajas Petri con agar Nutritivo.



1 tubo con 5mL de Caldo Nutritivo.



1 tubo con agar SIM.



2 tubos con agar Nutritivo en bisel.



1 tubo con agar PDA en bisel.



2 hisopos estériles en tubo taparosca.



1 asa bacteriológica.



1 asa micológica.



1 mechero Bunsen.



1 cultivo bacteriano en caja Petri con agar Nutritivo de 24h.



1 cultivo fúngico en caja Petri con agar PDA de 3 días.



Etanol 70%.



Toallas desechables.



1 rollo de papel para sellar cajas Petri.



1 rollo de cinta de papel.



2 incubadoras de35±2°C y 25°C.

PROCEDIMIENTO. Procedimiento para la realización de las siembras. De acuerdo a la fundamentación teórica de esta guía, a las indicaciones del docente y al material de trabajo, efectúe las siembras listadas a continuación: 1.

Siembre por picadura en tubos de agar sin inclinar (rectos) (bacteria).

2.

Siembre por estría en tubos de agar inclinado (bacteria).

3.

Siembre por técnica mixta en tubos de agar inclinado (bacteria).

4.

Siembre por agotamiento (aislamiento o estría cruzada), en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).

5.

Siembre por la técnica de cuadrantes, en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).

6.

Siembre por la técnica masiva y con hisopo, en la superficie de una caja Petri con agar Nutritivo (bacteria).

7.

Siembre en tubos de Caldo Nutritivo, utilizando asa bacteriológica (bacteria)

8.

Siembre por punción cajas de agar PDA (hongo).

9.

Siembre por punción tubos de agar PDA inclinado (hongo).

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. 1.

Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?

2.

Mencione brevemente el proceso de purificación de un aislamiento bacteriano obtenido en agares.

3.

Explique brevemente la metodología para realizar siembras en placa profunda y placa en superficie.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Lectura e interpretación de los cultivos. Pruebas de identificación

Trabajo Práctico Nº 7 TÍTULO: Lectura e interpretación de los cultivos. Pruebas de identificación. TEMA: Reproducción bacteriana:

Sexual y Asexual

Crecimiento y multiplicación microbiana. Curva de

crecimiento. Fases. Cinética de la reproducción de microorganismos. Crecimiento exponencial. Tiempo de generación. Influencia de los factores físicos y químicos. Presión, temperatura, nutrientes. Variaciones. OBJETIVOS A ALCANZAR. Capacitar al estudiante en las metodologías más utilizadas en microbiología, para la cuantificación directa e indirecta de microorganismos. Desarrollar habilidades en los estudiantes para el recuento de las poblaciones de microorganismos presentes en muestras de diferente origen. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Metabolismo De Carbohidratos Y Lípidos INTRODUCCIÓN AL TEMA: Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos o el peso seco (biomasa), de las células microbianas presentes en un cultivo. Los métodos en general se agrupan en directos o indirectos. MÉTODOS DIRECTOS. Los métodos directos, requieren de preparaciones puras sin ningún tipo de partículas que puedan interferir con los resultados y se refieren básicamente a la medida de la masa celular o directamente del número de individuos presentes en una muestra. Estas metodologías incluyen: Determinación del peso húmedo. En el cual se determina el peso del sedimento (microorganismos). Con esta metodología se pueden presentar errores debido al líquido intercelular retenido, el cual depende de la forma y tipo de agrupaciones del a bacteria y cuan intenso es este agrupamiento. Determinación de peso seco. Se basa en la misma técnica que el anterior, solo que el sedimento se seca antes de ser pesado. Los inconvenientes incluyen el hecho de ser una metodología compleja en tiempo y equipos; también, se presentan varios errores de cálculo de cantidades de biomasa muy pequeñas. Se calcula que 1mg de peso seco es igual a 5x109 bacterias. Determinación de nitrógeno total. Calculada por la técnica micro-Kjeldahl. Determinación de componentes característicos de las células. Como peptidoglicano, ácidos nucléicos, proteínas, ATP, etc. Esta metodología es aplicada comúnmente en bacterias, cuando otros métodos evidencian ser poco

exactos, debido a la formación de grumos no dispersables por el crecimiento típico del microorganismo y para mediciones de crecimiento en muestras de ambientes naturales. Recuento en cámara de Petroff-Hauser. Cámara de Neubauer o Hemacitómetro. La metodología se desarrolla sobre un portaobjetos en el cual se deposita la muestra; este portaobjetos tiene impresa una cuadrícula graduada y con medidas exactas: Profundidad de 0.02mm, área 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes (cada uno de ellos subdividido en 16 cuadrados más pequeños, en un arreglo de 4x4); entonces, cuando la muestra a cuantificar es depositada entre el portaobjetos calibrado y el cubreobjetos, se distribuye en 400 celdas (16 x 25 = 400) (Figura 1). Ya la muestra depositada y reposada, se procede a contar las células en 16 celdas (aunque las áreas contadas son variables), se registra el número contado en estas y se calcula la población de células de la siguiente forma: Concentración en células/mL = n x 25 x 50 x 1000 Donde n = número de células contadas en las 16 celdas. La ventaja de este método está dada por la rapidez para el cálculo del número de células, pero solo debe ser utilizado en muestras con poblaciones concentradas de células (>10 x 106 células/mL), pues con menores poblaciones, la observación al microscopio es poco significativa estadísticamente. Para obtener resultados más exactos, es recomendable tener un conteo entre 200 y 300 células por muestra.

Fig. 1. La imagen de la izquierda muestra la cámara de Neubauer y el portaobjetos para el depósito de la muestra, así como la cuadrícula graduada para el conteo de células (imagen central). El círculo amarillo indica el área de conteo de 25 cuadrados subdivididos a su vez en 16 (imagen de la derecha) Contadores electrónicos de partículas Coulter. El fundamento del método, es la interrupción de corriente por el paso de una célula. Con esta metodología se requieren muestras totalmente puras, pues cada partícula presente que no sea una célula, es registrada por el equipo o puede ser la causante de un daño del mismo. El registro de los individuos se realiza, haciendo pasar la suspensión microbiana a través de un tubo capilar entre dos polos de una corriente eléctrica; cada vez que por un orificio pasa una partícula (célula), se interrumpe la corriente y esta información es colectada por un dispositivo electrónico que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando y de esta manera se determina la población de células.

MÉTODOS INDIRECTOS. Consumo de nutrientes o producción de metabolitos / tiempo. Como por ejemplo la medición del consumo de oxígeno, consumo de gas carbónico, producción de ácidos y otros metabolitos, etc. Métodos ópticos de turbidimetría. Es la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo microbiano (efecto Tyndall). La dispersión es proporcional a la masa del cultivo y solo es válido para concentraciones mayores a 107 células/mL; donde, la proporcionalidad de la absorbancia y la masa bacteriana se conservan. Con este fin, puede ser utilizado el espectrofotómetro, que mide la densidad óptica (D.O.), es decir, la absorbancia. El nefelómetro, es un equipo similar al espectrofotómetro, pero la lectura registrada es de la luz dispersada por la muestra. Escalas o patrones de McFarland. Técnica basada en turbidimetría; La escala se basa en la capacidad de precipitación del Cloruro de Bario en presencia de Ácido Sulfúrico y su utilidad, es la poder elaborar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón y valorando su concentración; para esto, se toma una alícuota de la muestra de bacterias y se inocula en un tubo conteniendo solución salina fisiológica (0,85%). El objetivo es lograr ajustar una concentración de bacterias a uno de los patrones señalados en la Tabla 1 o determinar la concentración de una muestra. Tabla 1. Escala de McFarland, forma de preparación de cada patrón y su correspondencia en turbidez a una población de bacterias expresada en UFC/mL. Tubo

Escala de McFarland BaCl2 1% (mL)

H2SO 4 1% (mL)

UFC/mL

1

4,0

0,1

9,9

3,0x10 8

2

3,7

0,2

9,8

6,0x10 8

3

3,5

0,3

9,7

9,0x10 8

4

3,4

0,4

9,6

1,2x10 9

5

3,3

0,5

9,5

1,5x10 9

6

3,2

0,6

9,4

1,8x10 9

7

3,15

0,7

9,3

2,1x10 9

8

3,10

0,8

9,2

2,4x10 9

9

3,04

0,9

9,1

10

3,00

1,0

9,0

2.7x10 9 3,0x10 9

Los patrones de McFarland, permiten establecer una relación entre una precipitación química y una suspensión de bacterias (Figura 2). Se elaboran 10 estándares (Tabla 1), y por espectrofotometría se crea una recta patrón con la cual se va a poder determinar la concentración de las diluciones bacterianas elaboradas. La información arrojada es aproximada, ya que la lectura depende de factores como el tamaño de la bacteria y la formación de agrupaciones.

Fig. 2. Esquematización de los patrones de McFarland, donde se observa la turbidez ocasionada por la precipitación del Cloruro de Bario en presencia de Ácido Sulfúrico en diferentes proporciones, así como, su correspondencia a una población bacteriana expresada en UFC/mL. Recuento en placa estándar o recuento de microorganismos viables. Con este método se puede distinguir entre células viables y no viables; esto se logra sembrando diluciones de las muestras que contienen los microorganismos en medios de cultivos sólidos dispensados en cajas Petri, incubando y posteriormente realizando el conteo de las colonias visibles (la metodología puede ser aplicada en la superficie del agar o dentro del agar). Estas colonias a su vez, son multiplicadas por el factor inverso de la dilución (o diluciones), utilizado (Figura 3). Con esta metodología y con el objetivo de reducir el error estadístico, se recomienda realizar suficientes réplicas de las mismas diluciones, así como, de las diferentes diluciones a utilizar. Adicionalmente, el conteo y cálculo de la población de viables, se debe realizar en cajas que contengan entre 30 y 300 colonias (algunos autores reportan el rango de 50 a 300). En este tipo de conteo de viables, las colonias no siempre han de proceder de una sola célula, dado que algunas bacterias pueden formar agrupaciones y estas serán las que darán origen a la colonia; por lo anterior, los reportes de esta metodología se refieren a corresponde como mínimo a una bacteria formando una colonia, así como, también a un grupo de estas que han sido las formadoras de la misma.

Fig. 3. Cajas Petri sembradas con diluciones sucesivas, donde, la imagen de la izquierda representa la dilución menor (o más concentrada), en progresión hacia la dilución mayor o más diluida (imagen de la derecha)

Con esta metodología se pueden aplicar algunas modificaciones, como es el uso y conteo de viables sobre filtros de membrana de nitrocelulosa o nylon (para muestras con bajas poblaciones de microorganismos), en los cuales quedan atrapados los microorganismos, pues el tamaño del poro no permite su paso. Para este caso, las muestras se hacen pasar a través del filtro y posteriormente, el filtro es depositado sobre un medio de cultivo sólido, incubado y realizado el conteo de colonias formadas sobre él. PREPARACIÓN DE DILUCIONES. La fracción de la muestra destinada para el análisis microbiológico, debe ser representativa de la población y constituida normalmente por 200 gramos o mililitros (esto dependiendo del análisis). Para la puesta en marcha, se utilizan 100 g o mL y el resto se almacena como reserva, por si se hace necesario repetir el recuento. Si la muestra está constituida por distintos componentes, se tomarán fracciones representativas de cada una de ellas en la superficie y en la profundidad de la misma Para casi todos los análisis, se parte de una suspensión líquida de concentración conocida, que se denomina suspensión madre y que tiene una dilución 1:10 (10-1). Para conseguir este factor de dilución, se mide una cantidad de muestra (en gramos o mililitros), y el resultante, se multiplica por 9 (nueve). Este nuevo resultado serán los mililitros de diluyente que se debe añadir a la muestra para lograr la dilución decimal. A partir de esta dilución, se preparan las siguientes (1:100 o 10-2, 1:1000 o 10-3, etc.), hasta el factor requerido y establecido por el analista; recuerde que siempre se debe tener la precaución de cambiar la pipeta entre la realización de cada una de las diluciones y de mantener en frío, los tubos de la serie de diluciones, hasta el comienzo de los análisis, pero sin prolongar por más de dos horas esta refrigeración. Con la finalidad de realizar las diluciones con diferentes volúmenes o pesos de las muestras y obtener diferentes factores de dilución, se puede hacer uso de la siguiente fórmula: Factor de Dilución =

Soluto Solvente + Soluto

Donde, el soluto es la muestra (sólida o líquida), y el solvente es el diluyente utilizado. Tenga en cuenta que para el cálculo de la segunda dilución y posteriores, debe multiplicar el resultado por el factor de dilución, de la dilución inmediatamente anterior. Para la pesada de la muestra, aplique la técnica mencionada a continuación: -

Tarar el recipiente estéril que se vaya a utilizar para triturar la muestra.

-

Introducir asépticamente, la porción de un volumen adecuado en dicho recipiente.

-

Pesar de nuevo para determinar el peso neto de la muestra.

-

Con una probeta graduada estéril, añadir la cantidad de diluyente estéril, para obtener la dilución deseada.

-

Para el caso de muestras líquidas, utilizar pipetas de volumen adecuado y estériles.

La característica principal de un buen diluyente, es que no produzca modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la microbiota de la muestra que van a ser analizada, sin suprimir ni favorecer su desarrollo. En microbiología, se utilizan varios diluyentes, pero habitualmente se usan los siguientes: Agua de Triptona con Sal, Solución de Ringer ¼ y/o Agua de Peptona Tamponada. El diluyente utilizado para la solución madre se suele emplear posteriormente, para efectuar las diluciones decimales. La trituración de la muestra, es una operación muy importante, pues en esta se debe evitar la destrucción de los gérmenes presentes, ya sea por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Además de una trituración perfecta de la muestra, es necesario obtener una mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los microorganismos. Para la homogenización de la muestra, existen varios tipos de trituradores, como: - Jarra o licuadora, que consiste en un envase de vidrio o acero provisto de una hélice que funciona cuando se adapta a un motor. - Vástago, provisto de una hélice en su extremo que se introduce en la mezcla que se va a triturar. Funciona eléctricamente y necesita de un envase de vidrio acero estériles, que se adapten especialmente al vástago. - Triturador de paletas o Stomacher, que actúa golpeando rítmicamente la mezcla de la muestra y diluyente, que han sido previamente introducidos en una bolsa de plástico estéril; los choques producidos por las paletas disgregan la muestra y ponen a los microorganismos en suspensión. -

Para las muestras líquidas, posterior a la realización de la dilución, se debe agitar suavemente de forma manual o en vórtex, con el objetivo de homogenizar los microorganismos en todo el diluyente.

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR. -

1 stomacher o licuadora.

-

1 recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para stomacher).

-

1 balanza de precisión de 0.1g.

-

Para preparación de muestras: Cuchilla y tijeras esterilizadas.

-

9 pipetas de 1mL estériles.

-

1 pipeta de 10 mL estéril.

-

3 tubos con Agua Peptona 0.1% estéril.

-

6 cajas Petri estériles.

-

3 cajas Petri con agar para Standard Plate Count (SPC).

-

1 pipeta Pasteur pláticas estéril.

-

2 tubos con 10mL de Solución Salina 0,85%.

-

1 microscopio binocular compuesto.

-

1 espectrofotómetro.

-

45 mL de agar SPC fundido y mantenido a 45-50°C.

-

1 baño de agua mantenido a 45 - 50°C.

-

1 incubadora de 35±2°C.

-

1 contador de colonias.

-

45 mL de agar OGY, Sabouraud, PDA (para conteo de Mohos y levaduras).

-

1 calculadora.

-

1 tubo con cultivo bacteriano de 24h en Caldo Nutritivo.

-

1 caja Petri con cultivo fúngico de 3d en agar PDA.

-

2 asas de vidrio o de hockey estériles.

-

1 asa bacteriológica.

-

1 cámara de Neubauer.

-

1 batería de patrones de McFarland.

-

1 mechero Bunsen.

PROCEDIMIENTO. Recuento en placa profunda (o técnica de Barry), y placa en superficie. -

Realice inicialmente los cálculos de diluciones decimales iguales a 10-1, 10-2 y 10-3, siguiendo las indicaciones de la guía y las indicaciones del tutor.

-

Realice el proceso de dilución utilizando la muestra problema y el diluyente apropiado, guiándose por los cálculos realizados anteriormente. Recuerde utilizar solo material estéril en el procedimiento.

-

Con las tres diluciones preparadas, proceda a inocular diferentes cajas Petri vacías y con agar SPC (siembra en profundidad y en superficie).

-

Para la siembra en profundidad: De la dilución 10-1, tome con una pipeta estéril de 1mL de capacidad, 1mL y colóquelo en una caja de Petri estéril; repita este procedimiento en otra caja (cada dilución tendrá un duplicado), y de igual forma para las dos siguientes diluciones.

-

Cuando haya sembrado todas las cajas (seis cajas en total), proceda a verter agar Standard Plate Count – SPC (Agar para conteo estándar), fundido y mantenido a 45°C aproximadamente. Homogenice cada caja, realizando movimientos circulares y en ocho, hasta que el agar inicie su polimerización.

-

Para la siembra en superficie: De la dilución 10-1, tome con una pipeta estéril de 0,1mL de capacidad, 0,1mL y colóquelo en la superficie de una placa de agar SPC y con asa de vidrio, inmediatamente homogenice el inóculo por toda la superficie del agar; repita este procedimiento en otra caja (cada dilución tendrá un duplicado), y de igual forma para las dos siguientes diluciones.

-

Recuerde que en la técnica en superficie, debe utilizar 0.1mL de la dilución y en la técnica en profundidad 1 mL.

-

Incube invertidas las cajas a 37±2°C. Revise las cajas a las 24 horas de incubación y realice un recuento de las colonias visibles; incube nuevamente y revise a las 48h, realice el recuento (Estas temperaturas y tiempos se aplican para el análisis de bacterias aerobias mesófilas). Para el recuento de Mohos y Levaduras, aplique la misma técnica (profundidad y superficie), e incube invertidas las cajas a 25°C por 3 a 5 días (al igual que en el recuento de bacterias aerobias mesófilas, realice conteos a los 3 y posteriormente a los 5 días de incubación).

-

Con los datos obtenidos en los recuentos, proceda a realizar los cálculos, de acuerdo a los volúmenes utilizados en la siembra y al factor de dilución de cada pareja de cajas.

-

Reporte correctamente sus resultados del conteo de viables en UFC, por gramo o mililitro, de acuerdo a la naturaleza de la muestra analizada.

Recuento en cámara de Neubauer. -

Revise los conceptos relacionados en esta práctica y siga las instrucciones proporcionadas por su tutor.

-

Verifique que la muestra se encuentre diluida, para proceder a calcular la concentración de células por mililitro de muestra.

-

Monte la cámara de Neubauer en el microscopio, localice la cuadrícula para conteo y lleve a aumento de 10x. En este momento, debe observarse correctamente la cuadrícula y comprender la distribución y las áreas a contar.

-

Coloque el cubreobjetos de la cámara al borde de la misma y cubriendo la cuadrícula de conteo.

-

Homogenice en vórtex la muestra y con una pipeta Pasteur estéril, tome una alícuota de la misma; permita que por capilaridad, la cámara absorba la muestra.

-

Verifique por observación, que la distribución de las células en la cámara sea homogénea. Si no es así, realice nuevamente el montaje de la cámara.

-

Proceda a realizar el conteo, registre sus datos y calcule la concentración de células/mL. Ajuste de concentraciones bacterianas mediante Patrones de McFarland. Método A:

-

Revise los conceptos relacionados en esta práctica y siga las instrucciones proporcionadas por su tutor.

-

A cada patrón McFarland, determine su turbiedad mediante el uso de un espectrofotómetro. Tenga en cuenta calibrar el equipo con un tubo que solo contenga agua destilada.

-

Grafique las lecturas obtenidas de la siguiente forma: En el eje Y (ordenadas), los valores de densidad óptica (D.O.), registrados y en el eje X (abscisa), el número aproximado de bacterias representado para cada patrón McFarland.

-

Concluida la calibración de los diferentes patrones, proceda a calcular la población de bacterias en la(s) muestra problema.

-

Vierta asépticamente cada muestra problema en las celdas adecuadas para el espectrofotómetro y determine la D.O.; recuerde ajustar el “0” del equipo, con la muestra problema.

-

Calcule la población bacteriana en UFC/mL. Método B:

-

Los patrones de McFarland para la preparación de suspensiones bacterianas de concentración conocida, pueden también ser elaborados a partir de parámetros visuales de turbidez.

-

Primero, seleccione uno de los patrones McFarland, de acuerdo a la concentración necesaria de bacteria y homogenícelo totalmente (ya que los patrones se precipitan cuando no están en uso).

-

Para el ajuste de la concentración por comparación con un patrón, tome asépticamente alícuotas del crecimiento de la bacteria en cajas Petri y con asa bacteriológica; transfiéralas a un volumen adecuado de solución salina fisiológica (en porciones pequeñas).

-

Compare la turbidez del patrón con la turbidez de la muestra en preparación, colocando a contra luz o en un fondo oscuro los dos tubos, para realizar una correcta comparación visual.

-

Detenga la adición de bacterias, cuando haya logrado la misma turbidez de la suspensión bacteriana con el patrón McFarland seleccionado.

-

Registre correctamente la información de cada patrón y la concentración que corresponde a cada uno de ellos y a la muestra bacteriana preparada.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. 1. Explique brevemente el proceso mediante el cual se realiza el recuento de microorganismos por la técnica de tubos múltiples (o técnica del Número Más Probable - NMP). 2.

Defina el término inóculo.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996. 

                           

Medición y recuento de microorganismos. Recuento en placa y en cámaras

Trabajo Práctico Nº 8 TÍTULO: Medición y recuento de microorganismos. Recuento en placa y en cámaras. Técnicas de coloración de microorganismos. Coloración de Gram-Nicolle. Otras coloraciones TEMA: Definición de virología. Los virus: Forma, tamaño, replicación y principales especies. Procesos enzimáticos. Las enzimas: definición, generalidades. Características físico-químicas. Propiedades fundamentales. Estudios cinéticos. Variables. Producción. Transferencia de energía OBJETIVOS. Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Gram positi-vas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cápsulas con tinciones selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Bacteriología, virología y protozoología general INTRODUCCIÓN AL TEMA: La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el coloran-te primario (cristal violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero la combinación con el colorante es más permanente en los gram positivos. Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color prima-rio, pero tiñe a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retención o eliminación del colorante primario después del proceso de decoloración. Otras tinciones que permiten obtener mayor información son la negativa y la selectiva. La tinción negativa facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del calor así como de estructuras especiales, como la cápsula de algunas especies bacterianas. La cápsula también llamada glicocálix es una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la desecación y la fagocitosis.

La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo obscuro. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son importantes criterios de clasificación taxonómica. Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR. 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Parrilla de calentamiento 1 Mechero 5 Portaobjetos 1 Piceta con agua destilada Cristal violeta (Anexo 1.3) Safranina (Anexo 1.8) Lugol (Anexo 1.5) Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6) en Verde de malaquita (Anexo 1.4) Tinta china Fenol 2% (Anexo 1.9) Aceite de inmersión Microscopio compuesto de campo claro PROCEDIMIENTO. El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcussp., Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp. El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinción de Gram. También realizará la tinción selectiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinción negativa en cultivos de K/ebsiel/a sp. Tinción diferencial de Gram a)

Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto

b)

Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante

c)

Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.

d)

Lavar cuidadosamente el frotis con agua.

e)

Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya más

tintura. f)

Inmediatamente lavar con agua.

g)

Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.

h)

Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar

secar al aire.

Tinción negativa para observación de cápsulas a)

Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del I cultivo líquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.

b)

Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra.

c)

Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.

d)

Dejar secar al aire.

Observaciones al microscopio 1.

Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2.

Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

3.

Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas.

Resultados A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3 de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos. B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

Cuadro 3 Descripción microscópica de cultivos bacterianos

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. 1.

Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tinción diferencial.

2.

¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?

3.

¿Explique qué reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma importancia que para las bacterias? ¿Por qué?

4.

Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Qué dificultades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción?

5.

Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica. ¿Qué tipo de información se obtiene? Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Análisis Microbiológico de agua y bebidas.

Trabajo Práctico Nº 9 TÍTULO: Análisis Microbiológico de agua y bebidas. Técnica de filtración por membrana. Estudio de muestra problema TEMA: Definición de protozoología. Los protozoarios: Forma, tamaño, reproducción y principales especies. OBJETIVOS A ALCANZAR. Valorar la realización del análisis microbiológico Conocer y llevar a cabo técnicas de análisis microbiológico de estos productos. Adquirir habilidades para la realización de la técnica de filtración por membrana. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Bacteriología, virología y protozoología general INTRODUCCIÓN AL TEMA: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE VINOS Y MOSTOS Con el objeto de detectar problemas relacionados o provocados por microorganismos durante el proceso de elaboración o en el producto terminado, se deben realizar de manera criteriosa estudios microbiológicos en momentos determinados del proceso completo. La Asamblea General de la Organización Internacional del vino (O.I.V.) público una guía para la realización de los mismos. Según las informaciones que se deseen obtener hace referencia a tres tipos de técnicas: 1. Ensayos de comportamiento -

Ensayo de comportamiento al aire.

-

Ensayo de comportamiento en estufa.

2. Detección, diferenciación de microorganismos y recuento directo de levaduras. -

Examen microscópico de los líquidos o de los depósitos.

-

Coloración vital con azul de metileno.

-

Coloración de gram.

-

Determinación de la catalasa

-

Recuento directo de las levaduras en microscopio

3. Recuento de los microorganismos por cultivo. -

Cultivo en placas

-

Cultivo en membrana luego de filtración.

-

Cultivo en medio líquido.

Técnica de Filtración por Membrana Instalar el equipo de filtración estéril y conectada a la bomba de vacío. Enjuagar el conjunto completo del filtro con agua estéril, haciendo pasar varios enjuagues por el mismo. Esto eliminara los rastros de alcohol que pudieren haber quedado del procedimiento de esterilización. Colocar una membrana filtrante estéril de 0,2 um en la frita o soporte para la misma, utilizando pinzas esterilizadas (las que deben de permanecer en un recipiente con alcohol, que no cubra más de la tercera parte de la misma, y prenderle fuego a las puntas antes de cada uso). Mojar el filtro con unos milímetros de agua estéril de amortiguación, para facilitar la distribución de los microorganismos sobre el mismo. Si el volumen de la muestra que se va a filtrar es inferior a 10 ml agregar al menos 10 a 50 ml de amortiguación. El volumen deseado de muestra debe ser transferido rápidamente al recipiente superior del aparato, empleando siempre técnica aséptica. Luego se debe aplicar una aspiración moderada para filtrarla. Enjuagar el embudo dos veces con solución amortiguadora. Detener la aspiración del aparato y retirar la membrana para depositarla sobre la superficie del medio de cultivo, que se encuentra en una placa de Petri. Si se realizan más de una siembra por muestra no es necesario esterilizar el equipo entre cada una de ellas. En cambio es indispensable hacerlo entre cada muestra. Las placas deben ser incubadas a las temperaturas y tiempos indicados para cada tipo de microorganismo buscado. En el presente trabajo se realizaran siembra para la búsqueda de levaduras, bacterias lácticas y acéticas, consideradas importantes en el vino, tanto su presencia como su ausencia, según los objetivos perseguidos para el producto. Mencionaremos las diferencias más importantes que hay entre estos dos últimos grupos de microorganismos, ya que el tema será abordado en clase teórica. Principales diferencias entre bacterias lácticas y acéticas Características Morfología Gram Requerimiento de oxígeno

Bacterias Lácticas Bacilos

largos

Bacterias acéticas y

delgados, Bacilos

elipsoidales

cocobacilos cortos y cocos.

curvos o cocobacilos.

+

-

Microaerófilas o aerotolerantes o anaerobias facultativas

rectos

o

Aerobias

Prueba de catalasa

-

+

Cultivo

Man Rogosa Shape

Medio CAAR Agar YPD + CO3Ca

Generos, ejemplos

Oenococcus Lactobacillus

Acetobacter Gluconobacter

Agar YPD + CO3Ca Estracto de levadura 5 g/L Peptona 5 g/L

Glucosa 40 g/L Agar 20 g/L Pimaricina 1 g/L CO3Ca 5 g/L CAAR Estracto de levadura 30 g/L Agar 20 g/L Verde Bromocresol 4,4 % 0,5 ml/L Agua destilada (hasta Volumen final) Pimaricina 1g/L Esterilizar y atemperar. Agregar etanol 99% 20%. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.  Mecheros  Equipo de filtración por membrana  Membranas filtrantes de 0,2 um de porosidad estériles  Bomba de vacío  Placas con medios de cultivo para bacterias lácticas, acéticas y para levaduras.  Alcohol etílico al 70%.  Equipos para anaerobiosis.  Algodón  Gasa  Estufa de cultivo Hipoclorito de Sodio  Encendedor PROCEDIMIENTO. Se realizaran siembras para la búsqueda de bacterias lácticas, acéticas y levaduras, en los medios de cultivo apropiados, de una muestra aportada por el docente, en grupos de dos o tres alumnos. Los resultados serán evaluados en la clase siguiente. Incubaciones Bacterias lácticas: en anaerobiosis o microaerofilia a 28-30°C hasta 10 días. Bacterias acéticas: en aerobiosis entre 28-30 °C durante 3 a 5 dias Levaduras: en aerobiosis entre 25 y 30 °C durante 3 a 10 días.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. LOS ALUMNOS DEBERAN DCONTROLAR SUS CULTIVOS Y EFECTUAR LAS LECTURAS E INTERPRETACIONES EN LOS TIEMPOS INDICADOS PARA ELABORAR LOS INFORMES. Análisis Microbiológico del agua El análisis microbiológico del agua se realiza en función de los objetivos planteados para el mismo, de acuerdo a la utilidad que se le da al objeto de estudio, no son los mismos para un agua de red para consumo, que para una empleada para riesgo exclusivamente, por ejemplo. Los microorganismos patogénicos que pueden encontrarse en el agua, provienen generalmente de la contaminación con excrementos de animales y del hombre. Pueden ocasionar patologías en los mismos huéspedes, de allí el interés por detectarlos y evitarlos. Organismo patogénicos entéricos encontrados en el agua: Bacterias

Protozoarios

Virus

Salmonella

Giardia

Coxsackievirus

Shigella

Cryptosporidium

Echovirus

Campylobacter

Entamoeba histolýtica

Poliovirus

Escherichia coli

Adenovirus

Leptospira

Reovirus

Yersinia

Rotavirus

Legionella

Hepatitis A

Vibrio cholerae

Norwalk-type

Los desafíos que se plantean para poder aislarlos son los siguientes: 1. Detección específica para cada microorganismo 2. No existe un único procedimiento para todos los patogénicos 3. Están presentes en pequeñas cantidades 4. Técnica trabajosa para el aislamiento y personal altamente entrenado 5. Tiempo y costo económico. Obtención de muestra de agua a partir de un grifo: Debe flamearse convenientemente el grifo, dejar que fluya el agua sin turbulencias durante 5 minutos y luego recogerla en frascos estériles, que se abren en el mismo momento de la toma, preferentemente de un litro de capacidad. Si es un agua clorada el frasco debió ser esterilizado con una solución 0,01 de tiosulfato de sodio.

Si se tratara de agua procedente de lagos, ríos, estanques, pantanos se tendrán en cuenta otras premisas. En todos los casos deben evitarse los remansos, las cercanías de las orillas y las zonas superficiales o excesivamente profundas. Generalmente se sumerge el frasco se le destapa a 10 cm de profundidad y allí se le llena a contracorriente. El traslado debe ser rápido y refrigerado a 4°C y el análisis debe ser efectuado lo antes posible, antes de las 48 horas. Se debe realizar una estimación de cantidad de microorganismos presentes en la muestra, para determinar si es necesario o no efectuar diluciones de la misma (las que se tendrán en cuenta en el momento del cálculo de los recuentos). Recuento de bacterias mesófilas: en agar nutritivo o PCA. Incubación a 37°C durante 24 a 48 horas. Recuento de mohos y levaduras: en agar sabouraud (o similar). Incubación a 20-22 °C durante 5 días. Bacterias coliformes: por el método del NMP (Número más probable) a 37°C – 48 h. (Caldo Mc Conkey o Luril Sulfato), en 100 ml. Este método se basa en una estimación derivada de la teoría de probabilidades aplicable a la enumeración de microorganismos bajo ciertas condiciones. Se emplea el medio Mc Conkey (o similar) líquido con campanas de dírham. Se considera positivo aquellos tubos en los cuales se evidencia cambio de color y presencia de gas. Presencia de Escherichia coli: todos los tubos que resulten positivo en el ensayo anterior, se repican a medio solido (agar Mc Conckey o similar) y a partir de allí a las colonias sospechosas se les efectúan pruebas de identificación (IMVIC, urea, fermentación de azucares, motilidad, etc.) Presencia de Pseudomonas aeruginosa: en agar cetrimide y se incuba 48 horas a 37°C. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.  Mecheros  Equipo de filtración por membrana  Membranas filtrantes de 0,2 um de porosidad estériles  Bomba de vacío  Placas con medios de cultivo ( Agar Mc Conkey, Agar sabouraud, agar cetrimide, agar nutritivo)  Tubos con caldo Mc Conckey y campana de Durham.  Alcohol etílico al 70%  Equipos para anaerobiosis  Algodón  Gasa  Estufa de cultivo  Hipoclorito de Sodio  Encendedor

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. LOS ALUMNOS DEBERAN DCONTROLAR SUS CULTIVOS Y EFECTUAR LAS LECTURAS E INTERPRETACIONES EN LOS TIEMPOS INDICADOS PARA ELABORAR LOS INFORMES. BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Micología. Técnicas micológicas.

Trabajo Práctico Nº 11 TÍTULO: Micología. Técnicas micológicas. Preparación de medios de cultivo. Repiques de hongos levaduriformes y filamentosos para su posterior identificación TEMA: Definición de Micología. Generalidades. Los hongos: Forma, tamaño, reproducción y principales especies. Hongos filamentosos. Hongos levaduriformes. Estructura. Metabolismo. Principales especies relacionadas con procesos agroalimentarios OBJETIVOS A ALCANZAR. -

Practicar las diferentes técnicas de siembra para el desarrollo de cultivos y subcultivos de hongos y bacterias, en medios de cultivo dispensados en tubos y cajas Petri, así como, en medios de diferente composición y estado.

-

Desarrollar en los estudiantes la capacidad de selección de una metodología específica, de acuerdo a los criterios proporcionados, para la aplicación correcta de las técnicas de siembra de acuerdo al microorganismo y al objetivo de la prueba.

COMPETENCIAS RELACIONADAS: Microbiología y Sanidad, técnicas de observación. INTRODUCCIÓN AL TEMA: El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre de siembra; esta operación la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus secreciones, etc.), de análisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras ambientales (agua, suelo, etc.), o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de un cultivo a otro la denominamos subcultivo o repique. Para el estudio de las bacterias y otros microorganismos cultivables, es necesario además, conocer y reconocer la morfología microscópica y macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo. Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos elementos importantes para realizar siembras, como: El mechero (de alcohol o de Bunsen), el asa bacteriológica (asa de argolla), o micológica (asa recta), cámaras de flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones asépticas y los medios de cultivo ya preparados y atemperados a 37°C; esta última observación es importante tenerla en cuenta, ya que los microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras o cultivos, deben evitar ser estresados con cambios bruscos de temperatura o por otros factores (incluida la composición del medio de cultivo).

Contando con estos implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de cultivar o subcultivar muestras o aislamientos previamente obtenidos. TÉCNICAS DE SIEMBRA. La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, hongos y otros cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axénico (o cultivo puro). Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus características en estos medios. Se entiende por cultivo puro, una población de células las cuales todas proceden de una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI. Siembra en cajas de Petri por la Técnica de agotamiento, aislamiento o de estría cruzada. Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias aisladas); mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo. Para su realización: (i) se toma la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un área periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo. (ii) El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no dañarlo); a continuación se realiza una estría partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie del agar. Se debe procurar que en cada sección de la caja, las estrías queden trazadas con mayor separación. (iii) Repita el paso ii, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear y enfriar el asa cada vez que culmine una estría y solo tocar con el asa la estría inmediatamente anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla (Figura 1).

Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros microorganismos emulsionables como las levaduras) (Fuente: Rojas, A.).

Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes. El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan estrías en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriográfico por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inóculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria. Con esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última estría realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2).

Fig. 2. Técnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estrías realizadas una a continuación de la otra y sin cargar el asa nuevamente (Fuente: Rojas, A.). Siembras en cajas de Petri por la Técnica de siembra masiva. Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos (incremento de inóculo), en la superficie de un agar. Esta técnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en la superficie de la placa (Figura 3).

Fig. 3. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica masiva, utilizando hisopos estériles y sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.).

Siembras en cajas de Petri por la Técnica de punción. Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo de cepas previamente almacenadas y /o conservadas. Consiste en tomar parte de micelio con un asa micológica (o asa recta), y por una punción suave en el centro de la caja inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo, pueden hacerse múltiples picaduras en el agar (varios puntos de siembra) (Figura 4).

Fig. 4. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica de punción, utilizando asa micológica y sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.). TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS. La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de interés, por lo tanto se deben tener las siguientes precauciones:

- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de este. - Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar. - Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación. - Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el medio de cultivo). - Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo. - Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo. - Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo. - Siembre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su defecto con mecheros Bunsen. - En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como, utilice asas totalmente rectas.

Siembra en tubos por estría simple. Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estrías (Figura 5A). Siembra mixta en tubos. Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo (Figura 5B). Siembra en tubos por picadura. Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura 5C y 5D). Siembra en tubo en medio líquido. Para transferir material a partir de un medio líquido o sólido a otro líquido, puede usarse el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estériles o hisopos. Si Usted utiliza asas bacteriológicas, inocule el microorganismo en el medio líquido haciéndola rotar del mango (Figura 5E).

Fig. 5. Técnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos, donde: (A) Siembra por estría simple, (B) siembra mixta (picadura y estría), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra con asa bacteriológica en medio líquido (Fuente: Rojas, A.).

NOTA: En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas Petri o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y la fecha. Para análisis clínico, marcar siempre las cajas en la base de la caja Petri y para análisis de control de calidad de alimentos u otras materias primas, marcar las cajas en la tapa de la caja Petri. Luego de realizada la siembra, usted debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado caso, un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inóculo no se ha adsorbido, espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa hacia arriba por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el agua de condensación que pueda formarse en la tapa de la caja, caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR. -

1 caja Petri con agar PDA.

-

4 cajas Petri con agar Nutritivo.

-

1 tubo con 5mL de Caldo Nutritivo.

-

1 tubo con agar SIM.

-

2 tubos con agar Nutritivo en bisel.

-

1 tubo con agar PDA en bisel.

-

2 hisopos estériles en tubo taparosca.

-

1 asa bacteriológica.

-

1 asa micológica.

-

1 mechero Bunsen.

-

1 cultivo bacteriano en caja Petri con agar Nutritivo de 24h.

-

1 cultivo fúngico en caja Petri con agar PDA de 3 días.

-

Etanol 70%.

-

Toallas desechables.

-

1 rollo de papel para sellar cajas Petri.

-

1 rollo de cinta de papel.

-

2 incubadoras de35±2°C y 25°C.

PROCEDIMIENTO. De acuerdo a la fundamentación teórica de esta guía, a las indicaciones del Docente y al material de trabajo, efectúe las siembras listadas a continuación: 1.

Siembre por picadura en tubos de agar sin inclinar (rectos) (bacteria).

2.

Siembre por estría en tubos de agar inclinado (bacteria).

3.

Siembre por técnica mixta en tubos de agar inclinado (bacteria).

4.

Siembre por agotamiento (aislamiento o estría cruzada), en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).

5.

Siembre por la técnica de cuadrantes, en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo (bacteria).

6.

Siembre por la técnica masiva y con hisopo, en la superficie de una caja Petri con agar Nutritivo (bacteria).

7.

Siembre en tubos de Caldo Nutritivo, utilizando asa bacteriológica (bacteria)

8.

Siembre por punción cajas de agar PDA (hongo).

9.

Siembre por punción tubos de agar PDA inclinado (hongo).

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. 1.

¿Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?

2.

Mencione brevemente el proceso de purificación de un aislamiento bacteriano obtenido en agares.

3.

Explique brevemente la metodología para realizar siembras en placa profunda y placa en superficie.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996. 

                         



Hongos levaduriformes. Observaciones

Trabajo Práctico Nº 12 TÍTULO: Hongos levaduriformes. Observaciones. Técnicas de identificación. Auxonograma y zimograma. Métodos convencionales y comerciales TEMA: Agitación y aireación, requerimientos de oxígeno. El fermentador como reactor biológico. Materiales de construcción. Instalaciones accesorias. El proceso de fermentación. Fermentadores continuos. Aplicación en la industria enológica. OBJETIVOS A ALCANZAR. Que el alumno aprenda las técnicas de cultivo y manipulación de diferentes tipos de hongos. Que el estudian-te conozca las principales características morfológicas (macroscópica y microscópicas) de los hongos. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Microbiología y Sanidad, técnicas de observación. INTRODUCCIÓN AL TEMA: Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bacterias, se distinguen de otros eucariontes como los animales por ser inmóviles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicos que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son 5 absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongos di mórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambientales como la temperatura. Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación, un proceso por el cuál brota una protuberancia o yema de la célula madre que posteriormente se separa como célula individual. El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce como hifas cenocíticas. El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, por fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abundantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifas aéreas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripción de las estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de

clasificación, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las cuáles se han descrito más de 250 000 y de éstas solo se conocen 150 especies patógenas para el hombre y otras tantas para plantas y animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios que proporcionan al hombre, ya que como se mencionó la mayoría son saprobios (utilizan materia orgánica muerta), por lo que tienen una gran capacidad de reciclar materiales orgánicos de diferentes tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de biodegradación de compuestos recalcitrantes en procesos de biorremediación. Desde la antigüedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentos como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversas especies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y que pueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas). MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR.  4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA  4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox  3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA  2 matraces Erlenmeyer de 250 mL  1 Probeta de 100 mL  1 Vaso de precipitados de 100 mL  1 Mechero Fisher  5 Portaobjetos y cubreobjetos  1 Aguja de disección  1 Asa de siembra  Cinta adhesiva transparente  Microscopio óptico de campo claro  Aceite de inmersión  Autoclave  Incubadora a 30 °C  Azul de lactofenol PROCEDIMIENTO. El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, Penicllum chrysogenum, Rhizopus oligosporus, Trlchodermaviridey de la levadura Saccharomycescerevislae.

El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo. Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica la realizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol. Siembra de hongos 1.

Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con aguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.

2.

Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio de Czapek-Dox.

3.

Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inoculación de bacterias.

4.

Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a 28-30 °C durante 3-5 días.

Descripción macroscópica de levaduras y mohos 1.

Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae.

2.

En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.

Descripción microscópica de levaduras 1.

De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teñirlo con azul de metileno.

2.

Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.

Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva 1

Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos.

2.

Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la colonia.

3.

Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el centro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejor posible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.

4.

Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X.

5.

Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos, esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. A. Reportar sus observaciones. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cada uno de los microorganismos y colorearlos. B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6. C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la práctica.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Hongos filamentosos. Observaciones

Trabajo Práctico Nº 13 TÍTULO: Hongos filamentosos. Observaciones. Técnicas de identificación. Colonia gigante. Microcultivos TEMA: Biosíntesis y degradación de aminoácidos. El ciclo de la Urea: regulación. OBJETIVOS A ALCANZAR. - Que el estudiante se familiarice con las morfologías macro y microscópicas típicas de los hongos y logre establecer comparaciones con la morfología y estructuras bacterianas. - Que el estudiante esté en la capacidad de realizar diferentes tipos de montajes, utilizados para la identificación de hongos. - Reconocer los diferentes tipos de estructuras de los hongos, de acuerdo a la Clase a la cual pertenecen. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Microbiología y Sanidad, técnicas de observación.

INTRODUCCIÓN AL TEMA: Los hongos son organismos de organización Eucariota y de mayor tamaño que las bacterias; estos se diferencian de otros Eucariotas, por ser inmóviles (aunque algunas células presentan mecanismos de locomoción), carecer de pigmentos fotosintéticos y por las variaciones en la composición de su estructura (como paredes celulares). Los hongos presentan una tipo de nutrición heterótrofa (quimiorganótrofos), dependiendo de nutrientes orgánicos, solubilizados por los sistemas enzimáticos de los hongos y absorbidos a través de la pared y membrana celulares. Los hongos pueden ser unicelulares (como las levaduras), o multicelulares (hongos filamentosos); sin embargo, existen hongos pleomórficos, que de acuerdo al medio en el cual se encuentren, desarrollan un crecimiento filamentoso o un crecimiento de tipo levadura. Estos últimos son principalmente hongos patógenos. Las levaduras son hongos unicelulares de forma esférica, alargada u oval y con diferentes colores (blanco, rosado, beige o rojo). Su tamaño oscila entre 2,5–10 x 4,5-21 µm. Son anaerobios facultativos, siendo las levaduras aeróbicas productoras de CO2, agua y biomasa relativamente alta y las levaduras anaerobias, fermentadoras de azúcar en alcohol, CO2 y menos biomasa. La mayoría son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC, crecen en un rango amplio de pH entre 2,5 y 8. No presentan mecanismos de locomoción, por lo que únicamente pueden ser transportadas a través de corrientes de aire, fluidos o por insectos. Las levaduras se reproducen por gemación, generando en este proceso la célula madre, una o varias yemas que, crecen y se separan formando células independientes; otra forma de división de las levaduras es la división transversal o escisión. En medios de cultivo forman colonias opacas, cremosas o pastosas (Figura 1).

Fig. 1. (A) Morfología típica de las levaduras y reproducción por gemación (círculo rojo), y (B) característica de las colonias sobre medio de cultivo PDA (Fuente: Rojas, A.). En comparación con las levaduras, los hongos filamentosos (mohos), presentan un desarrollo de estructuras denominadas talo, que está compuesto a su vez por hifas ramificadas y que en su total, conforman el micelio del hongo (que es macroscópicamente observable). Estas hifas, a su vez, pueden presentar septos o tabiques transversales, conformando el micelio tabicado o septado (las hifas septadas a su vez, pueden contener un núcleo o varios núcleos formando células multinucleadas). De forma contraria, en algunas Clases de hongos, las hifas son continuas (sin ningún tipo de separaciones), denominándose hifas cenocíticas, como en los hongos de la Clase Zygomycetes y anteriormente los Oomycetes (o pseudohongos), los cuales, actualmente pertenecen a un reino diferente a los hongos, el reino Stramenopila (junto con las diatomeas, las algas pardas, etc.). Las hifas que conforman el talo de los hongos filamentosos, se ramifican en todas direcciones del sustrato, donde van absorbiendo los nutrientes necesarios. La pared de las hifas es delgada, transparente, tubular que interiormente puede tener una capa de protoplasma variable en su grosor. Las hifas presentan crecimiento apical y en el ápice de las hifas, existen un gran número de vesículas citoplasmáticas, que tienen diferentes disposiciones, según el tipo de hifa (septada o cenocítica) (Figura 2).

Fig. 2. Tipos de hifas de hongos filamentosos, donde se observan (A), hifas septadas o tabicadas e, (B) hifas cenocíticas (Fuente: Rojas, A.). Fisiología y nutrición de los hongos. Fisiológicamente los hongos se adaptan a condiciones más severas que las bacterias. Por ejemplo, los mohos se desarrollan en sustratos con concentraciones de azúcar que las bacterias no pueden tolerar ya que, los hongos no son tan sensibles a la presión osmótica elevada. Los hongos toleran y se desarrollan en concentraciones de

acidez elevadas, soportan escalas de pH entre 2 a 9 pero el pH óptimo es 5.6. Aunque necesitan humedad para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmósfera y del medio, los hongos pueden vivir en ambientes deshidratados que serán inhibitorios para la mayor parte de las bacterias. Casi todos los hongos son estrictamente aerobios, pero su crecimiento se aumenta por la presencia de oxígeno (las levaduras son facultativas y los mohos u hongos filamentosos son estrictamente aerobios, con algunas excepciones); se desarrollan en condiciones de temperatura muy variadas pero entre 22-30ºC es la temperatura óptima. La glucosa es una fuente de carbono muy aprovechada por muchos hongos; otros azúcares como, sacarosa y maltosa y muchos carbohidratos más complejos como almidón y celulosa son utilizados por muchas especies. El Nitrógeno inorgánico es aprovechado por algunas especies en forma de amonio o nitratos; otras especies necesitan sustratos con Nitrógeno orgánico que, frecuentemente se proporciona a los medios artificiales en forma de peptona. Los hongos son capaces de catabolizar y utilizar una gran variedad de sustratos. Son altamente eficientes en transformar material nutritivo en sustancia celular. En medios en los que el material nutritivo está en cantidades moderadas la mayor parte de los sustratos son sintetizados en sustancias celulares, pero si el alimento abunda, se acumula como reserva en el micelio (carbohidratos y lípidos), y muchos productos del metabolismo son excretados en el medio. En condiciones apropiadas los mohos transforman carbohidratos a alcoholes y ácidos orgánicos. Las actividades bioquímicas de los hongos modifican la fertilidad del suelo, son deteriorantes de algunos materiales, participan en la maduración de algunos alimentos, muchos géneros son patógenos para plantas, humanos y animales y, son importantes en la producción de antibióticos y otros metabolitos de importancia comercial. Reproducción de los hongos. Los hongos se pueden reproducir de forma sexual y asexualmente. En algunas especies coexisten las dos formas de reproducción, denominándose holomorfo. El holomorfo, tiene a la vez una forma de multiplicación asexuada, conocida como anamorfo (o estado imperfecto), y una sexuada, conocida como teleomorfo (o estado perfecto). La reproducción asexuada, puede ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentos de micelio, o por formación de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.). La reproducción sexuada se caracteriza por la unión de dos núcleos que dan lugar a esporas sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.). Adicionalmente, los hongos pueden ser homotálicos, si poseen en el mismo micelio núcleos complementarios que pueden conjugarse; o heterotálicos, cuando requieren núcleos provenientes de micelios diferentes. En general la reproducción asexuada es más importante para la propagación de las especies, en muchos hongos la reproducción sexual se da solo una vez al año o con poca frecuencia. En el tipo de reproducción asexual, existe un grupo de hongos a los que no se les conoce reproducción sexual y por lo cual, son agrupados dentro de una Clase tentativa, la Clase Deuteromycetes o clase de hongos imperfectos

(Fungi Imperfecti); a los integrantes de esta Clase, se los reclasifica dentro de una Clase específica, cuando es hallado su estado perfecto (teleomorfo o sexual); principalmente, los estados sexuales de los Deuteromycetes, son hongos de las Clases Ascomycetes y algunos Basidiomycetes. Es importante subrayar, que no todos los hongos producen esporas, dado que, dentro de la Clase Deuteromycetes, se encuentra un Orden denominado Mycelia Sterilia o Agonomycetales, que está conformado por hongos que no forman esporas de ningún tipo y solo se reproducen por fragmentación del micelio (Rhizoctonia spp., Sclerotium spp.). Clases de hongos. Clase Zygomycetes. Hongos filamentosos con micelio no tabicado (cenocítico). Pueden presentar órganos de fijación, como rizoides (típicos de Rhizopus spp.). Reproducción asexuada por Clamidosporas (células vegetativas que se rodean de una pared gruesa constituyendo a la vez elementos de resistencia, que posteriormente dan origen al micelio; y por Esporangiosporas (esporas producidas endógenamente dentro de un esporangio); algunas veces en el esporangio se presenta una columela (Mucor spp.), que es una vesícula o parte central del esporangio (hifa que genera el esporangio) (Figura 3). Reproducción sexual por Zigosporas (cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente están cubiertos por espinas, formados por la fusión de dos gametangios). Estos zigotos pueden ser heterotálicos (Ej.: Absidia coerula), o zigotos homotálicos (Ej.: Mucor baciliformis) (Figura 3)

Fig. 3. Estructuras asexuales (esporangiosporas y clamidosporas), y sexuales (zigosporas), de Rhizopus spp., hongo clasificado en la Clase Zygomycetes (Fuente: Rojas, A.). Clase Ascomycetes. Son hongos filamentosos con micelio tabicado y también presencia de levaduras. Los Ascomycetes integran la clase más numerosa de los hongos perfectos, conociéndose aproximadamente unas 15.000 especies. Como es de esperar en un grupo tan grande existe una notable variedad de formas y estructuras. En un extremo de la escala se hallan los microorganismos unicelulares que se conocen

corrientemente con el nombre de levaduras y en el otro, especies como con desarrollo de micelio y complejas estructuras de reproducción. El asca (Gr. Askos = piel de cabra, saco), estructura característica que da nombre a la Clase, es una estructura que contiene un número generalmente definido de ascosporas (esporas sexuales), y que a su vez, pueden o no estar contenidas en una estructura denominada ascocarpo (que puede ser: apotecio, cleistotecio y peritecio) (Figura 4). La reproducción asexual se lleva a cabo por gemación o fisión en las levaduras y, en los mohos por esporas o conidias formadas en conidióforos. Los anamorfos o estados imperfectos de estos hongos (reproducción asexual), se encuentran agrupados en la Clase Deuteromycetes (hongos imperfectos). La reproducción sexual es llevada a cabo en la formación de ascosporas, contenidas en un asca y que se forman frecuentemente por procesos de cariogamia de dos núcleos distintos; generalmente se forman ocho ascosporas, aunque pueden formarse de dos o cuatro. A su vez, las ascas pueden estar incluidas o no dentro de un ascocarpo. De acuerdo a la forma en la cual se desarrolla el ascocarpo y el cual es utilizado como carácter taxonómico de identificación, se definen: Los apotecios, son cuerpos fructíferos con forma de copa, normalmente de colores marrones claros, se pueden producir a partir de la germinación de esclerocios o del mismo material vegetal invadido por el hongo. Algunos alcanzan más de un centímetro de diámetro y dentro de él, se encuentran las ascas conteniendo ascosporas (Figura 4). Los cleistotecios, son cuerpos fructíferos con forma esférica y que no poseen abertura para la salida de las ascosporas, por lo tanto deben romperse para que estas se liberen. Generalmente se producen sobre el tejido vegetal colonizado por el hongo. A simple vista pueden observarse como puntos negros (Figura 4). Los peritecios, son cuerpos fructíferos con forma de pera y con una abertura para la salida de las ascosporas. Generalmente se producen sobre el tejido vegetal colonizado por el hongo y a simple vista pueden observarse como puntos negros (Figura 4).

Fig. 4. Estructuras de reproducción sexual en hongos de la Clase Ascomycetes, donde se observan las esporas sexuales o ascosporas, el saco que las contiene (asca), el tipo de ascocarpo que contiene las ascas (cleistotecio, peritecio y apotecio), y ascas desnudas (Fuente: Rojas, A.). Clase Basidiomycetes. Los Basidiomycetes son caracterizados por la presencia de una célula fértil en su ciclo de vida, llamada basidio, la cual produce exógenamente 4 basidiosporas. Estas son originadas en tétrada, desde

una estructura llamada basidio y por medio de un esterigma, que es una prolongación del ápice del basidio. Esta Clase, se caracteriza por presentar micelio tabicado y a su vez, los basidios pueden ser septados o no (Figura 5). En esta clase, se encuentran los hongos de sombrilla o repisa que pueden ser observados a simple vista, creciendo sobre madera en descomposición o residuos de animales o vegetales. También, se encuentran hongos de gran importancia económica, por ser causantes de enfermedades en plantas (Royas, Carbones, Pudriciones blancas, etc.), o de uso comestible-medicinal (Pleurotus spp., Ganoderma spp., Lentinula spp., etc.). Su reproducción asexual, está dada por el crecimiento vegetativo, gemación, fragmentación y producción de esporas (uredosporas y teliosporas); y su reproducción sexual dada por basidiosporas formadas sobre basidios. La reproducción en esta Clase de hongos, reviste mayor complejidad, dado que se observan diferentes tipos de esporas, formadas por algunos géneros, como: espermacios, aeciosporas, uredosporas y teliosporas, así como, el cuerpo o estructura que los contiene (Figura 5)

Fig. 5. Tipos de esporas observadas en hongos de la Clase Basidiomycetes, donde se observan: (A, B y C) esporas sexuales o basidiosporas y basidio; (D) espermacios, (E) aeciosporas, (F, G y H) uredosporas y uredosoro y, (I, J y K) teliosporas y teliosoro (Fuente: Rojas, A.). Clase Deuteromycetes o Fungi Imperfecti. Esta Clase incluye a los hongos con micelio tabicado que no se les conoce reproducción sexual. Estos hongos pueden no tener reproducción sexual o si la tienen, esta se produce rara vez y no se le conoce aún. Estos hongos se reproducen de forma asexual formando esporas denominadas conidios, los cuales pueden producirse en forma libre o dentro de cuerpos fructíferos. De igual manera, los conidios pueden tener diferentes formas y tamaños (Figura 6), pueden ser hialinos o pigmentados, pueden ser unicelulares o pluricelulares, sueltos o agrupados en ramilletes o cadenas. Las anteriores características, son utilizadas como patrones de identificación de los géneros y especies y los cuales forman los Órdenes y Familias, por las cuales pueden ser ubicados taxonómicamente estos hongos. De acuerdo a la pigmentación las esporas reciben varios nombres; las esporas que presentan pigmentación se denominan phaeosporas y las no-pigmentadas hialosporas; dicho prefijo se antepone a la forma de la espora. Las formas son definidas como: Las amerosporas son conidias unicelulares, las didimosporas son esporas bicelulares, las phragmosporas son esporas con más de dos células y septos transversales únicamente, las

dictyosporas o esporas muriformes son esporas con más de dos células con septos transversales y longitudinales, las scolecosporas son esporas filiformes, las helicosporas son esporas con forma de espiral y las staurosporas son esporas con forma de estrella (Figura 6)

Fig. 6. Tipos de esporas de acuerdo a su forma, donde: (A) Amerosporas, (B) didimosporas, (C) phragmosporas, (D) dictyosporas o esporas muriformes, (E) scolecosporas, (F) helicosporas y (G) staurosporas De acuerdo a la forma como ellas se desarrollan, se encuentran: Blastosporas (espora producida por gemación), botryoblastosporas (blastosporas producidas por células esporógenas; pueden ser individuales o en cadena), sympodulosporas (el conidióforo crece en forma simpodial y en cada eje se forma una espora), aleuriosporas (las esporas son liberadas por explosión del conidióforo), annelosporas (en la media en la cual se producen conidias, se forman anillos en el conidióforo), phialosporas (conidias producidas en un conidióforo con forma de botella, con una abertura en el extremo), porosporas (la liberación de la conidia deja un poro en el conidióforo), arthrosporas (el conidióforo se forma y se fragmenta dando origen a las esporas), arthrosporas meristemáticas (la base del conidióforo se comporta como un meristemo), y blastosporas meristemáticas (la base del conidióforo se comporta como un meristemo) (Figura 7).

Fig. 7. Tipos de esporas de acuerdo a su forma de desarrollo, donde: (A) Blastosporas (Aureobasidium spp.), (B) botryoblastosporas (Botrytis spp.), (C) sympodulosporas (Cercospora spp.), (D) aleuriosporas (Nigrospora spp.), (E) annelosporas (Spilocaea spp.), (F) phialosporas (Chalara spp.), (G) porosporas (Drechslera spp.), (H) arthrosporas (Geotrichum spp.), (I) arthrosporas meristemáticas (Oidium spp.), y (J) blastosporas meristemáticas (Zygosporium spp.) (Fuente: Rojas, A.). Adicionalmente, las esporas pueden ser de origen asexuado (mitosporas), o sexuado (meiosporas), y por su ubicación relativa se denominan esporas internas o externas. Se presume que éstos hongos, son los estados no sexuados o anamorfos de muchos Ascomycetes (eventualmente de Basidiomycetes), cuyos estados sexuados o teleomorfos no han sido descubiertos. En el momento en el cual se conoce el estado sexual de un género de Deuteromycetes, ambos estados se transfieren al grupo al que pertenece el teleomorfo (o estado perfecto). Su reproducción está dada por la formación de conidias, formadas en células especializadas llamadas células conidiógenas y que se encuentran en una hifa especializada denominada conidióforo. Los conidióforos pueden encontrarse libres, sin formar ningún tipo de agrupación, así como, agruparse para originar las siguientes estructuras (Figura 8): Acérvulos. Forma de un estrato plano o con forma de plato, conformado por conidióforos cortos (generalmente), que crecen juntos y forman una masa de hifas y conidias. Son subepidérmicos o subcuticulares y errumpentes al madurar. Estructura característica del Orden Melanconiales, hongos que atraviesan la cutícula del huésped y producen una masa blanda de conidióforos. Picnidios. Es un cuerpo esférico o con forma de botella, con el interior cubierto de conidióforos. Presentan una abertura (ostiolo largo o corto), o estar cerrados completamente; pueden ser confundidos con los peritecios o apotecios formados por los Ascomycetes, pero con la diferencia que en los picnidios no se encuentran ascas, solo conidias libres, las cuales son observadas al estallar la estructura.

Sinema o coremio. Haz compacto y erecto de conidióforos. Estos pueden ser de longitud diferente, más o menos cilíndricos y revestidos de esporas en casi toda su extensión; o pueden ser de longitud aproximadamente igual, en cuyo caso el sinema tiene un tallo patente y una cabeza esporófora. El término sinema se emplea también, al referirse a asociaciones de conidióforos de forma menos definida que un coremio verdadero. Esporodoquio. Haz de conidióforos en forma de almohadillada y estrechamente apiñados. En la realidad, es un tipo de sinema en el cual los conidióforos son demasiado cortos para formar un tallo. También, pueden encontrarse agrupaciones denominadas Funículos, que es una cuerda de hifas de la cual surgen a ciertos intervalos los conidióforos (Figura 8).

Fig. 8. Estructuras formadas por hongos de la Clase Deuteromycetes, donde se observa: (A) Acérvulo, (B) esporodoquio, (C) picnidio, (D) sinema y (E) funículo (Fuente: Rojas, A.) Características del examen microscópico. La forma de las levaduras se determina mediante las técnicas de tinción que ordinariamente se usan para las bacterias, pero como muchas tinciones enmascaran el contenido celular, se emplean métodos especiales para demostrar las estructuras específicas. Es útil cualquier colorante de anilina, pero para observar los detalles del contenido celular, especialmente el núcleo, la hematoxilina férrica es adecuada. Sudan III, pone de manifestó los glóbulos de grasa, el rojo neutro hace que los gránulos metacromáticos y las vacuolas aparezcan de color rosa débil o rojos y los colorantes policromáticos de azul de metileno, tiñen el material núcleo proteico. Los hongos filamentosos, comúnmente, pueden ser teñidos con azul de Lactofenol e identificados por sus caracteres morfológicos mediante el uso de claves específicas para cada Clase de hongos (Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes-pseudohongos). Características de cultivo. Para estudiar los hongos filamentosos se usan los mismos métodos generales que para las bacterias. Casi todos se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medio de cultivo bacteriológicos usuales a temperaturas que varían entre 20 y 30ºC. La mayor parte de ellos, lo hace más lentamente que las bacterias y así, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de éstas sobrepasa al de los hongos.

Las levaduras cuando se desarrollan en medios de cultivo adecuados, sus colonias varían en aspecto, textura y margen, así, algunas son lisas, otras rugosas, algunas son aplanadas, otras elevadas; tienen bordes bien definidos e irregulares; pueden producir pigmentos. El tipo de desarrollo en caldo de cultivo, también proporciona información significativa. Algunas colonias se desarrollan en el fondo del líquido a manera de sedimentó, otras crecen uniformemente en el caldo y otras crecen sólo en la superficie. Cultivo de hongos. Si se requiere aislar hongos, resulta muy práctico utilizar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que, no sea óptimo para las bacterias. Los medios ácidos con concentraciones altas de azúcar, son tolerados bien por los hongos, pero inhiben a muchas bacterias. Existen tres tipos generales de medios de cultivo para los hongos: - Medios Naturales: Como pedazos e infusiones de frutas, vegetales, granos de cereales o tejidos animales. Estos medios varían mucho en su composición y no son fácilmente reproducibles. - Medios Semisintéticos: Preparados con peptonas, extractos de plantas, agar y otros compuestos de composición desconocida o variable. - Medios de cultivo sintéticos: De composición química definida (comercialmente disponibles). Uno de los medios de cultivo más conocido para cultivar hongos en la práctica es el agar Sabouraud que, contiene maltosa y peptona como principales ingredientes. Este medio se utiliza mucho para el crecimiento de hongos patógenos. Su acción selectiva se debe a su alta concentración de azúcar y bajo pH. Adicionalmente, se conocen innumerables medios, como agar Papa Dextrosa- PDA, Agar OxitetraciclinaGlucosa-Extracto de Levadura-OGY, Agar Rosa de Bengala, etc. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS HONGOS. Para el estudio microbiológico de los hongos de una muestra, se debe realizar la observación directa al microscopio y obtener aislamiento del microorganismo en medio de cultivo. Observación microscópica de hongos filamentosos. Se pueden aplicar diferentes metodologías para la observación de las estructuras típicas del hongo, como: Montaje en portaobjetos o en rastrillo. Se coloca una gota del colorante Azul de Lactofenol sobre un portaobjetos, se toma la muestra con la ayuda de un asa micológica y se emulsiona y homogeniza la muestra con la ayuda de otra asa; se coloca el cubreobjetos encima y se procede a observar hasta el objetivo 40x. A menudo, el rastrillado de la colonia, rompe las delicadas estructuras de fructificación de los hongos filamentosos, alterando la observación de la posición y origen de algunas estructuras, como las esporas, dificultando así la identificación definitiva. Preparación en cinta engomada o impronta. Se coloca una gota del colorante Azul de Lactofenol sobre la superficie de un portaobjeto. Utilizando cinta trasparente, presionar suavemente la parte adhesiva sobre la superficie de la colonia, procurando adherir una porción de micelio aéreo a esta. Pegar un extremo de la cinta sobre la superficie del portaobjetos, a un lado de la gota del colorante y con cuidado pegar la cinta con la muestra sobre la gota del colorante, para que el micelio aéreo se impregne con éste. Durante el procedimiento debe

evitarse la acumulación de burbujas de aire, para evitar la aparición de estructuras que dificulten la observación. Llevar al microscopio hasta objetivo 40x. Técnica de cultivo en Microplaca o Microcultivo. En algunas ocasiones, cuando ninguna de las preparaciones anteriores permite una observación satisfactoria de la muestra para el diagnóstico o cuando se desea el montaje sobre portaobjetos para estudios futuros, se recomienda esta técnica (Figura 9). La técnica consiste en colocar en el interior de una caja de Petri estéril, unas varillas de vidrio estériles y sobre ellas una lámina portaobjetos. Las varillas evitan que la lámina portaobjetos haga contacto con el fondo de la caja de Petri. Luego sobre el portaobjetos se coloca un fragmento de 1cm2 del medio de cultivo sólido (PDA, Sabouraud, OGY, etc.), estéril. Una vez realizado este montaje, con un asa previamente flameada se siembra el hongo a analizar en la mitad de cultivo, se calienta rápidamente el cubreobjetos (para fijar la laminilla al agar), y se cubre la preparación con este. Este montaje, se dispone en una caja Petri con agua destilada humedeciendo un papel filtro estéril, el cual mantendrá una atmósfera húmeda (o papel humedecido con glicerina 10%). Después se procede a la incubación a la temperatura requerida y por el tiempo necesario (Figura 9). Pasado el tiempo de incubación, se retira con cuidado el cubreobjetos (teniendo en cuenta que en este se encuentra adherido el hongo), se monta la laminilla con el hongo a estudiar sobre un portaobjeto con azul de Lactofenol (o sin colorante, dependiendo del objetivo de la observación), y se procede a su observación en fresco. También puede removerse el segmento de agar del portaobjeto original y teñirlo, procediendo a colocar un cubreobjetos y observando las dos preparaciones. Llevar hasta objetivo 40x.

Fig. 9. Materiales requeridos para el montaje de un Microcultivo para hongos (Fuente: Rojas, A.).

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR. - 1 asa micológica. - 2 cajas Petri estériles. - 1 bandeja para tinción. - 2 varillas de vidrio o pitillos plásticos. - 1 mechero Bunsen o de alcohol. - Azul de Lactofenol. - 1 microscopio binocular compuesto. - Solución de Lugol. - 3 portaobjetos estériles. - 5mL de glicerina 10%. - 3 cubreobjetos estériles. - 1 set de papel para óptica. - 1 disco de papel filtro estéril (10 cm de diámetro). - Cultivos fúngicos en agar PDA con 3 - 5 días de incubación. - 1 rollo de cinta adhesiva transparente. - Toallas de papel desechable. PROCEDIMIENTO. 1.

De cada uno de los hongos y levaduras suministrados por el tutor, realice la caracterización macroscópica basándose en el aspecto del micelio o del crecimiento en las levaduras. Como marcadores de caracterización en las levaduras, utilice los aplicados a caracterización macroscópica de colonias bacterianas.

2.

Para los hongos filamentosos: Micelio algodonoso, pulverulento, aterciopelado.

3.

Pigmentación del crecimiento (pigmentos confinados al hongo o difundidos al medio de cultivo).

4.

Consistencia: Dura, blanda, viscosa.

5.

Realice el montaje en placas portaobjetos por las metodologías de toma de muestra con asa micológica o impronta, descritos en esta guía y utilizando como colorante, azul de Lactofenol.

6.

Para la observación de levaduras, realice el montaje con solución de Lugol y lleve a objetivo de inmersión.

7.

Del aislamiento asignado por su tutor, realice un microcultivo siguiendo las indicaciones dadas en esta guía. Incube a 25-28°C/3-5 días. Concluido el tiempo de incubación, realice el montaje y observación del hongo en el microcultivo, de la forma indicada en esta guía.

8.

Realice la observación de los montajes indicados por el tutor en los microscopios dispuestos para ello. Grafique sus observaciones. Tenga en cuenta la bibliografía relacionada en la guía, para la utilización de claves en la identificación de los hongos observados.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. Ilustre todas las observaciones y realice el flujograma de cada experiencia realizada. BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Morfología bacteriana

Trabajo Práctico Nº 14 TÍTULO: Morfología bacteriana. TEMA: Levaduras vínicas. Ecología de las levaduras vínicas. El mosto como microecosistema. Proceso fermentativo espontáneo del mosto de uva. Microbiología enológica. El análisis microbiológico en enología. Técnicas de aislamiento. Especies aisladas. Descripción de las especies más representativas. Criterios de selección. Micotoxinas. Intoxicaciones fúngicas. OBJETIVOS A ALCANZAR. - Reconocer la morfología celular bacteriana, así como, las diferentes agrupaciones y otros aspectos morfológicos de las bacterias. - El estudiante desarrollará la capacidad de caracterizar mediante marcadores morfológicos, aislamientos bacterianos de diferentes fuentes, como etapa inicial en la identificación bacteriana. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Metabolismo de proteínas y ácidos nucleicos. INTRODUCCIÓN: Las bacterias en condiciones normales se desarrollan con formas definidas, las cuales son proporcionadas por la rigidez de la pared celular; estas formas son esféricas, ovaladas, en forma de bastón o como espirales. De acuerdo a lo anterior, es importante realizar una correcta observación de estas características, dado que, dicha forma se convierte en uno de los principales marcadores para la identificación inicial de géneros bacterianos, encontrándose registrado en el Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey; adicionalmente, es importante subrayar que, cada género posee unas características particulares que permiten diferenciarlo de otros, esto teniendo en cuenta que, la caracterización de un aislamiento debe incluir otro tipo de marcadores, como los bioquímicos, serológicos y moleculares, para poder concluir al respecto de un género y una especie. Del mismo modo, los rasgos de las colonias y la disposición o agrupación bacteriana, son criterios taxonómicos que deben ser descritos correctamente para aislamientos no identificados, como parte de la identificación primaria. OBSERVACIÓN DE LA MORFOLOGÍA BACTERIANA EN MUESTRAS TEÑIDAS. La morfología de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados frescos o fijos y, teñidos por algunos de los métodos de tinción conocidas; ya que, por su misma estructura son difíciles de visualizar en su estado natural. Las tinciones biológicas y los procedimientos de tinción en unión con la microscopía de luz son una herramienta básica importante en microbiología, permitiendo estudiar las propiedades de los microorganismos y su división en grupos específicos para propósitos diagnósticos.

En algunas ocasiones, se hace necesario fijar los microorganismos y durante este proceso se produce la muerte celular debido a la coagulación del protoplasma, preservándose la morfología celular, además de, adherirlos a la lámina. El agente más utilizado para fijar es el calor, aunque puede también utilizarse alcohol y otros compuestos químicos que frecuentemente permiten una mejor diferenciación de los detalles como las soluciones de etanoléter, alcohol sublimado (Cloruro de Mercurio II, Etanol absoluto y agua destilada), y solución de ácido ósmico (vapores). Consideraciones generales en la morfología de las bacterias. Tamaño. Son invisibles al ojo humano, por lo tanto estas se miden en micrómetros (µm), unidad que equivale a 10-3 mm. El tamaño de las bacterias varía dependiendo de las especies entre menos de 1µm y 250µm; siendo lo más habitual entre 1 y 10µm. Una característica de las células bacterianas es la alta proporción que existe entre el área de la superficie y el volumen de la célula. Esto significa que, poseen una gran superficie a través de la cual pueden entrar nutrientes para alimentar a un pequeño volumen; con lo cual, pueden realizar muchas reacciones metabólicas y crecer rápidamente. Así, por ejemplo Escherichia coli, tarda 20 minutos en dividirse mientras que, una célula de mamífero en laboratorio tarda de 13 a 24 horas. Forma. La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared celular. Las bacterias poseen una de las tres formas fundamentales: esférica, cilíndrica y espiral. Las células esféricas, se denominan cocos y suelen ser redondeadas aunque pueden presentar formas ovoides o elípticas. A las de forma cilíndrica se les denomina bacilos; los extremos de estas células suelen ser redondeados, rectos, en forma de huso o cuerno. A las de forma espiral o helicoidal, se las denomina espirilos y se caracterizan por su forma de sacacorchos. Existe una morfología intermedia entre los cocos y los bacilos, denominada cocobacilos; muchos de ellos parásitos del hombre y de los animales, como Brucella spp., Bordetella spp., Francisella spp., y Pasteurella spp., las cuales aparecen en el Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey, en la sección de bacilos y cocos Gram-negativos aerobios. Existen modificaciones a estas tres formas fundamentales y aunque la mayor parte de las bacterias mantienen su forma constante, algunas especies pueden variar la forma, por lo que se les llama pleomórficas. Arthrobacter spp., es un ejemplo de pleomorfismo debido a que, su forma cambia en función de la edad del cultivo. También, exhiben pleomorfismo aquellas bacterias que no poseen pared celular, como es el caso de los micoplasmas (o fitoplasmas, de acuerdo a su origen animal o vegetal). Otro ejemplo son las formas de L que, son bacterias que carecen de pared celular debido a una situación de estrés (choque térmico u osmótico, antibióticos, etc.), pero cuando cesa el estrés sintetizan de nuevo la pared celular. Debido a que, la forma es un carácter taxonómico, el pleomorfismo puede inducirnos a confusión ya que podemos pensar que un cultivo está contaminado con otro tipo de bacteria. Sin embargo, el pleomorfismo no suele ser lo más frecuente. Disposición: Muchas veces al mirar al microscopio se observan células unidas unas a otras. Mientras que, las bacterias en forma de espiral (espirilos), suelen ser células separadas, otras especies suelen crecer en una disposición característica; disposición que, va a depender del plano en el que se realice la división celular y si la célula hija permanece junto a la madre una vez realizada la división celular. Cada una de estas disposiciones es

típica de una especie particular y puede usarse en la identificación. Hay que tener en cuenta que, raramente todas las células de una especie se disponen exactamente de la misma manera. Cuando un coco se divide en un plano, forma un diplococo o dos células juntas (Neisseria spp.). Cuando un coco se divide en un plano y permanece unido después de varias divisiones, forma una cadena que se denomina estreptococo (Streptococcus spp.). Si las células se dividen en más de un plano o dimensión, la disposición es más complicada. Cuando un coco se divide en ángulo recto al primer plano de división forma tétradas (Pediococcus spp.). Una posterior división en el tercer plano puede resultar de un paquete cúbico de ocho células conocido como sarcinas (Sarcina spp.). Si la división en los dos planos es de forma irregular se forman similar a un racimo de uva conocido como estafilococo (Staphylococcus spp.). Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones características, aunque hay excepciones. Por ejemplo, el bacilo de la difteria, tiende a agruparse en empalizada. Dentro del género Bacillus spp., algunas especies forman cadenas llamadas estreptobacilos. De acuerdo a la disposición, forma y tamaño, las bacterias se clasifican en (Figura 1):

Fig. 1. Formas y disposiciones representativas de las células bacterianas (Fuente: Rojas, A.).

- Cocos. Células esféricas, generalmente de 1µ de tamaño. La división celular da lugar a una distribución característica de las células hijas. En el caso más simple las células hijas se separan resultando células aisladas. - Diplococos: Son pares de células que no se separan. - Estreptococos: Cadenas de células esféricas que no se separan. - Tétradas: En las células aisladas se presentan divisiones en ángulo recto (como el género Gaffkya spp.), formando cuadros de cuatro células. - Estafilococos: Las células presentan un eje de división al azar, dando como resultado la agrupación de las bacterias en racimos (Staphylococcus aureus) - Sarcina: Las células presentan tres planos de división en ángulos rectos, produciéndose paquetes regulares de 8 a 16 bacterias cada uno (Sarcina spp.). - Bacilos. Bacterias cilíndricas en forma de varilla. Estas células presentan tamaños aproximadamente de 0,5 a 1µ de ancho por 2 a 3µ de largo. Se pueden encontrar aislados, en cadenas cortas y largas o, en pares paralelos, lo que en algunos casos facilita su clasificación. - Bacterias en forma de coma y espiral. Se encuentran como células aisladas con una gran variedad de tamaños, número de espiras y rigidez de la pared (Campylobacter spp., Vibrio spp., Borrelia spp., y Treponema spp.). - Espiroquetas: Presentan forma de sacacorchos, son flexibles y pueden llegar a medir hasta 250µ de largo. - Espirilos: Son microorganismos Gram-negativos, móviles y flagelados. - Vibrios o vibriones: Se presentan como bacilos curvos en forma de coma. - Bacterias filamentosas y ramificadas. Los Actinomicetes, en un principio se consideraron hongos por su tipo de crecimiento, pero en realidad difieren en la composición de su pared y en el núcleo. Nocardia spp. (De importancia médica e industrial), presenta un crecimiento de filamento compacto; Streptomyces spp. (De importancia médica, industrial y agrícola), forma filamentos ramificados que dan origen a un micelio, pero de dimensiones bacterianas. - Bacterias con yemas y/o apéndices (Prostecadas). Presentan crecimiento y división celular característica, al darse de una manera desigual en la célula, en los cuales se origina una célula hija sin que, la célula madre pierda su identidad (Rhodomicrobium spp., Pirella spp., y Blastobacter spp.). - Formas de involución. Es una morfología anormal que se encuentra a menudo en cultivos viejos (Típicos en Pasteurella pestis y Neisseria spp.). Estos tipos de células suelen no ser viables, pero sí lo son, al ser transferidas a un medio favorable, se dividen dando origen a células de morfología normal. Dentro de la morfología debe tenerse en cuenta la presencia de cápsula, flagelos y endospora (no todas las bacterias forman estas estructuras). También se debe tener en cuenta, la posición de la endospora dentro de la célula (terminal, subterminal, central), y la distribución de los flagelos si están presentes.

Morfología de la colonia bacteriana. Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben diferencias en la apariencia macroscópica de su crecimiento, estas diferencias llamadas características culturales, son la base para la separación de ellas en grupos taxonómicos. Las características culturales de los microorganismos conocidos, están consignadas en Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology y, son determinadas por el cultivo de los microorganismos en agar Nutritivo inclinado y en placas de Petri, en caldo Nutritivo y en Gelatina Nutriente. La morfología colonial, es una característica indispensable a tener en cuenta en el aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la elevación de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y la textura de la masa celular, pues también son características distintivas. La consistencia va desde la colonia seca que, tocada con una asa se desplaza en la superficie del medio, hasta las colonias viscosas que se pegan al asa y se separan de la colonia formando un hilo (generalmente son bacterias con cápsulas gruesas). Así como, también la pigmentación de la colonia, las películas continúas de crecimiento (bacterias mótiles), colonias lisas (generalmente virulentas), o colonias rugosas (generalmente avirulentas). Caracterización del crecimiento sobre Agar Nutritivo inclinado. Los cultivos en este medio se inoculan en una sola línea recta (sobre la superficie del bisel), y se evalúan de la siguiente manera (Figura 2):

Fig. 2. Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en una sola línea sobre agar Nutritivo inclinado, donde: (A) Crecimiento filiforme, (B) equinulado, (C) barbado, (D) difuso (E), arborescente y, (F) rizoide 1. Abundancia de crecimiento. La cantidad de crecimiento es designada como ninguna, leve, moderada o abundante. 2. Pigmentación. Los microorganismos cromogénicos, pueden producir pigmentos intracelulares que son responsables de la coloración de las colonias; otros microorganismos, producen pigmentos solubles

extracelulares que son excretados en el medio y también producen un color; sin embargo, la mayoría de los microorganismos son no cromogénicos y aparecerán en tonalidades que van desde el blanco al gris. 3. Las características ópticas. Pueden evaluarse con base en la cantidad de luz transmitida a través del crecimiento; estas características son descritas como: opaca (ninguna transmisión de luz), translúcida (transmisión parcial), o transparente (transmisión total de la luz). 4. Forma. La apariencia del crecimiento de la siembra en una sola línea sobre la superficie del agar inclinado se designa de la siguiente forma (Figura 2): A. Filiforme: Crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos. B. Equinulado: Crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares continuos. C. Barbado: Colonias semi-confluentes o no confluentes. D. Difuso: Crecimiento difuso y reducido. E. Arborescente: Crecimiento en forma de árbol. F. Rizoide: Crecimiento en forma de raíz. Caracterización del crecimiento en Caldo Nutritivo. Son evaluados según la distribución y apariencia del crecimiento como sigue (Figura 3): A. Turbidez fina uniforme: Crecimiento fino y totalmente disperso. B. Floculante: Crecimiento en agregados escamosos totalmente dispersos. C. Película: Crecimiento en la superficie como plataforma, grueso. D. Sedimento: Concentración del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser granular, escamoso o floculante

Fig. 3. Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en caldo Nutritivo, donde: (A) Crecimiento de turbidez fina uniforme, (B) floculante, (C) película y, (D) sedimento (Fuente: Rojas, A.).

Caracterización del crecimiento en placas de Agar Nutritivo. La descripción se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable macroscópicamente), de forma aislada y se evalúa de la siguiente manera (Figura 4)

Fig. 4. Descripción macroscópica realizada en colonias creciendo sobre agar Nutritivo, donde se aprecia la forma, la elevación y el borde (Fuente: Rojas, A.). a. Tamaño: Grande (diámetro mayor a 1mm), mediano (diámetro aproximado a 1mm), pequeño (diámetro inferior a 1mm), y puntiforme. b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada. c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado, espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso). d. Elevación: Plana o aplastada (no elevación), elevada (convexa baja, convexa cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada). e. Superficie: Lisa o rugosa. f. Consistencia: Blanda, dura o mucoide. g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translúcido.

h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que decoloran el medio; piocianina (azul verdosa y factor de virulencia en P. aeruginosa), pigmentos fluorescentes y pigmentos no difundibles confinados a las colonias. i. Hemólisis: Parcial (Alfa, parcial aclaración de la sangre alrededor de las colonias, con decoloración verde del medio; borde de células rojas intacta), total (Beta, zona de completa aclaración de sangre alrededor de las colonias, debida a la lisis de las células rojas), y no hemólisis (Gamma, no hay cambio en el medio circundante a la colonia; no hay lisis ni decoloración de las células rojas de la sangre). La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de identificación bacteriana, siendo estas características, comunes entre cada género bacteriano. Sin embargo, la morfología puede alterarse por el tiempo de incubación, composición del medio de cultivo (excesiva desecación o humedad), etc. Esta descripción es también aplicable a las levaduras, debido a que estas presentan crecimientos típicos bacterianos. MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR. - 1 asa bacteriológica. - 1 bandeja para tinción. - 1 set de papel para óptica. - 5 portaobjetos. - 5 cubreobjetos. - Colorante Azul de Metileno. - Colorante Cristal violeta. - Colorante Tinta china. - Etanol 70% - 1 microscopio compuesto binocular. - Aceite de inmersión. - 1 mechero Bunsen o de alcohol. - Colorante Fucsina. - Colorante Verde Malaquita. - Colorante Safranina. - 1 cultivo bacteriano en agar Nutritivo en caja Petri, sembrado por aislamiento o agotamiento. - 1 cultivo bacteriano en Caldo Nutritivo en tubo taparosca. - 1 cultivo bacteriano en agar Nutritivo en tubo taparosca-bisel, sembrado por estría PROCEDIMIENTO. 1.

Con los cultivos bacterianos suministrado por su tutor (agar en cajas Petri, agar en tubos y caldos en tubos),

realice la descripción morfológica de la colonia o tipo de crecimiento observado; para esto, defina los marcadores

relacionados en esta guía: Forma, elevación, borde, tamaño, superficie, consistencia, aspecto y presencia de pigmentos (en el medio o en la colonia), y los marcadores para crecimiento en tubos de agar inclinado o caldos. 2.

Tabule los datos recolectados. Recuerde que, las observaciones deben hacerse en colonias aisladas, no en

zonas con crecimiento abundante de la bacteria; así como, caracterice un número representativo de colonias y concluya al respecto. 3.

Una vez finalizada la caracterización de la colonia bacteriana, proceda a realizar la caracterización de la

morfología y agrupación bacteriana; para esto, elabore un frotis y sobre él realice una tinción simple. No olvide fijar el frotis al mechero. 4. Una vez coloreada la preparación, llévela a observación bajo el microscopio binocular compuesto, siguiendo las instrucciones correctas de manejo del equipo y con las indicaciones de su tutor. 5. Describa y registre sus observaciones, definiendo el tamaño, la forma y la disposición o agrupación bacterianas. 6. Repita los pasos de 1 a 5 con cada una de las muestras suministradas por su tutor. Presente los resultados condensados en una Tabla, dentro del informe del Laboratorio. EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia práctica BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Tinciones simples y compuestas para bacterias

Trabajo Práctico Nº 15 TÍTULO: Tinciones simples y compuestas para bacterias TEMA: Bacterias lácticas. Antecedentes históricos. Morfología. Taxonomía. Ecología y aislamiento. Fermentación láctica del ácido málico: bioquímica de la transformación. Factores que influyen en el proceso. Factores ampelográficos. Factores tecnológicos. Factores físicos y químicos. Requerimientos nutricios. Bacteriocinas. OBJETIVOS A ALCANZAR. Introducir a los estudiantes en los fundamentos, utilidades y procedimientos aplicados a las tinciones bacterianas, para la observación de las principales estructuras. Los estudiantes desarrollarán las metodologías de tinciones simples y compuestas aplicadas a las bacterias, reconociendo la funcionalidad y finalidad de cada una. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Microbiología y Sanidad, técnicas de observación INTRODUCCIÓN AL TEMA: Los microorganismos son seres pequeños y su protoplasma posee un índice de refracción cercano al del agua, por lo cual se requiere generalmente de tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente. La introducción de coloraciones a finales del siglo pasado, permitió demostrar el fino detalle de sus estructuras. Las tinciones se preparan en soluciones acuosas y orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren una variedad de colores a los microorganismos. Los colorantes, no solo sirven para la tinción directa o indirecta. La tinción simple puede ser directa cuando se tiñe la estructura microbiana mientras el medio permanece sin colorear y simple indirecta en la cual se tiñe el entorno que rodea la estructura microbiana, mientras esta permanece sin teñir. La tinción con azul de metileno puede ser útil para teñir gránulos metacromáticos (tinción directa). Así mismo, los colorantes sirven como indicadores de cambio de pH o de óxido-reducción, para demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias. Casi todos los colorantes biológicos son derivados del alquitrán y la estructura fundamental alrededor de la cual están construidos químicamente la mayoría de los colorantes, es el anillo bencénico. En términos generales la clasificación de los colorantes es convencional y se basa en la presencia de grupos cromóforos. Son ácidos o básicos no necesariamente ligados con el pH, sino más bien, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica; así los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear; los ácidos por su parte reaccionan con sustancias básicas como las estructuras del citoplasma y poseen además una elevada afinidad por el hidrógeno. Cuando todos los sitios moleculares aceptores de

hidrógeno están ocupados, el colorante se halla en su estado reducido y es generalmente incoloro y se denomina "Leucocompuesto". Teniendo en cuenta este concepto desde un criterio opuesto, un colorante retiene su color en tanto sus afinidades por el hidrógeno no estén completamente satisfechas. Dado entonces que, el oxígeno posee generalmente mayor afinidad por el hidrógeno que muchos colorantes, el aire retiene el color. Esta es la razón por la cual ciertos colorantes (como el azul de metileno), se utilizan como indicador de aerobios, ya que este es incoloro en ausencia de oxígeno. De acuerdo a lo anterior, químicamente un colorante se define como un compuesto orgánico que contiene un grupo benceno más un grupo cromóforo, así como, un auxócromo. Un cromóforo, es un grupo químico que imparte color al benceno (solvente orgánico); mientras que un auxócromo, es un grupo químico que le confiere la propiedad de ionización al cromógeno, capacitándolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos. La habilidad de un colorante para unirse a macromoléculas de componentes celulares (proteínas, ácidos nucléicos, etc.), radica en la carga eléctrica tanto de la porción cromogénica como del componente celular a teñir (Figura 1). Los colorantes ácidos son aniónicos, es decir que en forma ionizada la porción cromogénica exhibe una carga negativa que tendrá afinidad por los constituyentes de la célula cargados positivamente. Las proteínas, componentes celulares cargados positivamente, se unirán y aceptarán el color de un cromógeno aniónico cargado negativamente de una tinción ácida

Fig. 1. Naturaleza de los componentes de los colorantes utilizados en tinciones de bacterias (Fuente: Rojas, A.). Los colorantes básicos son catiónicos, es decir, la ionización de la porción cromogénica exhibe una carga positiva, lo cual permite una fuerte afinidad por los constituyentes de la célula cargados negativamente. Los ácidos nucléicos, componentes celulares cargados negativamente, se unirán y aceptarán cromógenos catiónicos cargados positivamente; un ejemplo es el azul de metileno. Los colorantes básicos son los más comúnmente empleados para tinciones bacterianas, la presencia de carga negativa en el exterior celular, repele los colorantes ácidos y evita su penetración en la célula. La Tabla 1, resume algunas técnicas de tinción y los propósitos de cada una.

Tabla 1. Técnicas de tinción aplicadas a bacterias

Las tinciones simples, se aplican para incrementar el contraste de las células a observar bajo el microscopio, por medio de un único colorante que, tiñe con la misma tonalidad toda la célula; de esta forma, se hace visible la morfología y el arreglo de crecimiento de las mismas. Es aconsejable, utilizar colorante básicos que contengan un cromógeno (compuesto que da el color), con carga positiva, dado que en la pared celular de las bacterias existen compuestos con cargas negativas que, atraen y ligan el cromógeno. El azul de metileno es uno de los más utilizados, actuando sobre todas las células bacterianas rápidamente y sin producir un color intenso que oscurezca los detalles de las células; también pueden ser utilizadas la safranina, cristal violeta y tinta china (azul de Lactofenol para observación de hongos). Este tipo de tinción, es especialmente útil para detectar observar bacterias en muestras naturales (no aisladas), debido a que, la mayor parte de los artefactos o materiales no celulares, no son teñidos por el colorante. Las tinciones compuestas, son aquellas en las cuales se utiliza más de un colorante y tienen por objetivo, la observación de estructuras específicas de las bacterias. Este tipo de tinciones, se caracterizan por presentar un colorante principal o primario (básico que tiñe células cargadas negativamente), un agente mordiente (sales metálicas, solución Yodada o Lugol, ácido tánico o fenol que, potencia el desarrollo de color), un agente decolorante (disolventes orgánicos), y un contractor, colorante secundario o de contraste (de distinto color al utilizado en el primer colorante). Las principales tinciones compuestas aplicadas a las bacterias son: Tinción de Gram, de bacterias ácido-alcohol resistentes-BAAR, endosporas, cápsulas, flagelos y gránulos. Preparación de frotis bacterianos para tinciones simples y compuestas. Se denomina frotis, a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de un cultivo bacteriano, con el objetivo de separar por extensión los microorganismos presentes. Esta etapa es importante para lograr los resultados esperados en cada una de las tinciones (simples o compuestas). Tenga en cuenta que, para algunas tinciones la elaboración del frotis, puede ser diferente. Con el objetivo de lograr lo anterior, realice las siguientes indicaciones: 1. Limpie las láminas con agua y jabón, papel y, posteriormente desengrase con alcohol, dejándolo evaporar; este paso es esencial ya que, la grasa o aceite de los dedos no permiten una buena elaboración de frotis e interfieren en la tinción. 2. Identifique cada lámina con el nombre o numeración de la muestra.

3. Si la muestra procede de un cultivo en caldo, tome una o dos alícuotas de las células con la ayuda de un asa bacteriológica y colóquelas directamente sobre la lámina, extiéndalas de forma circular y luego extienda longitudinalmente en la placa. 4. Si la muestra procede de un cultivo sólido, coloque una gota de solución salina fisiológica estéril (NaCl 0,85%) sobre el portaobjetos y extienda con la ayuda del asa bacteriológica estéril, la muestra de las bacterias. 5. Permita que el extendido seque al aire, pero no flamee, ya que la morfología celular o las estructuras pueden denaturarse. 6. Fije al calor la preparación para evitar la elusión del frotis durante el proceso de tinción. Esto se realiza, pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un mechero Bunsen. Procedimiento para la realización de las tinciones simples. Siga los pasos relacionados a continuación: 1. Realice el frotis con la técnica mencionada previamente y con las indicaciones del tutor. 2. Coloque la lámina en los sitios dispuestos para tinciones, dentro de la bandeja de coloración y vierta sobre el frotis uno de los siguientes colorantes: Cristal violeta/30-60 segundos, azul de metileno/1-2 min., o Carbolfucsina 15-30 segundos. 3. Pasado en tiempo de tinción, lave cuidadosamente el frotis con agua corriente, para remover el exceso del mismo. 4. Deje secar al aire, con la placa en posición inclinada (no seque flameando la preparación). 5. Lleve la preparación al microscopio y observe bajo los objetivos de 4x, 10x, 40x e inmersión Procedimientos para la realización de tinciones compuestas. Tinción de Gram. Nombrada así, en honor al bacteriólogo Christian Gram. Clasifica y diferencia las bacterias en dos grupos principales: Gram-positivas y Gram-negativas (Figura 2). La tinción emplea 4 reactivos diferentes (Anexo A): 1. Cristal Violeta. Colorante primario de color violeta, su función es dar color a todas las células. 2. Yodo de Gram (Lugol). Reactivo que actúa como mordiente, formando el complejo cristal violeta-yodo (CV-I), insoluble por unión al colorante primario. Sirve para intensificar el color en la tinción. En este punto todas las células permanecerán violeta oscuro. Solo en células Gram-positivas, el complejo se une al componente ácido ribonucléico-magnesio de la pared celular (Mg-ARN-CV-I), este complejo resultante es más difícil de remover que el complejo más pequeño cristal violeta-yodo. 3. Alcohol etílico 95% o Alcohol-acetona (Etanol 95% y acetona 70:30). Agente decolorante. Un agente decolorante, puede o no remover el colorante primario de la célula entera o solo de ciertas estructuras celulares. Tiene doble función, como solvente de lípidos y como agente deshidratante de proteínas. Su acción en el procedimiento, está determinada por la cantidad de lípidos de la envoltura celular. En células Gram-positivas, la baja concentración de lípidos es importante para retener el complejo Mg-ARN-CV-I, siendo los lípidos disueltos por el agente decolorante y formándose pequeños poros en la pared celular que, son cerrados por la acción deshidratante del alcohol. Como consecuencia, la tinción primaria se une fuertemente y es difícil de remover,

permaneciendo las células de color púrpura. En células Gram-negativas, la alta concentración de lípidos en la capa externa, es disuelta por el alcohol formándose grandes poros que no cierran a causa también de la deshidratación de las proteínas. Así, se facilita la liberación del complejo CV-I dejando a las células decoloradas o desteñidas. 4. Safranina. Reactivo de contratinción. Tiene un color de contraste al colorante primario (rojo). Si después de la decoloración el colorante primario ha sido lavado, los componentes decolorados de la célula tomarán el color del colorante de contraste. Solo las células Gram-negativas, que se decoloran, absorben el color rojo del colorante, mientras que, las células Gram-positivas retienen el color púrpura del colorante primario. Procedimiento para realizar correctamente una tinción de Gram. 1. Realice el frotis con la técnica relacionada en esta guía y fíjelo al calor. 2. Vierta sobre el frotis cristal violeta y déjelo actuar por 1 minuto. 3. Lave con agua de la llave y escurra el exceso. 4. Cubra ahora el frotis con Lugol (Iodo de Gram), y deje actuar por 1 minuto. 5. Lave con agua de la llave y escurra el exceso. 6. Cubra ahora con solución decolorante (alcohol-acetona), por 30 segundos. 7. Lave con agua de la llave y escurra el exceso 8. Cubra ahora con colorante de contraste (Safranina o fuschina), y deje actuar por 45 segundos. 9. Lave con agua de la llave y escurra el exceso. 10.

Permita que la preparación teñida se seque al aire, dejando la lámina en posición inclinada.

11.

Observe al microscopio hasta objetivo de inmersión (Figura 2).

Fig. 2. Proceso de la tinción de Gram, donde se observa el color tomado por las células en cada etapa. (A) Cristal violeta, (B) Adición de Lugol, (C) Decoloración con Alcohol-acetona y, (D) adición de Safranina. Las bacterias Gram-positivas mantienen su color violeta y la Gram-negativas son decoloradas por el solvente, aceptando el color conferido por la Safranina, y por lo cual se ven rojas-rosadas Recuerde. - Lo más crítico del procedimiento es el paso de decoloración, si en este paso no se remueven completamente los complejos CV-I, los organismos Gram-negativos aparecerán falsamente como Gram-positivos. - Es imperativo remover completamente con agua el reactivo de cada etapa de la tinción, de manera que se preparare la lámina para el subsiguiente reactivo.

- Preparaciones teñidas con Gram, se realizan con cultivos frescos, es decir hasta con 24 horas de cultivo. Cultivos viejos y especialmente de bacterias Gram-positivas, tienden a perder la habilidad para retener el colorante primario -variables”, apareciéndose Gram algunas células - Un frotis grueso causa decoloración inadecuada. - Un tiempo excesivo de decoloración puede llevar a la observación errónea del color tomado por las bacterias. - La remoción de frotis durante el secado puede eliminar la muestra de la lámina. Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR). Se aplica para bacterias que no se tiñen fácilmente por los colorantes corrientes, debido a su alto contenido de lípidos en la pared celular (p.e., Mycobacterium spp.). Se fundamenta en que, las bacterias ácido-alcohol resistentes, en especial las mycobacterias, por su composición de pared difícilmente toman los colorantes, pero una vez teñidas, retienen el color y no lo pierden aún por la acción energética de los ácidos. Los bacilos ácido alcohol resistentes, se tiñen de rojo por la Carbol-fucsina y, los microorganismos restantes se tiñen de azul por el colorante de contraste (Figura 3; Anexo A). Procedimiento para realizar correctamente una tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR). 1. Cubrir la preparación con Carbol-fucsina y calentar hasta la emisión de vapores. Mantener así por 10 minutos, evitando el secado del colorante sobre la preparación (el ácido carbólico actúa como el primer mordiente y el calor como segundo mordiente o mordiente físico). 2. Lavar con agua suavemente 3. Decolorar completamente con alcohol-ácido (ácido sulfúrico al 3% en el alcohol etílico al 95%). 4. Lavar con agua. 5. Cubrir con azul de metileno por 2 minutos. 6. Lavar con agua y colocar en posición vertical, dejar secar y observar al microscopio hasta el objetivo de inmersión. NOTA: La coloración de Kenyou, es igual que la coloración de Ziehl-Neelsen, sólo difiere en que no es necesario calentar la Fuschina y la cual es más concentrada, los demás colorantes son idénticos.

Fig. 3. Resultados de la tinción de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), donde se observa: (A) Bacilos no ácido-alcohol resistentes teñidos de azul por efecto del colorante azul de metileno y, (B) bacilos ácido-alcohol resistentes, teñidos de rojo por acción de la Carbol-fucsina Tinción de esporas. Cuando el medio ambiente de las bacterias se torna desfavorable, muchas de ellas entran en latencia; algunas especies bacterianas forman esporas, para contrarrestar la adversidad del medio con la deshidratación, el calor,

el frío, o la escasez de nutrientes. Si las condiciones ambientales retornan a la normalidad, la espora absorbe agua, rompe la pared interna y la célula bacteriana vuelve a surgir por el proceso de germinación (activación del crecimiento vegetativo). Las endosporas, están formadas por una cubierta alrededor del ADN y una pequeña porción de citoplasma dentro de ella; esta estructura, posee una mayor resistencia a los agentes físicos y químicos que la célula vegetativa. El diámetro de la espora con respecto a la célula bacteriana y la posición que ocupa dentro de ella son características distintivas de las especies. Las endosporas no se colorean por métodos corrientes y por consiguiente, se recurre a métodos de coloración especiales para su observación. Algunas coloraciones para esporas son: Coloración de Möeller y de Schaeffer-Fulton. Tinción de esporas de Schaeffer-Fulton. En este tipo de tinción se utiliza como colorante primario, el verde de malaquita y uno de contraste (Safranina o Fucsina) (Figura 4; Anexo A). Por medio de esta técnica se pueden diferenciar las endosporas de la célula vegetativa. De acuerdo con ella, se aplica el colorante primario en solución acuosa y se le hace vaporizar para incrementar la penetración de los recubrimientos relativamente impermeables de las endosporas. Las endosporas sometidas correctamente al método, resistirán la sustitución por el colorante de contraste y a menudo se podrán observar endosporas verdes dentro de células rojas; de esta forma, se puede determinar la ubicación intracelular de la misma (terminal, subterminal o central), para usarse con fines taxonómicos PROCEDIMIENTO para realizar correctamente una tinción por el método de schaeffer-fulton. 1. Prepare el frotis y fíjelo al calor. 2. Agregue unas gotas de verde de malaquita, hasta cubrir totalmente la preparación; caliente por 5min., hasta que se observe la emisión de vapores pero, sin dejar hervir ni secar el colorante. La placa puede ser cubierta con papel filtro para evitar salpicaduras y siempre tenga en cuenta que el montaje debe estar lo suficientemente húmedo. 3. Deje enfriar y lave con agua destilada. 4. Contracolorear con Safranina al 0,5% por 1 minuto. 5. Retire el exceso de colorante lavando con agua destilada. 6. Deje secar al aire. 7. Realice la observación al microscopio hasta el objetivo de inmersión. Las esporas aparecen verdes y las células vegetativas de color rosado (Figura 4A). Procedimiento para realizar correctamente una tinción por el método de Möeller. 1. Realice el frotis de la muestra y déjelo secar al aire; fíjelo. 2. Cubra el frotis con fucsina-carbólica de Ziehl-Neelsen y caliéntelo hasta que desprenda vapores. Tenga cuidado de no dejar secar ni hervir el colorante. Continúe este proceso por 5 min. 3. Lave con agua. 4. Decolore con Ácido Sulfúrico 1%. 5. Lave con agua. 6. Cubra con Azul de Metileno de Löeffler durante 2min.

7. Lave con agua, deje secar y observe al microscopio hasta objetivo de inmersión. Las esporas aparecen rojas y las células vegetativas de color azul (Figura 4B).

Fig. 4. Resultados de las tinciones de endosporas bacterianas de (A) Schaeffer-Fulton, donde se observan las endosporas teñidas de verde y la célula vegetativa de color rosado y de (B) Möeller, donde se observan las esporas rojas y la célula vegetativa de color azul Tinción de cápsulas bacterianas. Tinción negativa. En esta tinción se puede identificar la estructura externa que envuelve a algunas bacterias como Klebsiella spp., Streptococcus pneumoniae y Clostridium perfringens. Utiliza como colorante primario tinta china o Nigrosina. La técnica de tinción negativa incorpora materiales como la tinta china, que se compone de partículas demasiado grandes para penetrar en la célula; después de haber utilizado el colorante primario se adiciona el de contraste que, penetra fácilmente a la célula bacteriana. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea a la pared celular (las células no se tiñen), sobre un fondo negro. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la recesión o separación de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado presenta muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es posible que sean reales y no artificiales (Figura 5). Procedimiento para realizar correctamente una tinción Negativa. 1.

Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado deposite en un extremo una gota de tinta china.

2.

Tome una gota del cultivo y mezcle a lo largo del portaobjetos (técnica del frotis sanguíneo). También,

puede mezclar en un tubo, partes iguales de cultivo y tinta china. 3.

Tome la muestra, suspéndala sobre la lámina y realice el extendido.

4.

Deje que el extendido seque naturalmente (nunca fije al calor).

5.

Cubra con Safranina por 10 segundos y luego retire el exceso de colorante con agua destilada muy

cuidadosamente para no eliminar el frotis. 6.

Deje secar al ambiente.

7.

Realice la observación bajo el microscopio hasta el objetivo de inmersión (Figura 5A)

Fig. 5. Resultados de las tinciones de cápsulas bacterianas por los métodos de (A) tinción negativa, donde se observan las cápsulas transparentes (las células no se tiñen), y el fondo oscuro y, (B) tinción de Hiss, donde se observan las cápsulas azul claro y la célula vegetativa de color púrpura oscuro bajo un fondo claro (Fuente: Rojas, A.). PROCEDIMIENTO para realizar correctamente una tinción de cápsulas de Hiss. Con esta tinción, las células se ven teñidas intensamente y la cápsula de azul o rosado según se use violeta o fucsina. 1. Previamente se cultivan las bacterias para el desarrollo máximo de cápsulas. 2. Fijar los frotis con vapores de Ácido Ósmico durante 10-20 segundos. 3. Dejar secar sin calentar. 4. Fijar la preparación adicionando alcohol y flameándolo. 5. Cubrir con una solución de fucsina básica o cristal violeta, calentando ligeramente hasta la emisión de vapores. 6. Retirar el colorante mediante solución al 20% de Sulfato de Cobre en agua. 7. Secar con papel filtro y examinar al microscopio hasta objetivo de inmersión. Si emplea cristal violeta, la cápsula aparecerá azul claro en contraste con el color púrpura oscuro de la célula (Figura 5B). Tinción de flagelos. Los flagelos son órganos de locomoción delgados, de naturaleza proteica que se originan en la región protoplásmica inmediatamente debajo de la pared celular. No todas las bacterias poseen estas estructuras y En consecuencia, la presencia de flagelos, al igual que la distribución y las cantidades en que están presentes en ellas, son características útiles para su clasificación (patrones de flagelación: Polar, perítricos, monotricos, lofotricos, anfítricos). La observación de flagelos se realiza comúnmente en microscopios electrónicos, sin embargo, con la técnica adecuada se pueden observar en microscopios ópticos, cuando se aplican mordientes y colorantes alrededor de ellas, ya que, estas incrementan el diámetro de los flagelos (Figura 6). Procedimiento para realizar correctamente una tinción de flagelos modificada de Leifson. 1.

Prepare una suspensión poco densa de bacterias en agua y a partir de un cultivo joven.

2.

Coloque dos gotas de la suspensión en un extremo del portaobjetos, deje secar al aire y con un lápiz vidriográfico, dibuje una línea perpendicular en la superficie del vidrio y en el extremo opuesto de la suspensión.

3.

Coloque el portaobjetos, en un soporte inclinado y cubra la suspensión bacteriana seca con una película fina de colorante de Leifson (Fucsina básica 1.2% en alcohol 95%, Ácido Tánico 3% (mordiente), en agua y NaCl 1.5% en agua; mezclados en iguales volúmenes). La marca con el lápiz de cera, impide que el colorante se escurra del extremo del portaobjeto.

4.

Permita que el colorante actúe por 5-15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que se evapora el alcohol. El tiempo de tinción disminuye si el colorante es fresco y si la temperatura del ambiente es alta.

5.

Cuando se forme el precipitado, enjuague el portaobjetos suavemente con agua destilada, elimine el exceso de agua y dejar secar al aire. Observe al microscopio hasta objetivo de inmersión (Figura 6).

Fig. 6. Resultados de la tinción de flagelos bacterianos por el método de Leifson, donde se observan las células vegetativas de color rojo y los flagelos de color rosado Tinción de gránulos bacterianos. Se usa para teñir gránulos metacromáticos de Polimeta-fosfato, los cuales se tiñen de color rojizo mientras el cuerpo de la célula se tiñe de color azul-verdoso. Cuando se tiñe con azul de Toluidina y verde de metilo acidificado en solución alcohólica y, Lugol, se observan los gránulos de color azul oscuro y la célula de color verde claro; es una técnica de tinción útil para observar los gránulos de las corynebacterias. El azul de toluidina tiñe los gránulos principalmente y el verde de metilo el protoplasma de la bacteria. Procedimiento para realizar correctamente una tinción de gránulos de Albert. 1.

Cubra el frotis con el colorante de Albert y deje por 10 minutos.

2.

Lave suavemente con agua corriente.

3.

Cubra el frotis con Lugol y deje actuar por 5 minutos.

4.

Deje secar la muestra a temperatura ambiente

5.

Realice la observación bajo microscopio y hasta objetivo de inmersión.

6.

Las corynebacterias se observan con formas de L, V o Y de color verde claro y los gránulos metacromáticos de color azul oscuro.

Causantes de error en el proceso de tinción. 1.

El cristal violeta puede precipitarse, ocasionando la observación de estructuras falsas en el frotis. Para evitar esto, filtre el colorante antes de su uso.

2.

La evaporación (concentración del colorante), es causa de mal funcionamiento.

3.

El uso de portaobjetos engrasados o sucios, es la causa de mala fijación del frotis y teñido de la muestra.

4.

El sobrecalentamiento del frotis en el momento de la preparación del mismo, provoca daños físicos en la pared celular de las bacterias, afectándose la retención de los colorantes.

5.

Lavado muy fuerte del frotis durante la tinción.

6.

Aplicación de tiempos o proporciones inadecuadas de los colorantes utilizados en el proceso de tinción.

7.

Algunos tintes pueden contaminarse (safranina y fucsina básica). Si se sospecha contaminación, cultive 1mL del colorante en Caldo Tioglicolato y observe la reacción o, preferiblemente descarte el colorante.

8.

La tinción de Zielh-Neelsen, presenta algunas limitaciones por la no especificidad a micobacterias y la baja sensibilidad (el nivel de detección 5.000-10.000 bacilos/mL). Para esta tinción, siempre debe ser teñido un aislamiento control positivo (p.e.: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177), cada vez que se cambie de reactivos (nueva preparación o compra)

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR. - 1 asa bacteriológica. - 1 cultivo bacteriano en agar Nutritivo de 18-24 horas, sembrado por agotamiento. - 1 bandejas para tinción. - 1 cultivo bacteriano en caldo Nutritivo de 18-24 horas. - 1 mechero Bunsen o de alcohol. - Ácido sulfúrico 1%. - 1 microscopio binocular compuesto. - Azul de metileno de Zeehl-Neelsen. - 10 portaobjetos desengrasados. - 1 pinza metálica. - 10 cubreobjetos desengrasados. - 1 rejilla metálica. - 6 pipetas Pasteur plásticas. - 1 beaker de 1000mL (o un recipiente de gran capacidad y resistente al calentamiento). - 1 hornilla eléctrica. - Papel filtro o toalla. - 1 set de papel para óptica. - Reactivo de Hiss. - Azul de Metileno.

- Reactivo de Albert - Cristal violeta. - Tinta china - Lugol de Gram. - Colorante de Leifson. - Alcohol-acetona. - Solución de fenol 5%. - Safranina. - Fuschina carbólica de Zeehl-Neelsen. - Verde Malaquita. - Aceite de inmersión. - Fucsina (para fucsina fenicada de Ziehl). PROCEDIMIENTO. 1. De cada uno de los cultivos bacterianos (que se encuentran en agar y caldo), proporcionados por su tutor, prepare una lámina; realizando un frotis y fijándolo o no al mechero, esto de acuerdo a las instrucciones mencionadas en esta guía en el apartado de elaboración de frotis y tinciones de estructuras. 2. Coloree cada preparación de acuerdo a las metodologías proporcionadas en esta guía, para tinciones simples y compuestas; tenga en cuenta realizar mínimo una placa para las tinciones de Gram, endosporas, cápsulas y flagelos y, mínimo una placa de tinción simple. 3. Una vez coloreadas las láminas, llévelas una a una a observación bajo el microscopio compuesto, siguiendo las instrucciones correctas de manejo del microscopio binocular compuesto y con las indicaciones del tutor. 4. Describa y grafique cada una de las observaciones realizadas, registrando: Color o colores observados, estructuras, morfología y agrupación bacteriana. EJERCICIOS DE APLICACIÓN. RESOLUCIÓN DE CASOS PROBLEMAS. CUESTIONARIOS. Realiza la descripción detallada de las actividades realizadas durante la experiencia práctica BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA.  Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p.  Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid.  VARNAM, A. H. Bebidas. Tecnología, química y microbiología. Editorial Acribia. 2009  PELCZAR, M. R. 2002. Microbiología. 4ta Edición. Editorial Castillo S.A. Madrid, España.  SCHLEGEL. Microbiología general. Editorial Acribia. 1996.

Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano

Trabajo Práctico Nº 16 TÍTULO: Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano TEMA: Bacterias acéticas. Generalidades. Morfología. Ecología. Aislamiento. Clasificación. Transformación provocada en el vino por bacterias acéticas. Biotecnología de la elaboración del vinagre. Sistemas industriales de fabricación de vinagre. Alteraciones y defectos del vinagre. Vinagres especiales. OBJETIVOS A ALCANZAR. Que el estudiante conozca el efecto del pH y la temperatura como parámetros de control del crecimiento microbiano. Que el alumno comprenda la importancia de estos factores fisicoquímicos en la selección de poblaciones microbianas en los diferentes ambientes en que se encuentran y los mecanismos de adaptación a nivel celular y metabólico que han desarrollado. COMPETENCIAS RELACIONADAS: Microbiología y Sanidad, técnicas de observación INTRODUCCIÓN AL TEMA: Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya que éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasificar en tres grupos: a).- Físicos.- temperatura, presiones externas, humedad. b).- Químicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de productos tóxicos. c).- Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especies coexistentes. Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los hábitats extremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienen propiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales sitios. En otros hábitats menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia en la selección de las poblaciones que se encontrarán. Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los fisicoquímicos como: la temperatura y pH. Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento que los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de crecimiento. También hay límites de temperatura, la temperatura mínima en las que son metabólicamente inactivos y una temperatura arriba de la cuál el crecimiento ya no es posible llamada temperatura máxima. De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento, los microorganismos se dividen en psicrófilos (