Guía de Prácticas UNFV.pdf

2011

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE TECNOLOGÍA MÉDICA

Escuela de Laboratorio y de Anatomía Patológica

MANUAL DE PRÁCTICAS DE HISTOTECNOLOGÍA “En la vejez la ciencia es para nosotros un cómodo refugio; y si no la plantamos de jóvenes, no nos dará sombra cuando seremos viejos.”…

Perteneciente a: ………………………………………………….………………………. 1

LIMA - PERÚ

Edición de la guía de práctica

Cuarta edición 2011

Profesor Eduardo Sedano Gelvet Profesor Carlos Neira Montoya

La edición de la presente guía de práctica, fue posible gracias a la experiencia acumulada de los docentes y colaboradores durante los últimos años.

Asignatura de Histotecnología Año Académico 2011 1.

2.

Profesor responsable de la asignatura: Eduardo Eulogio Sedano Gelvet. Categoría: Auxiliar. Clase: Tiempo parcial 12 horas. Profesores de la asignatura: Carlos Ricardo Neira Montoya. Categoría: Auxiliar. Clase: Tiempo parcial 12 horas.

Universidad Nacional Federico Villarreal. Facultad de Tecnología Médica. ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE LABORATORIO Y DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. Jr. Río Chepen 290, El Agustino, Lima-Perú. Correo electrónico: [email protected] [email protected]

2010  Derechos Reservados. Prohibida la reproducción parcial o total sin autorización escrita de los autores.

Nuestra constante misión es buscar nuevas tecnologías,..... nuevas formas de procedimientos. Y avanzar osadamente, a donde no ha llegado ningún otro.......histotecnólogo Eduardo Sedano G.

2

CONTENIDO Prologo

Pág. 6

Modificaciones sugeridas

Pág. 8

Decálogo del estudiante

Pág. 9

Test de estilos de aprendizaje

Pág. 10

El proceso de estudio

Pág. 13

Mapas conceptuales

Pág. 15

Formato de desarrollo y de presentación de un proyecto de Investigación

Pág. 17

Departamento de patología del Hospital de Apoyo “María Auxiliadora”

Pág. 21

Laboratorio de procedimientos histológicos del departamento de patología

Pág. 23

Factores de riesgo ocupacional en el laboratorio de procedimientos histológicos

Pág. 33

Medidas generales de seguridad

Pág. 34

Clasificación de materiales peligrosos

Pág. 36

Procedimientos a seguir en caso de accidente

Pág. 37

Recomendaciones de seguridad en caso de sismo

Pág. 38

Un programa de garantía de la calidad

Pág. 41

Elección de un método histológico o histoquímico

Pág. 42

Métodos de estudio en histología

Pág. 43

Pasos de las técnicas microscópicas

Pág. 44

Tabla de tejidos y fijadores

Pág. 49

Deshidratación e inclusión en parafina

Pág. 50

Obtención de los cortes

Pág. 50 3

Coloración

Pág. 51

Montaje

Pág. 53

Recomendaciones útiles

Pág. 53

Método de coloración de hematoxilina y eosina

Pág. 55

Reacción del ácido peryódico de Schiff (método de P.A.S.)

Pág. 57

Reacción de P.A.S (para demostrar glucógeno)

Pág. 60

Método del carmín de Best (modificado por Lillie) Método del hierro coloidal de Hale (método modificado)

Pág. 63 Pág. 65

Método del azul alciano (método del alcian blue)

Pág. 67

Coloración metacromática con azul de toluidina

Pág. 69

Observación metacromática de glucosaminoglicanos ácidos con azul de toluidina

Pág. 69

Método de Feulgen (Feulgen-Rossenbeck)

Pág. 70

Método del verde de metilo-pironina (Unna-Pappenhein)

Pág. 73

Método del rojo Congo de Bennhold

Pág. 75

Método de coloración con Sudan III o IV

Pág. 77

Método de Sudán Black B (Sudan negro)

Pág. 79

Método de Perls (azul de Prusia, azul de Berlín)

Pág. 81

Método de von Kossa

Pág. 83

Método de Masson Fontana

Pág. 85

Panel de tamizado primario y secundario

Pág. 87

Procedimiento del complejo streptavidina-biotina fosfatasa alcalina (método del H.A.M.A)

Pág. 90

Método de coloración con luxol fast blue para mitocondrias

Pág. 96

Método de hematoxilina férrica de Weigert para ergastoplasma

Pág. 98

Método de impregnación argéntica directa de Da Fano para el aparato de Golgi

Pág. 99 4

Coloración de van Gieson para fibras colágenas

Pág. 101

Coloración tricrómica de Masson

Pág. 103

Impregnación argéntica de Gomori para de reticulina

Pág. 106

Coloración de Verhoeff para fibras elásticas

Pág. 108

Coloración de Giemsa (modificación de Wolbach)

Pág. 110

Método de Schmorl para demostración de lagunas y Canalículos óseos

Pág. 112

Coloración de azul de toluidina para colorear sustancia fundamental de tejido cartilaginoso.

Pág. 114

Método de coloración con luxol fast blue para bandas de mielina

Pág. 115

Coloración de Ziehl-Neelsen para microorganismos ácido-alcohol resistentes.

Pág. 117

Coloración de Wayson para Helicobacter pylori

Pág. 119

Impregnación argéntica de Warthin-Starry para Helicobacter pylori

Pág. 120

Impregnación de nitrato de plata-metanamine de Gomori (aplicación de Grocott para hongos)

Pág. 122

5

PROLOGO Esta guía de práctica de Histoquímica dedicada al estudiante de Tecnología Médica intenta exponer cada método en forma sintética y a la vez completa, suficiente en extensión y con la profundidad necesaria. Presentará, un Test de Estilos de Aprendizaje porqué es preciso tener una idea de como aprenden los alumnos para poder ayudarlos, luego de una introducción de lo que es el Departamento de Patología y el Laboratorio de Procedimientos Histológicos del mismo, las cinco etapas principales de las Técnicas Histológicas, que permiten la obtención de preparaciones histológicas permanentes (láminas) para el estudio al microscopio óptico y, además, Histoquímica; cada uno de estos dos últimos tópicos presentará algunos de los métodos más comúnmente utilizados en el estudio de células y tejidos. Los principios en que se basan estos métodos serán explicados sumariamente a fin de que se puedan evaluar debidamente los resultados con ellos obtenidos. Como es lógico suponer, lo que se desea es llevar al microscopio una preparación en que los tejidos ya sean normales o patológicos estén perfectamente conservados, presentando la misma estructura y composición química que poseían cuando estaban vivos. Sin embargo, a pesar de las medidas adoptadas, este ideal no se alcanza, observándose en todas las preparaciones histológicas ciertos artefactos consecuentes del procesado que sufrieron. Todas las características que presenta esta guía de práctica han sido elaboradas acorde con la experiencia acumulada durante 20 años en la enseñanza de pre-grado en Técnicas Histológicas e Histoquímica, así como en la investigación y en el trabajo diario realizado en el Laboratorio de Procedimientos Histológicos del Departamento de Patología del Hospital de Apoyo "María Auxiliadora"; que sirven para transmitir destrezas eminentemente prácticas y aplicadas que permitan al alumno: 1) correlacionar el conocimiento histológico con los métodos que permiten su estudio, y 2) el conocimiento de métodos que posee actualmente la histología, para aplicarlos y coadyuvar así, al diagnóstico histopatológico. Cabe mencionar, que esta guía de práctica está sujeta a las correcciones sugeridas por colegas y alumnos. Por último, que sirvan estas líneas para agradecer a quienes contribuyeron en nuestro desarrollo en las Técnicas Histológicas, Histoquímica y en la docencia, porque nos enseñaron que los conocimientos no tienen barreras profesionales. A los doctores MARCOS COPAIRA BELTRÁN y CÉSAR EDUARDO MONTALVO ARENAS nuestro eterno agradecimiento. CARLOS RICARDO NEIRA MONTOYA EDUARDO EULOGIO SEDANO GELVET

6

Esta guía de práctica ha tenido modificaciones sugeridas por: Interno T.M. JUAN AUQUI SULCA Interno T.M. LUIS CAPCHA Alumna de Biología: NANCY ODILE CHANCO APARICIO Interno T.M. CESAR EDUARDO ROJAS NARVAEZ Interno T.M. MOISÉS SALDAÑA OREJÓN Interno T.M. LUIS VALLEJOS SÁNCHEZ Interno T.M. JAFFET VARGAS VITTORINO Alumno de T.M. EDUARDO MANUEL CORNEJO RUIZ. Doctor ALFREDO GUILLEN ONEGLIO En todo tecnólogo médico ha de haber una primavera de dudas, un verano de reposo, un otoño de conocimientos y un invierno de sabiduría. Eduardo Sedano Gelvet

7

REGULACIONES INFORMACION GENERAL 

Antes de cada sesión de trabajo se debe leer la guía de práctica y planificar el trabajo cuidadosamente.



No empezar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones. La sesión de trabajo se iniciará con las instrucciones del profesor de prácticas. Si la información del instructor o del manual no están claras, realice las preguntas adecuadas.



Anote las observaciones cuando las realice. El examen práctico incluirá la información que el profesor de prácticas le brindará, la del manual y la de sus propias observaciones y conclusiones.



Responda y discuta las preguntas de la guía con su profesor de práctica, estas serán consideradas en el examen práctico.

REGLAS DEL LABORATORIO 

Debe usar un mandil blanco o chaqueta, limpios cuando este en el laboratorio. Este debe ser lavado por lo menos una vez a la semana utilizando agua caliente y lejía. No se permitirá el ingreso o la permanencia de alumnos sin mandil o chaqueta.



Antes de empezar y después de trabajar limpie la mesa del laboratorio y cada vez que sea necesario (derrame de material contaminado).



Coloque sólo el material indispensable sobre las mesas de laboratorio. No colocar bolsas, ni mochilas u otro material que no sea del curso.

 

Nunca utilice la boca para pipetear, el material puede ser tóxico o infeccioso. Está PROHIBIDO comer, fumar o aplicarse cosméticos en el laboratorio.



Lávese las manos con agua y jabón antes de retirarse del laboratorio.



Colocar el material usado desechable en envases apropiados al terminar las prácticas, siendo de responsabilidad del alumno N° 1 correspondiente de acuerdo al cronograma.



Algunos de los reactivos con que se trabajan son peligrosos. Use guantes o mascarillas descartables cuando sea necesario y siga las instrucciones del profesor de prácticas.



Reporte todos los accidentes o derrames, incluso los menores, al instructor. Estos reportes no serán tomados en cuenta para la nota pero son importantes para tomar medidas de bioseguridad para todos y evitar la repetición de los accidentes.

MATERIAL NECESARIO (para todas las prácticas) El alumno debe contar con el siguiente material para el desarrollo de las prácticas: 

Guía de prácticas (obligatorio)



Desinfectantes: Alcohol 70%, fenol al 5%



Jabón líquido y toallas de papel



Material de escritorio: Marcador de tinta indeleble, lápiz de cera, caja de colores, papel kraft.



Material de limpieza: detergente, escobillas.



Material de laboratorio: láminas portaobjetos y cubreobjetos, asa de siembra y aguja de cultivo.



Equipos: microscopio compuesto, estufa, balanza y refrigeradora.



Set de colorantes del método de coloración de hematoxilina – eosina, agua destilada

8

DECÁLOGO DEL ALUMNO

1• Lo ético como principio básico. 2• El orden y la limpieza. 3• La integridad. 4• La puntualidad. 5• La responsabilidad. 6• El deseo de superación. 7• El respeto a las leyes y los reglamentos. 8• El respeto por el derecho de los demás. 9• Su amor al trabajo. 10•Su esfuerzo por acometimiento.

la

economía

y

9

Test de Estilos de Aprendizaje Por favor, rodee con un círculo el número (del 1 a 6) que corresponde más a cómo usted se ve o cómo se describiría usted: 1. Yo me describiría como imparcial (de mentalidad abierta)

1 2 3 4 5 6

Yo me describiría como explícito (tajante)

2. Yo me describiría como reflexivo

1 2 3 4 5 6

Yo me describiría como orientado a la acción

3. Me gusta permanecer flexible

1 2 3 4 5 6

Me gusta ser específico

4. Valoro la paciencia

1 2 3 4 5 6

Valoro lograr hacer cosas

5. Me gusta que las cosas sean variadas y tengan colorido

1 2 3 4 5 6

Me gusta que las cosas sean exactas y precisas

6. Yo me describiría observador

como

1 2 3 4 5 6

Yo me describiría como activo

7. Tomo un enfoque creativo e imaginativo para resolver problemas

1 2 3 4 5 6

Tomo un enfoque preciso y calculado para resolver problemas

8. Me siento bien cuando entiendo las cosas

1 2 3 4 5 6

Me siento bien cuando logro un impacto en las cosas

Me gusta permanecer flexible (no ser tan específico)

1 2 3 4 5 6

Me gusta ser lo más preciso posible

10.Soy bueno mirando las cosas bajo diversas perspectivas

1 2 3 4 5 6

Soy bueno logrando hacer cosas

11.Yo me describiría como receptivo y complaciente

1 2 3 4 5 6

Yo me describiría como evaluativo y lógico

12.Me gusta mirar lo que pasa a mi alrededor

1 2 3 4 5 6

Me gusta ver los resultados de mis acciones

13.Lucho por ser versátil

1 2 3 4 5 6

Lucho por ser preciso

14.Me considero reservado y lógico

1 2 3 4 5 6

Estoy preparado para actuar

9.

10

Instrucciones.- Los items impares miden la dimensión EC/CA (Sentir/Pensar). Los items pares miden la dimensión EA/OR (Actuar/Observar). Por favor, sume los items que correspondan a cada dimensión, tal como se indica a continuación: EC/CA (Sentir/Pensar) Item

1

3

5

7

9

11

13

Total

6

8

10

12

14

Total

Puntos EA/OR (Actuar/Observar) Item

2

4

Puntos Coloque el Total EC/AC (Sentir/Pensar) en el eje vertical de la figura a continuación. Después coloque el Total EA/OR (Actuar/Observar) en el eje horizontal. Luego, coloque una cruz en el lugar de intersección de los dos puntajes. Esta cruz reflejará su modo adaptativo. EC -7 8-

ABEJA

EA 42

40 38 36 34 32 30 28 41 39 37 35 33 31 29 27

CASTOR

-9 10--11 12--13 14--15 16--17 18--19 20--21 22-23 26 -26 27 -28 29 -30 31 -32 33 -34 35 -36 37 -38 39 -40 41 -42

DELFÍN

OR 22 20 18 16 14 12 10 8 23 21 19 17 15 13 11 9 7

BÚHO

CA 11

El diagrama a continuación señala las fuerzas y debilidades de cada estilo de aprendizaje con notas para mejorar Acomodador (Abeja)

Experiencia concreta (Sentir)

Fuerzas: Lograr hacer las cosas Liderazgo Toma de riesgos Debilidades: Mejoras triviales. Actividad sin sentido.

Rasgos típicos: Trabajo terminado a tiempo. Planes prácticos. Dirigido a metas. Para desarrollar sus habilidades de de aprendizaje acomodador, practique: *Comprometerse con objetivos. *Buscar nuevas oportunidades. *Influir y dirigir a otros. *Involucrarse en forma personal. *Tratar a gente.

Experimentación Activa (Actuar)

Divergente (Delfín)

Fuerzas: Habilidades imaginativas. Comprender a la gente. Reconocer problemas. Tormenta de ideas. Debilidades: Paralizado por las alternativas. No puede tomar decisiones. Rasgos típicos: Tener ideas. Reconocer problemas y oportunidades.

Para desarrollar sus habilidades aprendizaje divergente, practique: *Ser sensible a los sentimientos de la gente. *Ser sensible a valores. *Escuchar con mente abierta. *Reunir información. *Imaginarse las implicaciones de situaciones inciertas.

Observación Reflexiva (Observar) Asimilador (Búho)

Convergente (Castor) Fuerzas: Solución de problemas. Tomar decisiones. Razonamiento deductivo. Definir problemas.

Fuerzas: Planificación. Creación de modelos. Definir problemas. Desarrollo de teorías.

Debilidades: Resolver el problema erróneo. Decisiones apresuradas.

Debilidades: Castillos en el aire. Falta de aplicaciones prácticas.

Rasgos típicos: Presencia de foco. Probar las ideas. Pensamientos centrados

Rasgos típicos: Capaz de aprender de los errores. Base sólida para el trabajo. Enfoque sistemático.

Para desarrollar sus habilidades de aprendizaje convergente, practique: *Crear nuevas formas de pensar y actuar. *Experimentar con nuevas ideas. *Escoger la mejor solución. *Establecer metas. *Tomar decisiones.

Para desarrollar sus habilidades de aprendizaje asimilador, practique: *Organizar información. *Construir modelos conceptuales. *Probar teorías e ideas. *Diseñar experimentos. *Analizar datos cuantitativos.

Conceptualización abstracta (Pensar) 12

EL PROCESO DEL ESTUDIO Para concluir con los desagregados referidos al método del estudio, debemos señalar tanto cuanto secuencia el proceso del estudio: 1.

Prepara y examina la temática que ha de exponerse durante la clase inmediata posterior.

2.

Estudia y analiza el o los temas de las materias que se expusieron en la clase anterior.

3.

Busca uno o varios motivos que comprometan el estudio.

4.

Precisa una noción clara de los objetivos que debes lograr.

5.

Empieza el mapa conceptual siguiente lo antes posible, a fin de repasar con detenimiento y en forma crítica la lección anterior.

6.

A través de la práctica, descubre y determina qué te es mejor, si empiezas por la tarea más difícil o por la más fácil cuando te encuentres frente a varios deberes de dificultad desigual.

7.

Evalúa y valora diariamente el grado de importancia de los temas que te son presentados, a fin de dedicar tus mayores esfuerzos y fijar permanentemente aquellos que son vitales y fundamentales.

8.

Comienza a trabajar tu mapa conceptual lo más pronto posible.

9.

Durante tu trabajo, desarróllalo intensamente y mantente concentrado.

10.

Cuida que tu atención no se desvíe o confunda cuando estés trabajando.

11.

Trata de actuar tú mismo sin pedir ayuda mientras no te sea imprescindible.

12.

Elabora tus propios ejemplos concretos y con tus palabras sobre los temas, principios y reglas que analizas.

13.

Subraya y resalta las ideas esenciales en tus libros o toma notas fichadas.

14.

Haz un mapa conceptual a fin de dominar el material que se te presente extenso y complejo. Utiliza tu memoria en forma inteligente.

15.

Acostúmbrate a estudiar en forma razonada repasando mentalmente cada párrafo, tan pronto lo hayas leído.

16.

Al encontrarte con términos técnicos, fórmulas, definiciones, fechas y bosquejos trata de memorizarlas una vez que las hayas comprendido.

17.

Si debes aprender algo de memoria es mejor leer en voz alta que silenciosamente, y es mejor leer rápidamente que despacio.

18.

Toma un descanso y deja divagar tu mente antes de empezar otra tarea, después que hayas realizado un estudio intenso de un material difícil y complicado. 13

19.

Aplica tus conocimientos en todo trabajo que puedas, a fin de reafirmarlos.

20.

Toma apuntes y mantente activo durante tus clases a las que debieras asistir.

BLANCO Lourdes; CÉSPEDES Pablo: Metodología del estudio. El trabajo intelectual. En: Monografías.com, Newsletter #181,. Visto 25 de Noviembre de 2004. http://www.monografias.com/trabajos15/trabajo-intelectual/trabajo-intelectual.shtml

14

15

16

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE TECNOLOGÍA MÉDICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE TECNOLOGÍA MÉDICA

LABORATORIO CLÍNICO Y DE ANATOMIA PATOLÓGICA

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN TEMA:

ALUMNO:

LIMA-PERÚ 2010 17

INDICE CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Pagina 1.1

Descripción de la realidad

1.2

Delimitaciones y definición del problema 1.2.1 Delimitaciones a.

Delimitación temporal

b.

Delimitación espacial

c.

Delimitación social

d.

Delimitación conceptual

1.2.2 Definición del problema 1.3

Planteamiento del problema 1.3.1 Problema principal 1.3.2 Problemas secundarios

1.4

Objetivos de la Investigación 1.4.1 Objetivo principal 1.4.2 Objetivos específicos

1.5

Justificación e importancia

1.6

Limitaciones

18

CAPITULO II

MARCO TEORICO

2.1

Antecedentes de la Investigación

2.2

Marco histórico 2.2.1 Sobre ......... 2.2.2 Sobre ..........

2.3

Marco conceptual 2.3.1 Relacionado con .......... 2.3.2 Relacionado con .......... 2.3.3 Relacionado con ..........

2.4

Hipótesis de la Investigación 2.4.1 Hipótesis general 2.4.2 Hipótesis específicas

2.5

Variables e indicadores 2.5.1 Variable independiente 2.5.2 Variable dependiente

2.6

Definición de términos

19

CAPITULO III

METODOLOGIA

3.1

Tipo y Nivel de la Investigación 3.1.1 Tipo de Investigación 3.1.2 Nivel de Investigación

3.2

Método y Diseño de Investigación 3.2.1 Método 3.2.2 Diseño

3.3

Cobertura de Estudio 3.3.1 Población 3.3.2 Muestra

3.4

Técnicas e Instrumentación

3.5

Programa de Actividades y Presupuesto 3.5.1 Cronograma de Actividades 3.5.2 Presupuesto

Addendum

20

DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA DEL HOSPITAL DE APOYO "MARÍA AUXILIADORA" Definición del Departamento El Departamento de Patología, es el órgano operativo de línea encargado de brindar diagnóstico patológico integral de la más alta calidad a la población usuaria, mediante el estudio macroscópico y microscópico de las piezas quirúrgicas, biopsias y necropsias; y del estudio a nivel citológico y citogenético de exudados, líquidos corporales y células exfoliantes. Esta integrado por Médicos Especialistas, Tecnólogos Médicos Especialistas, Técnicos y Auxiliares de las Ciencias de la Salud, así como personal de Apoyo Administrativo y de Servicio. Posición estructural y dependencia. El Departamento de Patología, es un Órgano de Línea de los Servicios Intermedios de Apoyo al Diagnóstico del Hospital de Apoyo "María Auxiliadora", que depende en lo administrativo y funcional de.................. y en lo técnico-normativo de ..... Principales funciones y atribuciones: a) Desarrollar actividades de Apoyo al Diagnóstico para la protección, recuperación y rehabilitación del paciente, en el contexto de la familia y su comunidad. b) Contribuir en la protección de la salud del usuario y de la comunidad a través de programas de despistaje y prevención de cáncer. c) Brindar atención y servicios con criterios de calidad y calidez a la población usuaria, en todos los sectores de trabajo del Departamento: Jefatura, Secretaria, Servicios, Laboratorio de Procedimientos Histológicos, y en especial el Servicio de Mortuorio y Necropsias. d) Promover el desarrollo de los recursos humanos del Departamento de Patología, destinados a lograr la calidad y competitividad en el desempeño de sus funciones, mediante la implementación de programas de capacitación y educación continúa, utilizando metodología de problematización y solución de casos. e) Promover y desarrollar la investigación científica en los diferentes campos de la patología y de la histotecnología. f) Brindar apoyo técnico y de asesoría especializada a los directivos de la Institución y a los establecimientos de menor complejidad, interactuando con equipos multidisciplinarios. g) Desarrollar actividades de docencia universitaria de pre y post grado en patología e histotecnología, según convenios establecidos con las Universidades y las normas Institucionales vigentes. 21

h)

Otras funciones afines que le asigne la Institución.

Ubicación y áreas físicas del Departamento de Patología. El Departamento de Patología se encuentra ubicado en el primer piso al costado del Servicio de Emergencia. Las áreas físicas con que cuenta el Departamento de Patología son: Oficina de la Jefatura del Departamento Servicio de Citología Exfoliativa Servicio de Patología Quirúrgica Servicio de Mortuorio y Necropsia Laboratorio de Procedimientos Histológicos. Todo Departamento de Patología debe contar con un manual de organizaciones y funciones (MOF), Manual de Normas y Procedimientos (MNP), donde se especifica en forma detallada lo que debe hacer cada persona del Departamento, facilitándose el trabajo en equipo y con un Plan Operativo Anual. De igual forma debe existir un fluxograma en el cual se consigna en forma gráfica la organización en relación al movimiento de las muestras en el Departamento. La organización del Departamento está conformada por: Jefe de Departamento, Jefe de Sección, Patólogo Asistente, Jefe de Laboratorio ( Tecnólogo Médico) que puede ser jefe de sección en caso de que no se encuentre presente un patólogo; Tecnólogo Médico Asistente, Biólogo; Técnico y Auxiliar de laboratorio; empleado de servicio de morgue y limpieza.

"El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta que la ciencia logra abrir." — Albert Einstein

22

LABORATORIO DE PROCEDIMIENTOS HISTOLÓGICOS DEL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA Definición del Laboratorio de procedimientos histológicos del departamento de patología. El Laboratorio de procedimientos Histológicos del Departamento de Patología, es el órgano tecnológico de línea encargado de brindar el servicio de elaboración de preparados histológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos de la más alta calidad al patólogo (usuario), mediante el procesamiento de las piezas quirúrgicas, biopsias y necropsias por el método de la parafina u obtenidas por congelación. Esta integrado por Tecnólogos Médicos Especialistas, Técnicos y Auxiliares de las Ciencias de la Salud, así como personal de Apoyo Administrativo y de Servicio. Posición estructural y dependencia. El Laboratorio de Procedimientos Histológicos, es un Órgano Tecnológico de Línea de los Servicios Intermedios de Apoyo al Diagnóstico Histopatológico, que depende en lo administrativo y funcional del Departamento de Patología y en lo técnico-normativo del Jefe de Laboratorio. Principales funciones y atribuciones: a) Desarrollar actividades de Apoyo al Diagnóstico Histopatológico con la finalidad de satisfacer las necesidades diagnósticas del patólogo. b) Coadyuvar el diagnostico histopatológico a través de métodos histológicos, reacciones histoquímicas e inmunohistoquímicas. c) Brindar el servicio de elaboración de preparados histológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos con criterios de calidad y calidez al usuario. d) Promover el desarrollo de los recursos humanos del Laboratorio de Procedimientos histológicos, destinados a lograr la calidad y competitividad en el desempeño de sus funciones, mediante la implementación de programas de capacitación y educación continua. e) Promover y desarrollar la investigación científica en los diferentes campos de la histotecnología. f) Brindar apoyo técnico y de asesoría especializada a los Laboratorios de Procedimientos Histológicos Periféricos. g) Desarrollar actividades de docencia universitaria de pre y post grado en Histotecnología, según convenios establecidos con las Universidades y las normas Institucionales vigentes. h) Otras funciones afines que le asigne la Institución.

23

Ubicación y áreas físicas del Laboratorio de Procedimientos Histológicos. El Laboratorio de Procedimientos Histológicos se encuentra ubicado dentro del Departamento de Patología. Las áreas físicas con que cuenta el Laboratorio de Procedimientos Histológicos son: • Técnicas Histológicas • Histoquímica. • Laboratorio de Inmunohistoquímica. A continuación mostramos un gráfico en el que se refleja un modelo organizativo propio del Laboratorio de Procedimientos Histológicos del Departamento de Patología del Hospital de Apoyo "María Auxiliadora":

"Nunca consideres el estudio como una obligación sino como una oportunidad para penetrar en el bello y maravillosos mundo del saber." — Albert Einstein

24

+----------+ |LABORATORIOS| +----------+

Procedimiento histológicos

Inmunohistoquímica

+-------------+

+------------------+

|TAREAS ASIGNADAS|

| MÉTODOS REALIZADOS

+-------------+

+------------------+

|

Procesamiento de:

Tecnicas histológicas

Histoquímica

Biopsias Piezas quirúrgicas Material de autopsias Biopsias por congelación

Hematoxilina-eosina Tricromico de Masson Impreg. de Gomori Color. de Verhoeef Coloración de Gram Col.de Ziehl Neelsen Coloración de Waysson Impreg. argtca.de Grocott Coloración de Wolbach

Reacción de P.A.S Col.de alcian blue Hierro coloidal de Hale Col.metacromática Col.de carmín Best Reacción de Feulgen Coloración de sudan Reacción de Von Kossa Reacción de Perls

Procesamiento de: Biopsias Piezas quirúrgicas Material de autopsias Biopsias por congelación para estudio con sueros policlonales y anticuerpos monoclonales.

Anticuerpos ligados a enzimás: Método de inmunofosfatasa alcalina.

25

Del Jefe del Laboratorio Denominación del cargo: Jefe del Laboratorio de Procedimientos Histológicos. Naturaleza del trabajo: Encargado de dirigir eficaz y eficientemente la planificación, organización, control y mejora, de las actividades y desempeño del Laboratorio de Procedimientos Histológicos; orientados al logro de la misión asignada y el cabal cumplimiento de los objetivos y metas establecidas por el Departamento y la Institución. El Jefe del Laboratorio de Procedimientos Histológicos, depende administrativa y funcionalmente del Jefe del Departamento de Patología, ejerce autoridad sobre los Tecnólogos Médicos, personal profesional, Internos de Tecnología Médica, personal técnico y auxiliar asignado al Laboratorio; así como sobre el personal que desarrolla funciones administrativas. Principales funciones y responsabilidades: 1. Coordinar efectiva y permanentemente con el Jefe del Departamento de Patología la planificación, organización, control y mejora de las actividades del Laboratorio. 2. Dirigir la organización y funcionamiento del Laboratorio de Procedimientos Histológicos, en concordancia a las necesidades y expectativas de los usuarios; así como el cumplimiento de los objetivos del Departamento y las metas operativas del Laboratorio. 3. Cumplir y hacer cumplir las normas, disposiciones, directivas y manuales vigentes del Departamento y de la Institución. 4. Cumplir y hacer cumplir las normas, manuales y procedimientos vigentes de Bioseguridad en el Laboratorio. 5. Participar activamente en la formulación del Plan Operativo y el Plan de Capacitación Anual del Laboratorio. 6. Implementar y dirigir la ejecución del Programa Total de Control de Calidad. 7. Coordinar efectiva y permanentemente con los Tecnólogos Médicos Asistentes, Técnicos y Auxiliares la planificación, organización, control y mejora de las actividades del Laboratorio, según competencias y responsabilidades del personal. 8. Supervisar, monitorear y evaluar las actividades, tareas, procedimientos, resultados y tendencias del Laboratorio. 9. Realizar y participar en el desarrollo de actividades de Docencia e Investigación programadas por el Departamento, los Servicios o el Laboratorio. 10. Otras funciones afines que le sean encargadas por el Jefe del 26

Departamento de Patología. Perfil del cargo Para ocupar el cargo de Jefe de Laboratorio de Procedimientos Histológicos, los requisitos mínimos son: Ser Tecnólogo Médico, Especialidad Laboratorio Clínico y de Anatomía Patológica. Estar debidamente registrado en el Colegio Tecnólogo Médico del Perú. Tener Grado Académico de Magíster o estudios de Maestría. Tener experiencia mínima de 5 años en Laboratorio de Procedimientos Histológicos. Tener capacitación en sistemas de informática básica. Régimen laboral Tecnólogo Médico nombrado.

Del Tecnólogo Médico Denominación del cargo: Tecnólogo Médico Asistente. Funciones y responsabilidades: Técnicas: 1. Es responsable de la pieza quirúrgica, biopsia o muestras de necropsias desde su entrada al Laboratorio de Técnicas Histológicas hasta obtener el preparado histológico (lámina) en un lapso de 24-48 horas, además de verificar que las solicitudes anatomopatológicas tengan todos los datos requeridos. 2. Es responsable del control de calidad de las láminas histológicas, verificando siempre que el número de cortes corresponda a la descripción hecha en el estudio macroscópico. 3. Es responsable de los procedimientos histológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos. 4. Es responsable de la preparación y del control de calidad de colorantes y reactivos, para los procedimientos nombrados en el punto 4. 5. Es responsable de implementar procedimientos histológicos, e histoquímicos eficaces y eficientes para coadyuvar el diagnóstico. 6. Responsable de la preparación de piezas para museo y de material didáctico (microfotografías y slide). 7. Responsable de los equipos, materiales, reactivos y colorantes depositados 27

8.

en el almacén del servicio. Es responsable de evaluar el trabajo de su personal a cargo (técnico y auxiliar) en quien puede designar funciones bajo su responsabilidad.

Administrativas: 1. Cumplir y hacer cumplir en el Laboratorio los reglamentos, normas y procedimientos vigentes en el Hospital. 2. Cumplir y hacer cumplir en el Laboratorio las normas y procedimientos vigentes de bioseguridad. 3. Poner a consideración del Jefe de Laboratorio las necesidades de personal, equipos, materiales y reactivos del Laboratorio de Procedimientos Histológicos. 4. Colaborar y coordinar con el Jefe del Laboratorio en la organización, funcionamiento del Laboratorio de Procedimientos Histológicos y además en la confección de normas que permitan mejorar el trabajo. 5. Colaborar con el Jefe del Laboratorio en la elaboración del Plan Estratégico. 6. Cuidar que las instalaciones, mobiliarios, equipos y materiales se conserven en buen estado. 7. Informar al Jefe del Laboratorio de los problemas que se susciten por indisciplina, irresponsabilidad o deficiencia del personal a cargo. Docentes: 1. Participar activamente en el proceso de enseñanza-aprendizaje. 2. Organizar y/o participar en reuniones científicas con las diferentes secciones de Laboratorio Central, de Emergencia y el de la U.C.I. 3. Asistir y/o participar en cursos y congresos nacionales e internacionales. 4. Participar activamente en los programas de capacitación y formación profesional. 5. Capacitar periódicamente al personal a cargo. Investigación: 1. Realizar investigación, participar en los proyectos que tengan propósito de efectuarlos y alentar esta actividad. 2. Presentar cuando menos un trabajo científico cada 2 años. Perfil del cargo Para ocupar el cargo de Tecnólogo Médico Asistente, los requisitos mínimos son: Ser Tecnólogo Médico, Especialidad Laboratorio Clínico y de Anatomía Patológica. Estar debidamente registrado en el Colegio Tecnólogo Médico del Perú. 28

-

Tener cursos o capacitación en Laboratorio de Procedimientos Histológicos o en Histotecnología. Tener capacitación en sistemas de informática básica.

Régimen laboral: Tecnólogo Médico nombrado o contratado.

Atender a los pacientes que vienen al laboratorio de procedimientos histológicos no es un trabajo ni una obligación, sino algo que yo debo hacer. Eduardo Sedano G. y Ricardo Neira M.

29

EQUIPOS DE UN LABORATORIO DE HISTOTECNOLOGÍA En un laboratorio de procedimientos histológicos, es necesaria la utilización de ciertos instrumentos para llevar a cabo su normal funcionamiento. Los instrumentos más comunes en un laboratorio de procedimientos histológicos son: micrótomo, microscopio, estufa, refrigeradora, baño María, balanza, potenciómetro. EL MICROSCOPIO Y SUS PARTES  El microscopio, es el instrumento más importante utilizado por los histotecnólogos, de los cuidados y correcto uso dependerán el éxito de las observaciones. Es función del microscopio hacer visible aquellas cosas tan pequeñas que el ojo humano no puede hacerlo, está compuesto de un sistema de lentes de suficiente magnificación y poder de resolución que aquellos elementos que están muy juntos entre sí, se puedan distinguir separados dando una imagen clara y detallada cuando se utiliza suficiente iluminación.  El aumento total de un microscopio se determina multiplicando el aumento que proporciona el ocular por el aumento que proporciona el objetivo.  Parte mecánica esta constituida por: Soporte, Cuerpo con el revólver porta-objetivos, Platina, Reguladores de enfoque: tornillos macrométrico y micrométrico.  Parte óptica, constituida por: oculares, con diferentes aumentos 5X, 10X o 15X, puede ser monocular o binocular, Objetivos secos, bajo poder 10X, alto poder 45X, Objetivo de inmersión de gran definición 96X ó 100X  Sistema de iluminación, constituido por: condensador, diafragma, Fuente de iluminación interna o externa con un espejo plano/cóncavo. INDIQUE LAS PARTE DEL MICROSCOPIO

30

Microtomo de rotación tipo Minott

Microscopio óptico

Centro de enfriamiento

Baño de flotación

Centro de inclusión

Afilador de cuchilla

31

Refrigeradora

Estufa

Microondas

Criostato

Cocinilla eléctrica

Procesador automático de tejidos

Microondas

32

FACTORES DE RIESGO OCUPACIONAL EN EL LABORATORIO DE PROCEDIMIENTOS HISTOLÓGICOS Químicos: 1. Colorantes: a. Naturales: Hematoxilina, carmín b. Artificiales: Escarlata de biebrich, eosina 2. Reactivos: a. Ácidos: Ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico b. Alcalis: Hidróxido de sodio, hidróxido de amonio c. Solventes orgánicos: Xilol, alcohol, metanol d. Gaseosos: Formaldehído, amoniaco e. Sales: Nitrato de plata Físicos: a. b. c. d. Biológicos: a. b. c. d.

Mecánicos: Campos electromagnéticos: Temperaturas extremas: Electricidad

Parásitos: Bacterias: Mycobacterium tuberculosis Virus: HIV, hepatitis B Hongos:

Ergonómicos: Psicosocial: a. Relaciones interpersonales b. Estrés c. Madures emocional

33

MEDIDAS GENERALES DE SEGURIDAD En la manipulación de productos químicos deberían observarse siempre las medidas de seguridad descritas a continuación, incluso en el caso que en la etiqueta del producto químico no haya ninguna caracterización de sustancia peligrosa. • En todos los trabajos llevar gafas protectoras y si es posible guantes protectores. • Pipetear y medir los volúmenes de sustancias volátiles o de ácidos bajo una campana extractora y protegido con una mascara antigases, ó como mínimo realizarlo en locales bien ventilados. • Evitar en cualquier caso el contacto con la piel, ojos y mucosas. • Lavar con agua fría abundantemente y de forma inmediata las salpicaduras sobre la piel, lavar con polietilenglicol las sustancias lipófilicas. No utilizar nunca disolventes orgánicos debido al peligro de reabsorción. • Los ojos que hayan entrado en contacto con sustancias cáusticas se lavan con un chorro suave de agua (ó con una ducha especial para ojos) poniendo a la persona afectada en posición horizontal y protegiendo el ojo no afectado. Abrir ampliamente los párpados y mover el ojo dañado en todas direcciones. A continuación consultar inmediatamente al oculista indicando la sustancia cáustica. • Quitarse inmediatamente las prendas de vestir que estén impregnadas de la sustancia corrosiva. • En caso de accidente o de malestar consultar inmediatamente al médico. • No comer, beber ó fumar en el laboratorio de procedimientos histológicos. • Protección preventiva del trabajo en el caso de sustancias y preparaciones cancerígenas y mutágenas.

El primer deber que tenemos como persona y como profesional es para con la verdad, ya sea verdad científica, histórica o filosófica. Eduardo Sedano Gelvet y Carlos Neira Montoya

34

35

36

37

RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD EN CASO DE SISMO Todos debemos estar prevenidos y entrenados frente a la ocurrencia de un desastre natural, y saber cual debe ser nuestra participación para protegernos, proteger a nuestra familia, a nuestros compañeros o a nuestros pacientes. Por eso es importante que participemos solidaria y activamente en cumplir las normas establecidas por el comité de defensa civil nacional, y podamos apreciar cual será nuestro accionar y como coordinar con nuestros compañeros, la conducta a desarrollar frente a un siniestro. Las siguientes son recomendaciones que el personal de salud, el público en general y usted señor alumno deben de seguir en caso de desastres naturales (terremotos), de tal forma que se evitara la mayor cantidad de daños en usted y los que los rodean. ¿Qué hacer antes de un sismo?: 1. Prepare un plan de protección y seguridad con tus compañeros de sección, crea una conciencia de preparación, 2. Cuando ingrese al Departamento de Patología, localice las zonas de seguridad señalizadas, así como también cuales son las salidas y escaleras de emergencia que tiene el Departamento. 3. En el Laboratorio de Procedimientos histológicos identifica que zonas corren peligro, 4. Reconoce las zonas de seguridad que deben estar señalizadas, generalmente junto a las columnas y vigas de construcción, debajo del marco de la puerta y alejado de las ventanas o puertas de vidrio. 5. Verifica que objetos pesados no estén colocados encima de muebles cuya caída pueda ocasionar daños. 6. Si hay balones de oxígeno, estos deben estar en un ambiente donde no puedan caerse y de preferencia sujetos a las paredes por bridas. 7. Reconoce los lugares de la llave de luz, donde puede cortarse el suministro, igualmente donde esta el ducto que contiene las llaves de agua del servicio. 8. Elabora una ruta de salida, reconociendo las vías que puedan llevarte a un lugar seguro, en cada piso hay tres escaleras de salida que deben estar libres o cuyas llaves deben de estar disponibles. Las zonas más seguras de cada piso se encuentran en el pasillo entre los ascensores. 9. Ubica donde están los extintores y como se usan. 10. En el hogar, deben de tener cerca de la salida y en lugar visible, una radio portátil, pilas o baterías, linterna, galonera de agua y mantas. Todo esto en una bolsa que pueda ser transportada en forma rápida. ¿Qué hacer durante el sismo?: 1. Cuando se inicie algún desastre, mantenga la calma, solo con eso habrá conseguido mucho, y tendrá más oportunidad para asegurar su integridad. 2. Recuerde que cuando se inicia un desastre, se debe de proceder a desconectar 38

3. 4. 5. 6. 7.

8. 9.

10. 11. 12.

todos los artefactos eléctricos que se encuentren encendidos, también si fuera el caso desconectar las conexiones de gas. Conserva la calma, ubícate en un lugar seguro: colóquese debajo de las señales de seguridad o de las columnas del edificio. Protégete de los objetos pesados Proceda a alejarse de las ventanas, por los vidrios que puedan caer, Colócate debajo de mesas, escritorios o camas fuertes, zonas seguras son los encuentros de columnas y vigas, no salgas del edificio. Durante el sismo los ascensores y escaleras son sumamente peligrosos. Por ningún caso use los ascensores, ya que estos posiblemente no funcionaran, y se pueden convertir en una trampa. Si el movimiento persiste proceda a dirigirse hacia las escaleras de manera ordenada, manteniendo siempre la calma. El personal de salud, debe de proceder a realizar el apoyo de los pacientes que pueden valerse por si mismo para la evacuación, y realizar el apoyo del transporte en los pacientes que no lo pueden hacer. La evacuación del local, debe de realizarse en forma ordenada, recuerde que si el pánico se apodera de usted perderá una gran oportunidad de ponerse a salvo. Cuando este fuera del local, diríjase a lugares abiertos, o aquellos que estén debidamente señalizados, haga un círculo y mantenga la calma. Recuerde que sus familiares donde estén si siguen estas mismas recomendaciones estarán a salvo, de tal forma que cuando se inicie algún desastre PIENSE EN SU SEGURIDAD Y EN LA DE LOS QUE ESTÉN A SU ALREDEDOR, ya que en ese momento no podrá hacer nada efectivo por sus familiares que se encuentren lejos de usted.

¿Qué hacer después del sismo? 1. Luego de pasado el desastre, ayude a las brigadas de rescate, y piense que pueden existir replicas del sismo, así que no ingrese a locales con peligro de caerse. 2. Si te encuentras atrapado llama o haz ruido para recibir ayuda, en caso contrario calma a los demás. Prepárate para temblores secundarios o réplicas que ocurren luego del sismo mayor. 3. Haz una rápida inspección inicial por si hay incendios, escape de gas, heridos o gente atrapada, establece las prioridades de acuerdo a las circunstancias, 4. Si hubiese fuego trata de controlarlo, debes saber donde están los extintores y como usarlos, de no ser posible ayuda a los heridos y pacientes a salir, abandonando rápidamente el edificio por rutas seguras, que ya conoces. 5. No tocar cables, desconecta el sistema eléctrico de tu sección, ya sabes donde esta la llave. 6. No abras puertas de armarios o reposteros ya que los objetos te pueden caer encima. 7. Presta atención prioritariamente a los que más lo necesitan, impedidos físicos, niños, ancianos. 39

8.

Organiza las evacuaciones de pacientes y personal, así como la reanimación, clasificación y atención de heridos.

Es importante leer con detenimiento estas recomendaciones y prepararnos para participar. No olvidemos que esto puede ocurrir en cualquier momento y a cualquier hora, debiendo todos participar con responsabilidad y solidaridad.

Todo ser viviente proviene de un huevo (Omne vivum ex ovo) William Harvey – Fisiólogo inglés (1578-1657) 40

UN PROGRAMA DE GARANTIA DE LA CALIDAD Para obtener los mejores resultados posibles en los preparados histológicos, un programa de garantía de la calidad deberá incluir distintos aspectos del funcionamiento adecuado del laboratorio de procedimientos histológicos del departamento de patología. Un programa de este tipo debe tener tres sistemas, que se resumen a continuación: 1. Sistema de Mejoramiento continuo de la calidad A. B. C. D.

Creación de círculos de calidad Elección del método histológico, histoquímico o inmunohistoquímico. Desarrollo de un manual de procedimientos estándar Programas de entrenamiento y actualización permanente para el personal del laboratorio de procedimientos histológicos del Departamento de Patología. E. Recepción adecuada de la muestra y de las solicitudes de estudio anatomopatológico. 2. Sistema de control de calidad interno A. Adquisición de equipos, de productos químicos y colorantes de calidad para el laboratorio. B. Procedimientos para la detección de errores, tales como lámina problema, lámina patrón, lámina testigo, lámina blanco y sueros negativos en caso de métodos inmunohistoquímicos. C. Mantenimiento preventivo de instrumentos y equipos. D. Decisiones a tomar cuando se presentan resultados fuera de control. 3. Sistema de control de calidad externo. 4. Documentación de la ejecución y resultados del programa de garantía de calidad.

41

ELECCIÓN DE UN MÉTODO HISTOLÓGICO O HISTOQUÍMICO Para implementar un método histológico o histoquímico, es necesario que se estandarice al máximo posible, es cuestión de probar los métodos más asequibles a nuestra realidad para determinar el que tenga precisión en condiciones óptimas y normales de trabajo. A continuación representamos los diversos factores que influyen en la selección de un método: Interferencias Costo de materiales

Cantidad de personal

Desembolso de capital

Exactitud

Flexibilidad Colegas

Utilidades Decisión final

Linealidad Láminas/hora Espacio requerido Velocidad del procedimiento

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Precisión Entrenamiento Reparaciones Tipo de método Indicaciones del fabricante

Todos estos factores se pueden resumir en los siguientes: Debe ser técnicamente simple y de buen rendimiento. Los reactivos deben ser inicuos para el operador. Debe ser de bajo costo. Debe ser sensible, es decir, que tenga capacidad para detectar cantidades pequeñas de la muestra o sustancia que se quiere demostrar. Debe tener precisión. Debe tener exactitud. Debe ser rápido. Estos siete factores son los más importantes para la elección de un método "ideal".

REFERENCIA: SÁNCHEZ DE ROMERO, Doris.: TÉCNICAS INSTRUMENTALES DE USO MÁS FRECUENTES EN EL LABORATORIO CLÍNICO Y DE INVESTIGACIÓN. Imprenta IMPOFFOT L.T. Lima-Perú, 1992. pp 39-40 42

43

PASOS DE LAS TÉCNICAS MICROSCÓPICAS Los pasos de las técnicas microscópicas para obtener un preparado histológico permanente (láminas) son: 1. Toma de la muestra. 2. Fijación. 3. Inclusión. 4. Microtomía. 5. Coloración. 1.

TOMA DE LA MUESTRA OBTENCIÓN DE LA PIEZA El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de observación se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtención y crianza puede ser fácilmente efectuada en el laboratorio. Fases en la obtención de material animal: - Muerte del animal: podemos producirla valiéndonos de un traumatismo brusco, o por la intoxicación a causa de una dosis exagerada de narcótico. - Extracción de los órganos: conociendo la anatomía del animal, debemos dirigirnos directamente a los órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo. - Reducción a piezas: teniendo en cuenta que para el tamaño de las piezas debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar, hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijación. Una condición indispensable para la buena confección de preparaciones es el hacer correctamente la toma de tejidos. Para ello hay que observar lo siguiente: el tejido debe ser removido del conejo y colocado en el fijador lo más rápido que sea posible. La velocidad es esencial. Hay que tener el equipo de disección listo y a la mano. Planificar antes; tener las soluciones preparadas antes de matar al conejo. Tener la suficiente cantidad de fijador de modo que cada pieza de tejido quede cubierta por lo menos con una cantidad de líquido cerca a 10 veces su propio volumen (cerca de 100,00 mL de cada fijador). Marcar muy bien todos los recipientes (o cápsulas, si se usan) con lápiz o tinta indeleble. El conejo debe ser muerto tan rápido como humanamente posible. Colocarlo en un recipiente grande con una tapa ajustada dentro de la cual se habrá colocado antes 44

a.

b.

c.

d.

papel toalla empapada con éter o cloroformo. Poner una toalla seca encima de las otras para prevenir que el conejo entre en contacto con estos líquidos. Tan pronto como el conejo deje de respirar, cortar y sacarle la médula espinal justo debajo de la cabeza. Si Ud. no esta familiarizado con la anatomía interna del ratón, debe trabajar con un compañero que pueda disecar al animal rápidamente. Poner el cuerpo de espaldas en una base de madera, estirar sus miembros y clavar pies y manos sobre la base. Humedecer la piel a lo largo de la línea ventral con agua. Pinzar la piel del abdomen con fórceps. Cortar a través de la piel y de los músculos abdominales con unas tijeras. Con la punta de las tijeras hacer un corte longitudinal anterior a lo largo de la línea ventral media, hacia y a través de la parrilla costal. Conservar la punta de las tijeras cerca de los músculos abdominales para prevenir el cortar accidentalmente los órganos abdominales. Las células germinales y las células con alto contenido enzimático degeneran notoriamente rápido con la muerte. Por lo tanto es necesario disecar los tejidos en el orden siguiente: Hígado. Cortar piezas no mayores de 5 mm de diámetro del borde del hígado. Enjuagar rápidamente estas con solución salina (cloruro de sodio al 0.7%) y colocar cada uno en su propio fijador. Duodeno. Retirar el hígado a un lado, jalar el estómago y cortar el duodeno longitudinalmente en piezas de no más de 3 mm de largo. Enjugarlas rápidamente en la solución salina. Limpiar gentilmente el lumen a chorro con una pipeta llena de solución salina y colocar cada pieza en su propio fijador. Testículos. Rasgar los sacos escrotales con un par de tijeras. Remover los testículos completos y dejarlos caer directamente en el fijador. Este no es el momento de darse cuenta que uno mato a un conejo hembra. Corazón. Retirar el corazón, cortarlo por la mitad longitudinalmente y enjugarlo vigorosamente con solución salina para retirar los coágulos de sangre. Colocar cada pieza en su propio fijador. Cuando corten los tejidos manipularlos cuidadosamente. No pincharlos o dañarlos con la pinza. Cortarlos con una navaja de afeitar o con unas tijeras filudas. Permitir que solo herramientas de acero inoxidable entren en contacto con los fijadores a base de cloruro de mercurio, pues son muy corrosivos. Ningún tejido debe tener un diámetro mayor de 5 mm Cuando el testículo ha sido endurecido ligeramente por el fijador (cerca de 5 minutos), rebanarlo cuidadosamente con una navaja de afeitar filuda. El testículo es un tejido sumamente blando y se quiebra fácilmente. El etiquetar cada tejido es muy importante debido a la necesidad de identificarlos durante los muchos pasos. Etiquetar cada envase con el nombre del tejido y el fijador usado. Conservar los tejidos por separado en viales marcados. Tejidos que van a ser lavados luego con agua corriente deben ser puestos en paquetes o en cápsulas disponibles comercialmente. Cuando mucho, mientras más tejidos van a 45

ser procesados se necesitan gran cantidad de envases adecuados. Frascos de comida de bebé son disponibles, tienen tapas rosca resistentes a ácidos y son descartables (especialmente los recipientes que contienen soluciones de cloruro de mercurio. Instrumentos y material de vidrio no deben entrar en contacto con el tejido viviente. Obtención de material humano: El hombre no es sujeto de experimentación, esta verdad indiscutible hace que sólo en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser estudiado histológicamente. De tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De éstas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos últimas proporcionarán tejidos patológicos. - Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es necesario que se trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesión, por lo menos el órgano que se quiere estudiar. - Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico. - Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de investigación pero, como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica. 2.

FIJACIÓN A fin de evitar la destrucción de las células por sus propias enzimas (autólisis), o por bacterias, los tejidos separados del cuerpo de un animal (especimenes) deben ser fijados, inmediatamente después de ser cortados. Este tratamiento denominado fijación tiene por finalidad endurecer los tejidos, volviéndolos más resistentes para las etapas subsiguientes de las técnicas microscópicas. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES FIJADORAS

Procedimiento general para preparar una solución fijadora: 1. Identificar las sustancias químicas a emplearse teniendo en cuenta su peso molecular o peso formula, densidad, peso específico, grado de pureza, presencia de contaminantes, índices de solubilidad, reacciones y su bioseguridad en su manejo. 2. Realizar los cálculos matemáticos, encontrando los pesos o volúmenes necesarios para su preparación. 3. Contar con el material y equipo necesario para pesar como espátulas, vasijas, balanza con sensibilidad adecuada. 46

4. 5.

6.

7.

Tener el material volumétrico necesario a usar como fiolas, pipetas, probetas, etc. Verificar su limpieza y resistencia. Preparar la solución agregando cantidades crecientes del soluto ya medido sobre una parte del volumen total (1/3 a ½) con agitación constante. Concluir la preparación enrazando con el solvente en una fiola de volumen adecuado. Las soluciones pueden guardarse en frascos de plásticos o de vidrio, este ultimo de preferencia de color caramelo. Las tapas pueden ser de rosca o esmeriladas, no usar tapas de presión por la peligrosidad que originan cuando se destapan las soluciones fijadoras, ni tapas de metal por la oxidación y corrosión que sufren. Las soluciones fijadoras una vez preparadas, deben ser apropiadamente identificados y las etiquetas deben contener la siguiente información: a. Nombre del fijador. b. Concentración de la solución fijadora. c. Requerimiento de almacenamiento (medio ambiente o refrigeración). d. Iniciales de la persona que preparo la solución fijadora. e. Fecha de preparación. f. Expectativa de duración y fecha de expiración. g. Peligros potenciales de la solución fijadora. h. pH si se trata de una solución fijadora bufferada. Práctica

Se encargara a cada dos alumnos la preparación de las siguientes soluciones fijadoras: Fijador simple Solución de formol al 10% Formol comercial al 37-40% Agua corriente

1 vol. 9 vol.

Fijadores compuestos o mezclas fijadoras Líquido de Zenker Dicloruro de mercurio Dicromato de potasio Agua corriente Ácido acético glacial

5.0 g 2.5 g 100.0 mL 5.0 mL

Después que los tejidos son fijados en Zenker, es necesario eliminar el precipitado de mercurio tratando los cortes, primero, con lugol y posteriormente, con tiosulfato de sodio. 47

Líquido de Bouin Solución acuosa de ácido pícrico saturada Formol comercial al 37-40% Ácido acético glacial

15 vol. 5 vol. 1 vol.

Líquido de Regaud Dicromato de potasio al 3% Formol comercial al 37-40%

80.0 mL 20.0 mL Liquido de Da Fano

Nitrato de cobalto Agua destilada Formol comercial

1,0 g 100,0 mL 15,0 mL

Para lo cual tendrán que realizar los cálculos respectivos, teniendo en cuenta el volumen indicado por sus profesores además, de la información técnica inscrita en los reactivos

Lo peor no es cometer un error, sino tratar de justificarlo, en vez de aprovecharlo como aviso providencial de nuestra ligereza o ignorancia. Santiago Ramón y Cajal

48

Tabla de tejidos y fijadores (Anotar el número de piezas de tejido que ponga en cada fijador) Órgano

Líquido de

Líquido de

Líquido de

Líquido de

Formol al

Zenker

Bouin

Regaud

DaFano

10%

Cerebro Cerebelo Corazón Aorta Tiroides Pulmón Hígado Bazo Páncreas Riñón Glándula adrenal Próstata Testículo Lengua Esófago Estómago Intestino delgado Intestino grueso Glándula parótida Glándula sublingual Glándula submaxilar

49

DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA Deshidratación Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente. Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración) Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este último es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo. Penetración de la parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina. Inclusión definitiva o formación del bloque En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera. A los 15-30 minutos la parafina se habrá solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirámide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una espátula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrótomo. OBTENCIÓN DE CORTES El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones. Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo. - Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.

50

- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta. - Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica. - Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante de inercia que controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra a -60º C gracias a la existencia de una placa de congelación instantánea. Frente al micrótomo convencional de congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de cortes mucho más delgados (por lo general de 4 µm y, en manos experimentadas, hasta 2 µm). Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrótomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta. COLORACIÓN Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración. Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante. Clasificación de los colorantes: Según su origen se clasifican en: COLORANTES NATURALES: -

Animales (carmín)

-

Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)

51

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA): -

Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.

-

Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.

-

Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.

-

Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).

Por otro lado, las coloraciones pueden ser: -

Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.

-

Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.

Métodos de coloración: -

Coloración directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.

-

Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar.

-

Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.

-

Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación.

-

Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.).

-

Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores.

-

Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).

-

Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten.

Colorantes más utilizados en histología humana: HEMATOXILINA: 52

-

Es una materia prima para elaborar un colorante.

-

Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.)

-

Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto.

EOSINA: -

Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo).

-

Presenta autofluorescencia espontánea.

-

Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.

Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración. MONTAJE Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio. RECOMENDACIONES ÚTILES -

Las técnicas histológicas pertenecen al tipo denominado "técnicas contrarreloj". Si Ud. está apurado no las empiece, déjelas para cuando su trabajo le permita dedicarse solo a esa actividad.

-

Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar perfectamente limpios.

-

Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.

-

Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo. 53

-

Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre tapados.

-

Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por estas sustancias.

-

Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.

-

Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con los pasajes del material.

-

Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.

-

Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.

-

Antes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material de vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y después comience el proceso.

-

Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.

REFERENCIA: http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/modtecni.htm

54

MÉTODO DE COLORACIÓN DE HEMATOXILINA Y EOSINA FIJACIÓN: Puede usarse cualquier fijador. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 3 a 4 micrómetros de grosor. Cortar secciones en el críostato o en el micrótomo de congelación de 6 a 7 micrómetros de grosor. SOLUCIONES: Solución colorante de hematoxilina de Harris o hemalumbre de Harris Hematoxilina (C.I. 75290) 5,0 g Sulfato doble de aluminio y potasio o sulfato doble de aluminio y amonio 100,0 g Agua corriente 1000,0 mL Oxido mercúrico rojo o amarillo 2,0 g Disolver el alumbre (sulfato doble) en el agua con ayuda del calor. Luego agregar la hematoxilina. Mezclar. Llevar la mezcla a ebullición tan rápido como sea posible, luego sacarla del calor y adicionar el óxido mercúrico. Recalentar la mezcla, hasta que tenga un color púrpura oscuro, cerca de 1 minuto. Luego retirar del calor y enfriar rápidamente. La solución está lista para ser usada. Solución de alcohol ácido al 1% Alcohol al 70% c.s.p. Ácido clorhídrico

100,0 mL 1,0 mL Solución de agua amoniacal al 3‰

Agua corriente c.s.p Amoníaco o hidróxido amónico Solución stock de eosina acuosa al 1% Eosina amarilla (C.I. 45380) Agua corriente Disolver y adicionar: Ácido acético glacial

1000,0 mL 3,0 mL

10,0 g 1000,0 mL 2,0 mL

Solución colorante de trabajo de eosina Solución stock de eosina acuosa al 1% 1 vol. Alcohol al 80% 3 vol. Adicionar 0,5 mL de ácido acético glacial por cada 100,0 mL de solución colorante. 55

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos. 2. Desparafinar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos. 3. Tratar los cortes en alcohol absoluto 1 durante 5 minutos. 4. Tratar los cortes en alcohol absoluto 2 durante 5 minutos. 5. Tratar los cortes en el alcohol corriente 1 durante 5 minutos. 6. Tratar los cortes en el alcohol corriente 2 durante 5 minutos. 7. Si las secciones fueron fijadas con algún fijador mercurial, desenkerizar. 8. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 9. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 5 minutos. 10. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 11. Sumergir los cortes, rápidamente, 3 veces en el alcohol ácido al 1%. 12. Lavar inmediatamente con agua corriente. 13. Sumergir los cortes, rápidamente 3 veces en solución de agua amoniacal al 1%. 14. Lavar inmediatamente con agua corriente y verificar si los núcleos están bien teñidos observando al microscopio. 15. Colorear con la solución de trabajo de eosina, durante 4 minutos. 16. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 17. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol corriente 1. 18. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol corriente 2. 19. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 1 durante 5 minutos. 20. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 2 durante 5 minutos. 21. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos. 22. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos. 23. Montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Las estructuras basófilas se observan de color azul y las estructuras eosinófilas de color rosado.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1942, p 86. 56

REACCIÓN DEL ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (MÉTODO DE P.A.S) OBJETIVO: Determinar sustancias P.A.S. positivas FIJACIÓN: Los tejidos fijados en formol dan buenos resultados, así mismo aquellos que han sido fijados en líquidos a base de ácido pícrico o alcohol. MICROTOMÍA: Hacer cortes en parafina de 5 micrómetros de grosor. De la muestra objeto de estudio se harán dos láminas, una de ellas seguirá el procedimiento completo (lámina problema) y la otra (la lámina blanco), no seguirá el paso de la oxidación. Simultáneamente se correrá una lámina patrón para conocer la validez de la prueba, para este último se puede usar un corte de duodeno. FUNDAMENTO: La reacción de P.A.S. tiene dos pasos fundamentales; el primero consiste en la formación de grupos aldehídos, esto se logra gracias a la acción oxidante del ácido peryódico que actúan rompiendo y oxidando los grupos alfa glicol. El segundo paso consiste en la detección de los grupos aldehídos usando el reactivo de Schiff. REACTIVOS:

Solución de ácido clorhídrico 1N Ácido clorhídrico concentrado de peso específico 1,19 Agua destilada c.s.p.

8,35 mL 100,00 mL

Reactivo de Schiff Fucsina básica (C.I. 42510) 0,5 g Ácido Clorhídrico 1N 10,0 mL Metabisulfito de sodio o de potasio ó disulfito de sodio o de potasio 0,5 g Agua destilada 100,00 mL Carbón activado 0,25 g Disolver la fucsina básica en el agua destilada caliente. Llevar a punto de ebullición. Enfriar y agregar el disulfito de sodio y agitar la mezcla; luego añadir el ácido clorhídrico 1N y agitar constantemente por espacio de 20 minutos. Dejar en la oscuridad en frasco herméticamente cerrado hasta el día siguiente. Después de este tiempo la solución ha adquirido una ligera coloración amarillenta, se recomienda entonces añadir el carbón activado y agitar. Finalmente se filtra y se guarda en frascos color caramelo y de cierre hermético.

Solución acuosa de ácido peryódico al 0.5% Cristales de ácido periódico Agua destilada c.s.p

0,5 g 100,0 mL 57

Solución de agua sulfurosa (opcional) Metabisulfito de sodio o de potasio al 10% 5,0 mL Ácido clorhídrico 1 N 5,0 mL Esta mezcla es utilizable mientras tiene olor a anhídrido sulfuroso, en caso contrario deberá desecharse. Solución colorante de Hematoxilina de Harris. PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar las secciones hasta agua corriente. 2. Tratar la lámina problema y el patrón con ácido peryódico durante 10 minutos; la lámina blanco se dejará en agua corriente por el mismo tiempo. 3. Lavar con agua destilada. 4. Tratar con el reactivo de Schiff de 5 a 10 minutos. 5. Lavar con agua sulfurosa por 3 cambios de 2 minutos cada uno, o con chorros de agua destilada por 1 minuto. 6. Colocar en hematoxilina de Harris durante 2 minutos 7. Lavar en agua corriente. 3. Deshidratar rápidamente 4. Aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Sustancias P.A.S. positivas de color rojo magenta, núcleos de color azul. OBSERVACIONES: • Los lugares con reacción positiva en la muestra problema, deberán ser negativos en la muestra blanco. • La muestra blanco deberá ser totalmente negativa a la reacción, si hubiera alguna positividad esta se debe a grupos aldehídos propios del tejido, y esto no debe considerarse como reacción P.A.S. positiva. PRECAUCIONES: El reactivo de Schiff debe ser cuidadosamente preparado y reunir una serie de características que permitan confiar en los resultados obtenidos. La base de este reactivo es el Clorhidrato de p-rosanilina, que es un componente de la fucsina básica, la cual debe ser de la mejor calidad. Dentro de las recomendaciones tenemos: a) Evitar la disolución (ni aún con agua destilada) ya que ello lleva como consecuencia la ruptura del equilibrio iónico del reactivo. b) Debe evitarse la pérdida del anhídrido sulfuroso, por esta razón el reactivo se almacena en frascos pequeños completamente llenos y herméticamente cerrados, conservándolos en refrigeración cuando no estén en uso. c) Evitar la aireación excesiva al tener los frascos del reactivo destapados o 58

agitándolos innecesariamente. d) Cuando el reactivo va a ser usado debe sacarse con anticipación del refrigerador para que tome la Temperatura del medio ambiente, debe evitarse la elevación de la temperatura por medios artificiales. e) La recoloración espontánea o la presencia de precipitados en el reactivo son signos suficientes para desecharlo. f) Si después de la preparación del reactivo este conserva un color rosado, esto es debido a que la p-rosanilina usada no es de buena calidad. g) El reactivo de Schiff se prueba tomando una alícuota de él, al que se le adiciona unas gotas de formol se formará entonces una solución de color rojo púrpura. APLICACIONES: Dentro de las sustancias P.A.S. positivas tenemos las siguientes: Glucógeno, reticulina, mucina, membrana basal, glucocálix, glándulas mucosas. También son positivas a esta reacción el Histoplasma capsulatum, Criptococcus neoformans, Cándida albicans, entre otros.

REFERENCIA: Mac Manus, J.F.A.: Stain Technology, 23: 99, 1948 (AFIP Modificado). 59

REACCIÓN DE P.A.S. OBJETIVO: Demostrar la presencia de glucógeno FIJACIÓN: Para el estudio ordinario del glucógeno, los mejores fijadores son: el ácido acético - alcohol- formol (5-85-10), el de líquido de Bouin y el alcohol etílico. MICROTOMÍA: Se pueden obtener secciones por congelación de tejido fresco, los cuales deberán ser fijados en cualquiera de las soluciones mencionadas durante 5-10 minutos. Los cortes en parafina serán de 4 micrómetros. De la muestra problema se correrán dos láminas una de las cuales sufrirá previamente digestión con amilasa salival (lámina testigo). FUNDAMENTO: La reacción de P.A.S. tiene dos pasos fundamentales; el primero consiste en la formación de grupos aldehídos, esto se logra gracias a la acción oxidante del ácido peryódico que actúan rompiendo y oxidando los grupos alfa glicol. El segundo paso consiste en la detección de los grupos aldehídos usando el reactivo de Schiff. REACTIVOS:

Solución de ácido clorhídrico 1N Ácido clorhídrico concentrado de peso específico 1,19 Agua destilada c.s.p.

8,35 mL 100,00 mL

Reactivo de Schiff Fucsina básica (C.I. 42510) 0,5 g Ácido Clorhídrico 1N 10,0 mL Metabisulfito de sodio o de potasio ó disulfito de sodio o de potasio 0,5 g Agua destilada 100,00 mL Carbón activado 0,25 g Disolver la fucsina básica en el agua destilada caliente. Llevar a punto de ebullición. Enfriar y agregar el disulfito de sodio y agitar la mezcla; luego añadir el ácido clorhídrico 1N y agitar constantemente por espacio de 20 minutos. Dejar en la oscuridad en frasco herméticamente cerrado hasta el día siguiente. Después de este tiempo la solución ha adquirido una ligera coloración amarillenta, se recomienda entonces añadir el carbón activado y agitar. Finalmente se filtra y se guarda en frascos color caramelo y de cierre hermético.

Solución acuosa de ácido peryódico al 0.5% Cristales de ácido periódico Agua destilada c.s.p

0,5 g 100,0 mL 60

Solución de agua sulfurosa (opcional) Metabisulfito de sodio o de potasio al 10% 5,0 mL Ácido clorhídrico 1 N 5,0 mL Esta mezcla es utilizable mientras tiene olor a anhídrido sulfuroso, en caso contrario deberá desecharse. Solución colorante de Hematoxilina de Harris. PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. La lámina testigo se somete a la digestión salival, en estufa a 37 °C durante 15 minutos. La saliva debe ser abundante y se evitará que ella se seque sobre el porta objetos (colocar la lámina en cámara húmeda). La lámina problema, patrón y la lámina blanco se dejará en agua corriente por el mismo tiempo. 3. Lavar en agua corriente. 4. Tratar la lámina problema, patrón y la lámina testigo con ácido peryódico durante 10 minutos, mientras que la lámina blanco se dejará en agua corriente por el mismo tiempo. 5. Lavar todas las láminas con agua destilada. 6. Tratar todas las láminas con el reactivo de Schiff de 5 a 10 minutos. 7. Lavar con agua sulfurosa por 3 cambios de 2 minutos cada uno o con agua destilada por 3 a 5 minutos. 8. Colocar en hematoxilina de Harris durante 2 minutos 9. Lavar en agua corriente. 5. Deshidratar rápidamente, aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Las sustancias que dan reacción P.A.S. positiva en la lámina problema y que dan reacción negativa en la lámina con digestión salival (lámina testigo) corresponden al glucógeno; aquellas sustancias que mantienen positividad en esta última lámina no corresponden a glucógeno, núcleos de color azul.

61

Lámina problema

problema Lámina

testigo

OBSERVACIONES: Una reacción histoquímica de rutina muy útil es la reacción del ácido peryódico - Schiff (P.A.S. del inglés periodic acid- Schiff) para glucógeno. Esta reacción como ya se vio es fácil de llevar a cabo y de interpretar, aunque debe recordarse que se pierde glucógeno en tejidos pobremente preservados y que está aumentado en las células que rodean áreas de necrosis.

REFERENCIA: Mac Manus, J.F.A.: Stain Technology, 23: 99, 1948 (AFIP Modificado). 62

MÉTODO DEL CARMÍN DE BEST (Modificado por Lillie) OBJETIVO: Demostrar la presencia de glucógeno FIJACIÓN: Para el estudio ordinario del glucógeno, los mejores fijadores son: el ácido acético - alcohol- formol (5-85-10), el de líquido de Bouin y el alcohol etílico. MICROTOMÍA: Se pueden obtener secciones por congelación de tejido fresco, los cuales deberán ser fijados en cualquiera de las soluciones mencionadas durante 5-10 minutos. Los cortes en parafina serán de 4 micrómetros. De la muestra problema se correrán dos láminas una de las cuales sufrirá previamente digestión con amilasa salival (lámina testigo) y la otra no (lámina problema).. FUNDAMENTO: Es un método de coloración empírico. SOLUCIONES:

Solución stock de Carmín de Best Carbonato de potasio 1,0 g Carmín (C.I. 75470) 2,0 g Cloruro de potasio 5,0 g Agua corriente 60,0 mL Mezclar los componentes en un beaker, hervir suave y con cuidado durante 5 minutos (evitar la formación de espuma. Enfriar y adicionar 20 ml de amoníaco concentrado de peso específico 0.88 ó 20 mL de hidróxido de amonio). La solución puede conservarse durante 3 meses en refrigeración.

Solución de trabajo de Carmín de Best Solución madre filtrada recientemente 2 vol Amoníaco concentrado o hidróxido de amonio 3 vol Metanol 3 vol El metanol se agrega lentamente y con agitación constante. Esta solución dura de 2 a 3 semanas.

Solución diferenciadora Etanol absoluto Metanol Agua destilada

4 vol. 2 vol 5 vol

Solución colorante de Hematoxilina de Harris. 63

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Teñir con Hematoxilina de Harris durante 15 minutos. 3. Lavar en agua corriente y luego en agua destilada. 4. Colocar en la solución de trabajo de Carmín de Best durante 20 minutos. Agitar constantemente. 5. Sacudir y transferir directamente a la solución diferenciadora, 2 cambios. 6. Deshidratar rápidamente 7. Aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: El glucógeno se observa de color rojo; la lámina sometida a digestión con amilasa salival no debe presentar coloración positiva, núcleos de color azul. OBSERVACIONES: Las amebas se tiñen bien en los cortes, sobresaliendo por su brillante coloración de los tejidos circundantes.

REFERENCIA: Mallory, F. B.: Pathological Technica, Philadelphia, W. B. Saunders Co., 1942, p 127. 64

MÉTODO DEL HIERRO COLOIDAL DE HALE (método modificado) OBJETIVO: Demostrar la presencia de glucosaminoglicanos ácidos. FIJACIÓN: Es preferible el uso de fijadores a base de dicromatos y los metálicos (como el subacetato de plomo). También se obtiene buenos resultados con formol en solución salina, formol neutro y formol - alcohol. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 4 micrómetros de grosor. Deberá correrse una lámina patrón que bien puede ser traquea, y dos secciones del tejido problema uno de los cuales no será sometido a la solución de hierro coloidal (lámina blanco). FUNDAMENTO: Los grupos aniónicos de los glucosaminoglicanos ácidos en particular los radicales sulfatos (-SO4) y carboxilo (-COOH), poseen una gran afinidad por los iones metálicos; esta propiedad se utiliza para fijar el hierro, el cual se encuentra bajo la forma de hierro coloidal. Este hierro ligado así, es posteriormente reconocido por el método de Perls (azul de Prusia). REACTIVOS:

Solución acuosa de cloruro férrico al 10% Cloruro férrico Agua destilada c.s.p.

5,0 g 100,0 mL

Solución stock de hierro coloidal Solución acuosa de cloruro férrico al 10% 4,5 mL Agua destilada 250,0 mL Hervir el agua y añadir el cloruro férrico agitando constantemente, la solución toma un color pardo rojizo.

Solución de trabajo de hierro coloidal Solución stock de hierro coloidal Agua destilada Ácido acético

20,0 mL 15,0 mL 5,0 mL

Solución acuosa de ácido acético al 12 % Solución acuosa de ferrocianuro de potasio al 2 % Solución acuosa de ácido clorhídrico al 2 %

65

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Colocar el ácido acético al 12 % por 30 segundos. 3. Tratar la lámina problema y el patrón con solución de trabajo de hierro coloidal. Tratar la lámina blanco con agua destilada. Tiempo de exposición una hora. 4. Lavar en agua destilada varias veces para quitar el exceso de hierro coloidal. 5. Agregar a todas las láminas un volumen de ferrocianuro de potasio y dejar actuar durante un minuto. 6. Sobre el ferrocianuro agregar un volumen igual de ácido clorhídrico y hacer una mezcla homogénea. Dejar que actúe durante hasta que el tejido tome una coloración azul. 7. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 8. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos. 9. Lavar en agua corriente durante 1 minuto 10. Colorear con la eosina durante 15 segundos 11. Lavar en agua corriente durante 20 segundos 12. Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Los glucosaminoglicanos ácidos sulfatados y no sulfatados se observan de color azul turquesa intenso (azul de Prusia), núcleos de color azul y citoplasma de color rosado.

REFERENCIA: McManus and Mowry: Stainig Methods-Histologic and Histochemical; pp 135-136, 1960. 66

MÉTODO DEL AZUL ALCIANO (Alcian Blue) OBJETIVO: Demostrar la presencia de glucosaminoglicanos ácidos sulfatados y glucosaminoglicanos ácidos no sulfatados FIJACIÓN: El fijador de elección es el Carnoy. Los fijadores Zenker y Bouin tienden a suprimir la coloración. MICROTOMIA: Cortes secciones de parafina de 5 micrómetros. Utilizar como patrón de glucosaminoglicanos ácidos traquea; y como patrón de glucosaminoglicanos neutros, mucosa gástrica. FUNDAMENTO: El azul Alciano es un colorante que pertenece al grupo de las ftalocianinas o pigmentos pirrólicos, cuyo principio coloreador es la ftalocianina de cobre. Este colorante tiene gran afinidad por los grupos ácidos de los glucosaminoglicanos, dando una coloración específica con los glucosaminoglicanos ácidos sulfatados cuando se le usa a pH de 0.5 a 1; mientras que su especificicidad varía hacia los glucosaminoglicanos ácidos no sulfatados y sulfatados cuando se le usa a pH de 2.5. SOLUCIONES:

Solución acuosa de ácido acético al 3% Ácido acético glacial Agua destilada c.s.p.

3.0 mL 100.0 mL Solución colorante de azul Alciano

¡Error! Marcador definido. no Autor

Azul Alciano 8GX

Ácido

Ácido

Agua

(C.I. 74240)

acético

clorhídrico

destilada

pH

Spicer

1,0 g

1,0 mL

0

100,0 mL

2

Lev et Spicer

1,0 g

3,0 mL

0

100,0 mL

2,5

Lev et Spicer

0,5%

0

0,5 N

0

0,5

Lev et Spicer

0,5%

0

0,1 N

0

1

La solución de azul Alciano debe filtrarse antes de su uso; no es estable y cuando se forma un precipitado debe desecharse.

Solución colorante de hematoxilina de Harris 67

Solución colorante de eosina PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Tratar los cortes en solución acuosa de ácido acético al 3% durante 3 minutos. 3. Colocar los cortes con la solución colorante de azul Alciano durante 30 minutos. 4. Lavar en agua destilada por 2 minutos. 5. Colorear con hematoxilina-eosina. 6. Deshidratar, aclarar y montar con bálsamo de Canadá. RESULTADOS: pH = 0,5 - 1 Los glucosaminoglicanos ácidos sulfatados se observan de color azul verdoso (cartílago y mayoría de mucinas epiteliales), núcleos de color morado pH = 2.5

Los glucosaminoglicanos ácidos no sulfatados y sulfatados se observan de color azul verdoso (glucocalix, ácido hialurónico, sialomucinas, cápsula mucoide de Cryptococus neoformans), núcleos de color morado.

OBSERVACIONES: Tanto el pH así como el tiempo de exposición son de importancia para asegurar la especificidad del método. pH igual a 2.8 o mayores disminuyen la especificidad; mientras que tiempos de exposición prolongados terminan por colorear con mayor o menor intensidad todos los componentes histológicos.

REFERENCIA: Johnson,F. B.: Armed Forces Institute of Pathology. 68

COLORACIÓN METACROMÁTICA CON AZUL DE TOLUIDINA FIJACIÓN: Formol al 10% MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina 5 micrómetros de grosor. Se recomienda usar como lámina patrón secciones de traquea. SOLUCIONES:

Solución colorante de azul de toluidina Azul de toluidina (C.I. 52040) Agua destilada c.p.s.

0,1 g. 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada 2. Colorear con solución de azul de toluidina entre 30 segundos a 1 minuto. 3. Enjuagar en agua destilada. 4. Cubrir las secciones con un cubreobjeto. 5. Sellar el borde del cubreobjeto con esmalte de uña presionando la laminilla con la uña. 6. Examinar las secciones tan pronto como sea posible después de la preparación. RESULTADOS: La metacromasia α se observa de color azul por ejemplo núcleos. La metacromasia β se observa de color azul violáceo por ejemplo glucosaminoglucanos ácidos no sulfatados (ácido hialurónico) del cordón umbilical. La metacromasia γ se observa de color rojo violáceo por ejemplo glucosaminoglucanos ácidos sulfatados (ácido condroitin sulfato) del cartílago hialino de la traquea. La metacromasia δ se observa de color rojo, por ejemplo hongos.

OBSERVACIÓN METACROMÁTICA DE MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS CON AZUL DE TOLUIDINA 1)

Glucosaminoglucanos ácidos no sulfatados muestran metacromasia con azul de Toluidina a pH= 3, pero no a pH= 1.5

2)

Glucosaminoglucanos ácidos sulfatados muestran metacromasia a pH=1.5 con Azul de Toluidina.

REFERENCIA: Johnson, F. B.: Available in mimeographed form from Armed Forces Institute of Pathology. 69

MÉTODO DE FEULGEN (Feulgen-Rossenbeck) OBJETIVO: Ácido Desoxirribonucleico FIJACIÓN: La formalina no es un buen fijador para los ácidos nucleicos porque bloquean un número considerable de grupos reactivos, de tal manera que se reduce considerablemente la reacción. Los fijadores más recomendables son los líquidos a base de alcohol y ácido acético, el fijador de Carnoy es el más popular; sin embargo, hay que tener presente que la permanencia prolongada en soluciones ácidas tienden a extraer a los ácidos nucleicos, primero al ARN y luego al ADN. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina o por congelación de 4 micrómetros de grosor. Simultáneamente se correrá una lámina blanco. FUNDAMENTO: El método de Feulgen presenta dos pasos fundamentales, el primero de ellos consiste en la formación de grupos aldehídos; esto se logra gracias a la acción de una hidrólisis ácida suave con HCl 1 N, el cual permite la liberación de las bases purínicas del ADN con la consiguiente formación de grupos -CHO. El segundo paso es el reconocimiento de estos grupos por el reactivo de Schiff. REACTIVOS:

Solución de ácido clorhídrico 1N Ácido clorhídrico concentrado de peso específico 1,19 Agua destilada c.s.p.

8,35 mL 100,00 mL

Reactivo de Schiff Fucsina básica (C.I. 42510) 0,5 g Ácido Clorhídrico 1N 10,0 mL Metabisulfito de sodio o de potasio ó disulfito de sodio o de potasio 0,5 g Agua destilada 100,00 mL Carbón activado 0,25 g Disolver la fucsina básica en el agua destilada caliente. Llevar a punto de ebullición. Enfriar y agregar el disulfito de sodio y agitar la mezcla; luego añadir el ácido clorhídrico 1N y agitar constantemente por espacio de 20 minutos. Dejar en la oscuridad en frasco herméticamente cerrado hasta el día siguiente. Después de este tiempo la solución ha adquirido una ligera coloración amarillenta, se recomienda entonces añadir el carbón activado y agitar. Finalmente se filtra y se guarda en frascos color caramelo y de cierre hermético. Solución de agua sulfurosa (opcional) Metabisulfito de sodio o de potasio al 10%

5,0 mL 70

Ácido clorhídrico 1 N 5,0 mL Esta mezcla es utilizable mientras tiene olor a anhídrido sulfuroso, en caso contrario deberá desecharse.

Solución stock de light green sf yellowish Light green sf yellowish (C.I. 42095) Agua destilada Ácido acético glacial

0,2 g 100,0 mL 0,2 mL

Solución de trabajo de light green sf yellowish Solución stock de light green sf yellowish Agua destilada

10,0 mL 50,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente; los cortes por congelación se fijarán y se llevarán también hasta agua. 2. Colocar los cortes en el ácido clorhídrico 1 N a 60°C, para realizar la hidrólisis. El tiempo de permanencia en el ácido dependerá del fijador que se haya utilizado (ver tabla adjunta)

FIJADOR

TIEMPO

FIJADOR

TIEMPO

Carnoy 6:3:1 Carnoy 3:1 Fleming Susa Etanol

8' 6' 16' 18' 5'

Gendre Helly Regaud Zenker Formol

5' 8' 14' 5' 8'

La lámina blanco se colocará en agua destilada a 60°C por el mismo tiempo que la lámina problema. 3. Lavar en agua destilada varios cambios. 4. Colocar en el reactivo de Schiff durante 20 a 30 minutos. 5. Lavar en agua sulfurosa o agua destilada varios cambios. 6. Lavar en agua corriente. 7. Colorear con el verde luz durante 30 segundos. 8. Lavar en agua corriente. 9. Deshidratar, aclarar y montar. RESULTADOS: El ácido ácido del núcleo se observa de color rojo púrpura y el citoplasma de color verde. 71

OBSERVACIONES: Las preparaciones de Feulgen se conservan indefinidamente. La pérdida del color es insignificante (alrededor del 3 a 4 %, durante el primer año, medido con espectrofotometría). Los cortes teñidos y no montados se pueden guardar en ácido acético al 45% de -14 a -35°C, sin que se produzca ninguna pérdida de color. La intensidad del color producido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada (ADN). En este caso podemos aplicar la ley de Lambert-Beer que nos permite con el auxilio del histofotómetro, microfotómetro o en el microespectrofotómetro, medir la sustancia cuantitativamente en los tejidos.

REFERENCIA: Lillie, R. D.: Histopathologic Technic and Practical Histochemistry, 3ª Ed., pp 148-155, 1965. REFERENCIA DE TABLA DE TIEMPO DE HIDRÓLISIS: Pearse, A. G. E.: HistochemistryTheorical and Applied. Little, Brown & Co. p 823. 1961. 72

MÉTODO DEL VERDE DE METILO PIRONINA (Unna-Pappenhein) OBJETIVO: Ácido desoxirribonucleico y ácido ribonucleico FIJACIÓN: El fijador de Carnoy da los mejores resultados, pero se puede usar los fijadores habituales como el formol al 10%. MICROTOMIA: Realizar cortes en parafina o por congelación de 4 micrómetros de grosor, simultáneamente se correrá una lámina testigo. FUNDAMENTO: Tanto al verde de metilo (un trifenil metano) como la pironina (un xanteno), son colorantes básicos cuyas afinidades de coloración varían según el pH de la solución colorante. Cuando se aplica la mezcla de ambos a pH 9, la pironina tiene poca actividad y solo colorea el verde de metilo; ocurre lo contrario en un pH ácido donde sólo se fija la pironina y no el verde de metilo. Sin embargo, cuando la mezcla de ambos colorantes se aplica a pH de 4,8 se produce una coloración selectiva, donde el verde de metilo colorea el ADN mientras que la pironina tiñe al ARN. Para darle mayor confiabilidad al procedimiento es conveniente correr cortes controles (lámina testigo), las cuales serán sometidas a digestión enzimática (DNAasa y RNAasa) antes de la coloración. REACTIVOS:

Solución concentrada de verde metil-pironina Verde metil (C.I. 42585) 4,0 g Pironina (C.I. 45005) 5,0 g Agua destilada 100,0 mL Cloroformo (aprox.) 150,0 mL Disolver el verde metil en el agua destilada, colocarlo en una pera de decantación y realizar extracciones sucesivas con el cloroformo, con la finalidad de eliminar el violeta de metilo (generalmente contaminante del verde metil). El proceso se repetirá tantas veces sea necesaria hasta que el cloroformo quede transparente. Por último agregar la pironina y disolverla. Esta solución es estable.

Amortiguador de acetato pH 4.8 Ácido acético 0.1 M Acetato sódico 0.1 M Verificar el pH y guardar en refrigeración.

40.0 mL 60.0 mL

Solución diluida de verde metil-pironina.

Solución concentrada de verde metil-pironina

1 vol.

Amortiguador de acetato pH 4.8 Esta solución es estable por una o dos semanas.

1 vol. 73

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Colorear con la solución diluida de verde metil-pironina durante 10 minutos a 24 horas. 3. Retirar el exceso de colorante con papel de filtro. Algunos autores recomiendan lavar rápidamente en agua. 4. Deshidratar rápidamente en acetona absoluta. 5. Pasar a una mezcla de acetona-xilol 1:1 6. Pasar a una mezcla de acetona xilol 1:10 7. Aclarar en xilol y montar. RESULTADOS: El ácido desoxirribonucleico del núcleo se observa de color verde y el ácido ribonucleico del ergastoplasma se observa de color rojo a rosado. OBSERVACIONES: Para que esta coloración tenga un real valor histoquímico es necesario teñir al mismo tiempo una lámina testigo tratada previamente con la ribonucleasa o con un método de extracción química. El ácido ribonucleico se puede demostrar en los tejidos gracias a su acentuada afinidad con colorantes básicos (basofilia) como el azul de metileno y el azul de toluidina. Por tanto, las áreas de citoplasma que se tiñen con estos colorantes son generalmente ricas en ribosomas. Pero como el ARN no es la única sustancia basófila de los tejidos, es necesario incubar una lámina testigo antes de su coloración con la enzima ribonucleasa (Test de Brachett) que digerirá el ARN presente. Cualquier estructura que pierda su basofilia debido al tratamiento previo con la ribonucleasa se considera que contiene ARN.

REFERENCIA: Pearse, A. G. E.: Histochemistry-Theorical and Applied. Little, Brown & Co. p 825. 1961. 74

MÉTODO DE ROJO CONGO DE BENNHOLD OBJETIVO: Demostración de Amiloide FIJACIÓN: Los fijadores alcohólicos son los de elección. De preferencia emplear el líquido de Carnoy o el alcohol de 95 %. La fijación prolongada en formol al 10 % tiende a disminuir la tinción con el rojo Congo, ya que los grupos oxidrilos del amiloide y los grupos aldehídos del formol interactúan formando acetales y hemiacetales. Los fijadores con dicromato o ácido crómico también disminuyen la intensidad de la coloración con este método, porque se producen complejos Cr-O-Cr con los grupos oxidrilos del amiloide. MICROTOMIA: Cortar secciones en parafina de 6 - 7 micrómetros de grosor . FUNDAMENTO: Este método se basa en que este colorante diazoico se dispone paralelamente a las fibrillas de amiloide para luego unirse mediante puentes de hidrógeno entre los grupos oxidrilos de las fibrillas y los grupos amino laterales del colorante. SOLUCIONES:

Solución de rojo Congo Rojo Congo (C.I. 22120) Agua destilada

1.0 g 100.0 mL

Solución acuosa saturada de carbonato de litio Solución colorante de hematoxilina de Harris. PROCEDIMIENTO 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Colorear con la solución de rojo Congo por 30 minutos. 3. Tratar los cortes con la solución saturada de carbonato de litio por 15 segundos. 4. Lavar con agua corriente durante 15 minutos. 5. Colorear con hematoxilina de Harris por 2 minutos. 6. Lavar con agua corriente durante 1 minuto 7. Deshidratar ,aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Observadas las láminas con luz convencional, los depósitos de amiloide varían de color naranja a rojo. Otros componentes como el tejido elástico, fibras de celulosa, las paredes de variedades de hongos y gránulos eosinófilos también adquieren esta coloración. Cuando se observa con luz polarizada, los depósitos de amiloide exhiben una birrefringencia verde; una birrefringencia similar muestran los derivados de la celulosa y las paredes de algunos hongos, sin embargo, estos últimos materiales pueden 75

distinguirse del amiloide por características morfológicas o por otras coloraciones. Los gránulos de los eosinófilos y el tejido elástico no exhibe birrefringencia. El amiloide teñido con Rojo Congo muestra fluorescencia roja bajo luz ultravioleta. OBSERVACIONES: El éxito de esta coloración requiere de una solución de rojo Congo recién preparada. VARIANTE : Coloración de rojo Congo con permanganato de potasio. REACTIVOS :

Solución de permanganato ácido de potasio Solución acuosa de permanganato de potasio al 0.5%. Solución acuosa de ácido sulfúrico al 3 %

47.5 mL 2.5 mL

Solución acuosa de ácido oxálico al 1% PROCEDIMIENTO: 1.Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada. Secar bien la lámina. 2.Tratar con permanganato ácido de potasio por 30 segundos a 3 minutos. Lavar con agua destilada. 3.Tratar los cortes con ácido oxálico 1% hasta que el tejido se blanquee. Lavar con agua destilada. 4. Colorear con la solución de rojo Congo por 30 minutos. 5. Tratar los cortes con la solución saturada de carbonato de litio por 15 segundos. 6. Lavar con agua corriente durante 15 minutos. 7. Colorear con hematoxilina de Harris por 2 minutos. 8. Lavar con agua corriente durante 1 minuto 9. Deshidratar ,aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Amiloidosis Primaria Amiloidosis Secundaria

Amarilla. Negativa al color Amarillo.

REFERENCIA: Lillie, R. D.: Histopathologic Technic, and Practical Histochemistry, New York, The Blakiston Company, Inc., 1954, p 293. 76

MÉTODO DE COLORACIÓN CON SUDAN III O IV OBJETIVOS: Demostración de grasas neutras. FIJACIÓN: Los tejidos objeto de estudio pueden ser frescos o fijados el fijador de elección es el líquido de Baker (Formol-calcio), líquido en el que los tejidos se pueden conservar. MICROTOMÍA: Para hacer el estudio de grasas se tendrá que recurrir siempre a seccionar los tejidos por micrótomo de congelación o por criostato, ya que los métodos habituales de procesamiento histológico extraen estas sustancias. Realizar cortes por micrótomo de congelación o criostato de 7 a 8 micrómetros de grosor. Pueden montarse en láminas o procesarse por flotación. FUNDAMENTO: Los diazocolorantes del tipo Sudan son colorantes indiferentes, y tienen la propiedad de solubilizarse fácilmente en los lípidos, también se disuelven en solventes orgánicos (alcohol, acetona) pero en menor proporción. Cuando estos colorantes en solución alcohólica se enfrentan a tejidos que contienen grasas, el colorante difunde hacia su interior porque aquí su grado de disolución es mayor confiriéndole por tanto su color. Como se notará aquí no hay ningún tipo de reacción química ni de unión electrostática, sino un simple fenómeno físico. SOLUCIONES: Solución colorante de Sudán Sudan III o IV (C.I. 26100 o C.I. 26105) 0.2 g Acetona 50,0 mL Alcohol al 70% 50,0 mL Disolver el Sudán III o IV en una mezcla a partes iguales de acetona y etanol al 70% (solución de Herxheimer). Se deja en reposo por lo menos 2 días y se debe filtrar antes de usar. Alcohol de 70% Alcohol al 50 % Solución colorante de Hematoxilina de Harris.

Gelatina glicerinada Gelatina 1,0 g Agua destilada caliente 6,0 mL Agregar la gelatina al agua caliente y mover hasta que se disuelva. Adicionar: Glicerina 7,0 mL Fenol 0,1 mL 77

PROCEDIMIENTO: 1. Las secciones se llevan a alcohol de 70 % por 3 minutos. 2. Colocar las secciones en la solución de Sudán por 1 minuto. 3. Eliminar el exceso de colorantes en alcohol de 50 % durante 2 minutos. 4. Lavar los cortes en agua durante 3 minutos. 5. Colorear con hematoxilina de Harris durante 1 minuto. 6. Lavar en agua corriente. 7. Montar en gelatina. RESULTADOS: Las grasas neutras se observan de color naranja con el sudán III o de color rojo con el sudán IV y los núcleos de color azul. OBSERVACIONES: El método tiene algún inconveniente y es el de extraer total o parcialmente las finas partículas lipídicas a causa del solvente del colorante; este inconveniente se puede evitar usando como disolvente al polietilenglicol, el cual es un solvente muy bueno para el Sudán pero es un pésimo disolvente de las grasas.

REFERENCIA: Clark, A. E.: J. Path. & Bact. 59: 337. 1947. (Permission of Oliver and Boyd, Ltd., London, England.) 78

MÉTODO DE SUDÁN BLACK B (SUDAN NEGRO) OBJETIVO: Demostrar la presencia de fosfolípidos FIJACIÓN: Se puede trabajar con tejidos frescos y seccionados por micrótomo de congelación o criostato. Para fijar los tejidos debe de usarse el líquido de Baker, pues lo cationes evitan que los fosfolípidos pasen a la solución, con la misma finalidad se pueden agregar a la solución de formol iones de cadmio o de cobalto. Posteriormente con paso óptimo se hace el cromado durante 24 a 48 horas en dicromato de Potasio al 3 %; la cromatación produce la oxidación de los fosfolípidos, haciéndolos insolubles a los solventes orgánicos utilizados en la inclusión en parafina. MICROTOMIA: Los cortes serán de 5 a 6 micrómetros de grosor, si se tratan de bloques de parafina y de 10 micrómetros de grosor si son por congelación o por criostato. FUNDAMENTO: El principio de la coloración estriba en que éste diazocolorante tiene un alto grado de solubilidad en fosfolípidos; es un colorante indiferente, por tanto no forma sales y la coloración se da por un simple fenómeno físico. SOLUCIONES: Solución colorante de Sudán black b Sudán black b (C.I. 26150) Alcohol al 70% Dejar reposar por 2 días y filtrar antes de usar.

1,0 g 40,0 mL

Alcohol al 70 % Alcohol al 50 % Solución colorante de rojo neutro al 0.1 % Rojo neutro Agua destilada

0,1 g 100,0 mL

Gelatina glicerinada Gelatina 1,0 g Agua destilada caliente 6,0 mL Agregar la gelatina al agua caliente y mover hasta que se disuelva. Adicionar: Glicerina 7,0 mL Fenol 0,1 mL PROCEDIMIENTO: 79

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Desparafinar y llevar los cortes hasta el alcohol de 70%; o, si son cortes por congelación. llevarlos hasta el alcohol de 50%. Colorear con el Sudán black b durante 30 minutos en un recipiente herméticamente cerrado. Eliminar el exceso de colorante con alcohol de 70 %, o en alcohol de 50 % para los cortes por congelación. Lavar en agua corriente. Colorear con rojo neutro durante 30 segundos. Lavar con agua corriente. Montar en gelatina.

RESULTADOS: Las porciones de tejido que contengan fosfolípidos se observaran de color negro y los núcleos de color rojo. OBSERVACIONES: La saturación y filtración de la solución de Sudán a baja temperatura disminuye la formación de precipitados. El Sudán Negro se descompone en solución ácida, esto se produce rápidamente a pH por debajo de 4. El producto de descomposición contiene un colorante básico con apetencia por los ácidos nucleícos y los glucosaminoglicanos ácidos.

REFERENCIA: Chifelle, T. L., and Putt, F. A.: Stain Technology, 26: 51, 1951. 80

MÉTODO DE PERLS (Azul de Prusia, Azul de Berlín) OBJETIVO: Demostración de hierro trivalente. El hierro demostrable por este método, es el que se encuentra bajo la forma de hemosiderina, Este compuesto visto en una lámina coloreada con el método de hematoxilina-eosina suele presentarse como un pigmento granular intracitoplasmático de color marrón, el cual debe necesariamente de diferenciarse de otros pigmentos marrones. FIJACIÓN: El mejor fijador para este fin es la formalina neutra al 10% este preserva más hierro con menos difusión que con otros fijadores como por ejemplo los alcohólicos. No deben usarse fijadores que contengan ácidos, porque estos disuelven los depósitos de hierro de los tejidos. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 4 micrómetros de grosor. FUNDAMENTO: El hierro trivalente al enfrentarse al ferrocianuro de potasio o de sodio forma in situ un complejo fuertemente coloreado de azul turquesa, el ferrocianuro férrico; este complejo precipita a manera de sustancia amorfa o microgranulosa que es atraído electrostáticamente por ciertas estructuras citoplasmáticas. El ácido clorhídrico interviene en la liberación del hierro, ya que éste se encuentra almacenado en las células unido a proteínas en cuya forma no puede interactuar con el ferrocianuro de potasio. REACTIVOS:

Solución acuosa de ferrocianuro de potasio al 2% Ferrocianuro de potasio o de sodio Agua destilada

2,0 g 100,0 mL

Solución acuosa de ácido clorhídrico al 2% Ácido clorhídrico Agua destilada

2,0 mL 100,0 mL

Soluciones colorantes de hematoxilina de Harris y eosina PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar las secciones hasta agua destilada. 2. Agregar a la lámina un volumen conocido de ferrocianuro de potasio y dejar actuar durante 1 minuto. 3. Sobre el ferrocianuro agregar un volumen igual de ácido clorhídrico y hacer una mezcla homogénea. Dejar que actúe durante 15 a 20 minutos o hasta que el tejido tome una coloración azul. 4. Lavar con agua corriente por 2 minutos. 81

5. 6. 7. 8. 9.

Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos. Lavar en agua corriente durante 1 minuto Colorear con la eosina durante 15 segundos Lavar en agua corriente durante 20 segundos Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá.

RESULTADOS: Los depósitos de hierro trivalente se observan de color azul turquesa (azul de Prusia), núcleos de color morado y citoplasma rosado. OBSERVACIONES: Los colorantes de contraste (colorantes nucleares) deberán ser usados por breves períodos de tiempo, para evitar que ellos se adhieran a las partículas de ferrocianuro férrico y por tanto enmascaren la reacción. Este método permite, por ejemplo, no sólo localizar las células del organismo que catabolizan la hemoglobina, sino también diagnosticar enfermedades en las cuales se produce un depósito de hierro en los tejidos. La hemosiderina es una forma parcialmente desnaturalizada de ferritina que se aglomera con facilidad y se reconoce en el examen microscópico como unos gránulos pardo-amarillentos en el citoplasma que debido a la reacción de Perls, se tiñen de color azul turquesa (presencia de hierro trivalente). Normalmente existe hemosiderina en el bazo, médula ósea y células de Kupffer del hígado.

REFERENCIA: Mallory, F. B. and Wright, J. H.: Pathological Technique, ed. 8, Philadelphia, W. B. Saunders Co., 1924, p 207. (A.F.I.P. modification). 82

MÉTODO DE VON KOSSA OBJETIVO: Demostración de depósitos insolubles de calcio. Los depósitos anormales de las sales de calcio pueden tener diferentes causas, pero todas ellas están bajo la forma de fosfatos y/o carbonatos, y según la naturaleza de su origen se les denomina calcificación metastásica, calcificación patológica, etc. FIJACIÓN: Los fijadores alcohólicos son los que dan los mejores resultados, se deberán evitar los fijadores que contengan ácidos porque disuelven las sales de calcio. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 5 micrómetros de grosor. FUNDAMENTO: Este método realmente demuestra la presencia de fosfatos y carbonatos insolubles, como en el organismo todos los fosfatos y carbonatos insolubles son de calcio, es que se le considera como un método específico para este elemento. Se basa en el reemplazo de la sal cálcica del tejido (método de sustitución) por una sal de plata. Luego esta plata es reconocida por reducción a plata metálica negra. REACTIVOS:

Solución acuosa de nitrato de plata al 5% Solución acuosa de tiosulfato de sodio al 5% Soluciones colorantes de hematoxilina de Harris y eosina PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Someter los cortes a la solución de nitrato de plata por 25 a 40 minutos, expuesto a la luz directa del sol o de una lámpara de 100 w. 3. Lavar en varios cambios de agua destilada. 4. Colocar en tiosulfato de sodio por 1 minuto. 5. Lavar en agua corriente por 1 minuto. 6. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos. 7. Lavar en agua corriente durante 1 minuto 8. Colorear con la eosina durante 15 segundos 9. Lavar en agua corriente durante 20 segundos 10. Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Los depósitos de calcio se observan de color nego o marrón oscuro, núcleos de color morado y citoplasma rosado. 83

OBSERVACIONES: Después del paso 3 podría ser necesario el uso de Cloruro de Oro, esto con la finalidad de acentuar la coloración. Es importante que siempre que se trabaja con plata el agua sea destilada, para evitar cualquier reducción de plata inespecífica.

REFERENCIA: Mallory, F. B.: Pathological Technique, Philadelphia, W. B. Saunders Co.,1942, p 144 (A.F.I.P. modification)

84

MÉTODO DE MASSON FONTANA OBJETIVO: Pigmentos melánicos. Estos pigmentos están ampliamente distribuidos, variando del negro al amarillo claro, y son notables por su insolubilidad en la mayoría de los solventes y por su resistencia a los ácidos. No obstante las bases fuertes los disuelven y diversos oxidantes llegan a decolorarlos, entre ellos el agua oxigenada. FIJACIÓN: Los fijadores recomendados son el formol al 10% o el Bouin, no debe usarse fijadores crómicos por ser oxidantes. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 4 micrómetros de grosor. FUNDAMENTO: Las impregnaciones argénticas del tipo argentafin, ponen de manifiesto estas estructuras sin necesidad de un agente reductor (formol o hidroquinona), la reducción de las sales de plata es producida espontáneamente por la o las sustancias presentes en los tejidos (polifenoles, aldehídos, etc). Los pigmentos melánicos son derivados metabólicos de la tirosina y de la fenilalanina y como estos poseen núcleos fenólicos, se produce una reducción de la plata a plata metálica negra. REACTIVOS:

Solución de nitrato de plata amoniacal Antes de comenzar a trabajar, todo material de vidrio se debe de dejar en mezcla sulfocrómica durante 5 a 10 minutos, luego lavar con chorros de agua corriente y por último enjuagar con agua destilada. A 65 mL de nitrato de plata al 10% agregar, gota a gota, amoníaco concentrado, se producirá entonces un precipitado grumoso; seguir agregando el amoníaco hasta que la solución se vuelva transparente. Adicionar 5 mL de nitrato de plata lentamente y con agitación constante, el producto final será una solución clara. Dejar reposar toda la noche en frasco hermético y en lugar oscuro. Para trabajar diluir 25 mL de esta solución en 75 mL de agua destilada. Solución acuosa de cloruro de oro al 0.1 % Solución acuosa de tiosulfato de sodio al 5 % Soluciones colorantes de hematoxilina de Harris y eosina PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente 2. Lavar en agua destilada rigurosamente 3. Colocar en la solución de nitrato de plata amoniacal por 1 hora a 56°C 85

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 13. 14.

Lavar en agua destilada varios cambios Colocar en el cloruro de oro durante 10 minutos Lavar en agua destilada Colocar en el tiosulfato de sodio por 5 minutos Lavar en agua corriente por 1 minuto. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos. Lavar en agua corriente durante 1 minuto Colorear con la eosina durante 15 segundos Lavar en agua corriente durante 15 segundos Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá.

RESULTADOS: Los pigmentos melánicos y sustancias argentafines se observan de color negro, los núcleos de color morado y el citoplasma rosado.

REFERENCIA: Lillie, R. D.: Histopathology Technic, Philadelphia, Blakiston Co., 1948, p 102. 86

DEMOSTRACION DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE PEROXIDASA OBJETIVO: Demostración de actividad de la enzima peroxidasa FIJACION: Los frotices sanguíneos y los cortes por congelación pueden ser fijados en alcohol-formol (10:1); los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina también sirven ya que la enzima peroxidasa , resiste estos procedimientos. MICROTOMIA: Secciones de parafina de 4 micras, o secciones por congelación de 5 o 6 micras. FUNDAMENTO: La peroxidasa es capaz de activar oxígeno de peróxidos. El oxígeno liberado tiene acción oxidante sobre substratos adecuados. Utilizando bencidina la oxidación tiene como resultado la formación de un producto de color azul o pardo. REACTIVOS: SOLUCION ACUOSA SATURADA DE BENCIDINA Disolver 50 mg de bencidina en 200 ml de agua destilada a 80 °C, dejar enfriar a temperatura ambiente y filtrar antes de usar. SOLUCION DE PEROXIDO DE HIDROGENO AL 3 % SOLUCION ACUOSA SATURADA DE CLORURO AMONICO Disolver 40 g de cloruro amónico en 100 ml de agua destilada. ETILENDIAMINO TETRAACETICO AL 5 % Ajustar el pH a 6,0 con Hidróxido de sodio. MEZCLA DE INCUBACION Mezclar 1 ml de cloruro amónico con 1 ml de EDTA y añadir 9 ml de bencidina. Finalmente agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno. PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. Fijar los frotices en alcohol-formol y llevarlos hasta agua corriente. 87

2. Someter los tejidos al baño de incubación durante 5 – 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Lavar los tejidos con agua corriente durante 2 minutos 4. Contrastar los tejidos con Hematoxilina de Harris durante 1 - 3 minutos. 5. Lavar con agua corriente. 6. Deshidratar aclarar y montar RESULTADOS: Los sitos que demuestran actividad enzimática de la peroxidasa se ven de color marrón oscuro, núcleos de color azul.

REFERENCIA: SPANNHOF, Ludwig.: Histoquímica Práctica, Zaragoza, Edit. Acribia, 1966, p 195.

88

INMUNOHISTOQUÍMICA

89

PROCEDIMIENTO DEL COMPLEJO STREPTAVIDINA-BIOTINA FOSFATASA ALCALINA MÉTODO DEL H.A.M.A. FIJACIÓN: Formol-zinc, formol neutro al 10% o en su defecto formol al 10% MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 3 a 4 micrómetros de grosor y recogerlas del baño maría sobre láminas con poli L-lysina, inmediatamente se coloca en la estufa a 70°C durante 15 minutos o 37-40°C hasta el día siguiente. SOLUCIONES:

Solución de buffer cítrato pH=6.0 Solución de ácido citrico 0.1M (Solución A): Ácido citrico monohidratado (C 6 H8O 7.H2O) Agua destilada c.s.p.

21.01 g 1000.00 mL

Solución de citrato de sodio 0.1M (Solución B): Citrato trisodico dihidratado (C 6H 5Na3 O 7.2H 2O) Agua destilada c.s.p. Solución de trabajo: Solución A Solución B Agua destilada El pH de esta solución debe ser 6.0 +/- 0.1

29.41 g 1000.00 mL

9.00 mL 41.00 mL 450.00 mL

Solución de buffer fosfato salino Fosfato de sodio, dibásico, anhidro Fosfato de sodio, monobásico, anhidro Cloruro de sodio Agua destilada c.s.p. pH final 7.0 a 7.6

1.48 g 0.43 g 7.20 g 1000.00 mL

Solución de pepsina Pepsina Solución acuosa de ácido clorhídrico pH=2.5

0.4 g 100.0 mL

Proteína bloqueadora Suero normal de la misma especie del anticuerpo primario.

Solución de anticuerpo primario 90

Solución de anticuerpo secundario biotinilado Solución del conjugado enzimático Streptavidina-fosfatasa alcalina Solución del cromógeno-substrato PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos. 2. Desparafinar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos. 3. Tratar los cortes en alcohol absoluto 1 durante 5 minutos. 4. Tratar los cortes en alcohol absoluto 2 durante 5 minutos. 5. Tratar los cortes en el alcohol corriente 1 durante 5 minutos. 6. Tratar los cortes en el alcohol corriente 2 durante 5 minutos. Si las secciones fueron fijadas con algún fijador mercurial, desenkerizar y luego lavar en agua corriente durante 3 minutos. Despigmentación de tejidos ricos en melanina: • Tratar los cortes con solución acuosa de permanganato de potasio al 0.25% durante 1-4 horas. • Lavar con agua corriente. • Tratar los cortes con solución acuosa de ácido oxálico al 5% hasta que el tejido se aclare. • Lavar en agua corriente durante 10 minutos. 7. Lavar en agua destilada 3 veces (dejar el agua en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez). 8. Recuperación del antígeno. Colocar los portaobjetos con los cortes de tejido desparafinado en un recipiente de plástico. Usar un microondas y efectuar los siguientes pasos:

¡Error! Marcador no definido. PASO N° 1

¡Error! Marcador no definido. PASO N° 2 ¡Error! Marcador no definido. PASO N° 3

Llenar el recipiente de plástico con solución de ácido cítrico pH=6. Colocar en el microondas

Marcar 15 minutos. Ponga en funcionamiento el microondas y observar. Cuando el líquido comience a hervir, parar el microondas.

Completar el volumen del recipiente con solución de ácido cítrico pH=6. Colocar nuevamente en el microondas

Ponga nuevamente en funcionamiento el microondas y observar. Cuando el líquido comience a hervir parar el 91

¡Error! Marcador no definido. PASO N° 4

¡Error! Marcador no definido. PASO N° 5

9.

10.

11. 12. 13. 14.

15. 16.

17. 18.

19. 20.

21. 22.

microondas. Sacar el recipiente de plástico del microondas y repetir los pasos 2 y 3, hasta completar los 10 minutos marcados.

Por último dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Lavar en solución de ácido cítrico pH=6 fría

El número de tratamientos en el microondas y la óptima dilución del anticuerpo, debe ser determinada por cada Laboratorio. Sacar las láminas del recipiente de plástico, colocarlas sobre un puente y, si el anticuerpo primario lo requiere, digerir las secciones con una solución fresca de pepsina durante 10 minutos a 37°C.(efectuar este paso dentro de una cámara húmeda). Sacar las láminas de la estufa y lavar en solución buffer fosfato salino 3 veces (dejar la solución buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez). Escurrir y secar los bordes de la sección con papel de filtro. Tratar los cortes con la proteína bloqueadora, durante 20 minutos, escurrir y secar los bordes de la sección con papel de filtro. No enjuagar, no lavar. Tratar los cortes con la solución de anticuerpo primario, durante 60 minutos. Descartar la solución anterior y lavar en solución buffer fosfato salino 3 veces (dejar la solución buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez). Escurrir y secar los bordes de la sección con papel de filtro. Tratar los cortes con la solución de anticuerpo secundario biotinilado, durante 20 minutos. Descartar la solución anterior y lavar en solución buffer fosfato salino 3 veces (dejar la solución buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez). Escurrir y secar los bordes de la sección con papel de filtro. Tratar los cortes con la solución del conjugado enzimático Streptavidina-fosfatasa alcalina, durante 20 minutos. Descartar la solución anterior y lavar en solución buffer fosfato salino 3 veces (dejar la solución buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez). Escurrir y secar los bordes de la sección con papel de filtro. Tratar los cortes con la solución del cromógeno-substrato, durante 20 minutos. Descartar la solución anterior y lavar en solución buffer fosfato salino 3 veces (dejar la solución buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez), continuar el enjuague con agua destilada. Colorear con hematoxilina de Harris diluida a la mitad, durante 2 minutos. Lavar con agua corriente durante 3 minutos. Escurrir y secar los bordes de la 92

23.

sección con papel de filtro. Montar en resina sintética miscible con agua.

RESULTADOS: Reacción antígeno-anticuerpo positiva de color rojo, los núcleos de color azul.

PROCEDIMIENTO DEL COMPLEJO STREPTAVIDINA-BIOTINA PEROXIDASA MÉTODO DEL H.A.M.A. 1. Preparar láminas con Poli-L- lisina 2. Cortar la muestra problema y la muestra control con el Micrótomo unos 3 micrómetros de grosor; recogerla en la lámina preparada con Poli- L- lisina, e inmediatamente se coloca en la estufa a 70º C durante un tiempo de 10 minutos. 3. Desparafinar Xilol 01 por 5 minutos Xilol 02 por 5 minutos 4. Rehidratar Alcohol absoluto 01 por 5 minutos Alcohol absoluto 02 por 5 minutos Alcohol corriente 01 por 5 minutos Alcohol corriente 02 por 5 minutos Agua corriente por 3 minutos. 5. Recuperación Antigénica: se colocan las láminas en un envase plástico resistente al calor del horno microondas (coplin), se llena el recipiente con Buffer Citrato pH 6, colocar en el horno microondas por 10 minutos, hasta que se inicie la ebullición, sacar y agregar más buffer citrato, colocar nuevamente en el horno microondas y así sucesivamente hasta cumplir los 10 minutos. Culminado los 10 minutos se agrega una solución detergente (12,5 ml de pinesol + 1 litro de agua) al envase plástico, colocar en el horno microondas por 10 93

minutos, igual que el anterior. Terminado dejar las láminas en el envase plástico con la solución detergente a temperatura ambiente hasta enfriar. 6. Lavado de láminas: colocar en un puente todas las láminas, lavar estas 3 veces con agua destilada y eliminar el sobrenadante. 7. Agregar el peróxido de hidrógeno (que cubra todo el tejido), dejar reposar por 20 minutos. 8. Eliminar el peróxido de hidrógeno y enjuagar 3 veces con agua destilada. Inmediatamente lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces este procedimiento. 9. Secado de láminas con papel blanco, sin tocar las muestras. 10. Aplicar proteína bloqueadora, dejar reposar por 20 minutos. 11. Secar el excedente con papel blanco, sin tocar las muestras. 12. Agregar 1 ó 2 gotas del Anticuerpo Primario cubriendo todo el tejido problema, incubar por 60 minutos a Tº ambiente. 13. Lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces este procedimiento. 14. Secado de láminas con papel blanco, sin tocar las muestras. 15. Agregar 1 ó 2 gotas de Anticuerpo Secundario Biotinilizado, incubar por 20 minutos a Tº ambiente. 16. Lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces este procedimiento. 17. Secado de láminas con papel blanco, sin tocar las muestras. 18. Agregar la Enzima Conjugada (Streptavidina + Peroxidasa) de 1 a 2 gotas, incubar por 20 minutos a Tº ambiente. 19. Lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces este procedimiento. 20. Secado de láminas con papel blanco sin tocar las muestras. 21. Agregar el Sustrato con el Cromógeno (1ml de sustrato cromógeno + 1 gota de solución cromógena (DAB)), por 10 minutos. Lavar con agua destilada. 22. Alcohol corriente 01 (6 sumergidas) Alcohol corriente 02 (6 sumergidas) Alcohol absoluto 01 (5 minutos) Alcohol absoluto 02 (5 minutos) Xilol 01 (5 minutos) Xilol 02 (5 minutos) Montaje. 23. Las muestras positivas mostrarán una coloración marrón en la zona donde se encuentren los respectivos receptores.

OBSERVACIONES: • FALSOS NEGATIVOS La fijación inadecuada, congelación, descongelación, lavados, secados, calentamiento pueden producir artefactos, atrapamientos de anticuerpos. •

FALSOS POSITIVOS Los falsos positivos pueden igualmente observarse a consecuencia de la reacción 94

cruzada de otros reactivos empleados en la coloración, como por ejemplo: fosfatasa alcalina endógena o peroxidasa endógena, respectivamente, o por reacciones inespecíficas con células necrosadas o degeneradas 1.

“..mientras más dura la tarea más dulce será la victoria..”

1

DAKO RECEPTOR ESTROGÉNICO DAKO-ER ID5 (Cód. N° M7047) 95

MÉTODO DE COLORACIÓN CON LUXOL FAST BLUE PARA MITOCONDRIAS FIJACIÓN: Fijar piezas pequeñas y delgadas en líquido de Regaud. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 3 micrómetros de grosor. SOLUCIONES: Solución colorante de luxol fast blue al 0.1%. Luxol fast blue MBS, MBSN (C.I. ) 0,1 g Alcohol de 95% 100,0 mL Disolver el colorante en el alcohol. Adicionar 5,0 mL de ácido acético glacial por cada 1000,0 mL de solución colorante. Solución de carbonato de litio al 0,05% Carbonato de litio Agua destilada c.s.p

0,05 g 100,0 mL

Solución colorante de hematoxilina de Harris o hemalumbre de Harris Hematoxilina (C.I. 75290) 5,0 g Alcohol corriente 95% 50,0 mL Sulfato doble de aluminio y potasio o sulfato doble de aluminio y amonio 100,0 g Agua corriente 1000,0 mL Oxido mercúrico rojo o amarillo 2,0 g Disolver la hematoxilina en el alcohol, el alumbre (sulfato doble) en el agua con ayuda del calor. Mezclar las dos soluciones. Llevar la mezcla a ebullición tan rápido como sea posible, luego sacarla del calor y adicionar el óxido mercúrico. Recalentar la mezcla, hasta que tenga un color púrpura oscuro, cerca de 1 minuto. Luego retirar del calor y enfriar rápidamente. La solución está lista para ser usada. Solución stock de eosina acuosa al 1% Eosina amarilla (C.I. 45380) Agua destilada Disolver y adicionar: Ácido acético glacial

10,0 g 1000,0 mL 2,0 mL

Solución colorante de trabajo de eosina Solución stock de eosina acuosa al 1% 1 vol. Alcohol al 80% 3 vol. Adicionar 0,5 mL de ácido acético glacial por cada 100,0 mL de solución colorante. PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar los cortes e hidratar hasta agua corriente. 2. Poner las láminas en un coplin y agregar solución colorante de luxol fast blue, tapar 96

4. 5. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

y colocar en una estufa a 57°C durante 24 horas. Lavar los cortes en el alcohol corriente. Lavar en agua corriente. Diferenciar los cortes en la solución de carbonato de litio al 0,05%. Sumergir los cortes, rápidamente, en agua corriente. Repetir los pasos 3,4 y 5 hasta que el corte se ponga claro. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. Colorear con la solución de trabajo de eosina, durante 10 segundos. Lavar en agua corriente durante 1 minuto. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol corriente 1. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol corriente 2. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 1 durante 3 minutos. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 2 durante 3 minutos. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos. Montar en bálsamo de Canadá. Montar con bálsamo de Canadá.

RESULTADOS: Las mitocondrias se observan de color azul turquesa, núcleos morados y citoplasma rosado.

REFERENCIA: Kluver, H., and Barrera, E.: Journal of Neuropathology and Exper. Neurol. 12: 400-403, 1953. 97

MÉTODO DE HEMATOXILINA FÉRRICA DE WEIGERT PARA ERGASTOPLASMA FIJACIÓN: Fijar piezas frescas de médula espinal en alcohol de 95%. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 3 micrómetros de grosor. SOLUCIONES: Solución A de hematoxilina férrica de Weigert Hematoxilina (C.I. 75290) Alcohol absoluto

1,0 g 100,0 mL

Solución B de hematoxilina férrica de Weigert Cloruro férrico 29% Agua destilada Ácido clorhídrico concentrado

4,0 mL 95,0 mL 1,0 mL

Solución de trabajo de hematoxilina férrica de Weigert Solución A Solución B

1 vol. 1 vol.

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar, hidratar y enjuagar con agua corriente. 2. Colorear en solución de hematoxilina de Weigerth por 10 minutos. 3. Lavar en agua corriente. 4. Deshidratar, aclarar y montar con bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Las sustancias basófilas como núcleo y ergastoplasma (retículo endoplásmico rugoso) se observan de color negro.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1942, página 86. 98

MÉTODO DE IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA DIRECTA DE DA FANO PARA EL APARATO DE GOLGI FIJACIÓN: Fijar pequeñas piezas frescas durante 3 horas en la siguiente mezcla fijadora: Formol comercial 15,0 mL Agua destilada 100,0 mL Nitrato de cobalto 1,0 g SOLUCIONES: Solución reductora de Cajal Formol neutro Agua destilada Hidroquinona Sulfito de sodio

7,5 mL 50,0 mL 1,0 g 0,25 g Solución acuosa de nitrato de plata al 1,5%

Nitrato de plata Agua destilada

1,5 g 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Después de fijar, lavar inmediatamente con agua destilada durante 30 minutos. 2. Tratar los tejidos con solución acuosa de nitrato de plata al 1,5%, durante 16 a 24 horas y en oscuridad. 3. Lavar con agua destilada durante 4 minutos. 4. Tratar los bloques de tejidos con la solución reductora de Cajal durante 8, 16 y 24 horas. 5. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 6. Tratar las piezas con alcoholes de 70%, 80%, 90%, 96% y 96% cada uno, una hora respectivamente. 7. Tratar las piezas con 3 alcoholes absolutos y 2 xiloles, cada uno 2 horas respectivamente. 8. Tratar los tejidos con 2 cambios de parafina, cada uno de 1 hora, respectivamente. 9. Cortar con el micrótomo de Minot, secciones de parafina de 3 micrómetros de grosor. Recoger los cortes con una lámina portaobjeto con albúmina. 10. Desparafinar los cortes e hidratar hasta agua corriente. 11. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 5 minutos. 12. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 13. Sumergir los cortes, rápidamente, 3 veces en el alcohol ácido al 1%. 14. Lavar inmediatamente con agua corriente. 15. Sumergir los cortes, rápidamente 3 veces en solución de agua amoniacal al 1%. 16. Lavar inmediatamente con agua corriente y verificar si los núcleos están bien 99

17. 18. 19.

teñidos observando al microscopio. Colorear con la solución de trabajo de eosina, durante 4 minutos. Lavar en agua corriente durante 10 segundos. Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá.

RESULTADOS: El aparato de Golgi se observa de color negro, núcleos azules y citoplasma rosado.

REFERENCIA: Martoja, R. Martoja-Pierson, M.: Initiation aux techniques de l' histologie animale. Masson ET Cie ,Éditeurs 120, bd St-Germain, Paris-VI. 1967, pp 106-107. 100

COLORACIÓN DE VAN GIESON PARA FIBRAS COLÁGENAS FIJACIÓN: Líquido de Bouin, formol al 10%. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 6 micrómetros de grosor. SOLUCIONES: Solución A de hematoxilina férrica de Weigert Hematoxilina (C.I. 75290) Alcohol absoluto

1,0 g 100,0 mL

Solución B de hematoxilina férrica de Weigert Cloruro férrico 29% Agua destilada Ácido clorhídrico concentrado

4,0 mL 95,0 mL 1,0 mL

Solución de trabajo de hematoxilina férrica de Weigert Solución A Solución B Solución de picrofucsina de Van Gieson Fucsina ácida (C.I. 42685) solución acuosa 1% Solución acuosa saturada de ácido pícrico (C.I. 10305)

1 vol. 1 vol.

5,0 mL 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar, hidratar y enjuagar con agua corriente. 2. Colorear con solución de trabajo de hematoxilina de Weigerth por 10 minutos. 3. Lavar en agua corriente durante 5 minutos y luego enjuagar con agua destilada. 4. Contracolorear en solución de Van Gieson por 5 minutos. 5. Diferenciar en alcohol de 95%. 6. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol absoluto 1. 7. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol absoluto 2. 8. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos. 9. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos. 10. Montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Las fibras colágenas se observan de color rojo; músculo, epitelio cornificado de color amarillo y núcleo de color azul o negro. NOTA: El agua de alta dureza puede remover la fucsina ácida de la solución de Van 101

-

Gieson, el cual se forma fucsinatos alcalinos que son incoloros. La solución B puede remover la hematoxilina de Weigert. Los órganos duros como el útero quedan relativamente suaves después de la fijación con Bouin al igual que el corazón. Montar en Permount o bálsamo. Se puede añadir 3 gotas de solución alcohólica saturada con ácido pícrico para cada 50 mL de xilol usado como aclarador. Montar en xilol acidificado. Esto intensifica el fondo y evita que las secciones se decoloren.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological techniques, Philadelphia, W.B. Saunders, 1942, página 152. 102

COLORACIÓN TRICRÓMICA DE MASSON FIJACIÓN: Líquido de Bouin o formol al 10%. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 6 micrómetro de grosor. SOLUCIONES: Solución de Bouin Solución acuosa saturada de ácido pícrico (C.I. 10305) Formaldehído comercial (37-40%) Ácido acético glacial

75,0 mL 25,0 mL 5,0 mL

Solución A de hematoxilina férrica de Weigert Hematoxilina (C.I. 75290) Alcohol absoluto

1,0 g 100,0 mL

Solución B de hematoxilina férrica de Weigert Cloruro férrico 29% Agua destilada Ácido clorhídrico concentrado

4,0 mL 95,0 mL 1,0 mL

Solución de trabajo de hematoxilina férrica de Weigert Solución A Solución B

1 vol. 1 vol.

Solución de fucsina ácida - escarlata de Biebrich Solución acuosa de escarlata de Biebrich (C.I. 26905) al 1% Solución acuosa de fucsina ácida (C.I. 17200) al 1% Ácido acético glacial

90,0 mL 10,0 mL 1,0 mL

Solución de ácido fosfomolíbdico - ácido fosfotúngstico Ácido fosfomolíbdico 5,0 g Ácido fosfotúngstico 5,0 g Agua destilada 200,0 mL O Solución de ácido fosfotúngstico 5% Ácido fosfotúngstico Agua destilada

5,0 g 100,0 mL

103

Solución de azul de anilina Azul anilina (C.I. 707) Ácido acético Agua destilada

2,5 g 2,0 mL 100,0 mL O

Solución de light green sf yellowish Light green sf yellowish (C.I. 42095) 5,0 g Agua destilada 250,0 mL Ácido acético glacial 2,0 mL Calentar el agua, disolver el verde brillante, enfriar, filtrar y adicionar el ácido acético. Solución de ácido acético al 1% Ácido acético glacial Agua destilada c.s.p

1,0 mL 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Mordentar en fijador de Bouin por 1 hora a 56°C, o durante toda la noche a temperatura ambiente. 3. Enfriar y lavar en agua corriente hasta que desaparezca el color amarillento. 4. Solución de hematoxilina férrica de Weigert por 10 minutos. Lavar en agua corriente por 10 minutos. 5. Enjuagar en agua destilada. 6. Solución Escarlata de Biebrich - Fucsina ácida por 15 minutos. Regresar la solución al frasco. 7. Enjuagar con agua destilada. 8. Solución de ácido fosfomolíbdico-ácido fosfotúngstico por 10 a 15 minutos antes de la solución de azul de anilina. O también se puede usar ácido fosfotúngstico en solución acuosa al 5% por 15 minutos antes del colorante light green. Descartar la solución. 9. Solución azul de anilina por 5 a 10 minutos o solución de light green por 4 a 8 minutos. Regresar la solución al frasco. 10. Lavar en agua destilada. 11. Agua acética al 1% por 3 a 5 minutos. Descartar la solución. 12. Alcohol al 95%. 13. Alcohol absoluto - 2 cambios. 14. Xilol - 2 cambios. 15. Montar en Permount o bálsamo. 104

RESULTADOS: Núcleos de color negro, citoplasma, queratina, fibras musculares de color rojo y fibras colágenas y moco de color azul si se uso azul de anilina o verde si se uso light green sf. NOTA: B. Para secciones del sistema nervioso central ( SCN), cambiar el tiempo establecido en los siguientes pasos: 7. Escarlata de Biebrich - fucsina ácida por 1 a 2 minutos. 9. Solución de ácido fosfomolíbdico - ácido fosfotúngstico por 10 a 30 minutos. 10. Solución de azul de anilina por 15 a 20 minutos. C. La deshidratación y aclaramiento tiene que ser rápidamente para evitar la pérdida de colorante en este proceso.

REFERENCIA: Masson, P.J.: J. Tech. Methods 12:75-90, 1929, y Lillie, R.D.: Histopathological Technique, Philadelphia, Blakiston Co., 1948, página 196. [Modificación de la A.F.I.P.] 105

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA DE GOMORI PARA RETICULINA FIJACIÓN: De preferencia fijar tejido fresco en alcohol de 95% o en su defecto usar formol al 10%. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 6 a 8 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución de plata amoniacal Antes de comenzar a trabajar, todo material de vidrio se debe de dejar en mezcla sulfocrómica durante 5 a 10 minutos, luego lavar con chorros de agua corriente y por último enjuagar con agua destilada. A 10 mL de solución acuosa de nitrato de plata al 10%, agregar de 2,0 a 2,5 mL de solución acuosa de hidróxido de potasio al 10%, luego añadir hidróxido de amonio, gota a gota, mientras se va agitando el recipiente constantemente, hasta que el precipitado este disuelto completamente. Añadir otra vez, con cuidado, solución de nitrato de plata, gota a gota, hasta que el precipitado resultante desaparezca con cierta dificultad al agitar la solución. Llevar la solución con agua destilada hasta dos veces su volumen. Solución de permanganato de potasio al 0,5 % Permanganato de potasio Agua destilada c.s.p

0,5 g 100,0 mL

Solución de disulfito de potasio al 2% Disulfito de potasio o de sodio Agua destilada c.s.p

2,0 g 100,0 mL

Solución de sulfato de amonio férrico Sulfato de amonio férrico Agua destilada

2,0 g 100,0 mL

Solución de formol Solución de formaldehido Agua destilada

20,0 mL 80,0 mL

Solución de cloruro de oro Solución stock de cloruro de oro Agua destilada

20,0 mL 80,0 mL

106

Solución de tiosulfato de sodio Tiosulfato de sodio Agua destilada

2,0 g 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Oxidar en solución acuosa de permanganato de potasio al 0,5% por 1 minuto. 3. Lavar en agua corriente por 2 minutos. 4. Diferenciar con solución acuosa de disulfito de potasio por 1 minuto. 5. Lavar en agua corriente por 2 minutos. 6. Sensibilizar en solución de sulfato de amonio férrico al 2% por 1 minuto. 7. Lavar en agua corriente por 2 minutos; seguido con 2 cambios de agua destilada 30 segundos cada vez. 8. Impregnar en la solución de plata por 1 minuto. 9. Enjuagar en agua destilada por 20 segundos. 10. Reducir por 3 minutos en formol al 20%. 11. Lavar en agua corriente por 3 minutos. 12. Tonificar con solución de cloruro de oro al 0,2% por 10 minutos. 13. Enjuagar en agua destilada. 14. Reducir la tonificación en una solución de metabisulfito de potasio al 2% por 1 minuto. 15. Fijar en solución de tiosulfato de sodio al 2% por 1 minuto. 16. Lavar en agua corriente por 2 minutos. 17. Deshidratar y montar en Permount. RESULTADOS: Fibras reticulares de color negro.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Co., 1938, página 164. 107

COLORACIÓN DE VERHOEFF PARA FIBRAS ELÁSTICAS FIJACIÓN: Se puede utilizar cualquier buen fijador tisular. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 6 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución colorante de tejido elástico Disolver 1,0 g de hematoxilina (C.I. 75290) en 22 mL de alcohol absoluto en un recipiente abierto sobre una plancha caliente. Enfriar, filtrar y añadir 8 mL de solución acuosa de cloruro férrico al 10% y 8 mL de solución de Iodo (iodo 2 g, yoduro de potasio 4 g disueltos en 100 mL de agua destilada). Nota: Para mejores resultados, hacer la solución momentos antes de colorear.

Solución de cloruro férrico Cloruro férrico Agua destilada

2,0 g 100,0 mL

Solución colorante de picrofucsina de van Gieson Fucsina ácida (C.I. 42685) solución acuosa 1% Solución acuosa saturada de ácido pícrico (C.I. 10305)

5,0 mL 100,0 mL

Solución de tiosulfato de sodio al 5% Tiosulfato de sodio Agua destilada c.s.p

5,0 g 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Coloración de tejido elástico de Verhoeff por 15 minutos. 3. Lavar en agua corriente. 4. Diferenciar en cloruro férrico al 2%, solo unos cuantos minutos. Chequear bajo el microscopio y si se sobrediferencia recolorear. 5. Colocar en tiosulfato de sodio al 5% por 1 minuto. 6. Lavar en agua corriente por 5 minutos y luego enjuagar en agua destilada. 7. Contracolorear en colorante de van Gieson por 1 minuto. 8. Diferenciar en alcohol 95%. 9. Alcohol absoluto - 2 cambios. 10. Xilol - 2 cambios. 11. Montar en bálsamo de Canada.

108

RESULTADOS: Fibras elásticas de color azul negruzco a negro, núcleo de color azul a negro, fibras colágenas de color rojo y otros elementos tisulares de color amarillo.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Co., 1942, página 170. 109

COLORACIÓN DE GIEMSA (MODIFICACIÓN DE WOLBACH) FIJACIÓN:

Los tejidos fijados en Zenker dan muy buenos resultados, pero pueden ser usados otros fijadores tisulares.

MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 4 a 5 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución stock de Giemsa Giemsa en polvo 1,0 g Alcohol metílico 66,0 mL Glicerina 66,0 mL Añadir la glicerina al Giemsa en polvo y colocarlo a la estufa a 60°C por ½ a 2 horas. Luego añadir el alcohol metílico.

Solución de trabajo Giemsa stock Alcohol metílico Agua destilada

1,25 mL 1,50 mL 50,00 mL

Solución stock de rosina Rosina pura Alcohol absoluto

10,0 g 100,0 mL

Solución de trabajo de rosina Solución stock de rosina Alcohol 95%

5,0 a 10,0 mL 40,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta alcohol de 95%. 2. Remover los precipitados de mercurio por medio del iodo y tiosulfato de sodio 5% si la muestra fue fijada en Zenker. 3. Lavar bien en agua corriente. 4. Enjuagar en agua destilada. 5. Colocar en solución de trabajo de Giemsa. Toda la noche. 6. Diferenciar en alcohol rosina hasta que las secciones asuman un color rosado púrpura. Chequear bajo el microscopio. 7. Alcohol absoluto. 2 cambios. 8. Xilol. 2 cambios. 9. Montar en Permount. 110

RESULTADOS: Núcleo de color azul, citoplasma, colágeno y otros elementos tisulares de color rosado

OBSERVACIONES: A. El método de coloración de Giemsa colorea mucho mejor si el tejido ha estado en pH ácido. Si el tejido no ha sido acidificado por la descalcificación, etc., colocar en alcohol-ácido, lavar bien, empezar la coloración. B. Se puede preparar una solución de trabajo modificada de la siguiente manera: se diluye la solución stock 1:20 con agua destilada o con solución buffer fosfato pH 6,8-7,2. debe ser una solución fresca y se prepara momentos antes de usar. 7. Colocar en solución de trabajo Giemsa por 30 minutos. 8. Enjuagar con agua destilada el exceso de colorante. 9. Diferenciar con ácido acético al 1 uno por mil en agua destilada pasando rápidamente y enjugando inmediatamente con agua destilada cuando se llegue al punto deseado, ósea, cuando los eritrocitos tomen un color rosa rojizo pálido. En todo caso, los cortes deben chequearse en el microscopio o cuando tomen un color rosado púrpura. 10. Enjuagar en agua destilada abundante. 11. Dejar secar los cortes histológicos a medio ambiente. 12. Montar en bálsamo de Canadá.

REFERENCIA: Lillie, R.D.: Histopathological Technique and Practical Histochemistry, New York, Blakiston Co., 1954, página 385. 111

MÉTODO DE SCHMORL PARA DEMOSTRACIÓN DE LAGUNAS Y CANALÍCULOS ÓSEOS FIJACIÓN: Líquido de Orth y luego lavar en agua y descalcificar en solución de Ebner. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 4 a 5 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Líquido de Ebner Solución acuosa saturada de cloruro de sodio Ácido clorhídrico Agua destilada Añadir 1 ó 2 mL de HCl cada día hasta que el hueso este suave.

100,0 mL 4,0 mL 100,0 mL

Solución de Nicolle Solución saturada de tiónina (C.I. 52000) en alcohol al 50% Solución acuosa de ácido carbólico al 1%

10,0 mL 100,0 mL

o

Solución de tionina Solución saturada de tiónina (C.I. 52000) en alcohol al 50% Agua destilada

2,0 mL 10,0 mL

Solución de ácido fosfotúngstico Ácido fosfotúngstico Agua destilada

para saturar 20,0 mL

Agua amoniacal diluida Hidróxido de amonio Agua destilada

10,0 mL 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Colorear en carbol-tionina de Nicolle 3 minutos o solución de tionina con 1 a 2 gotas de agua amóniacal diluida. 2. Llevar a la solución de ácido fosfotúngstico por unos pocos segundos hasta que las secciones quedan de color azul, verde o gris. 3. Lavar en agua 5 a 10 minutos hasta que las secciones queden azul claro. 4. Colocar en agua amoniacal diluida, 3 a 5 minutos. Si la sustancia de fondo está coloreada demasiado intenso, tratar con alcohol-ácido por 5 minutos y lavar en agua antes de deshidratar. 112

5. 6.

Lavar en alcohol 90%, varios cambios. Deshidratar rápidamente, aclarar y montar.

RESULTADOS: Los bordes de lagunas y canalículos óseos de color negro azulado, sustancia de fondo de color azul verdoso y otros elementos celulares de color azul difuso.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Co., 1938, página 173. 113

COLORACIÓN DE AZUL DE TOLUIDINA PARA COLOREAR SUSTANCIA FUNDAMENTAL DE TEJIDO CARTILAGINOSO FIJACIÓN: Formol al 10% neutro. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina en 6 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución de azul de toluidina Azul de toluidina (C.I. 52040) Agua destilada

0,1 g 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Colorear en solución azul de toluidina por 1 a 2 minutos. 3. Enjuagar en agua destilada. 4. Cubrir las secciones con un cubreobjeto. 5. Sellar el borde del cubreobjeto presionando con la uña. 6. Examinar las secciones tan pronto como sea posible después de la preparación. RESULTADOS: Cartílago de color rojo violáceo y núcleos de color azul .

REFERENCIA: Johnson, F. B.: Available in mimeographed form Armed Forces Institute of Pathology. 114

MÉTODO DE COLORACIÓN CON LUXOL FAST BLUE PARA BANDAS DE MIELINA FIJACIÓN: Fijar en líquido de Regaud o en formol al 10%. MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 5 a 6 micrómetros de grosor. SOLUCIONES: Solución colorante de luxol fast blue al 0.1%. Luxol fast blue MBS, MBSN (C.I.) 0,1 g Alcohol de 95% 100,0 mL Disolver el colorante en el alcohol. Adicionar 5,0 mL de ácido acético glacial por cada 1000,0 mL de solución colorante. Solución de carbonato de litio al 0,05% Carbonato de litio Agua destilada c.s.p

0,05 g 100,0 mL

Solución colorante de hematoxilina de Harris o hemalumbre de Harris Hematoxilina (C.I. 75290) 5,0 g Alcohol corriente 95% 50,0 mL Sulfato doble de aluminio y potasio o sulfato doble de aluminio y amonio 100,0 g Agua corriente 1000,0 mL Oxido mercúrico rojo o amarillo 2,0 g Disolver la hematoxilina en el alcohol, el alumbre (sulfato doble) en el agua con ayuda del calor. Mezclar las dos soluciones. Llevar la mezcla a ebullición tan rápido como sea posible, luego sacarla del calor y adicionar el óxido mercúrico. Recalentar la mezcla, hasta que tenga un color púrpura oscuro, cerca de 1 minuto. Luego retirar del calor y enfriar rápidamente. La solución está lista para ser usada.

Solución stock de eosina acuosa al 1% Eosina amarilla (C.I. 45380) Agua destilada Disolver y adicionar: Ácido acético glacial

10,0 g 1 000,0 mL 2,0 mL

Solución colorante de trabajo de eosina Solución stock de eosina acuosa al 1% 1 vol. Alcohol al 80% 3 vol. Adicionar 0,5 mL de ácido acético glacial por cada 100,0 mL de solución colorante.

115

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar los cortes e hidratar hasta agua corriente. 2. Poner las láminas en un coplin y agregar solución colorante de luxol fast blue, tapar y colocar en una estufa a 57°C durante 24 horas. 3. Lavar los cortes en el alcohol corriente. 4. Lavar en agua corriente. 5. Diferenciar los cortes en la solución de carbonato de litio al 0,05%. 6. Sumergir los cortes, rápidamente, en agua corriente. 7. Repetir los pasos 3,4 y 5 hasta que el corte se ponga claro. 8. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos. 9. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 10. Colorear con la solución de trabajo de eosina, durante 10 segundos. 11. Lavar en agua corriente durante 1 minuto. 12. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol corriente 1. 13. Tratar los cortes, rápidamente 5 veces en el alcohol corriente 2. 14. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 1 durante 3 minutos. 15. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 2 durante 3 minutos. 16. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos. 17. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos. 18. Montar en bálsamo de Canadá. 19. Montar con bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Las bandas de mielina se observan de color azul turquesa, núcleos morados y citoplasma rosado.

REFERENCIA: Kluver, H., and Barrera, E.: Journal of Neuropathology and Exper. Neurol. 12: 400-403, 1953. 116

COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN PARA MICROORGANISMOS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES FIJACIÓN: Se puede usar cualquier buen fijador tisular. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 4 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución de carbol-fucsina Ácido carbólico (fenol, ácido fénico) Alcohol absoluto Fucsina básica (C.I. 42510) Agua destilada Nota: Guardar a temperatura ambiente. Filtrar antes de usar.

2,5 mL 5,0 mL 0,5 g 50,0 mL

Alcohol ácido al 1% Ácido clorhídrico concentrado Alcohol 70%

1,0 mL 99,0 mL

Solución de trabajo de azul de metileno Azul de metileno (C.I. 52015) Ácido acético glacial concentrado Agua corriente

0,5 g 0,5 mL 100,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Colorear las láminas con solución de carbol-fucsina durante 10 minutos. Filtrar la solución antes de usar. 3. Enjuagar bien en agua corriente. 4. Decolorar con alcohol-ácido al 1% o ácido sulfúrico 1%, hasta que las láminas estén de color rosa pálido. 5. Lavar con agua corriente 8 minutos. 6. Contra colorear por un zambullida de la lámina a un tiempo en la solución de trabajo de azul de metileno. Las láminas deben de quedar de un color azul pálido. La sobre coloración puede enmascarar a los bacilos. 7. Lavar con agua corriente. 8. Secar en la estufa, aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Organismos ácido-alcohol resistentes (mycobacterium, Criptosporidium sp., Actynomices sp.) de color rojo brillante, eritrocitos de color naranja amarillento, otros elementos tisulares de color azul pálido. 117

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, Pa., W.B. Saunders Co. 1942, página 275 (Modificación de A.F.I.P.)

118

COLORACIÓN DE WAYSON PARA Helicobacter pylori FIJACIÓN: Se puede utilizar cualquier buen fijador tisular. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 4 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución A Fucsina básica (C.I. 42510) Alcohol etílico absoluto Azul de metileno (C.I. 52015)

0,2 g 20,0 mL 0,75 g

Solución B Ácido carbólico (fenol, ácido fénico) Agua destilada

5,0 g 100,0 mL

Solución de trabajo Solución A Solución B Nota: Filtrar antes de usar, esta solución puede durar hasta seis meses.

1 vol. 2 vol.

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. 2. Colorear durante 5 minutos en la solución de trabajo recién filtrada. 3. Deshidratar rápidamente, aclarar y montar. RESULTADOS: Helicobacter pilorico de color azul oscuro, fondo de color azul pálido.

REFERENCIA: Sonnenwirth, Alex C.: Método y Diagnóstico del Laboratorio Clínico. Editorial Panamericana, Buenos Aires. Argentina. pp 97-98, 1983. 119

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA DE WARTHIN-STARRY PARA Helicobacter pylori FIJACIÓN: Formol al 10%. No utilizar fijadores con ácido crómico MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina 3 a 4 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución tampón Acetato sódico Ácido acético Agua destilada

1,64 g 2,5 mL 200,0 mL

Solución de nitrato de plata Nitrato de plata Solución tampón

0,5 g 50,0 mL

Solución 1 Hidroquinona 0,3 g Solución tampón 10,0 mL Se toma 1,0 mL de esta solución y se mezcla con 15,0 mL de solución de gelatina al 5% a 37°C (5,0 g de gelatina en 100,0 mL de solución tampón). Almacenar a 37°C

Solución 2 Solución acuosa de nitrato de plata al 2% a 60°C

3,0 mL

Solución de trabajo Mezclar las soluciones 1 y 2 inmediatamente antes de usar. PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. Las láminas previamente coloreadas con otros colorantes pueden ser usados removiendo el cubreobjeto en xilol y corriendo a través de alcoholes hasta agua. 2. Lavar bien en solución tampón. 6. Colocar en la solución de nitrato de plata al 1% en la estufa a 58 a 60 °C por 30 a 60 minutos. Usar pinzas cubiertas con parafina para poder remover las láminas de esta solución. Lavar en la solución tampón. 7. Desarrollar las secciones en la solución de trabajo durante 3 minutos a 60°C 8. Enjuagar en agua corriente a 60°C. 9. Lavar los cortes en la solución tampón. 10. Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá. 120

RESULTADOS: Helicobacter pilorico de color negro, fondo amarillo parduzco.

REFERENCIA: García del Moral, Raimundo: Laboratorio de anatomía patológica. Primera edición. Interamericana. McGraw-Hill, Madrid, España. 1993, pp 286-287. 121

IMPREGNACIÓN DE NITRATO DE PLATA-METANAMINE DE GOMORI (APLICACIÓN DE GROCOTT PARA HONGOS) FIJACIÓN: Formol al 10%. MICROTOMÍA: Cortar secciones de parafina de 5 micrómetros de grosor. SOLUCIONES:

Solución de ácido crómico al 5% Ácido crómico Agua destilada

5,0 g 100,0 mL

Solución de nitrato de plata al 5% Nitrato de plata Agua destilada c.s.p.

5,0 g 100,0 mL

Solución de metenamine al 3% Hexametilenotetramino Agua destilada

3,0 g 100,0 mL

Solución de borax al 5% Borax Agua destilada

5,0 g 100,0 mL

Solución stock de nitrato de plata-metanamine Solución de nitrato de plata al 5% 5,0 mL Solución de metenamine al 3% 100,0 mL Se forma un precipitado blanco, pero inmediatamente agitar para disolverlo.

Solución de trabajo de nitrato de plata-metanamine Solución de borax al 5% Agua destilada Combinar y añadir: Solución stock de nitrato de plata-metanamine

2,0 mL 25,0 mL 25,0 mL

Solución de disulfito de sodio al 1% Disulfito de sodio Agua destilada

1,0 g 100,0 mL

Cloruro de oro al 0,1% Solución de cloruro de oro 1%

10,0 mL 122

Agua destilada Esta solución puede ser usada repetidamente.

90,0 mL

Solución de tiosulfato de sodio al 2% Tiosulfato de sodio Agua destilada

2,0 g 100,0 mL

Solución stock de light green sf yellowish Light green sf yellowish (C.I. 42095) Agua destilada Ácido acético glacial

0,2 g 100,0 mL 0,2 mL

Solución de trabajo de light green sf yellowish Solución stock de light green sf yellowish Agua destilada

10,0 mL 50,0 mL

PROCEDIMIENTO: 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. Las láminas previamente coloreadas con otros colorantes pueden ser usados removiendo el cubreobjeto en xilol y corriendo a través de alcoholes hasta agua. 2. Oxidar en solución de ácido crómico al 5% por una hora. 3. Lavar en agua corriente por pocos segundos. 4. Enjuagar en disulfito de sodio al 1% por 1 minuto para remover cualquier residuo de ácido crómico. Lavar en agua corriente por 5 a 10 minutos. 5. Lavar con 3 ó 4 cambios de agua destilada. 6. Colocar en solución de trabajo de nitrato de plata-metanamine en la estufa a 58 a 60 °C por 30 a 60 minutos hasta que los tejidos se tornen de color marrón amarillento. Usar pinzas cubiertas con parafina para poder remover las láminas de esta solución. Lavar en agua destilada y chequear bajo el microscopio. Los hongos pueden estar marrón oscuro en este estado. 7. Enjuagar en seis cambios de agua destilada. 8. Dar tono en solución de cloruro de oro 0,1% por 2 a 5 minutos. 9. Enjuagar en agua destilada. 10. Remover la plata no reducida con solución de tiosulfato de sodio al 2% por 2 a 5 minutos. Lavar en agua corriente. 11. Contrastar con solución de trabajo de light green sf yellowish por 30 a 45 segundos. 12. Lavar en agua corriente. Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de Canadá. RESULTADOS: Los hongos se observan de color negro, la mucina de color gris oscuro y el fondo de color verde pálido. 123

REFERENCIA: Grocott, R.G.: Am. J. Clin. Path. 25: 975-979, 1955. 124