Guia 2021 Inmunología

 

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Inmunología Básica

INTRODUCCION La Inmuno Inmunolo logi gia a

ha cobrad cobrado o un rol mu muyy im impo port rtan ante te en el campo campo cien cientí tífifico co,, es una

disciplina que estudia los procesos de defensa en los organismos vivos ,  el alumno de In Inge geni nier eria ia Bi Biot otec ecno nolo logi gica ca debe debe ser ser capa capazz de co cono noce cerr el sist sistem ema a in inmu mune ne y su funcionamie funci onamiento, nto, entender lños proce procesos sos biologicos involucr involucrados, ados, tener detal detalle le de las funciones de este sistema, y por tanto aspirar al descubrimiento de potenciales farmacos u otras estrategias, En la actualidad su importancia al estudiarla radica en el aporte investigativo, como paguiandose de la Biologia Molecular y la Ingenioeria Genetica.

Una de las preocupaciones fundamentales de la Inmunologia actual es no solo establecer  los pri princi ncipio pioss bas basico icoss de los mec mecani anismo smoss de ree reespu spuest esta a inm inmuni unitar tarioa ioa,, sin sino o tam tambie bien n investigar la aplicación de dichos principios a nuestra comprension de la enfermedad y al desarrollo de nuevas terapias, es de suma importancia acuñar el termino Inmunologia Molecular, ya que no basta al estudiante conocer las respuestas a nivel celular, sino llevar  ampliar el conocimiento y relacionar los procesos inmunitarios hacia los acidos nucleicos y proteinas, ejes fundamentales de muestros procesos biologicos.

La presente guía de práctica, está orientada a formar las bases celulares y moleculares necesarias para el estudiante de Ingenieria Biotecnologica, en el cual podrá conocer las técnic téc nicas as Inm Inmuno unoser serolo ologic gicas, as, asi com como o tam tambie bien n Tec Tecnic nicas as Mol Molecu ecular lares es apl aplica icadas das a la Inmuno Inm unolog logia ia com como o los son Wes Wester tern n Blo Blot, t, Inm Inmuno unoflu fluore oresce scenci ncia, a, Citome Citometri tria a de Flu Flujo, jo, Cultltiv Cu ivos os Ce Celu lula lare ress los los cual cuales es ayud ayudar aran an en su fo form rmac ació ión n pr prof ofes esio iona nal,l, asi asi co como mo su formacion con vision cientif cientifica ica y futuros estudios de Post – Grado.

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PRACTICA Nº 1 SUERO Y PLASMA SANGUÍNEO I.

OBJETIVOS  

II.

 Aislar suero y plasma sanguíneo. Estudiar las características del suero y plasma.

INTRODUCCIÓN El uso de la sangre como un recurso terapéutico se remonta a los primeros albores de la civilización, desde cuando era manejado, mas como componente mítico y mágico, que como un real elemento científico y terapéutico. Hoy en día el uso clínico de la sangre y sus derivad derivados os ha camb cambiado iado de form forma a si sig gnifi nificcat ativ iva a , ya que que con la ap apa arici rición ón de al alg gun unas as en enffermed rmedad ades es serotransmisibles (hepatitis b, c, e , HIV, malaria , chagas)de enfermedades por sensibilización ( anemias hemolíticas , reacción injerto contra el huesped, etc) el uso de este recurso requiere de un profundo conocimiento y de una responsab respon sabili ilidad dad pro profes fesion ional, al, que hac hace e nec necesa esario rio que tod todas as las per person sonas as involucrada invol ucradass en el área de la salud tengam tengamos os un claro conoci conocimiento miento de todas las propiedades y de todo los riesgos potenciales de esta práctica . La sangre es un tejid tejido o muy sui generi generis, s, ya que se encuentr encuentra a en fase líqui líquida da y posee pos ee eno enorme rme act activi ividad dad met metabó abólic lica a e inm inmuno unológ lógica ica.. Es una suspen suspensió sión n heterogénea de varios elementos formes (leucocitos, eritrocitos, plaquetas) en un medio acuoso rico en múltiples proteínas , enzimas. electrolitos , lípidos, etc. etc.(a (alb lbúm úmin ina, a, glob globul ulin inas as,, fa fact ctor ores es de coag coagul ulac ació ión) n).. La Lass an ante teri rior ores es características le imprimen un carácter dinámico a este elemento y por lo tanto hay que tener en mente esto cuando hagamos uso de el. El plasma es el medio acuoso de la sangre, desde un punto de vista técnico, el plasma puede obtenerse en varias formas, dependiendo de las necesidades, del método utilizado, de la disposición tecnológica o de la necesidad de su ulteri ult erior or fra fracci cciona onamie miento nto.. El med medio io más cor corrie riente nte par para a la obtenc obtención ión es la cent centri rifu fuga gacción ión de una una sangr angre e que que ha sid ido o ex extr traí aída da con el us uso o de antico ant icoagu agulan lantes tes (ci (citra tratoto-dex dextro trosa sa o ACD ACD,, citrat citrato-f o-fosf osfato ato–de –dextr xtrosa osa o CPD CPD,, Citrato-fosfato-dextrosa-adenina o CPDA-1 ,heparina, EDTA) El suero viene a ser el líquido sobrenadante cuando la sangre coagulada es llevada a centrifugación.  Ambos, el suero y el plasma se deben conversar en condiciones de esterilida esterilidad. d.

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MATERIAL Equipo para la extracción de sangre Centrifuga Tubos de centrifugación estéril Jeringa estéril y seca Pipetas pasteur 

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IV.

Chupetes Una pinza Frasco estéril de 10ml con tapa hermética a prueba de aire Un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO Obtención de suero 1. Extra Extraiga iga 10 ml de sangr sangre e de ssangre angre de una vena del b brazo razo 2. Saque la ag aguja uja de la jer jeringa. inga. De Deposit posite e la sangr sangre e en el tubo pa para ra centrifugac centrifugación, ión, tape este inmediatamente. 3. Deje que la sangre se ccoagule oagule a la temper temperatura atura ambiente. ambiente. 4. De Desp spué uéss de un lap lapso so de 30 mi minu nuto toss a 2 ho horas ras,, pero no más más,, cent centri rifu fugu gue e la sangre a la alta velocidad durante 10 minutos. Si no dispone de una centrifuga, la sangre se puede dejar varias horas en el frigorífi frigorífico, co, el coagul coagulo o se separará del suero. 5. Dest Destape ape el tubo. Aspir Aspire e el ssuero uero ccon on una pipet pipeta a Pas Pasteur. teur. 6. Depos Deposite ite el su suero ero en el ffrasco rasco es estéril téril de 10 ml. Co Coloque loque in inmedia mediatament tamente e la tapa rosca en el frasco. Si las muestras son pequeñas , se puede utilizar tubos eppendorf. Para efectuar algunos ensayos serológicos, se puede añadir un antiséptico preservativo a la muestra (por ejemplo el timerosal). Cumpla las instrucciones del laboratorio de referencia. La mayor parte de los sueros que se emplean en ensayos serológicos se puede pue de con conser servar var en el com compar partim timien iento to con congel gelador ador del fri frigor gorífi ífico co a -2°C -2°C o temperaturas inferiores, por lo menos un mes.

Obtención de plasma Elm procedimiento se realizara de la msima forma que la antgerior con la unica excepcion que para extraer plasma se debe recuerdar que la sangre debe ser  extraída con anticoagulante.

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RESULTADOS Rotule correc Rotule correctame tamente nte los tubos correspo correspondien ndientes tes al suero y plasm plasma a sanguí sanguíneo neo obten obtenido ido en la práctica. Describa las características de la sangre, suero y plasma obtenidos.

CUESTIONARIO 1. Cua Cuall es la di difer ferenc encia ia ent entre re el ssuer uero o y el pla plasma sma.. 2. Com Coment ente e sobre el vo volum lumen en norm normal al de sang sangre re que deb debe e tener un una a mujer ad adult ulto oy un varón adulto. 3. Desc Describa riba la lass carac caracterís terísticas ticas de los fa factore ctoress prese presentes ntes en el plasma. plasma. 4. Po Porq rque ue se ut utililiz iza a suer suero o de bo bovi vino no fe feta tall en lo loss me medi dios os de cu cultltiv ivo o de célu célula lass animales a una concentración de10-15%.

PRACTICA Nº 2

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RECUENTO LEUCOCITARIO Y HEMOGRAMA I.

INTRODUCCIÓN

Los glóbulos blancos también denominados leucocitos, son los encargados de la defens def ensa a del org organi anismo smo fre frente nte a inf infecc eccion iones. es. Los leu leucoc cocito itoss (mo (monon nonucl uclead eados os o poli polinu nucl clea eado dos) s),, a dife difere renc ncia ia de los los erit eritro roci cito tos, s, no co cont ntie iene nen n pi pigm gmen ento toss y so son n verdaderas verdad eras células con núcle núcleo, o, mitoc mitocondria ondria y organ organoides, oides, cabe recalcar que solo un pequeño porcentaje de leucocitos se encuentra circulando en el torrente sanguíneo, la mayor cantidad se encuentra en la medula ósea, tejidos y órganos, donde cumplen funciones especiales. El recuento leucocitario es una prueba que nos permite determinar el número de glóbulos blancos por milímetro cúbico de sangre. Se encuentran normalmente entre 5000 y 9000 leucocitos por mm3 de sangre. Estas cifras varían con la edad y con el momento que se toma la muestra. El aume aument nto o del del núme número ro de le leuc ucoc ocititos os circ circul ulan ante tess se llam llama a leucocitosis, se observa en el curso de algunas infecciones bacterianas piógenas.

Valor Va lores es elev elevad ados: os:

Valores reducido reducidos s: La

disminución del número total de leucocitos circulantes se

denomi den omina na leu leucop copeni enia. a. Se obs observ erva a en alg alguna unass inf infecc eccion iones es com como o la tif tifoid oidea ea y el paludismo.

II.

RECUENTO DE LEUCOCITOS

La concentración de leucocitos es el número de ellos que se encuentran en un litro de sangre, se expresa como el número de leucocitos por milímetro cúbico. El recuento celular tiene como objetivo determinar el número, de cada una de las células que es está tán n comp compre rend ndid idas as en un una a unid unidad ad de volu volume men n de me medi dio o en el qu que e es está tán n suspendidas. La cámara de neubauer es la más usada para realizar el recuento celular de forma manual. Consiste en una placa gruesa de cristal, cuya porción central está dividida en 3 ejes perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. Los dos ejes laterales se hallan más elevados con respecto al eje central. La banda central esta subdividida en 2 semi bandas idénticas separadas un surco paralelo al el ejerecuento longitudinal de la cámara y en cada una hayygrabada unapor cuadricula que facilitará celular.

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HEMOGRAMA

Hemograma, Hemog rama, es el recue recuento nto diferenci diferencial al o porcen porcentual tual de los leucoci leucocitos, tos, que indic indican an el número de cada tipo celular por mm3  y se realiza examinando un frotis de sangre coloreado. Se cuentan 100 leucocitos y se anota el número que se ha encontrado de cada tipo de ellos. La proporción de cada tipo de leucocitos se expresa como una fracción decimal.  ALGUNOS DATOS GEN GENERALES  ERALES  

No todos los leucocitos (glóbulos blancos) que circulan en la sangre son idénticos.



Hay cinco tipos principales que se diferencian por el tamaño, la forma del núcleo y el color de los gránulos del citoplasma.



La proporciónEsta o porcentaje tipo deseleucocitos esFórmula importante para el diagnóstico. proporcióndeo cada porcentaje denomina: leucocitaria.



Para trabajar esta fórmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el número que se ha encontrado de cada tipo de ellos.



Los valores normales de los distintos leucocitos en su proporción relativa (Fórmula leucocitaria porcentual) y en cifras absolutas por mm3, son: 6

 

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Cuando las células anotadas a la izquierda del recuadro se encuentran por encima de los porcentajes considerados normales, se dice que hay una desviación a la izquie izq uierda rda (infec (infecció ción n agu aguda) da).. En oca ocasio siones nes pue puede de reg regist istrar rarse se un aument aumento o del porcentaje de las células anotadas a la derecha, (linfocitos y monocitos) y se dice que el hemograma muestra una desviación a la derecha. El aumento de un determinado tipo de células tiene que repercutir en la disminución de las otras, para que la suma total sea 100%

a. Ex Exam amen en d de e la e ext xten ensi sión ón

l. Examinar la extensión de sangre coloreada con el objetivo de 40x para comprobar si los elementos celulares están bien distribuídos y la tinción es adecuada.

2. Verificar que los glóbulos blancos se encuentran uniformemente distribuidos en la extensión: si está  mal distribuida es posible que los 7

 

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neutrófilos se hallen agrupados.

3. Verificar que la extensión no sea  demasiado gruesa.   4. Si la lámi lámina na coloreada, está en buenas condiciones, colocar una gota de aceite   de inmersión b. Rec Recue uento nto de le leuco ucocit citos os

l. Iniciar el recuento en la última porción de la extensión, es decir, donde se observe que los eritrocitos comienzan a agruparse y sobreponerse. 2. Examinar una porción rectangular de la extensión mediante un movimiento ordenado, de un campo a otro, como se indica en la figura. 3. Tomar nota del tipo de leucocito que se observe en cada campo.  

4. Contar un total de 100 leucocitos.

IV IV..

PR PROC OCED EDIM IMIE IENT NTO O RE RECU CUEN ENTO TO DE LE LEUC UCOC OCIT ITOS OS 1. Con la mic microp ropipe ipeta ta de 1000 μl ml trasl traslade ade 950 μl del líq líquid uido o para dilu dilució ción n de leucocitos (turk) a un tubo eppendorf. 2. Aspire 50gre μ μll de venosa a (ant (anticogul icogulada) o capil capilar. ar. etamente 3. Aspir Si la esan sangre es sangre ven venosa osavenos ase asegúrese gúrese q que ue seada) mezc mezcle le compl completamen te invi invirtien rtiendo do el frasco que contiene esta sangre y el anticoagulante varias veces durante 1 min. Inmediatamente antes de aspirarla con la micropipeta. 4. De Depo posi site te la sang sangre re en el fr fras asco co que que cont contie iene ne el líqu líquid ido o pa para ra la di dilu luci ción ón.. Enjuague la pipeta aspirando y expulsando este líquido tres veces. La dilución de esta sangre será de 1: 20. 5. Mo Mont nte e la lami lamini nilllla a de vidr vidrio io en la cáma cámara ra de Neub Neubau auer er,, pr pres esio ioná nánd ndol ola a cuidadosamente para colocarla en su sitio 6. Mez Mezcle cle bie bien n lla a ssang angre re d dilu iluida ida.. 7. Por m medio edio d de e una pipeta llene la cá cámara mara de Ne Neubauer ubauer . 8. De Deje je repo reposa sarr la cáma cámara ra para recu recuen ento to sob sobre re la me mesa sa de tr trab abaj ajo o dura durant nte e 3 minutos a fin de que las células de asienten. 8

 

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9. Co Colo loqu que e la cáma cámara ra en la plat platin ina a de dell mi micr cros osco copi pio. o. Ut Utililic ice e el obje objetitivo vo x 10, 10, reduzca la cantidad de luz que entre en el condensador, ajustando el diagrama iris, enfoque la cuadricula de la cámara y los leucocitos.

V.

PROCEDIMIENTO HEMOGRAMA 1. 2. 3. 4. 5.

Hac Hacer er un frotis sanguí guíneo Col Colore orear ar fro co con ntislasan ttinc inción iónneo. d de e. Wr Wrigh ight. t. Llev Llevar ar a all mi micr cros osco copi pio. o. Inici Inicie e el rec recuento uento e en n la úl última tima porció porción n de la exten extensión. sión. Exami Examine ne una po porción rción re rectang ctangular ular de lla a exten extensión sión me mediant diante e un movi movimient miento o ordenado, de un campo al siguiente. 6. Tome no nota ta del titipo po le leu leucocit cocitos os que se o observ bserve e en cada ccampo. ampo. C Cuente uente un total de 100 leucocitos. 7. Vigil Vigile e que la ex extensi tensión ón no sea d demasi emasiado ado grue gruesa, sa, si observ observa a que la ex extensi tensión ón es cada vez más gruesa (los eritrocitos se encuentran muy agrupados), detenga el movimiento hacia el extremo donde comienza la extensión y retroceda hacia la última porción. VI.

RESULTADOS 

Grafique las vistas observadas a 40X y 100X, indique el nombre de las celulas encontradas y sus caracteristicas.

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RESULTADOS ANORMALES EN UN HEMOGRAMA NEUTROFILIA 

Es el aumento de la proporción de neutrófilos (más de 7 000) en sus formas inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos). 10

 

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LEUCOCITOSIS 

Es el aumento de la cifra total de los leucocitos con cifras superiores a 10 000 o 12 000. Se presenta en infecciones agudas graves.

DESVIACIÓN A LA IZQUIERDA 

Es el aumento de la proporción de neutrófilos en sus formas inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos). Se presenta en infecciones agudas graves.

EOSINOFILIA 

Es el aumento de la proporción de eosinófilos (más de 400). Ocurre en casos de parasitosis, asma o alergias.

LINFOCITOSIS  Es el aumento de la proporción de linfocitos (más de 3 000). Ocurre en casos de infecciones virales (sarampión, etc.) y en ciertas infecciones crónicas(tuberculosis, etc.). MONOCITOSIS 

Es el aumento de la proporción de monocitos (más de 800). Se puede observar en casos de infecciones bacterianas.

NEUTROPENIA 

  Es la disminución del número de neutrófilos. Puede ocurrir en enfermedades infecciosas graves.

VALORES NORMALES NORMALES DE LEUCOC LEUCOCITOS ITOS POR GRUPO D DE E EDAD

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PREDOMINIO DE LINFOCITOS 

En lactantes y niños menores de 10 años.

PREDOMINIO DE NEUTRÓFILOS 

En adultos, niños mayores de 10 años y recién nacidos.

NOTA: EN

UN EXAMEN DE LOS LEUCOCITOS

a. Se d debe ebe dif difere erenci nciar ar y tom tomar ar n nota ota 

Forma y tamaño de los leucocitos en comparación con los glóbulos rojos

(R).

Forma y tamaño del núcleo en relación con el área total de la célula de los diferentes leucocitos:



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Del los

citoplasma de diferentes leucocitos:

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

Las vacuolas y nucléolos constituyen áreas ovales o redondas, que no se tiñen o lo hacen débilmente.  – Las vacuolas (V) se encuentran en el citoplasma.  – Los nucléolos (N) se encuentran en el núcleo.



EJEMPLO Los neutrófilos polimorfonucleares (P) tienen un núcleo con varios lóbulos y gránulos en el citoplasma (de allí que también se les llama granulocitos). Lo Loss linf linfoc ocititos os (L) (L) y los los mo mono noci cito toss (M (M)) titien enen en un núcl núcleo eo co comp mpac acto to y citoplasma con gránulos o sin ellos.

CUESTIONARIO Y ACTIVIDADES I. Cuestionario 1. Hag Haga a una cclas lasifi ificac cación ión de lleuc eucoci ocitos tos 2. Dibuj Dibuje e la est estructu ructura ra de un leuco leucocito cito y rotul rotule e sus p partes artes 3. G rafi rafiqu que e los Gran Granul uloc ocit itos os y Ag Agra ranu nulo loci cito toss y ex expl pliiqu que e br brev eve ement mente e sus características 14

 

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4. 5. 6. 7. 8.

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Comen Comente te sob sobre re una patol patología ogía ca causada usada por aum aumento ento d de e leucocito leucocitoss Comen Comente te sobr sobre e una pa patologí tología a causa causada da por di disminu sminución ción de lleucoc eucocitos itos Reali Realice ce la car caracteri acterizació zación n de cada un una a de las ccélula élulass observ observadas. adas. Elabo Elabore re una tab tabla la de los valore valoress norma normales les de un hemogr hemograma ama por grupos grupos de de edad. Def Defina ina los sig siguie uiente ntess té térmi rminos nos.. NEUTROFILIA: EOSINOFILIA: LINFOCITOSIS: MONOCITOSIS: NEUTROPENIA:

II. II. Ac Acti tivi vida dade des: s: Con Ayuda de la fórm fórmula ula leucocita leucocitaria, ria, halle el numer numero o de leucocito leucocitoss contado en la cámara de Neu Bauer.

 

Cálculo del número de leucocitos en un mm3 de sangre Usar la siguiente fórmula:  3

 

Leucocitos / mm  = leucocitos contados x 10 x 20 4  3 Leucocitos / mm  = leucocitos contados x 50 Notificar el resultado como el número de leucocitos que hay en 1 mm3 de sangre sin diluir. Ejemplo: En los cuatro cuadros se cuentan 188 células. Leucocitos por mm3 = 188 x 50 Resultado que se notifica: 9 400 leucocitos/mm3 de sangre

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FOTOS REFERENCIALES DE UN HEMOGRAMA

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Fig. 1 Eritrocitos.

 

Fig. 3 Cayados.

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Fig. 2 Monocitos

Fig. 4 Neutrófilos.

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Fig. 5 Basófilo.

Fig. 6 Eosinófilo.

Fig. 7 Linfocitos.

Fig. 8 Plaquetas.

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PRACTICA Nº 3 OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA INMUNOLOG INMUNOLOGICO ICO APARTIR DE ORGANOS LINFOIDES

I. INTRODUCCIÓN Las respuestas inmunitarias innata y adaptativa dependen de las actividades de los leucocitos. Estas células se originan en la médula ósea, y muchas también se desarrollan y maduran ahí. Después migran para proteger los tejidos periféricos, algunas de ellas residen dentro de los tejidos, otras circulan en el torrente sanguíneo y en un sistema de vasos especializado llamado sistema linfático, que drena líquido extracelular y células libres desde los tejidos, los transporta transporta por el cuerpo como linfa linfa,, y final finalmente mente se vacía de regreso hacia el sistema vascular sanguíneo. Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran también en grandes números en tejidos linfoides u órganos linfoides, que son agregados organizados de linfocitos en una red de células no linfoides. Los órganos linfoides pueden dividirse a gra grand ndes es ras rasgo goss en linfoides órga órgano nossperiféricos linf linfoi oide dess ocent cesecundarios, ntra rale less o pr prim imar ario ios, s,se do dond nde e se gene ge ran n lo loss linfocitos, y órganos donde mantienen losnera linfocitos vírgenes maduros y se inician respuestas inmunitarias adaptativas. Los órganos linfoides centrales son la médula ósea y el timo, un órgano que se encuentra en la parte alta del tórax. Los órganos linfoides periféricos comprenden los ganglios linfáticos, el bazo, y los tejidos linfoides de la mucosa del intestino, las vías nasales y respir res pirato atoria rias, s, las vía víass uro urogen genita itales les,, y otr otras as muc mucosa osas. s. Los gangli ganglios os linfát linfático icoss est están án inte interc rcon onec ecta tado doss po porr medi medio o de un sist sistem ema a de va vaso soss linf linfát átic icos os,, que que dr dren enan an lílíqu quid ido o extracelular desde los tejidos, a través de los ganglios linfáticos, y de regreso hacia la sangre.

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II.

MATERIALES Y REACTIVOS -

Medio RPMI 1640 20

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Etanol al 70% - Tijeras y fórceps - Placas petri - Jeringas (3ml) -  Agujas 22G1 - Tubos Falcon de 15ml -

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Homogeneizador de tejidos de vidrio Suspensión celular. - Hemocimetro - Pipetas - Pipetas pasteur  - Tubos eppendorf  - Solución de Turk -  Azul de trypan, 0.4%(w/v) en agua agua - PBS - Tubo plástico de 5ml -

III. PROCEDIMIENT PROCEDIMIENTO O A) OBT OBTENC ENCION ION DE C CELU ELULAS LAS MÉDULA ÓSEA 1. Mat Matar ar la ra rata ta po porr dis disloc locaci ación ón ce cervi rvical cal o iinha nhalac lación ión de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba. Empapar la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire. 2. Hac Hacer er un cor corte te tr trans ansver versal sal la largo rgo a tr travé avéss de la pie piell en la par parte te med media ia del ár área ea abdominal. Retirar la piel de las patas traseras. 3. Sep Separar arar las pie pierna rnass del cuerpo al nive nivell de la arti articul culaci ación ón de la cade cadera. ra. Ret Retira irarr la grasa y colocar las piernas en una placa petri con medio. 4. Reti Retirar rar el teji tejido do muscul muscular ar del fémur y la titibia. bia. Sep Separar arar el fém fémur ur y la tibia y cor cortar tar las epífisis en ambos extremos. 5. Iny Inyect ectar ar por los ex extre tremos mos del del hues hueso o 3ml de medio o PBS PBS,, con una jering jeringa a para expulsar la medula ósea 6. Remov Remover er los desec desechos hos gra grandes ndes y los ac acúmulos úmulos celul celulares. ares. 7. La Lava varr la sus suspe pens nsió ión n po porr cent centri rifu fuga gaci ción ón a 30 300x 0xg g po porr 10 min minut utos os a 4 gra grado doss y colocar en el medio al 5% de FS.

TIMO 1. Mat Matar ar la ra rata ta po porr dis disloc locaci ación ón ce cervi rvical cal o iinha nhalac lación ión de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba. Empapar el abdomen la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire. 21

 

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2. Us Usan ando do la titije jera, ra, hac hacer er un una a inci incisi sión ón de desd sde e la re regi gión ón xifo xifoid idea ea hast hasta a la re regi gión ón submandibular y retirar la piel lateralmente. 3. Hace Hacerr una incis incisión ión en el tór tórax ax y separar separar los b bordes ordes de la incis incisión. ión. 4. Usan Usando do el fórce fórceps, ps, cui cuidadosa dadosamente mente ag agarrar arrar los llóbulo óbuloss tímic tímicos os y levá levántelos ntelos.. 5. Pon Poner er el ttimo imo en un una a pla placa ca pe petri tri ccon on me medio dio.. 6. Corta Cortarr el timo en p pequeño equeñoss ttrozos rozos y h haga aga una suspensión suspensión.. 7. Cui Cuidad dadosa osamen mente te tritu triturar rar el tejido tejido en el homog homogene eneiza izador dor de vid vidrio rio,, uti utiliz lizand ando o el embolo de una jeringa de 5 ml 8. Remov Remover er los desec desechos hos g grandes randes y los acúmu acúmulos los ccelula elulares. res. 9. La Lava varr la sus suspe pens nsió ión n po porr cent centri rifu fuga gaci ción ón a 30 300x 0xg g po porr 10 min minut utos os a 4 gra grado doss y colocar en el medio al 5% de FS.

BAZO 1. Mat Matar ar la ra rata ta po porr dis disloc locaci ación ón ce cervi rvical cal o iinha nhalac lación ión de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba Empapar el abdomen la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire. 2. Hac Hacer er una inc incisi isión ón a travé travéss de la piel en la regió región n ingui inguinal nal.. Con los dedos dedos sobre ambos lados del corte, tire tire entre la cabeza y la ccola ola hasta que la pared peritoneal lo el suficientemente expuesta. Empapar cavidad con etanol. 3. este Cor Cortar tar peri periton toneo, eo, lev levant ante e el baz bazo o con loslafórc fórceps eps,, yperitoneal separe separe est este e de los tej tejido idoss adyacentes con la tijera. Colocar el bazo en una placa petri con medio. 4. Corta Cortarr el bazo en pequeñ pequeños os ttrozos rozos y h haga aga una suspensión suspensión.. 5. Cui Cuidad dadosa osamen mente te tritu triturar rar el tejido tejido en el homog homogene eneiza izador dor de vid vidrio rio,, uti utiliz lizand ando o el embolo de una jeringa de 5 ml. 6. Remov Remover er los desec desechos hos g grandes randes y los acúmu acúmulos los ccelula elulares. res. 7. La Lava varr la sus suspe pens nsió ión n po porr cent centri rifu fuga gaci ción ón a 30 300x 0xg g po porr 10 min minut utos os a 4 gra grado doss y colocar en el medio al 5% de FS.

B) CO CONT NTEO EO C CEL ELUL ULAR AR 1. Dil Diluir uir llas as cé célul lulas as en lla a sol soluci ución ón de T Turk urk.. 2. Me Mezc zcla larr comp comple leta tame ment nte e y añad añadir ir 1 gota gota en la cáma cámara ra de Ne Neub ubau auer er us usan ando do la pipeta Pasteur o micropipeta 3. Conta Contarr las célu células las de los cu cuadrant adrantes es de los ex extremo tremoss (1,3,7 (1,3,7 y 9). Incluya Incluya en es este te recuento las células que se observan sobre las líneas de dos lados de cada cuadrado revisado. 4. Conte Conteo o de célul células/ml as/ml=Nume =Numero ro de célul células as (prom (promedio edio cor correspon respondient diente e a un área de 1mm2) x factor de dilución x104.

C) DETERMINACI DETERMINACIÓN ÓN DE LA VIABIL VIABILIDAD IDAD CEL CELULAR ULAR (Exclusió (Exclusión n por azul de Trypan) 1. Me Mezc zcla larr 0. 0.05 05 ml de la sol soluc ució ión n de azu azull de try trypa pan, n, y 0. 0.05 05 ml de la sus suspe pens nsió ión n celular. Dejar incubar 5 minutos. 22

 

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2. Tra Transf nsferi erirr una pequeñ pequeña a canti cantidad dad de la suspe suspensi nsión ón a la cáma cámara ra de Neuba Neubauer uer y contar las células. Las células no viables estarán teñidas de azul.

   

Células viables (%)= Número total de células viables / ml X 100 Número total de células / ml

COMENTARIO 

-

-

El azul de trypan tiene mayor afinidad afinidad por las proteínas del suero que por las proteínas celulares. Si el extendido es muy oscuro, resuspender las células en PBS antes de realizar el conteo. No incubar las células con azul de trypan por más de 15 minutos de lo contrario las células viables empezaran a captar el colorante.

ELIMINACIÓN DE ERITROCITOS DE LA SUSPENSIÓN CELULAR EMPLEANDO EL MÉTODO DEL CLORURO DE AMONIO MATERIALES Y REACTIVOS - Suspensión celular  - Tubo falcon de 15 ml - PBS - Buffer Lisis d de e eritrocitos (NH4C (NH4Cll 0,15M, KHCO3 y EDTA 0,1m 0,1mM) M) PROCEDIMIENTO 1. Mezcl Mezclar ar la su suspens spensión ión ccelular elular con e ell de buffe bufferr Li Lisis sis de Eri Eritroci trocitos tos en un una a proporció proporción n (1/4) 2. Mez Mezcla clarr el ttubo ubo p por or in inver versió sión n 5-6 vvece ecess 3. Incuba Incubarr las mue muestras stras ssobre obre hie hielo, lo, duran durante te 5min (m (mezcla ezclarr el tubo 2-3 ve veces ces durante durante la incubación). 4. Cen Centri trifug fugar ar a 4 4000 000rpm rpm dura durante nte 2 mi min. n. 5. De Desc scar arta tarr el sobr sobren enad adan ante te (c (cui uida dand ndo o de no el elim imin inar ar el pe pellllet et qu que e co cont ntie iene ne lo loss leucocitos). 6. Lavar el pellet con 1mL d de e suero fisio fisiológico lógico y volv volver er centr centrifuga ifugar  r 

NOTA: Si el pellet sigue contaminado con eritrocitos repetir la lisis.

IV. RESULTADOS 1. Esquematice el procedimiento de aislamiento de células inmunológicas a partir de la 2. med medula ula óse ósea, a, tim timo o y bazo bazo 23

 

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3. Haga un esque esquema ma de los órgano órganoss linfoi linfoides des utili utilizados zados en la prac practica tica 4. Haga los cál cálculos culos para det determina erminarr el número de celu celulas las por ml 5. Deter Determine mine el por porcenta centaje je de viabi viabilidad lidad cel celular ular

V. CUESTIONARIO 1. Indique ue cuales sonlalos órgano órganos linfoides es primari primarios os y secundar secundarios ios 2. Indiq Mencione cual es ffunción unción des linfoid los órganos linfoides en la respuesta inmunitaria 3. Cual es la estructura del timo y que importancia titiene ene desde el punto de vista Inmunológico 4. Comente la relación estructura-func estructura-función ión del bazo en la respues respuesta ta inmunológica 5. Expli Explique que el fundam fundamento ento del Mét Método odo de exclus exclusión ión del Azul de Try Trypan pan

PRACTICA N° 4 AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y NEUTROFILO NEUTROFILOS S HUMANOS

24

 

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I.

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OBJETIVOS 

 Aislar linfocitos y neutrófilos humanos utilizando dextrano y una gradiente de densidad con ficoll–hypaque



Cultivar linfocitos y neutrófilos humanos en medio de cultivo RPMI – 1640 o DMEM

II.

INTRODUCCIÓN  La densidad de una célula es la principal característica física que es usada para la purificación y separación de poblaciones celulares por medio de centrifugación isopicnica. La densidad refleja la composición química promedio de una célula mas que que su ta tama maño ño o algu alguna na cara caract cter erís ístitica ca de su su supe perf rfic icie ie.. Lo Loss pr prin inci cipa pale less componentes celulares difieren sustancialmente en sus densidades. Sin embargo, ya que muchas células tienen similares proporciones de estos componentes, el rango de densidad de las células es relativamente estrecho. La separación es conseguida simplemente por centrifugación de una célula con la suficiente fuerza centrífuga centr ífuga y por un periodo de tiempo suficien suficiente te para que alcanc alcance e su densidad isopicnica en la gradiente, que se define como la localización en la gradiente donde la densidad de la la célula es la misma que la densidad de la gradiente.  Este método es simple y rápido y toma ventajas de las diferencias de densidad entre las célul células as mononu mononuclear cleares, es, polim polimorfonu orfonuclear cleares es y otras células encon encontrados trados en la sangre. Primero las células son sedimentadas en dextrano y luego hay una separación diferencial en una gradiente de densidad discontinua de HISTOPAQUE - 1077. En el dextrano los eritrocitos forman roulex y de este modo sedimentan máss rápi má rápida dame ment nte e qu que e los los gr gran anul uloc ocititos os En el fico ficollll–h –hyp ypaq aque ue la lass célu célula lass mononuclear mononu cleares es y plaquet plaquetas as son colect colectadas adas en la parte super superior ior de la capa de, debido a que estas células tiene una baja densidad. En contraste los granulocitos (neutrófilos) tienen

una densidad densidad mayor que el HIST HISTOPAQU OPAQUE E - 1077 y son colecta colectados dos en la parte inferior de la capa HISTOPAQUE - 1077 las plaquetas son separadas de las células mononucleares por subsecuentes pasos de lavados y ccentrifugación. entrifugación. 25

 

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Figura 1.-

III. REACTIVOS Y MATERIALES Materiales -

Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)

-

Centrífuga

-

Micropipetas

-

Tubos eppendofts

-

Hemocitometro

Reactivos 26

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-

HISTOPAQUE - 1077

-

dextrano

-

medio de cultivo RPMI – 1640 o DMEM

-

PBS

-

Sangre con anticoagulante ( EDTA )

Inmunología Básica

-

Azul de trypan - NaCl 1,8 %

IV. PROCEDIMIENT PROCEDIMIENTO O  A. Obtención de la Sangre

 

1. Colectar 20ml de sangre en tubos de vidrio con anticoagulante (EDTA)

 

2. Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.

B. Sedimentación en dextrano

1. Anad Anadir ir 2. 2.55 ml d dee dext dextrano rano al 10% por ccada ada 20 20ml ml de sangr sangree 2. Mez Mezcla clarr suav suaveme emente nte p por or in inver versió sión n 10 vece vecess 3. Dejar sedi sedimenta mentarr dura durante nte ~4 ~400 minu minutos tos en p posici osición ón vertical vertical 4. Recuperar

la

capa

superior

(sobrenadante)

y

colocarla

sobre

el

HISTOPAQUE-1077, La relación HISTOPAQUE -1077/ sobrenadante debe ser  1:2.

C. Preparación de la gradiente de densidad con HISTOPAQUE - 1077 1. Colo Colocar car 5 ml de HISTO HISTOPAQU PAQUE E - 1077 en un tubo de falc falcon on

2. Colo Colocar car lentam lentamente ente 10 ml del sobre sobrenadan nadante te obtenid obtenido o en la etapa anteri anterior, or, sobre el ficoll–hypaque evitando la mezcla de ambas soluciones

D. Separa Separación ción de las ccélula élulass

1. Cent Centrifug rifugar ar a 2000 rp rpm m dura durante nte 20 mi min n ( 200 C ) 2. Retirar los tubos de la centrífuga lentam lentamente ente evitando mez mezclar clar las fases 27

 

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3. Cole Colectar ctar la interfa interfase se de leucocito leucocitoss mononu mononucleare clearess ubicada entr entree la capa de HISTOP HIS TOPAQ AQUEUE-107 10777 y la capa de pl plasm asmaa y tra transf nsferi erirla rla a un nuev nuevo o tubo falcon 4. Lu Luego ego col colect ectar ar el pec pecip ipita itado, do, conten contenien iendo do los neu neutró trófil filos os,, ubicad ubicado o po por  r  debajo de la capa de HISTOPAQUE - 1077 y transferirlo a un nuevo tubo falcon 3. Ag Agreg regar ar 10 10ml ml d dee PB PBS S 4. Cent Centrifug rifugar ar a 2000 rpm dur durante ante 4 min Si el pellet esta conta contamina minado do realiz realizar  ar  um shock osmótico 5. Elim Eliminar inar el sobren sobrenadant adantee y Resus Resuspende penderr el preci precipitad pitado o celular en 1-2 ml de medio de cultivo completo (RPMI – 1640 ) con suero humano AB + AL 10 %, penicilina 100 u / ml, estreptonicina 100 g / ml 6. Con Contar tar las células y determin determinar ar la viabili viabilidad dad celula celularr por el méto método do de azul de trypan. células Shock osmótico: Agregar um volumem de agua destilada a las células

 

mezclar por pipeteo , no mas de 28segundos y luego agregar un volumem  

igual de NaCl 1,8 %.

E. Cul Cultiv tivo o pri primar mario io de llinf infoci ocitos tos y neutrófilos

1.

Colocar 3 x 106 células ( 1 x106 células 1 cm2 ) en placas de cultivo de 60 mm. de diámetro diámetro con 4 ml d dee medio de cultivo completo 0

2.

 

2

Incubar las células a 37  C con 5 % de CO  95 % de humedad.

V. RESULTADOS

28

 

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1. Esquematice Esquematice el proced procedimien imiento to de aisla aislamient miento o y cultivo de linfo linfocitos citos y neutro neutrofilos filos humanos 2. Determinar la viabilidad y el número de linfocit linfocitos os y neutrofilos humanos obtenidos por mililitro

 

VI. CUESTIONAR CUESTIONARIO IO 1. Ind Indiqu ique e el funda fundamen mento to del ais aislam lamien iento to de linf linfoci ocitos tos y neut neutrof rofilo iloss human humanos os con ficoll–hypaque. 2. ¿Qué ca caracter racterístic ísticas as físi físicas cas de las cé células lulas de lla a sangre per permiten miten la d distri istribució bución n de las células de la sangre en distintos capas?. 3. ¿Qu ¿Qué é es una gra gradie diente nte de d dens ensida idad? d? 4. indiq indique ue los ttipos ipos d de e linf linfocito ocitoss que sse e encu encuentran entran en la sangre sangre 5. ¿Qu ¿Qué é es una ccent entrif rifuga ugacio cion n isop isopicn icnica ica? ? 6. Ind Indiqu ique e que otros med medios ios de dens densida idad d se pue puede de util utiliza izarr para la separa separacio cion n de linfocitos? 7.

Ind Indiqu ique e cua cuall es la ccomp omposi osició ción n del m medi edio o de Cu Culti ltivo vo RP RPMI MI-164 -1640 0 y DMEM DMEM e indique la importancia de sus componetes

8. Por Porque que se uti utiliz liza a CO2 en el cul cultiv tivo o de Célul Células as anim animale aless o humana humanass cual es su funcion? Que buffer se puede emplear en vez del CO2?

PRACTICA Nº 5

CULTIVO DE CELULAS 29

 

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I.

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OBJETIVOS  

II.

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Manipular células para su cultivo Cultivar células de mamíferos

INTRODUCCION

Una sola célula es el elemento fundamental para la vida humana. El material genético de cada célula en el cuerpo humano - se compone de 100 billones de células - guarda el secreto de las enfermedades hereditarias, como la enfermedad de Tay Sachs, fibrosis quística, la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades complejas como la enfermedad del corazón. El cultivo de tejidos se desarrolló por  primera vez en el 1900 como un método para estudiar el comportamiento de las células - libre de las variaciones que puedan producirse en el organismo – en respuesta al estrés normal y experimental inducida. Inicialmente, los científicos utilizaron fragmentos de tejidos, pero poco a poco desarrollado técnicas para estudiar el comportamiento de las células individuales y cambió el nombre por el de cultivo de células. El cultivo celular se refiere a la remoción de las células de un animal o planta y su posterior crecimiento en un entorno artificial favorable. Las células pueden ser  el elim imin inad ados os del del te tejijido do dire direct ctam ament ente, e, desgl desglosa osado doss po porr medi medios os enzi enzimáti máticos cos o mecánica antes del cultivo, o pueden ser derivados de una línea celular o cepa de células que ya se ha establecido. En su forma más simple, el cultivo de células implica la dispersión de células en un entorno artificial compuesto de soluciones de nutrientes, una superficie adecuada para pa ra sopo soport rtar ar el cr crec ecim imie ient nto o de las las cél célul ulas as,, y las las cond condic icio ione ness idea ideale less de temperatura, humedad, y la atmósfera gaseosa. En tal sistema, un investigador  puede medir con precisión la respuesta de las alteraciones de las células en cultivo culti vo alteraciones alteraciones,, fármacos potenc potenciales, iales, la presencia o ausencia ausencia de otros tipos de células, agentes cancerígenos, y los virus. Los cultivos de células y el ADN se pueden establecer a partir de sangre o pequeños fragmentos de tejido (biopsias). Los linfocitos (células blancas de la sangre) se pueden inmortalizar con el virus de Epstein-Barr virus y luego se replican indefinidamente en medio de cultivo. Los fibroblastos (células procedentes de una biopsia de la piel) se pueden utilizar para establecer una línea celular, aunque su crecimiento en medio de cultivo es limitado en el tiempo. El personal en los Coriell Cell Repositories establece cultivos de sangre y piel, y estas células se mantienen en el Instituto, listo para ser enviado a cualquier investigador interesado en el estudio de los procesos de enfermedad.

30

 

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Para el cultivo de células se requiere de material plástico para el cultivo (Botellas o placas), medios de Cultivo apropiados para cada tipo de células y los suplementos como antibióticos y Antimicóticos, en el presente protocolo se resume brevemente como se desarrolla un cultivo, en este caso particularmente para células Jurkat.

III.

MATERIAL Y REACTIVOS             

Células Campana de flujo laminar Incubadora con CO2 Placas o botellas de plástico para cultivo de células Filtros de esterilización (0.22um) Medio de Cultivo RPMI Microscopio Cámara de neubauer Pipetas descartables Centrifuga Baño maría  Aspiradores Refrigeración

PROCEDIMIENTO

IV.

PRIMER DIA 1. 2. 3. 4.

Obt Obtene enerr las cé célul lulas as en es estad tado o con congel gelado ado Descon Descongelar gelar las cé células lulas con el calor de la lass mano manoss Coloc Colocar ar el co conteni ntenido do en un una a placa conten conteniendo iendo 1 10 0 ml de medio Incub Incubar ar toda la noc noche he a 37 C, 100% de Hum Humedad edad co con n 5% de CO2

SEGUNDO DÍA 1. Mirar llas as célu células las ad adherentes herentes en el ffrasco rasco d de e cult cultivo, ivo, a través de u un n microscopio con baja luz, 2. Las célu células las debe deben n estar fo formando rmando u un n capa (m (mono ono capa) capa),, sobre lla a superfi superficie cie del frasco. 3. Alim Alimentar entar la lass células, re removie moviendo ndo el medi medio o y reemplaz reemplazar ar por medio ffresco, resco, 2 a tres veces por semana. Sexto a Octavo día. 1. Cuando la confluencia es elevadas (superficie llena), se debe realizar los subcultivos (pase o Split).

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CÉLULAS ADHERENTES 1. Rem Remover over el el med medio io del ffrasc rasco o de cul cultiv tivo o 2. Anadir 2 ml de tr tripsina ipsina mezcla mezclada dacapa con PBS PBS, , sobrepuede lla a capa célu células las (cubri (cubrir las células), alternativamente la de células serderemovida con r espátula.

CÉLULAS EN SUSPENSIÓN 1. Remov Remover er y contar una a alícuot lícuota a de cultivo cultivo ce celular lular 2. Empez Empezar ar un nu nuevo evo cul cultivo tivo ccon on un ap apropiado ropiado volume volumen n de célul células. as. La concentración de células en suspensión se realiza en una centrifuga a 1000 RPM por 5 minutos.

PRACTICA Nº 6

EVALUACION DE LA VIABILIDAD CELULAR: METODO DE EXCLUSION DEL AZUL DE TRYPAN 32

 

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I. OBJETIVOS 

Evaluar la viabilidad de una suspensión celular 



Determinar el numero de células viables en una suspensión celular

INTRODUCCIÓN El método de exclusión del colorante es una técnica simple y rápida para evaluar el número de células viables presentes en una suspensión celular. Se basa en el principio de que las células vivas poseen una membrana celular  intacta que excluye ciertos colorantes tales como el azul de trypan, eosina o yoduro de propidio, mientras que las células muertas han perdido su integridad de membrana membrana y no puede pueden n excl excluir uir el color colorant ante. e. En este método método se mezcla mezcla una suspensión celular con el colorante y luego se examina visualmente para determinar si las células determinar células han capta captado do o exclui excluido do el colo colorante. rante. Se considera considera que una célula esta viable si tiene un citoplasma claro mient mientras ras que una célula no viable tendrá un citoplasma azul.

III. REACTIVOS Y MATERIALES    

PBS.  Azul de trypan (0.2%) Suspensión celular



Micropipetas 0 – 20 ul – 200 – 100 ul Microscopio



Cámara de newbauer ( hemocitometro )

IV. ACTIVIDADES

33

 

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1. Cen Centri trifug fugar ar una alícuot alícuota a de una sus suspens pensión ión celu celular lar de la cual se desea determinar determ inar la viabilidad viabilidad dur durante ante 2 min. a 4000 rp rpm m y luego desc descartar artar el sobrenadante. 2. Res Resusp uspende enderr el pellet ce celul lular ar en 1 ml de PBS o medio de cul cultiv tivo o libre de suero. 3. Mezcla Mezclarr 1 part parte e de la suspe suspensión nsión cel celular ular (di (diluida luida en PB PBS) S) con una pa parte rte del azul de trypan 0.4 %. Incubar la mezcla por 3 min a temperatura ambiente. 4. Apli Aplicar car u una na g gota ota (ap (aprox rox.. 20 ul ul ) de la me mezcl zcla a células células – azu azull de ttryp rypan an en una cámara de newbauer. Colocar el hemocitometro en la platina del microscopio y enfocar las células con el objetivo de 40x. 5. Conta Contarr las células viables ( no teñida teñidass ) y las cél células ulas no viables (teñi (teñidas das ) 6. Deter Determinar minar el n número úmero de células vviables iables ut utilizand ilizando o la sgte fformula ormula::

 

Celulas Celulas viables (%)= Número Número total de células viables / ml

100  

Número total de células / ml

V. RESULTADOS 1. Haga los cálculos para determinar el numero de celulas por ml 34

X

 

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2. Determine el porcentaje de viabilidad celular

VI. CUESTIONARIO CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento del Método de exclusión del Azul de Trypan ? 2. ¿Por ¿Porqu que e se debe ev evititar ar ut utili iliza zarr un med medio io de cul cultitivo vo co con n su suer ero, o, en la evaluacion de la viabilidad celular por el metodo del azul de trypan? 3. ¿Cuáles serian las ventajas ventajas y desven desventajas tajas del método de exclusión exclusión del azul de trypan ? 4. ¿Qué otros colorantes se puede usar en la determinación de la viabilidad celular?

PRACTICA Nº 7 MODELO DE INFLAMACION IN VIVO: EDEMA PLANTAR EN RATA INDUCIDO POR CARRAGENINA 35

 

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I.

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OBJETIVOS    

II.

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Inducir inflación in vivo en ratas Conocer y comprender el proceso inflamatorio Identificar las moléculas que están comprometidas en la inflamación

INTRODUCCIÓN El proceso inflamatorio es complejo e involucra una serie de fenómenos que pueden pue den ser des desenc encade adenad nados os por var varios ios est estímu ímulos los,, entre entre los que se inc incluy luyen en factores endógenos (necrosis tisular o rotura ósea) o factores exógenos como lesiones por agentes mecánicos (corte), físicos (quemaduras, radiaciones, frío, calor) cal or),, quí químic micos os (co (corro rrosiv sivos, os, ven veneno enos, s, toxina toxinas), s), bio biológ lógico icoss (ba (bacte cteria rias, s, virus virus,, parásitos, hongos) e inmunológicos (reacciones de hipersensibilidad) El mis mismo mo tiene tiene lug lugar ar en el tej tejido ido con conjun juntiv tivo o vas vascul culari arizad zado o e implic implica a cam cambio bioss vascul vas culares ares,, eve evento ntoss cel celula ulares res,, y la pro produc ducció ción n de mediad mediadore oress químic químicos os de la infl inflam amac ació ión. n. To Todo doss esto estoss comp compon onen ente tess de dell sist sistem ema, a, es está tán n es estr trec echa hame ment nte e vinculados. En el proceso inflamatorio después de una breve contracción de las arte arteri riol olas as se prod produc uce e vaso vasodi dila lata taci ción ón qu que e es la ca caus usa a de dell au aume ment nto o de flfluj ujo o sanguíneo que a su vez es causa de rubor y calor, y un incremento de la permeabilidad vascular. Como consecuencia de estos eventos vasculares se torna lenta la circulación que hace que los leucocitos se dirijan hacia la periferia, proceso conocido como marginación. Estos leucocitos se sitúan sobre el endotelio vascular, lo que se conoce como rodamiento, se produce la adhesión leucocitaria y posteriormente, la trasmigración que es el proceso mediante el cual los leucocitos (fundamentalmente neutrófilos en la inflamación aguda) abandonan la circulación mediante diapédesis. Una vez fue fuera ra del sis sistem tema a vas vascul cular ar se pro produc duce e el fen fenóme ómeno no de quimio quimiotax taxis, is, migran mig rando do los leu leucoc cocito itoss hac hacia ia la zon zona a de lesión lesión.. Los fac factor tores es qui quimio miotác táctic ticos os pueden pue den ser exó exógen genos os o end endóge ógenos nos.. Ent Entre re los exó exógen genos os est están án los pro produc ductos tos bacterianos como los péptidos; entre los endógenos están los componentes del complemento, productos de lipoxigenasa y las citoquinas. En la zona de lesión, diversos factores favorecen la activación leucocitaria como las sus sustan tancia ciass qui quimio miotác táctic ticas as en con concen centra tracio ciones nes ele elevad vadas, as, la fag fagoci ocitos tosis is y complejos antígeno-anticuerpo. La activación leucocitaria se caracteriza por la producción de metabolitos del ácido araquidónico (AA) debido al incremento de la actividad de fosfolipasa A2 (FLA2) por diacilglicerol (DAG) y calcio, generación de especies reactivas del oxígeno (ERO) y liberación del contenido lisosomal a causa de la lisis celular, lo cual conduce al daño celular y tisular.

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Fig. 2 Pletismometro, para evaluar inflamación in vivo.

EDEMA PLANTAR EN RATA INDUCIDO POR CARRAGENINA Los modelos in vivo para la investigación de la actividad antiinflamatoria tienen como como ba base se pa para ra el en ensa sayo yo los los sí sínt ntom omas as de la in inflflam amac ació ión, n, sien siendo do el má máss frecue fre cuente ntemen mente te uti utiliz lizado ado el ede edema. ma. En est estos os mod modelo elos, s, la mayorí mayoría a de vec veces es solamente nos permite llegar a determinar la actividad más no el mecanismo implicado en el proceso antiinflamatorio que presenta el compuesto a investigar, pero son de gran importancia ya que nos permiten hacer un evaluación de esta acti activi vida dad d y capaces pu pued ede e ser se el punt punto oende pa part rtid ida a inflamatorio. para para la in inve vest stig igac ació ión n de nuev nuevos os compuestos der interferir el proceso El métod étodo o de edem edema a plan planta tarr indu induci cido do po porr car arra rage geni nina na cons consiist ste e en la admi admini nist stra raci ción ón subc subcut után ánea ea de una una solu soluci ción ón de ca carr rrag agen enin ina a a ni nive vell de la aponeurosis aponeu rosis plantar de la rata, provoca provocando ndo una reacción de carácter carácter inflamato inflamatorio rio medi me diad ada a por por la libe libera raci ción ón de dive divers rsos os auta autaco coid ides es (h (his ista tami mina na,, se sero roto toni nina na,, bradic bra dicini inina, na, pros prostag taglan landin dinas) as) ade además más div divers ersos os fac factor tores es del comple complemen mento to que están implicados en la amplificación de la respuesta. El producto a ensayar se puede administrar vía intraperitoneal, oral, etc. Una hora después de la administración de la sustancia problema, la histamina y la serotonina tienen un papel principal como mediadores. De una hora y media a dos y media horas después de la inyección de carragenina, intervienen las cininas como mediadores. La última fase esta mediada por prostaglandinas (PGE1 y PGE2, PGF2). La res respue puesta sta vascu vascular lar máx máxima ima ocurr ocurre e apr aproxi oximad madame amente nte a las 4 hora horass de la admi admini nist stra raci ción ón de carr carrag agen enin ina a y coin coinci cide de con con la fa fase se me medi diad ada a po porr la lass prostaglandinas. La extravasación de proteínas ocurre durante toda la respuesta al agen agente te edem edemat atóg ógen eno. o. La mi migra graci ción ón ce celu lula lar, r, fu fund ndam amen enta talm lmen ente te le leuc ucoc ocititos os polimorfonucleares, comienza a las 2 horas de haberse inyectado el agente.

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Se prefiere la carragenina ante otros irritantes porque el edema producido esta menos modificado por factores ajenos a los propiamente característicos de la inflamación y además, porque la actividad antiinflamatoria de este ensayo guarda una buena correlación con la actividad anti-inflamatoria en clínica.

Fig. 3 Fases de la Inflamación

III.

REACTIVOS Y MATERIALES 3.1 REACTIVOS - Carragenina - Suero fisiologico - NaCl 0.1% - Triton X100 - EDTA 5mM 3.2 MATERIALES -

IV.

Pletismometro Micropipetas Jeringas 1ml Tubos Eppendorf  Baño maria

PROCEDIMIENTO 38

 

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A. Preparación de la solución de carragenina 2% 1. Pesar 20mg d de e carra carragenin genina a y agr agregar egar 1m 1mll de su suero ero fifisioló siológico gico o 2. Diso Disolver lver lla a car carrageni ragenina na cal calentand entando o la ssoluci olución ón a 8 80 0 C

B. Inducción de inflamación 1. Iny Inyect ectar ar en la aponeu aponeuros rosis is plan plantar tar de la pata tras trasera era derech derecha a de la rata 100ul de la solución de carragenina al 2%, dejar la pata izquierda sin inyectar 2. Es Espe pera rarr 1 hora hora y re real aliz izar ar la me medi dici ción ón de dell volu volume men n de am amba bass pa pata tass utilizando el pletismometro. C. Medición de la Inflamación 1. Cal Calibr ibrar ar el pleti pletismo smomet metro ro con una solu solució ción n de NaC NaCll 0.1% y Tri Triton ton X100, X100, llevando a 0 ml (cero) el instrumento para luego colocar una pesa de 3ml en el reservorio reservorio de medida y apretar el botón de cali calibrado, brado, la panta pantalla lla deberá mostrar el valor de 3ml, lo cual indica

2. que el inst instrum rument ento o ya esta cali calibra brado do Al retir retirar ar la pesa la panta pantalla lla deberá deberá mostrar 0 ml 3. Intr Introd oduc ucir ir prim primer ero o la pata pata no inye inyect ctad ada a (izq (izqui uier erda da)) en el re rese serv rvor orio io de medida y anotar la lectura que aparece en la pantalla 4. Lue Luego go intr introdu oducir cir la pata iny inyect ectada ada (de (derec recha) ha) en el res reserv ervori orio o de medi medida da y anotar la lectura que aparece en la pantalla.

 

D. Calculo del porcentaje de Inflamación 1. Con las lect lecturas uras del plet pletism ismome ometro tro corr corresp espond ondien ientes tes a cad cada a pata pata trase trasera ra aplicar la siguiente fórmula para determinar el porcentaje de inflamación

% inflamación= Vt  (pata  (pata derecha) – Vnt  (pata  (pata izquierda) X 100

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V. RESULTADOS Esquematice los pasos para la inducción de inflamación in vivo, haga los cálculos para determinar el porcentaje de inflamación hasta las dos horas.  

VI. CUESTIONAR CUESTIONARIO IO 1. Defina inflamación aguda y crónica 2. Mencione los principales eventos que ocurren en un proceso inflamatorio 3. Describa el modelo de edema plantar por carragenina en la pata de la rata y que ventajas tiene frente a otros modelos 4. Mencione y comente otros modelos para evaluar actividad inflamatoria in vivo Esquematice atice el diseñ diseño o exper experiment imental al para evalu evaluar ar la actividad actividad antiinfla antiinflamatori matoria a 5. Esquem de un flavonoide obtenido a partir del llantén

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PRACTICA Nº 8 INMUNOAGLUTINACION DETERMINACIÓN DETERMINACIÓ N DE GRUPOS SANGUÍNEOS

I.

OBJETIVOS   

II.

Determinar los grupos ABO y Rh en hematíes, mediante la utilización de antisueros comerciales. Determinar los grupos ABO en plasma, mediante la utilización de hematíes. Reconocer una reacción de aglutinación debida a una reacción antígenoanticuerpo.

INTRODUCCION La agl agluti utinac nación ión se car caract acteri eriza za por la for formac mación ión de agr agrega egados dos vis visibl ibles es como como resultado de la interacción de anticuerpos específicos y partículas insolubles que contienen determinantes antigénicos en la superficie (epitopes).Estas pruebas son altamente sensibles, utilizadas en el diagnóstico de virus, bacterias, protozoarios y hongos; enfermedades auto-imunes; detección de hormonas y determinación de grupos sanguíneos, (figura 1). Son de fácil ejecución ya que pueden realizarse en láminas, placas o tubo, lectura visual la cual depende solamente del tamaño de los ag agre rega gado doss fo form rmad ados os,, es de bajo bajo cost costo, o, pr pres esen enta ta bu buen ena a es espe peci cififici cida dad d y reproductibilidad.

Fig.1.- Aglutinación La deter determinac minación ión del grupo sanguí sanguíneo neo es una práctica habitual e imprescindi imprescindible, ble, para la transfusión de componente hemáticos. La razón está en que el sistema inmune inm une de alg alguno unoss ind indivi ividuo duoss rec rechaz haza a los hem hematí atíes es de otros. otros. Est Esta a rea reacci cción ón inmu in muno noló lógi gica ca está está me medi diad ada a po porr anti anticu cuer erpo poss y es fá fáci cilm lmen ente te visi visibl ble e in vitr vitro o mediante reacciones de aglutinación. Se conocen más de 20 grupos de antígenos eritrocitarios siendo los más importantes a efectos transfusionales los antígenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh). Existen otros pero no causan problemas trasnfusionales como por ejemplo: MNS, Kell, Kidd, duffy, Lutheran, Diego, Chido, Rogers, Colton, Lewis, etc. 41

 

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Sistemas ABO Contiene cuatro fenotipos principales de ABO: A, B, O y AB. Los cuatro fenotipos están determinados por la presencia o ausencia de dos antígenos (A y B) en los eritrocitos. Son controlados por un solo gen con tres alelos (A,B, i), el alelo A da tipos A, el B tipos B y el alelo i tipos O (o “cero”) siendo A y B son alelos dominantes sobre i. Así, las personas que heredan dos alelos ii tienen tipo O; AA o  Ai dan lugar a tipos A; y BB o Bi dan lugar a tipos B. Las personas AB tienen ambos fenotipos por tener una relación de codominancia Este sistema también se caracteriza por la presencia o ausencia de anticuerpos generados naturalmente y que son denominados isohemaglutininas (Suelen ser  IgM), dirigidos contra los antígenos A y B ausentes. Se cree que la fuente de inmu inmuni niza zaci ción ón de dich dichos os Ac na natu tura rale less es está tá en el in inte test stin ino o y po porr bact bacteri erias as ambientales que se ha demostrado poseen estructuras como el ABO en sus paredes de lipopolisacárido, esto es muy importante desde el punto de vistas transfusional (Tabla 1, figura 2).

Dichos grupos sanguíneos están distribuidos entre la población mundial de raza blanca aproximadamente de la siguiente manera: grupos A y O 44-46% de cada uno, grupo B al 8-9% y grupo AB minoritario con un 3-4%.

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Sistema Rhesus Se han identificado más de 40 antígenos del sistema Rh aunque no se sabe cuantos genes son responsables de este sistema. Son proteínas integrales de membrana con un contenido lipídico alto. D es el antígeno Rh más inmunogénico y por tanto el más importante a efectos transfusionales. La presencia de D da lugar  al Rh+, mientras que la ausencia (d) da lugar al Rh-. Los anticuerpos anti D, que son IgG, aparecen en la circulación de los individuos sólo tras unalaexposición previa a sangre D, por ejemplo por una transfusión de Rhhematíes o tras gestación de un feto D.

Fig. 2 Grupos Sanguineos TIPS PARA ENTENDER ENTENDER LA TIPIFICAC TIPIFICACION ION DE GRUPO GRUPOS S SANGUINEOS



Los grupos sanguineos se heredan según las leyes geneticxas. Son 4 tipos y reciben el nombre de grupos sanguineos ABO. En tod toda a tra transf nsfusi usion on san sangui guinea nea se deb debera era det determ ermina inarr con muc mucho ho cuidad cuidado o los grupos sanguineos de cada donador y cada receptor. El paciente solo recibira sangre de su propio grupo.



La tipificacion de los grupos sanguineos se realiza:



-

Probando losconocidos, globulos rojos clasificadores anti A, (para anti B,reconocer y anti AB.sus antigenos) con sueros 43

 

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-



Probando suero (para identificsr sus anticuerpos) con globulos rojos de ensayo conocido, perteneciente a los grupos A, B y O. En los hospitales pequeños y en caso de urgencia, puede ser que el paciente deba recibir sangre de un grupo distinto del suyo, según las siguinetes reglas:

El paciente que tenga: - Grupo Sanguineo A:  Debera recibir sangre del grupo A; si no se

-

III.

MATERIALES            

IV.

dispone de del grupo G rupo S Sa anella, guinusar eo Bsangre : Debera recibirO.sangre del grupo B; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo O. Grupo ssaanguineo A AB B: Debera recibir sangre del grupo AB; si no se disponede ella, usar sangre del grupo A, del grupo B o del grupo O (en este orden)

Portaobjetos Lancetas de un solo uso  Algodón  Agua oxigenada Tubos eppendorf  Centrifuga para tubos eppendorf Micropipetas y puntas de 10, 50 y 100uL Soluciones y reactivos Solución anti-A Solución anti-B Solución anti-D (anti Rh) Una gota de sangre Suero salino fisiológico (NaCl 0.85%) EDTA

PROCEDIMIENTO Determinación de ABO y Rh en Hematíes

1. Prepar Preparar ar un por portaobj taobjetos etos rot rotulado ulado ccon on las in inicial iciales es del vo voluntar luntario. io. 2. Se lim limpia pia el pulp pulpejo ejo de un dedo (ta (tall como se real realizó izó para ex extra traer er la muestra muestra par para a frotis sanguíneo) con un algodón humedecido en alcohol y se pincha con la lanceta. 3. Col Coloca ocarr tre tress gotas de san sangre gre (apr (aproxi oximad madame amente nte 0.5 cm de diám diámetr etro, o, 25-50μl) 25-50μl) sobre un portaobjetos completamente limpio. 4. Añ Añad adir ir el Anti cue cuerp rpo o anti anti-A -A (25 (25μl μl)) a un una a de la lass gota gotass de sa sang ngre re,, el an antiti-B -B a la siguiente y finalmente el anti-D a la restante. 5. Mezc Mezclar lar ccon on una punta de pi pipeta peta d durante urante unos ssegundo egundoss 6. Deter Determinar minar la agl aglutinac utinación ión e interp interpretar retar el re resulta sultado. do. Determinación de ABO y Rh en plasma

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1. Pipet Pipetear ear en un ttubo ubo eppe eppendorf ndorf 1 10 0 μl de sa sangre ngre de lo loss dife diferentes rentes grupo he hemátic máticos os obtenido en la experiencia anterior (A, B, AB, O) y rotular. 2. Centr Centrifuga ifugarr el tubo tubo1minu 1minuto to a 2500 2500rpm rpm y des descarta cartarr el sobr sobrenadan enadante. te. 3. Resu Resuspende spenderr el p pellet ellet y aña añadir dir 1m 1mL L de ssuero uero fisi fisiológic ológico. o. 4. Re Repe petitirr e ell p pas aso o2 2.. 5. Resu Resuspende spenderr en 490 μl d de e suero ffisiol isiológico ógico y a esto sse e denomi denominará nará hem hematíes atíes al 2% (v/v). 6. Apart Aparte, e, ext extraer raer 1mL de sangr sangre de un es estudia tudiante nte X en un ttubo ubo epp eppendorf endorf conteniendo anticoagulante yecentrifugar 5 minutos a 2500rpm 7. Extr Extraer aer el pl plasma asma y de deposit positar ar 50uL e en n dos tub tubos os eppe eppendorf. ndorf. Pueden tambié también n prepararse controles negativos (suero fisiológico) y positivos si es que hubiera suero anti-A,B. 8. Pipet Pipetear ear 25μ 25μll de hema hematíes tíes A en u un n tubo y hemat hematíes íes B en el otro y m mezcl ezclar. ar. 9. Cen Centri trifug fugar ar a 25 2500r 00rpm pm po porr 15 se segun gundos dos.. 10. Dispersar el pellet y determinar aglutinación. Desarrollo Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la práctica, graficar el resultado.

Cuestionario 1. ¿Cuá ¿Cuáll fue la fina finalidad lidad de me mezclar zclar lo loss hematí hematíes es al 2% con el ssuero uero de un est estudian udiante te X? 2. ¿Exp ¿Explica lica br breveme evemente nte en qué con consist siste e la en enferme fermedad dad del Rh? 3. ¿Cuá ¿Cuáll es la altern alternativa ativa p para ara evit evitar ar la isoi isoinmuni nmunización zación ma materno terno fe fetal tal y como como actúa? 4. Expli Explique que bre brevemen vemente te a qué se le llllama ama ffenotip enotipo o Bom Bombay. bay. 5. Qué ca caracte racterísti rísticas cas disting distinguen uen a los e eritroc ritrocitos itos d de e las o otras tras célula célulass sang sanguíneas uíneas? ?

PRACTICA N° 9 45

 

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INMUNOCROMATOGRFIA  DETECCIÓN DEL VIRUS DEL SINDROME RESPIRATORIO AGUDO SEVERO(SARS CoV-2) y DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (HIV) 1. OB JETI VO VO S  

Conmprender la tecnica de Inmunocromatografia y su aplicación clinica.  Anal  An aliz izar ar e In Inte terp rpre reta tarr las la s pr prue ueba bass ra rapi pida dass pa para ra HIV HIV,, HbsAg Hb sAg y S Sififililis is  Antiti-T  An -TP P

2. INTR INTROD ODUC UCCI CION ON La inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modern mod ernas as cuy cuyas as pri princi ncipal pales es ventaj ventajas as son la sen sencil cillez lez y rap rapide idezz de la prueba. prueb a.  Actu  Ac tual alme ment nte e se ut utililiza iza como co mo pr prue ueba ba rá rápi pida da de tamiz tam izaj aje e pa para ra la detección de antígenos o anticuerpos presentes en el suero del paciente. Las pruebas mas comunes que utilizan la técnica de Inmunocromatografia en el laboratorio de análisis clínicos y son mayormente indicadas por los m é d i cos cos s o n: diagnóstico de embarazo (detección de hormona gonado gon adotro tropin pinica icacor corion ionica ica hum humana ana hGC hGC), ), rot rotavi avirus rus,, Sangre Sangre ocu oculta lta en Heces, Heces, Chlamydia sp, Leptospira sp., VIH, virus del dengue, virus respiratorios, etc.

3. INMU INMUNO NOCR CROM OMAT ATOG OGRA RAFI FIA A La inmunocromatografía consiste en la migración de una muestra (suero, plasma, orina, entre otros) en una membrana de nitrocelulosa la cual contiene anticuerpos específicos contra el antígeno o analito que se desea detectar. En el siguiente esquema se resume el fundamento del método:

a. Primero: La muestra se pone en contacto con la zona del conjugado. Esta lleva impregnada un conjugado formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el an antí tíge geno no a de dete tect ctar ar,, és éste te se un unir irá á al co conj njug ugad ado o fo form rman ando do un co comp mple lejo jo y empezarán a migrar a través de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse. zona na de ca capt ptura ura es está tá fo form rmad ada a po porr un se segu gund ndo o an antiticu cuer erpo po b. Segu Segundo: ndo:  La zo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados(muestras por la unión del antígeno conjugado quedaránelretenidos la línea se coloreará positivas). Si la ymuestra no contiene antígeno,y el 46

 

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segundo anticuerpo no captura nada y la línea queda trasparente (muestras negativas).

c. Tercero: La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reac re actitivo vo de de dete tecc cció ión. n. Cu Cuan ando do el re rest sto o de mu mues estr tra a al alca canz nza a es esta ta zo zona na,, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. captur a. Esta línea es un contr control ol de que el ensay ensayo o ha funci funcionado onado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.

Fig. N°1 Estructura lateral del Ensayo.

3.1 Ens Ensayo ayo para la Detecc Deteccion ion del Viru Viruss de Inmu Inmunod nodefi eficien ciencia cia Humana (HIV) El age agente nte eti etioló ológico gico del sín síndrom drome e de inmunod inmunodefic eficienc iencia ia adqu adquirid irida a (SI (SI D A ) e s, un re rettro rovvirus irus d des esii g na nado do co co mo Vi Virr u s de lla a Inmunodeficie Inmunod eficiencia ncia Humana (HIV). El HIV es transm transmitido itido por contac contacto to sexual y de la madre al feto o niño durante el periodo perinatal. Existen 2 tipos de HIV que son el HIV 1 y HIV 2. La presencia de anti anticu cuer erpo poss co cont ntra ra HI HIV V es evid eviden enci cia a acep acepta tabl ble e de in infe fecc cció ión n o exposición previa para este virus, pero la prueba de anticuerpos para HIV tiene limita limitaciones ciones.. Los anticuerpos usualment usualmente e aparece aparecen n dentro de las las 3 a 6 sema semanas nas desp despué uéss de la ex expo posi sici ción ón y su subs bsec ecue uente nte infe in fecc cció ión n cont contra ra HIV. HIV. De Debi bido do a que la lass per perso sona nass in infe fect ctada adass no desarrollan desarrol lan anticu anticuerpos erpos inmediatamen inmediatamente, te, un resultado resultado negativ negativo o no puede puede tom tomars arse e como como infec infecci ción ón po porr HI HIV V recien reciente te.. Un res resul ulta tado do 47

 

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negativo no puede descartar la infección por HIV recient negativo reciente, e, la prueba debe repetirse después de 6 meses. Este análisis es un Inmunoensayo cromatografico para la detección cualitativa de anticuerpos contra el HIV en suero, plasma o sangre total, la prueba esta destinada para uso profes profesional ional como una ayuda en la de dete tecc cció ión n de anti anticu cuer erpo poss cont contra ra el HI HIV, V, tr tres es pr prot oteí eína nass recombinantes seleccionadas del2).HIV se utilizan en la prueba (p24 y gp41 para HIV 1especialmente , gp36 para HIV

3.2 Ensayo para la Deteccion de Antigenos de Superficie para Hepatitis B (HBsAg) Es un inmu inmuno noen ensa sayo yo cual cualititat ativ ivo o de me memb mbra rana na pa para ra la dete detecc cció ión n del del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg) en suero o plas plasma ma hu huma mano no a un una a conc concen entr trac ació ión n ig igua uall o su supe peri rior or a 1 ng ng/m /ml.l. La membrana está recubierta por anticuerpos anti-HBsAg en la región de la ba band nda a de la prue prueba ba.. Du Dura rant nte e el en ensa sayo yo la mues muestr tra a re reac acci cion ona a co con n la partícula recubierta con anticuerpos anti-HBsAg. La mezcla migra a lo largo de la membrana cromatográficamente por  acci acción ón capi capila larr para para re reac acci cion onar ar co con n lo loss an antiticu cuer erpo poss anti anti-H -HBs BsAg Ag de la membrana generando una línea de color. La presencia de esta línea de colo colorr en la regi región ón de la band banda a de dell Test Test in indi dica ca un re resu sultltad ado o posi posititivo vo,, mientras que su ausencia indica un resultado negativo. La aparición de una banda coloreada en la región de Control sirve como procedimiento de control. La aparición de esta línea se utiliza para verificar que se ha añadido el volumen de muestra suficiente, que el flujo ha sido apropiado.

1.3Ensayo para la Deteccion de Sifilis Anti-TP Tr Trep epon onem ema a Pa Pallllid idum um cass casset ette te es un una a prueb prueba a para para la de dete tecc cció ión n de anti anticu cuer erpo poss Ig IgM M e Ig IgG G de Tre repo pone nema ma Pa Pallllid idum um (T (TP) P) me medi dian ante te la interpretación visual del desarrollo de color en la tira interna. Antígenos recombinantes específicos del TP han sido inmovilizados en la zona de test de la membrana. Cuando se aplica la muestra (S), esta reacciona con el antígenoTP recombinante específico, conjugado con partículas de color y pre-sensibilizado sobre la almohadilla de muestra de la prueba. La mezcla migra migra cr crom omat atog ográ ráfifica came ment nte e haci hacia a el ot otro ro ex extr trem emo o de la memb membra rana na y reacciona con los anticuerpos de Treponema Pallidum (TP) de la superficie. Si la muestra de suero o plasma contiene TP, aparecerá una línea de color  en el área de prueba, mostrando un resultado positivo. La ausencia de una línea de color indica que el suero, o plasma no contiene TP, mostrando un resultado negativo. Como prueba de control de procedimiento aparecerá siempre una línea en la región de control si la prueba se realizó de forma adecuada. 48

 

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4. RE REAC ACTI TIVO VOS S Y MA MATE TERI RIAL ALES ES a. REACTIVOS 

TEST SD HBsAg (BIOLINE)

b. MA MAT TER ERIA IALE LES S  

         

Muestra Problema para HIV (SUERO) Muest Mue stra ra Pro Proble blema ma par para a Rot Rotavi avirus rus y San Sangre gre Ocu Oculta lta en Hec Heces es (Heces (Heces Fecales) Dispositivos de Prueba (Sachetes diferentes para cada prueba) Guantes de latex Etanol al 70% Ligadura Jeringas de 3 cc Descartador de punzocortantes Timer  Micropipetas Automáticas de 20ul, 200ul a 1000ul. Tips para micropipetas de 20ul, 200ul a 1000ul Papel Toalla.

5. ME MET TOD ODOL OLOG OGIA IA a. Detecci Deteccion on del Virus de In Inmunod munodeficien eficiencia cia Hu Humana mana (HIV). - Co Cole lect ctar ar 10 100u 0ull de la m mues uestr tra a de Suer Suero o del del pacie pacient nte. e. - Dej Dejar ar llos os reactiv reactivos os a Tempe Temperatu ratura ra A Ambi mbiente ente por 10m 10min. in. - Con la ayuda de una micro micropipeta pipeta añad añadir ir 20ul de la muestra en la zona de conjugado, luego añadir 3 gotas del Reactivo de Deteccion. - Esperar que la mue muestra stra corra por es espacio pacio de 5min. - Observa Observarr y anotar lo loss resulta resultados. dos.

b. Detec etecci cion on de De Dete tecc ccio ion n de Ant ntig igen enos os de Sup uper erfi fici ciee pa para ra Hepatitis B (HBsAg) -

Co Cole lect ctar ar 20 20ul ul de lla a mu mues estra tra d de e Su Suero ero d del el p pac acie iente nte.. Dej Dejar ar llos os reactiv reactivos os a Tempe Temperatu ratura ra A Ambi mbiente ente por 10m 10min. in. Co Con n la ay ayuda uda d de e un una a mic microp ropip ipet eta a añadir añadir 20u 20ull de la mue muest stra ra en la zona de conjugado, luego añadir 3 gotas del Reactivo de Deteccion. Es Esper perar ar q que ue lla a mu mues estr tra a co corra rra po porr espac espacio io d de e 5m 5min in.. Ob Obse serv rvar ar y anot anotar ar llos os rres esul ulta tado dos. s. 49

 

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c. Ens Ensayo ayo pa para ra la De Detecc teccion ion d dee Sifi Sifilis lis An Anti-T ti-TP P -

Co Cole lect ctar ar 20 20ul ul de lla a mu mues estra tra d de e Su Suero ero d del el p pac acie iente nte.. Dej Dejar ar llos os reactiv reactivos os a Tempe Temperatu ratura ra A Ambi mbiente ente por 10m 10min. in. Co Con n la ay ayuda uda d de e un una a mic microp ropip ipet eta a añadir añadir 20u 20ull de la mue muest stra ra en la zona de conjugado, luego añadir 3 gotas del Reactivo

-

de Deteccion. Es Esper perar ar q que ue lla a mu mues estr tra a co corra rra po porr espac espacio io d de e 5m 5min in.. Ob Obse serv rvar ar y anot anotar ar llos os rres esul ulta tado dos. s.

6. RES ESU ULTA TAD DOS 

En la siguiente tabla codificar las muestras analizadas en la práctica y los resultados obtenidos según cada ensay ensayo. o.

CODIGO DE LA DET ETEC ECC CION ION MUESTRA HIV

DE DETECCION HBsAg

DETECCION Si Sifi fili liss abti abti-TP

7. CU CUES ESTI TION ONAR ARIO IO 1. Menci Mencione one 3 Ve Ventajas ntajas y 3 D Desventa esventajas jas del método utiliz utilizado. ado. 2. Pro Propong ponga a 2 Tes Testt que sean más se sensi nsible bless y específic específicos os para ca cada da una de las Enfermedades Estudiadas. Indique el por qué de su decisión. 3. Ind ndiq ique ue 3 limi limita taccione ioness qu que e te teng nga a la In Inmu mun noc ocro roma mato tog gra rafi fia a en el diagnostico clínico.

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PRACTICA N° 10 ENSAYO POR INMUNOABSORCION LIGADO A ENZIMAS (ELISA) DETERMINACION DETERMINAC ION DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEINAS Y PEPTIDOS CITRULINADOS I.

OBJETIVO 



II.

Cuantificar cualitativamente los niveles de anticuerpos contra proteínas y péptidos citrulinados (Anti-CCP). Comp Co mpre rend nder er el fu fund ndam amen ento to de la té técn cnic ica a EL ELIS ISA A () co como mo té técn cnic ica a de diagnóstico inmunológico.

NTRODUCCION 51

 

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La artritis reumatoide (AR) es la enfermedad articular más frecuente, con una prev preval alen enci cia a mu mund ndia iall esti estima mada da en 0, 0,55-1% 1% (D (Dej ejac aco o et al.,  20 2006 06). ). La pr prue ueba ba serológica seroló gica de apoyo diagnós diagnóstico tico más tradi tradicional cional para esta enfermedad enfermedad ha sido la determinación del factor reumatoide, la cual adolece de una baja especificad diagnóstica. A pesar de que el factor reumatoide puede ser encontrado hasta en el 80% 80% de los los paci pacien ente tess que que sufr sufren en AR AR,, es co cono noci cido do que que ot otra rass en enfe ferm rmed edad ades es autoinmunes, y aún hasta un 5-30% de personas sanas de edad avanzada, pueden presentar marcador otros autoanticuerpos que se encuentran en los este pacientes con serológico. AR poseenAlgunos menor sensibilidad diagnóstica, pero mayor especificidad especificidad para detec detectar tar esta enfermedad. enfermedad. Entre estos autoan autoanticue ticuerpos rpos están el denominado "factor perinuclear" y los anticuerpos anti-keratina. Al estudiar  la especificidad molecular de estos autoanticuerpos, se encontró que reconocen una proteína producida en las etapas avanzadas de la diferenciación de las células epiteliales durante la keratinización, llamada filagrina (Kuhn et al ., ., 2006). Durante el procesamiento de la filagrina, algunos de sus residuos de arginina son deiminados por enzimas de la familia de las peptidilarginina deiminasas (PADs), que los convierten de esta manera en residuos de citrulina (Fig.1). El suero de los pacientes pacie ntes con AR posee frecuent frecuentemente emente anticuer anticuerpos pos que reconocen reconocen regiones citrulinadas de la filagrina, así como de al menos dos proteínas más que presentan este tipo de modif modificaci icación ón postt posttraducc raduccional, ional, como lo son la fibrina y la vimentina citrulinadas. Interesantemente, existe evidencia de que los autoanticuerpos que reconocen proteínas citrulinadas no solo tienen un interés diagnóstico, sino que pued pueden en juga jugarr un pape papell pat patogén ogénic ico o en mode modelo loss de ar artr trit itis is re reum umat atoi oide de experimentales (Kuhn et al ., ., 2006), a diferencia del factor reumatoide.

Las primeras pruebas serológicas dirigidas a detectar anticuerpos contra filagrina citr citrul ulin inad ada a ut utililiz izar aron on esta esta pr prot oteí eína na,, ob obte teni nida da en fo form rma a re reco comb mbin inan ante te y posteriorme poster iormente nte modif modificada icada in vitro. Sin embargo, algunas de las limitaciones de esta estrategia fueron la dificultad en obtener un contenido reproducible de citrulina en este antígeno, afectando la estandarización de la prueba. Sumado a esto, se demostró que en los sueros de pacientes con AR y aún en individuos sanos, pueden pue den hal hallar larse se aut autoan oantic ticuer uerpos pos con contra tra la filagr filagrina ina no citrul citrulina inada, da, que podían podían conducir a resultados falsamente positivos. Un adelanto importante en el desarrollo de esta estass prue prueba bass sobr sobrev evin ino o al intr introd oduc ucir irse se el us uso o de un pé pépt ptid ido o sint sintét étic ico o citrulinado, derivado de la filagrina. Esto simplificó la detección de los anticuerpos contra con tra pro proteí teínas nas citrul citrulina inadas das y mej mejoró oró sus sustan tancia cialme lmente nte la est estand andari arizac zación ión,, en compara com paració ción n con el uso de la pro proteí teína na com comple pleta. ta. Median Mediante te la cic cicliz lizaci ación ón del péptido, se encontró que el epitopo que contiene citrulina queda óptimamente expuesto, llevando a una mejor sensibilidad de la técnica. Los primeros estudios basado bas adoss en el uso de un pép péptid tido o cíc cíclic lico o citrul citrulina inado do (CC (CCP) P) des descri cribie bieron ron una sensibilidad diagnóstica de 68% con una especificidad para AR de 97-98% (Pruijn et al ., ., 2005). Mediante técnicas de tamizaje realizadas sobre bibliotecas especiales de péptidos citrulinados se introdujo el uso de nuevas generaciones de CCP que han permitido elevar la sensibilidad diagnostica para AR hasta 80% (similar a la que provee la determinación del factor reumatoide), con una especificidad del 98%. Un conjunto de estudios apoyan la conclusión de que la detección de 52

 

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anticuerpos contra CCP provee un mejor apoyo diagnóstico para distinguir la artritis reumatoide de otras enfermedades. Adicionalmente, se ha encontrado que la detección de anti-CCP, cuya presencia en individuos sanos es menor del 1%, es un marcador temprano para el desarrollo de AR. El seguimiento de un grupo de individuos que presentaron la prueba positiva, en ausencia de manifestaciones clínicas, mostró que posteriormente una proporción desarrolló la enfermedad. Esta utilidad utili dad pronóstica es sumam sumamente ente valiosa, dado que le posibilita al clíni clínico co apoyar  sus decisiones terapéuticas en implementación un control farmacológico tempra tem prano no de est esta a enf enferm ermeda edad, d, laant antes es de que se de pre presen senten ten lesion lesiones es eros erosiva ivass avanzadas en las articulaciones.

Fig. 1 La conversión de un residuo de arginina en citrulina es catalizada por enzimas de la familia de las peptidilarginina deiminasas (PADs). Estas enzimas poseen polimorfismos genéticos que podrían tener alguna influencia en la predisposición para generar proteínas citrulinadas en distintos individuos, las cuales podrían inducir la respuesta autoinmune causante de artritis reumatoide

III.

REACTIVOS Y MATERIALES REACTIVOS 

CALIBR CAL IBRADO ADORES RES Y CON CONTRO TROLES LES:: Los rea reacti ctivos vos est están án listos listos par para a ser  usados. Mezclar cuidadosamente antes de usar. 53

 

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CONJUGAD CONJU GADO O ENZ ENZIMA IMATIC TICO: O: El con conjug jugado ado est está á listo listo par para a ser usa usado. do. Mezclar cuidadosamente antes de usar. BUFFER PARA MUESTRA: El buffer está listo para su uso. NOTA: Solo debe ser usado junto con la muestra.

BUFFER DE LAVADO: El Buffer está Concentrado 10X, tomar 5ml de Buffer de Lavado y diluirlo en 45 ml de Agua Destilada. Este es estable desde su preparación por 4 semanas a condiciones de 2°C a 8°C. SOLUC SOL UCION ION CR CROMOG OMOGENO ENO / SUS SUSTR TRATO ATO:: La sol soluci ución ón est está á lista lista par para a usarse. Cerrar la botella inmediatamente después de su uso, esta solución es fotosensible. SOLUCION DE PARADA: Lista para su uso. PLACAS RECUBIERTAS CON ANTIGENO: Lista para su uso, almacenar  de 4°C a 8°C.

MATERIALES 

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Muestra de Sangre Tubos Vacutainer Seco (Tapa roja)  Algodón Etanol al 70% Ligadura  Jeringas de 3 cc  Descartador de punzocortantes Timer  Micropipetas Automáticas de 20ul, 200ul a 1000ul. Tips para micropipetas de 20ul, 200ul a 1000ul Tubos Eppendorf de 1.5ml.

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Papel Toalla.

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IV.

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METODOLOGIA

Recolección de la Muestra

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  Con la ayud ayuda a de una Jer Jering inga a desca descarta rtable ble o Vacutain Vacutainer, er, ext extrae raerr una muestra mues tra de sangre por Venopu Venopuncion ncion del antebr antebrazo, azo, tomán tomándose dose todas todas las medidas de Bioseguridad en la obtención de la muestra.    Recolectar 3ml de Sangre.    Depositar la muestra dentro del tubo seco ( (tapa tapa roja) o con antic anticoagulante oagulante (EDTA y/o Heparina) , centrifugar y separar el suero o plasma del paquete 

globular.

DESARROLLO PREPARACION DE LA MUESTRA DE SUERO O PLASMA



Tomar 10ul del suero o plasma a analizar y diluirlo en 1.0ml de Buffer de muestra, obteniendo una dilución 1:101

INCUBACION DE LA MUESTRA





Transferi Transf erirr 100 100ul ul de los CON CONTR TROLES OLES (positivo (positivo y neg negati ativo) vo) y la MUESTRA PROBLEMA diluida previamente en los pocillos de la placa, asignar un pocillo por control y muestra. Dejar incubar a temperatura ambiente (18°C a 25°C) por 60minutos.

LAVADO DE LAS MUESTRAS 



Con la ayuda de una pipeta de 1000ul 1000ul,, añadir a cada pocillo pocillo con la 1ra solución (punto a) 300ul de Buffer de Lavado. Es Espe pera rarr 30 segu segund ndos os y de desc scar arta tarr po porr in inve vers rsió ión n de la pl plac aca a el



cont conten enid ido o (r (rea ealiliza zarr es este te pa paso so cuid cuidad ados osam amen ente te pa para ra ev evititar  ar  contaminación en los pocillos), secar la placa con la ayuda de papel absorbente. Repetir los procedimientos anteriores por 3 veces.



INCUBACION DEL CONJUGADO 





Tomar 100ul de la ENZIMA CONJUGADO (Peroxidasa IgG anti humano) y depositarlo dentro de los pocillos de trabajo con la ayuda de una micropipeta. Dejar incubar por 30minutos a temperatura ambiente (18°C a 25°C). 55

 

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Conclu Conc luid idos os los los 30mi 30minu nuto toss re real aliz izar ar el la lava vado do de lo loss po poci cillllos os repitiendo los pasos del punto b (Lavado de Muestras).

INCUBACION DEL SUSTRATO 



 

Tomar 100ul de lla a so solució lución n CR CROMOGEN OMOGENO O SU SUSTRAT STRATO O con la ayuda de micropipeta y añadir dentro de los poc pocillos illos de trabajo Dejar incubar por 30minutos a temperatura ambiente (18°C a 25°C). La incubación se realizara protegiendo las muestras de la luz (lugar  oscuro).

SOLUCION STOP 





Con la ayuda de una micropipeta, tomar 100ul de SOLUCION DE PARADA y añadir a cada pocillo de trabajo. Es Esta ta solu soluci ción ón será será añ añad adid ida a so sobr bre e la so solu luci ción ón CR CROM OMOG OGEN ENO O SUSTRATO.

MEDICION DE LA MUESTRA POR ESPECTROFOTOMETRIA 

V.

La medición fotométrica de la intensidad de color de las muestras se leerán a 450nm en un espectrofotómetro.

CALCULO DE L LO OS RESULTADOS 



 



La Lass abso absorb rban anci cias as obte obteni nida dass de la le lect ctur ura a del del equi equipo po,, se será rán n extrapolada extra poladass en una curva de calib calibració ración n previ previamente amente realizada realizada (Cuadro N° 1). Lo Loss resu resultltad ados os a re repo port rtar arse se so son n emit emitid idos os co con n la lass sigu siguie ient ntes es unidades RU/ml. Se cons consid ider erara ara un RESULTADO POSITIVO  cuando el resultado sea >5 RU/ml. Se considera considerara ra un RESULTADO NEGATIVO cuando el resultado sea