Guia de Laboratorio Aislamiento e Identificacion de Clostridium SPP

 

   Aislamiento e identificacion de Clostridium Clostridium spp  spp presente en suelos Isolation and identification of  Clostridium spp  Clostridium spp present in soils

Rosa Daniela Arnache Galvis Leide Vanessa González Rueda Katiuska Valentina Mejia Torres Kattia Marcela Montes Moreno Elia Maria Yance Guerrero

Universidad Popular del Cesar Facultad de ciencias de la salud Valledupar Cesar 2019

 

Objetivo General  

Determinar la prese presencia ncia de espe especies cies de bacterias anaerobias presentes presentes en el suelo.

Objetivos específicos  

implementar la toma de muestras para el posterior aislamiento de microorganismos.   Aislar e identificar bioquímicamente las especies de Clostridium Clostridium   spp utilizados para biorremediación de suelos.   Interpretar el resultado de las diferentes pruebas realizadas basándonos en bibliografías existentes.   implementar la toma de muestras para el posterior aislamiento de microorganismos.

INTRODUCCIÓN Las bacterias anaerobias se clasifican en tres categorías dependiendo de la capacidad que estas poseen para tolerar el oxígeno; anaerobios estrictos, facultativos y aerotolerantes. Dentro de los anaerobios estrictos se encuentran aquellas bacterias que no tienen la capacidad de crecer en presencia de oxígeno; los aerotolerantes no utilizan el oxígeno en sus proces procesos os biológ biológicos, icos, pero pueden vivir en entornos aerobios y se encuentran también los anaerobios facultativos, los cuales utilizan el oxígeno para vivir y cuando este no está presente utilizan procesos fermentativos. Estas bacterias se pueden encontrar en el ser humano en condiciones normales formando parte de la flora intestinal, y fuera de este en lugares como; suelos, agua, comida y animales. Entre estas bacterias existen algunas que tienen gran importancia a nivel de suelos, ya que participan en ciclos biogeoquímicos tales como el ciclo de nitrógeno y el ciclo del azufre, a su vez tienen participación en procesos de biorremediación; como es el caso de ciertas especies de Clostridium. Para el conocimiento, identificación y estudio de estos microorganismos es importante el aislamiento y utilización de pruebas bioquímicas que nos faciliten reconocer sus características morfológicas y metabólicas.

MARCO TEÓRICO La presencia de una atmosfera terrestre rica en oxigeno permitió a los seres vivos evolucionar desarrollando un metabolismo aerobico, las bacterias anaerobias precedieron a las aerobicas. El reconocimiento de la naturaleza aerobia de determinados microorganismos se acredita a Pasteur, el cual en 1863 observo que la facultad de moverse de ciertas bacterias desaparecía con la exposición al aire. El conocimiento de las bacterias anaerobias es reciente ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio, se necesitaban hasta los años 60 equipos costosos y técnicas bacteriologías muy complicadas. A partir de la introducción de sistemas simples para producir anaerobiosis con quipos y reactivos de bajo costo el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente.

 

 Agar sangre Medio utilizado para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adición de sangre, es útil para microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, así como para la observación de reacciones de hemólisis. La peptona y el almidón otorgan al medio un alto valor nutritivo que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos incluso aquellos que son muy exigentes. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. La adición de sangre de cordero, en una concentración de 5% a 10 %, aporta nutrientes esenciales para el crecimiento bacteriano; además, permite la observación de hemólisis.  Agar brain heart infusion (BHI) Brain Heart Infusion (B.H.I), Infusión Cerebro Corazón, es un medio líquido , de enriquecimiento indicado su uso para el cultivo de una gran variedad de microorganismos exigentes nutricionalmente , tanto aerobios como anaeróbios, así como de hongos y levaduras, tanto de muestras clínicas como no clínicas. El caldo BHI es un medio de cultivo nutritivo tamponado, que contiene infusiones de tejidos de cerebro y corazón además de peptonas, que suministran proteínas y otros nutrientes necesarios para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes y no exigentes. Tinción de verde malaquita: La tinción mediante Verde de Malaquita permite detectar la presencia de microorganismos con esporas. La localización de las esporas, así como la proporción entre esporas y células vegetativas proporciona información acerca del microorganismo en estudio. La gruesa pared externa de queratina de la espora es resistente al calor y a la tinción t inción con diversos colorantes. Para forzar la tinción con el Verde de Malaquita se utiliza calor. Una vez el colorante ha penetrado en el interior de la espora, se retira r etira la preparación de la fuente de calor y se elimina el colorante de las células vegetativas por un simple lavado con agua. La espora retiene el colorante y queda teñida de color verde. Como colorante de contraste, para la tinción de las células vegetativas, se utiliza Safranina. Jarra de anaerobiosis: Consiste en un recipiente de cierre totalmente hermético en el cual se trata de conseguir una atmosfera anaerobia. Tiene unos tubos en donde se conectan a una máquina que succiona el aire. La tapa tiene un catalizador para facilitar el proceso.

MATERIALES Y REACTIVOS: Cámara de anaerobiosis  Agar reinforced

 

 Agar sangre al 5% Cajas de Petri Tinción de verde malaquita (verde malaquita al 5%, safranina) Mortero Vortex Etanol Solucion salina al 0,7 %  Agar brain heart infusión (BHI) Caldo tioglicolato Tinción de Gram (safranina, cristal violeta, lugol, alcohol cetona). Mechero  Asas bacteriológicas Portaobjeto Microscopio Pruebas API  Agua peptonada esteril esteril Tubos de ensayo

PROCEDIMIENTO Toma de muestras -

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Se toman 20 muestras de forma aleatoria de la parte superficial del suelo a unos 10cm de profundidad. Tomar 15 15g g de las muestras de s suelos uelos y colocarlas en c cajas ajas de Petri para deshidratar a 37 ºc, luego homogenizar y macerar con ayuda de un mortero, posteriormente extraer un gramo y colocarlo en una solución de etanol por 30 minutos a 37ºc. Después de es este te tiemp tiempo, o, suspe suspender nder el gramo de suelo en 9 9ml ml de solución salina al 0,7% calentándolo al baño de maría a 80ºc por 10 minutos. Agitar la muestra obtenida con ayuda de un vortex. Extraer 0,1ml y sembrarlo sembrarlo por d duplicado uplicado en caldo de tioglicola tioglicolato to e incubarlas en cámaras de anaerobiosis por 48 horas a 37ºc. Luego de la incubación se to toma ma un mililitro del tubo más turbio e inocularlo por duplicado en caldo BHI e incubar nuevamente por 48horas a 37ºc en condiciones anoxigenicas.

Aislamiento de cepas

 

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Se toman 0,1ml de cada muestra e en n BH BHII y se realiz realiza a una siembra masiva en superficie en agar sangre al 5% por duplicado e incubar por 72 horas a 37ºc en anaerobiosis. Después de es este te laps lapso o de tiempo ev evaluar aluar la hemolisis producida en el medio, posteriormente realizar coloraciones de Gram y verde malaquita para identificar el crecimiento de bacilos Gram positivos esporulados, que se caracterizaron por ser colonias β hemolíticas en el medio.

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Luego s sembrar embrar po porr estría en agar sangre a all 5%, e incu incubar bar las cajas en cámaras de anaerobiosis.

Caracterización bioquímica -

Realizar identificación bioquímica mediante kits comerciales de tipificación microbiológica (API), a continuación realizar una suspensión concentrada en medio liquido correspondiente al patrón de McFarland (9x108mol/mL).

Concentración microbiana en las muestras -

Disolver 10g de muestra de suelo en solución salina. Realizar cuatro diluciones seriadas en base 10, esto se realiza agregando 1mL de la dilución anterior en 9mL d de e solución salin salina a estéril. Sembrar 0,1mL de cada dilución en agar reinforced por duplicado. Homogenizar e incubar por 48horas 48horas a 37 ºc en condiciones de anaerobiosis, transcurrido este tiempo observar en que cajas hubo crecimiento microbiano.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Venegas, C. P. P., & Vanegas, G. C. (2010). Dinámica de suelos amazónicos  procesos de degradación y alternativas para su recuperación recuperación.. Instituto  Amazónico de Investigaciones Investigaciones Científicas" SINCHI". SINCHI". Sagardoy, M. A., & Mandolesi, M. E. (2004). Biología del suelo: Guía de estudio (No. estudio  (No. 631.46). Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (1997). Brock biology of microorganisms (Vol. microorganisms  (Vol. 11). Upper Saddle River, NJ: Prentice hall. Koneman, E. W., & Allen, S. (2008). Koneman. Diagnostico Microbiologico/Microbiological diagnosis: diagnosis: Texto Y Atlas En Color/Text and Color Atlas. Atlas. Ed. Médica Panamericana. Prats, G. (2006). Microbiología clínica. clínica. Ed. Médica Panamericana.