Guia de Practicas de Laboratorio Bioquimica de Alimentos

PRÁCTICA No. 1: Desnaturalización y precipitación de proteínas

1.1 Marco teórico Se conoce como desnaturalización de proteínas a todo proceso que, sin ruptura o formación de enlaces químicos, determina una modificación en las propiedades de la proteína nativa; es decir, en este proceso no se alteran los enlaces peptídicos, manteniéndose también la secuencia u orden en que están unidos los aminoácidos. Se modifican únicamente el ordenamiento espacial. Las proteínas desnaturalizadas son químicamente más reactivas y más fácilmente hidrolizadas por enzimas. Para muchas proteínas, el aspecto más visible de su desnaturalización es la disminución de su solubilidad en agua. La desnaturalización de proteínas se puede realizar por

incremento de la

temperatura, por adición de ácidos o álcalis concentrados, también puede ser producida por algunos solventes orgánicos como alcohol o cetona.

1.2 Competencias Reconocer

la

modificación

en

las

propiedades

de

proteínas

por

desnaturalización.

1.3 Materiales y equipos Reactivos 

Albúmina (coger un huevo y perforar en un extremo, luego extraer la clara y agregar agua destilada hasta veces el volumen inicial, al final filtrar)



Acido clorhídrico cc



Alcohol etílico



Hidróxido de sodio 10%



HNO3 cc



HCl cc



NaOH cc



Sulfato de cobre 10%



Solución de ferrocianuro de potasio K3Fe(CN)6

Materiales 

cocinilla eléctrica



Pipeta 5 ml (3)



Pisceta



Termómetro



Tubos de ensayo (12)



Gradilla



Fiola 100ml



Probeta 100 ml



Bagueta



Embudo de vidrio



Beaker 250 ml (3)



Gotero (8)

1.4 Procedimiento

Desnaturalización de albúmina 

En cada uno de 5 tubos de ensayo colocar 20 gotas de solución de albúmina



El primer tubo

se calienta poco a poco observando la temperatura

aproximada a la que tiene lugar la coagulación. 

Al segundo tubo se adiciona 30 gotas de alcohol etílico.



Al tercer tubo adicionar 5 gotas de ácido clorhídrico concentrado.



Al cuarto tubo añadir 5 gotas de ácido nítrico concentrado.



Al quinto tubo, añadir 1 ml de solución concentrada de NaOH.



Anotar en que casos se produce la coagulación.

Precipitación de proteínas mediante cationes A seis tubos adicionar las siguientes soluciones: 

Al tubo A adicionar 20 gotas de agua



Al tubo B adicionar 20 gotas de solución de albúmina.



Al tubo C adicionar 20 gotas de agua más 3 gotas de ácido clorhídrico al 10%.



Al tubo D adicionar 20 gotas de solución de albúmina más 3 gotas de HCl al 10%.



Al tubo E adicionar 20 gotas de agua más 3 gotas de solución de NaOH al 10%.



Al tubo F adicionar 20 gotas de solución de albúmina más 3 gotas de solución de NaOH al 10%.



A continuación, adicione a cada tubo 2 ml de solución de sulfato de cobre al 10%, agitar los tubos y observe los resultados, haciendo las comparaciones por pareja.

Precipitación de proteínas mediante aniones 

Preparar 3 tubos idénticos a los tubos B, D y F del ensayo anterior. A cada uno se adiciona 2 gotas de solución de ferrocianuro de potasio. Observe el tubo que presente precipitado de proteína.

1.5 Resultados TRATAMIENTO

DESNATURALIZACIÓN

DE

LA

DE

LA

PROTEÍNA Calentamiento Etanol Acido clorhídrico Acido nítrico Hidróxido de sodio

TRATAMIENTO

DESNATURALIZACIÓN PROTEÍNA

Cationes CuSO4 en medio ácido Cationes CuSO4 en medio básico Aniones

K3Fe(CN)6

en

medio

K3Fe(CN)6

en

medio

ácido Aniones básico

1.6 Conclusiones Según

los

resultados

obtenidos

desnaturalización de proteínas.

concluya

sobre

la

coagulación

y

PRÁCTICA No. 2: Pardeamiento Enzimático 1.1 Marco teórico Se denomina Pardeamiento enzimático a la transformación enzimática en sus primeras

etapas

de

compuestos

fenólicos

en

polímeros

coloreados,

frecuentemente pardos o negros. Es muy común en frutas y vegetales (manzana, plátano, palta, berenjena, champiñones, papas) que han sufrido daños físicos y/o exponen su tejido interno al aire y la luz. Frecuentemente es considerado como perjudicial y debe tratar de prevenirse. El enzima responsable del Pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal sustrato. A pesar del nombre genérico de Pardeamiento (“browning” en inglés), los colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. En algún caso, como en las pasas, el té o el cacao el Pardeamiento enzimático contribuye al desarrollo de los colores característicos de estos productos, aunque como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Además de la alteración del color, los

productos

formados

pueden

reaccionar

con

las

proteínas,

insolubilizándolas. Por otra parte, puede producirse también una perdida nutricional, ya que la polifenoloxidasa no oxida directamente al acido ascórbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la reacción. Control de la reacción de Pardeamiento El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima se encuentra en los plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y también en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenólicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. Cuando se rompe la compartimentalización por daño mecánico, como el triturado, corte o

congelación y descongelación, la reacción de pardeamiento se puede producir. También se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción. Además de mantener la compartimentalización, la reacción de pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores: 

Inactivando la enzima (blanqueo, uso de inhibidores)



Minimizando el contacto con el oxígeno



Creando condiciones desfavorables para la actividad enzimática (descenso de pH, bajas temperaturas, reducción de Aw)



Tratamiento con antioxidantes (ac. Ascórbico, dióxido de azufre, etc.)

1.2 Competencias Determinar el efecto del calor, pH, de la adición de diferentes compuestos en la reacción de Pardeamiento. 1.3 Materiales y equipos 

Muestras: manzana, papa, yacón



15 placas petri



Equipo de Baño maría



3 tubos de ensayo pyrex



1 pisceta



2 pipeta de 10 ml



3 lunas reloj



3 beaker de 250 ml



1 cocina eléctrica



1 rejilla de asbesto



1 gradilla para tubos de ensayo



1 termómetros



2 fiolas de 100 ml



3 baguetas



1 embudo de vidrio



1 balanza



1 espatula



Licuadora o mortero (para extraer el jugo)



1 pinza de madera



Gasa



Cuchillo



Soluciones de acido cítrico al 0.1, 0.5 y 1 %



Solución de bisulfito de sodio al 0.1, 0.5 y 1%



Zumo de limón



Agua destilada

1.4 Procedimiento 1.4.1. Formación de Pardeamiento enzimático 

De forma rápida pelar 3 manzanas y extraer el zumo (diluido con 100 ml de agua)



De forma rápida filtrar con gasa



Colocar 15 ml de zumo en un Beaker de 100 ml y otros 15 ml en una placa petri



Dejar reposar por 15 minutos y observar cual de las 2 muestras se encuentra con mayor grado de pardeamiento.

1.4.2. Efecto de la temperatura Parte A 

Colocar 5 ml de zumo de manzana en cada uno de los tubos de ensayo: tubos A, B y C.



Tubo A: colocarlo a baño maria a 50º C por 15 minutos



Tubo A: colocarlo a baño maria a 100º C por 15 minutos



Tubo C: mantenerlo a temperatura ambiente



Comparar el grado de pardeamiento en los tubos de ensayo

Parte B 

Colocar al mismo tiempo, 4 trozos de vegetal previamiente pelado (manzana, papa o yacón) en agua hirviendo



Sacar los trozos después de 30, 60, 90 y 120 seg.



Enfriarlos en agua y cortar cada trozo por la mitad



Observar cual es el menor tiempo necesario para inhibir el pardeamiento enzimático de la muestra.

1.4.3. Efecto del pH 

Tomar 5 placas petri y rotule con las letras A,B,C,D y E.



Rápidamente colocar una lamina del vegetal (manzana) previamente pelado en cada una de las placas petri



Cubrir cada una de las placas petri con las siguientes soluciones:

A: solución de ácido cítrico al 1 % B: solución de ácido cítrico al 0.5 % C: solución de ácido cítrico al 0.1 % D: zumo de limón E: agua 

Dejar durante una hora y comparar el Pardeamiento que haya tenido lugar.

1.4.4. Efecto del bisulfito de sodio 

Tomar 4 placas petri y rotule con las letras A, B, C y D.



Rápidamente colocar una lamina del vegetal (manzana) previamente pelado en cada una de las placas petri



Cubrir cada una de las placas petri con las siguientes soluciones: A: solución de bisulfito de sodio al 1 % B: solución de bisulfito de sodio al 0.5 % C: solución de bisulfito de sodio al 0.1 % D: agua



Dejar durante una hora y comparar el pardeamiento que haya tenido lugar.

1.4.5. Tratamiento de los tejidos y su efecto en la reacción de Pardeamiento Parte A 

Cortar la muestra (manzana, papa o yacón) previamente pelado en 4



Dejar una parte en una placa petri



Una cuarta parte del vegetal cortarlas en trozos y colocarlo en una placa petri



Otra cuarta parte desmenuzar y colocarlo en una placa petri



Comparar el Pardeamiento que se produce en las muestras

Parte B 

La cuarta parte dividirla en 2



A una parte dividirla mediante rotura y a otra cortarla usando cuchillo. Colocar sobre placas petri



Observar el color desarrollado y cual pardea más rápidamente

1.5 Resultados Compare el grado de Pardeamiento obtenido en la práctica con alguna fuente bibliográfica.

1.6 Conclusiones Según los resultados obtenidos concluya sobre el efecto de la temperatura, pH, bisulfito y la influencia de los tejidos vegetales sobre el Pardeamiento enzimático en la muestra utilizada.

PRÁCTICA Nº 3: Determinación cuantitativa de proteínas en harinas y en leche

1.1. Marco teórico El gluten es una proteína de los cereales insolubles en agua, que se hidrata dos veces su peso de agua, está compuesto de dos fracciones, una prolamina llamada gliadina y una glutelina llamada glutenina que se separan por precipitación selectiva con etanol y ácido. Las gluteninas son las responsables de las propiedades elásticas y cohesivas de la harina de trigo en el proceso de elaboración del pan. El trigo es el único cereal cuya harina rinde cantidades considerables de gluten y se utiliza esta determinación como índice de calidad de harinas. El gluten húmedo en harinas normales de trigo debe ser igual o mayor a un 25 % y las cifras normales de gluten seco son 9 a 12% en trigo blando y de 11 a 17% en el trigo duro. El límite mínimo admitido es de 5.5%. Por otro lado, la caseína es la principal proteína de la leche, se encuentra dispersa como un gran número de partículas sólidas tan pequeñas que no sedimentan, y permanecen en suspensión. Estas partículas se llaman micelas y la dispersión de las mismas en la leche se llama suspensión coloidal. En estado puro la caseína es de color blanco, sin olor e insípida; puede ser extraída por filtración usando un filtro de porcelana y las partículas de caseína tal como se presentan en la leche pueden ser observadas con un ultra microscopio o por uso de un campo oscuro. La caseína se encuentra en la leche en combinación con el calcio en forma de caseinato de calcio. Este es precipitado por enzimas y alcoholes y por ácidos a un pH de 4.6. Los métodos oficiales del AOAC para determinación de caseína se basan en la precipitación de la caseína y determinación de nitrógeno en el precipitado lavado. La caseína precipita a menor temperatura que otras proteínas.

Un método sencillo y muy empleado en plantas de alimentos es el método Walker, el cual es utilizado para determinar proteínas totales. Este método se basa en el hecho de que las proteínas y sus productos derivados están relacionados con ciertos aminoácidos. Estas sustancias poseen propiedades básicas debido al grupo amino (NH2) y ácidas por el grupo carboxilo (COOH). Las proteínas reaccionan con el formaldehido para formar derivados los cuales no poseen el grupo amino y por ende pierden sus propiedades básicas. Las proteínas tienen reacción neutra a la fenolftaleína pero cuando son tratadas con formaldehido tienen reacción ácida. La naturaleza general del cambio puede ilustrarse de la siguiente manera: La glicilglicina se deriva de dos moléculas de glicina: 2 (NH2.CH2.COOH)

NH2.CH2.CO.NH.CH2.COOH+NH2

Glicina

Glicilglicina

NH2.CH2.CO.NH.CH2.COOH+NH2 + 2(HCHO) Glicilglicina

2(CH2N.CH2.COOH) + H2O

formaldehido

ácido

1.2. Competencias Conocer los procedimientos a seguir para la determinación cuantitativa de proteínas en leche (caseína) y harina de trigo (gluten).

1.3. Materiales y equipos 1.3.1. Materiales, equipos e instrumentos 

1 equipo de titulación



Erlenmeyer de 250 ml (1)



Pipeta de 10 ml (1)



Propipeta



Luna de reloj (2)



Beaker de 250 ml (2)



Bagueta



Estufa



Balanza



Espátula



Solución de yodo en yoduro de potasio 0.001 N



Solución de fenolftaleína al 1%



Solución de hidróxido de sodio 0.1 N



Solución de formaldehido neutro al 40%



Agua destilada

1.4. Procedimiento 1.4.1. Determinación de gluten en harinas de trigo por método de lavado 

Pesar 100 g de harina. Anote el peso de la muestra (Pm), mezclarla con 55 ml de agua potable en un beaker hasta obtener una masa homogénea, tape y deje reposar durante 20 minutos.



Coloque la masa en la palma de la mano izquierda y amasarla bajo el goteo continuo del agua hasta que se arrastre todo el almidón, evitando que el agua arrastre porciones de la masa.



Para comprobar la presencia de almidón, coloque en una luna de reloj unas gotas de la solución de yodo 0.001 N. La aparición del precipitado oscuro indica la presencia de almidón.



Al terminar los lavados prense la masa entre las manos bien secas, repetidas veces hasta obtener un cuerpo muy adherente, pese sobre una luna de reloj tarada para obtener el gluten húmedo. Peso del gluten húmedo (P1).



Para obtener el gluten seco, coloque el gluten húmedo sobre un vidrio de reloj tarado y lleve a la estufa a 105ºC por una hora.



Retire de la estufa y con una navaja o guillette bien afilado haga unos cortes longitudinales y lleve nuevamente a la estufa a 140ºC de 1 a 2 horas hasta peso constante para obtener el peso del gluten seco (P2). Cálculos:

1.4.2. Determinación de caseína en leche 

Pipetear 9 ml de leche en un matraz de 250 ml y adicionar 1 ml de solución de fenolftaleína al 1%.



Titular con la solución de hidróxido de sodio hasta obtener un color rosado profundo homogéneo.



Adicionar 2 ml de formaldehido neutro al 40% al matraz y el color se tornara blanco nuevamente.



Anotar la lectura de la bureta, adicione el álcali nuevamente hasta obtener nuevamente un color rosado homogéneo. Anotar el volumen en ml de álcali requeridos para virar el color de la muestra a rosado. Cálculo:

Cada mililitro de solución de hidróxido de sodio 0.1 N es igual a 1.63 % de caseína de leche, entonces el volumen gastado en la titulación después de la adición de formaldehido multiplicado por 1.63 nos reportara el porcentaje de caseína en la leche.

1.5 Resultados Compare los resultados obtenidos en el laboratorio con los datos teóricos de referencias bibliográficas.

1.6 Conclusiones Según los resultados obtenidos concluya al respecto sobre el contenido de gluten y de caseína de cada de las muestras evaluadas.

PRÁCTICA Nº 4: Coagulación enzimática de la leche

1.1. Marco teórico Leche es la materia prima principal para la elaboración de quesos es la leche. Una leche de buena calidad asegura la obtención de quesos de buena calidad. Debe asegurarse que la misma cumpla con los siguientes requisitos: Calidad físico-química y microbiológica: como se discutirá más adelante existen factores que afectan la coagulación de la leche que está ligado a

su

composición (cantidad de proteínas soluble, balance salino, pH, etc.) por otro lado la carga microbiana por razones obvias afecta la calidad sanitaria, la inocuidad del queso y la vida útil del mismo. La leche debe estar libre de inhibidores (residuos de detergentes, cloro, antibióticos, etc.) especialmente en la elaboración de quesos con la utilización de cultivos lácticos, lo cual no quiere decir que en aquellos que no se utilicen cultivos iniciadores, pueda permitirse la presencia de residuos químicos. Debe recordarse la influencia sobre la salud pública de dichos residuos. No debe ser almacenada por largos periodos, preferiblemente debe ser fresca. El almacenamiento prolongado de la leche a temperaturas de refrigeración por supuesto, produce cambios en el balance salino y reducción del tamaño de la micela de caseína por un aumento de la cantidad de caseína soluble (β-caseina) y paralelamente aumenta el grado de hidratación de la micela, todo lo cual se traduce en problemas para la coagulación enzimática de la leche. La mayoría de estos efectos pueden corregirse si la leche se mantiene por 30 minutos a una temperatura de 30-36º C antes de la coagulación. Otro efecto y quizás más perjudicial es el crecimiento de bacterias psicrófilas a las cuales en su mayoría tienen la capacidad de producir enzimas lipoliticas y proteolíticas capaces de soportar temperaturas de pasteurización y que alteran los componentes de la leche causando bajas en el rendimiento y alteración de las características organolépticas de los quesos. Enzimas coagulantes: en los quesos elaborados mediante coagulación enzimática o mixta, las enzimas coagulantes constituyen un elemento esencial. Tradicionalmente se utiliza la quimosina o renina, extraída del cuarto estomago

(cuajar) de los becerros lactantes. Pero debido al aumento en la demanda de cuajos se han desarrollado técnicas para la utilización de enzimas provenientes de microorganismos y vegetales. Los cuajos microbianos son elaborados principalmente a partir de cultivos de mohos de la especie rhizomucor. Actualmente se elabora quimosina producida por fermentación con microorganismos modificados genéticamente, con lo cual se obtiene una enzima bastante similar a la quimosina de origen animal; el extracto comercial contiene quimosina 100% a diferencia del producido por maceración del estomago el cual puede contener 90-95% de quimosina y 1015% de pepsina. Fuerza del cuajo: antes de utilizar cualquier enzima coagulante debe conocerse su fuerza lo cual permite utilizar las dosis necesarias sin caer en los errores que conlleva emplear dosis bajas o muy altas a las necesarias. La fuerza del cuajo se define como la cantidad de leche en mililitros, que cuaja a 35ºC en 40 minutos, cuando se le adiciona un gramo o mililitro de cuajo. El cloruro de calcio se utiliza para corregir problemas de coagulación que se presenta en la leche almacenada por largo tiempo en refrigeración y en leche pasteurizada. Su uso permite disminuir las pérdidas de rendimiento en estos casos y permite obtener una cuajada más firme a la vez que permite acortar el tiempo de coagulación. La dosis máxima a utilizar e del 0.02% (1 g por cada 5 litros de leche). Una dosis excesiva conduce a una cuajada dura y quebradiza y con sabor amargo. La sal se adiciona con el objetivo principal de darle sabor al queso, aunque además sirve para alargar la vida útil de los mismos al frenar el crecimiento microbiano al disminuir la actividad de agua. El porcentaje ideal depende del tipo de queso y del gusto del consumidor aunque se puede decir que puede estar entre el 2 – 3%.

1.2. Competencias Evaluar la coagulación enzimática de la leche fresca y determinar la fuerza del cuajo.

1.3. Materiales y equipos 1.3.1. Materiales, equipos e instrumentos 

4 Beaker (250 y 500 ml)



1 Probeta de 100 ml



1 Bagueta



1 Balanza



1 equipo de baño maría



1 pastilla de cuajo Marshall



Cocinilla eléctrica



Sal yodada



Tubos de ensayo (9)



2 pipetas (5 y 10 ml)



2 propipetas



1 cucharita espátula



1 luna reloj



1 fiola de 100 ml

1.4. Procedimiento 1.4.1

Efecto de la temperatura sobre una reacción catalizada por una enzima a) Poner 10 ml de leche cruda o pasteurizada dentro de una serie de 6 tubos de ensayo grandes. Etiquetarlos del 1 al 6. Colocar el tubo 1 en baño maría a 30º C x 5 minutos hasta que alcance los 30ºC,

añadir 0.5 ml de cuajo y homogenizar. Determinar el tiempo que se necesita para la coagulación. b) Repetir el mismo procedimiento a 40, 50, 60, 70 y 80ºC.

1.4.2

Efecto en la reacción del tratamiento previo de la leche por el calor a) Etiquetar 3 tubos de ensayo del 1 al 3 de llenarlos de la siguiente forma: 1

10 ml de leche cruda

2

10 ml de leche pasteurizada

3

10 ml de leche hervida y enfriada

b) Poner los 3 tubos en baño maría a 35ºC hasta que la leche alcance esta temperatura, agregar 0.5 ml de cuajo y anotar el tiempo de coagulación.

1.4.3

Producción de queso a)

Preparar una solución de cuajo a partir del cuajo en pastilla y llevarlo a una fiola de 100 ml y adicionarle 0.1 g de sal.

b)

En un Beaker Calentar 100 ml de leche fresca en baño maría a 37ºC, agregar 5 ml de cuajo

c)

Repetir la misma operación anterior en leche pasteurizada o esterilizada.

d)

Esperar unos 10 minutos y evaluar la cuajada formada mediante un corte cruz.

e)

Corte en cubito y agregar agua caliente para optimizar la cuajada

f)

Evaluar la firmeza de la cuajada en las muestras.

1.5 Resultados Compare los resultados obtenidos, y elabore un cuadro con ellos.

1.6 Conclusiones Según los resultados obtenidos concluya al respecto sobre la fuerza del cuajo y la importancia del tipo de leche en la coagulación enzimática.