UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
GUIA DE TRABAJO N°2: RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER OBJETIVO GENERAL
Realizar e interpretar la técnica para el recuento de levaduras y esporas de hongos en la cámara de Neubauer.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS La cámara de Neubauer es una cámara de recuento que se utiliza para determinar el número de partículas (levaduras, bacterias, eritrocitos, etc.) por unidad de volumen de un líquido a través del microscopio. Está constituida por un bloque grueso de cristal demarcado por una cuadrícula (Fig. 1), que contiene dos zonas ligeramente deprimidas cuyas dimensiones son conocidas. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul de metileno. El azul de metileno es un colorante que se introduce en el interior de las células que presentan daños en la membrana. Así pues las células que aparecen de color azul, son consideradas no viables.
. Figura 1. Vista superior y lateral de la cámara de Neubauer
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MÉTODOS MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES 1 Micropipeta 100-1000 ml con puntas 1 Balón aforado de 10 ml 1 Gotero 1 Cámara de Neubauer Lámina cubreobjetos 1 Micropipeta de 0,5-10 ul con puntas 1 Microscopio
R EACTIVOS Muestra de levadura Cultivo de hongo (esporulado) Agua destilada Azul de metileno al 0,01% (agua) Alcohol antiséptico
PROTOCOLOS 1- Conteo de levaduras 1.1- Preparación de la Muestra. Tomar 1 ml del cultivo líquido (muestra de la levadura) y aforar a 10 ml con agua destilada en un balón aforado. Añadir una gota de azul de metileno. Tapar y agitar cuidadosamente. En caso de que el cultivo se encuentre en medio sólido, tomar una colonia y resuspenderla en 5 ml de -1 diluyente; tomar 1 ml y realizar la dilución 10 .
1.2- Llenado de la cámara y conteo celular Limpie la cámara y la lámina cubre objetos con alcohol Coloque la laminilla sobre la cámara, esta debe quedar centrada. Llenar la cámara con una micropipeta pequeña (0,5-10 ul). El llenado debe ser continuo en un solo intento. No se deben observar porciones secas en las esquinas del recuadro de llenado, tampoco se debe inundar. Llevar la cámara al microscopio y enfocar el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará una imagen similar a la figura 2.
Figura 2. Cámara de Neubauer 4X.
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Si las células que va a contar son pequeñas como las levaduras, bacterias, etc. Ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X, se visualizará de la siguiente manera:
Figura 3. Cámara de Neubauer 10X. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central (señaladas por flechas en la Fig. 3), lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara de conocer como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:
Figura 4. Cámara de Neubauer en 40X Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas de la Fig. 5 para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen.
Figura 5. Orientación para realizar el conteo 3
Las células que tiene una X son las que no se deben contar (Fig. 6)
Figura 6. Conteo de células en cuadros terciarios Después de contar las células se procede a calcular el número de células por unidad de volumen. Para esto se debe tener en cuenta el área de cada cuadro y el espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla cubre objetos. La cámara tiene una profundidad de 0,1 mm y las siguientes dimensiones:
Figura 7. Dimensiones de la cuadricula de la Cámara de Neubauer Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las células u otras partículas no se sobrepongan y deben estar uniformemente distribuidas. Para células pequeñas se recomiendan contar cuatro esquinas y el cuadro del centro. Cada cuadro tiene un área de 0,2* 0,2= 0.04 mm 2 y 0,1 mm de profundidad. Por lo tanto el volumen total de cada cuadro es de 0,04* 0,1= 0,004 mm 3, si se contaron 5 cuadros se tiene un volumen de 0,02 mm 3. Si se
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contaron 187 células en un volumen de 0,02 mm 3 equivale a 9350 células/mm 3. Hay 1000 mm 3 en 1 cm3, dando un total de 9.350.000 células/ml. Para fines prácticos se puede aplicar la siguiente formula: Células/ ml = total de células contadas * 50.000 Células/ ml = 187 * 50.000 = 9.350.000 Pero, para poder determinar el número de células en la muestra original hay que multiplicar este valor por la dilución, que en este caso fue 10. Células/ ml = (total de células contadas * 50.000)* dilución Células/ ml = (187 * 50.000)*10 = 93.500.000
1.3- Determinación de la viabilidad celular El colorante azul de metilo es capaz de penetrar la pared de las células muertas, tiñéndolas completamente, de tal manera que las células vivas se observan sin teñir. Para determinar la viabilidad celular del cultivo es necesario aplicar la siguiente fórmula: Viabilidad % = (células totales- células muertas)/ células totales x 100 Es importante hacer el conteo lo más pronto posible después de realizada la tinción, debido a que algunas células pueden morir por procesos oxidativos, alterando el recuento.
2- Conteo de esporas de Hongos Tomar con un asa de argolla parte del micelio aéreo del hongo y diluir en 10 ml de agua destilada. De ser necesario, filtrar a través de una malla o gasa para eliminar el agar o restos de micelio. Cargar la cámara como en el procedimiento anterior. En caso de que el hongo tenga esporas grandes, hacer el conteo de los cuadros A, B, C y D (Fig. 8) y aplicar la siguiente formula: Esporas/ ml= (total de esporas contadas*10.000)/ (# de cuadros* factor de dilución) Ejemplo: si se obtuvo un conteo total de 66 esporas: Esporas/ ml= (66*10.000)/ (4 * 0,1) Esporas/ ml= 1.650.000 Si las esporas son pequeñas, el conteo se puede hacer como para levaduras.
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Figura 8. Cuadricula para el conteo de esporas de hongos.
BIBLIOGRAFÍA Universidad Autónoma de Guadalajara, Manual de ciencias químico- biológicas, Biotecnología: Apéndice 1 cuantificación de levaduras, http://es.slideshare.net/cesarturo26/practica-1-crecimiento-levaduras Libkind, D, Tognetti, C & M, Moliné ´Curso teórico-práctico sobre microscopia y recuento de levaduras para productores de cerveza´ [en linea], Laboratorio de Microbiología aplicada y biotecnología, Instituto de investigaciones en biodiversidad y medioambiente, BarilocheArgentina, http://www.somoscerveceros.com/wp-content/uploads/2014/11/Teorica-Curso-Microscopio-La-Plata-2014V5.pdf
Elaboró Revisado Aprueba
ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO Valeria Pérez Luna
[email protected] E-mail Sandra P. Rivera Msc. Departamento Ciencias Básicas x Área Microbiología 6
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