[Gonzalez Alfaro, J.] Laboratorio de Microbiologia(BookFi.org)

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Instrumentación y principios básicos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Instrumentación y principios básicos

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La Habana, 2004

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Datos CIP-Editorial Ciencias Médicas

González Alfaro José Laboratorio de Microbiología: Instrumentación y principios básicos/ José González Alfaro, Boris González González, Rosa T. Barrial González. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2004 256p. Fig. Incluye índice general. Está dividida en 19 capítulos. Listado de referencias al final de la obra. ISBN 959-212-131-1 1. MICROBIOLOGÍA 2. PERSONAL DE LABORATORIO 3. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. LIBRO DE TEXTO I. González González Boris II. Barrial González Rosa T. QW23

Diseño: Ac. Luciano O. Sánchez Núñez Emplane: Maria Pacheco Gola

© José González Alfaro, Boris González González y Rosa T. Barrial González, 2004 © Sobre la presente edición Editorial Ciencias Médicas, 2004

Editorial Ciencias Médicas Centro Nacional de Información de Ciencias Médicas Calle I No. 202, esquina Línea, Vedado, Ciudad de La Habana, 10400, Cuba Correo electrónico: [email protected] Teléfonos: 55 3375, 832 5338

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"Vivid en la serena paz de los laboratorios y preguntaos cada día: -¿Qué puedo hacer para mejorar la calidad del servicio que presto? -¿Cómo puedo ayudar a mi país? -¿Cómo puedo servir a la humanidad?

Luis Pasteur

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AUTORES José González Alfaro Técnico de Microbiología Especializado en Docencia, Profesor Facultad Tecnológica Dr. Salvador Allende Boris González González Lic. En Microbiología Hospital Salvador Allende, Profesor Facultad Tecnológica Dr. Salvador Allende Rosa T. Barrial González McS en Microbiología Hospital Salvador Allende, Profesora Facultad Tecnológica Dr. Salvador Allende

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ÍNDICE

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA / 17 INTRODUCCIÒN / 17 LABORATORIO CLÍNICO / 17 LABORATORIO DE MEDICINA TRANSFUSIONAL / 17 LABORATORIO DE RAYOS X / 17 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. GENERALIDADES / 18 ACTIVIDADES FUNDAMENTALES / 18 RECURSOS HUMANOS / 18 ESTRUCTURA ADMINISTRATIVA / 18 IMPORTANCIA DEL TRABAJO DE LOS PROFESIONALES Y TÉCNICOS DE MICROBIOLOGIA / 19 ESTRATEGIA ORGANIZATIVA DE TRABAJO / 19 DISPOSICIÓN DE LOS MATERIALES DE TRABAJO / 20 CERTEZA DE LOS MEDIOS REACTIVOS O MEDIOS A EMPLEAR / 20 ORDENAMIENTO DE LAS MUESTRAS / 20 PLANIFICACIÓN DEL TRABAJO A REALIZAR. / 20 CONCENTRACIÓN EN EL TRABAJO / 21 CUESTIONARIO / 21 BIOSEGURIDAD / 22 INTRODUCCIÒN / 22 RIESGOS FÍSICOS / 22 RIESGOS QUÍMICOS / 22 RIESGOS BIOLÓGICOS / 22 BIOSEGURIDAD. CONCEPTO / 22 DAÑO INDIVIDUAL Y COMUNITARIO. / 23 PRINCIPALES CAUSAS / 23 NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO / 23 PRINCIPIOS BÁSICOS / 24 PARA LA CORRECTA REALIZACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE LABORATORIO / 24 EMPLEO SISTEMÁTICO DE EQUIPOS Y MEDIOS DE SEGURIDAD / 25 EL DISEÑO ADECUADO DE LOS LABORATORIOS / 26 MEDIDAS DE PREVENCIÓN / 33 PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA PARA LA / 33 DESINFECCIÓN DE JERINGUILLAS Y AGUJAS REUSABLES, ANTES DE SU ESTERILIZACIÓN / 33 INDICACIONES EN CASOS DE ACCIDENTE / 34 LAVADO DE MANOS / 35 TIPOS DE LAVADO DE MANOS / 36 LAVADO SOCIAL DE LAS MANOS / 36

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LAVADO HIGIÉNICO O MÉDICO DE LAS MANOS / 36 LAVADO QUIRÚRGICO DE LAS MANOS / 37 MANEJO DE DESHECHOS PELIGROSOS / 38 CUESTIONARIO / 38 ETICA MEDICA / 40 INTRODUCCION / 40 LA MORAL / 40 ETICA / 41 TEORÍA DE LA MORAL / 41 ÉTICA NORMATIVA / 41 ÉTICA MÉDICA / 41 EN RELACIÓN CON EL PACIENTE Y SUS FAMILIARES / 42 EN RELACIÓN CON EL RESTO DE LOS TRABAJADORES DE LA SALUD / 44 EN LAS RELACIONES ENTRE EL DOCENTE Y LOS EDUCANDOS / 44 COMO PARTE DE LA SOCIEDAD / 44 LAS COMISIONES DE ÉTICA MÉDICA / 45 CUESTIONARIO / 45 EL AGUA / 46 INTRODUCCIÓN / 46 IMPORTANCIA / 46 CALIDAD DEL AGUA / 46 PURIFICACIÓN DEL AGUA / 47 DESTILACIÓN / 47 DESIONIZACIÓN / 48 PH DEL AGUA DESTILADA / 48 CONDUCTIVIDAD DEL AGUA / 48 CUESTIONARIO / 49 CRISTALERÍA DE LABORATORIO / 50 INTRODUCCIÓN / 50 COMPONENTES DEL VIDRIO / 50 SUSTITUTOS MODERNOS DEL VIDRIO / 50 CLASIFICACION / 51 CARACTERIZACIÓN DE LOS DIFERENTES TIPOS / 52 DE CRISTALERÍA / 52 CRISTALERÍA GENERALDE TRABAJO / 52 CRISTALERÍA DE MEDICIÓN / 59 MATERIALES DE PORCELANA / 63 LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN / 64 PREPARACIÓN PREVIA DE LA CRISTALERÍA / 65 PARA SU ESTERILIZACIÓN / 65 CUESTIONARIO / 67 ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN / 68 INTRODUCCIÓN / 68 TÉRMINOS EMPLEADOS RELACIONADOS CON LA ESTERILIZACIÓN Y LA DESINFECCIÓN / 68

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ESTERILIZACIÓN / 68 EL CALOR / 69 PROTOTIPO STANDARD DEL AUTOCLAVE / 70 MANIPULACIÓN DEL AUTOCLAVE / 71 CALOR HÚMEDO A 1000 C / 72 CALOR HÚMEDO A MENOS DE 1000C / 74 CALOR SECO / 74 USO DEL HORNO / 75 INCINERACIÓN / 76 MECHEROS / 76 LAS RADIACIONES / 79 RADIACIONES IONIZANTES / 79 RADIACIONES NO IONIZANTES / 80 FILTRACIÓN / 81 CARACTERÍSTICAS DE LOS FILTROS / 81 PREPARACIÓN DE LOS FILTROS / 81 DESINFECCIÓN / 83 SELECCIÓN DE LOS DESINFECTANTES / 84 CUESTIONARIO / 85 EQUIPOS CALORIFICOS / 87 INTRODUCCION / 87 INCUBADORA / 87 REQUERIMIENTO DE TEMPERATURAS / 87 CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DE ACUERDO CON SUS NECESIDADES DE OXÍGENO / 88 INCUBACIÓN DE BACTERIA ANAEROBIAS / 90 INCUBADORA PARA ANAEROBIOS / 92 BAÑO DE AGUA CALIENTE. (BAÑO DE MARÍA) / 92 CUESTIONARIO / 94 MICROSCOPIO / 95 INTRODUCCIÓN / 95 MICROSCOPIO. CONCEPTO / 96 DIFERENTES TIPOS / 96 MICROSCOPIO ÓPTICO / 96 CLASIFICACIÓN / 97 SISTEMA MECÁNICO / 98 PRINCIPIOS BÁSICOS / 109 INDICACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO / 111 OTRAS VARIANTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO / 112 MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO / 117 CUIDADO, LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO / 119 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO / 121 ESTRUCTURA DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO / 121 FUNCIONAMIENTO / 123

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CUESTIONARIO / 124 INSTRUMENTOS MECÁNICOS / 126 INTRODUCCIÓN / 126 PIPETAS MECÁNICAS / 126 PIPETA TIPO MARBURG / 127 EQUIPOS ELECTROMECÁNICOS / 131 LAS CENTRÍFUGAS / 131 PRINCIPIO TÉCNICO / 133 BALANCE DE LOS TUBOS / 133 FUNCIONAMIENTO / 134 EL ROTOR / 135 DISEÑO DEL EQUIPO / 135 FUNCIONAMIENTO / 136 EL AGITADOR / 136 DISEÑO DEL EQUIPO / 137 FUNCIONAMIENTO / 137 POTENCIOMETROS / 138 ESTRUCTURA / 138 ELECTRODOS / 139 TIPOS DE ELECTRODOS / 139 PRINCIPIO FUNCIONAL / 139 MEDICIÓN DEL PH / 140 PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO DEL POTENCIÓMETRO / 140 CUESTIONARIO / 141 BALANZAS / 143 INTRODUCCIÓN / 143 PRINCIPIO / 143 DIFERENTES TIPOS DE BALANZAS / 143 BALANZAS GRANATARIAS / 144 FUNCIONAMIENTO / 145 PROCEDIMIENTOS PARA EFECTUAR LA PESADA / 145 CAJA DE PESAS / 146 PRECAUCIONES / 147 BALANXA DE UN SOLO PLATILLO (TIPO OHAUS) / 147 BALANZA DE PRECISION O ANALÍTICA / 147 BALANZA DE PRECISIÓN MECÁNICA / 148 PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA PESADA / 150 PRECAUCIONES / 151 BALANZA DE PRECISIÓN ELÉCTRICA / 151 FUNCIONAMIENTO / 153 PESADA / 154 DETERMINACIÓN DEL PESO / 155 BALANZA ANALITICA DIGITAL / 156 CUESTIONARIO / 156 INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN / 158

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NO VOLUMÉTRICOS / 158 INTRODUCCIÓN / 158 INSTRUMENTOS. DIFERENTES TIPOS / 158 RELOJES / 158 TERMÓMETROS / 159 DENSÍMETROS / 160 CUESTIONARIO / 161 ACCCESORIOS, INSTRUMENTAL QUIRÚRGICO Y M ATERIALES DE CURACIONES / 162 INTRODUCCION / 162 ACCESORIOS / 162 GRADILLAS / 162 CESTOS / 163 SOPORTE UNIVERSAL / 163 PINZAS DE SUJECCIÓN / 164 TRÍPODE / 164 MALLA DE AMIANTO / 165 INSTRUMENTAL QUIRÚRGICO / 165 MATERIALES DE CURACIONES / 166 CUESTIONARIO / 167 TOMA DE MUESTRAS / 168 INTRODUCCIÓN / 168 MUESTRA. CONCEPTO / 168 MUESTRA REPRESENTATIVA / 168 MÉTODOS DE CONSERVACIÓN / 169 CALIDAD DE LA MUESTRA / 170 INSTRUCCIONES AL PACIENTE / 172 DIFERENTES TIPOS DE MUESTRAS / 172 EXUDADOS / 172 LÍQUIDOS ORGÁNICOS / 179 SANGRE / 181 LINFA / 182 EXCRECIONES / 183 FANERAS / 185 PRODUCTOS PATOLÓGICOS / 185 CUESTIONARIO / 186 PREPRACIÓN DE MUESTRAS EN LÁMINAS PARA EXÁMENES MICROSCÓPICOS / 187 INTRODUCCIÓN / 187 DIFERENTES MÉTODOS / 187 PREPARACIÓN DE MUESTRAS EN LÁMINAS PARA EXAMEN MICROSCÓPICO EN FRESCO / 187 MÉTODO DE LA GOTA COLGANTE / 188 PREPARACIÓN EN LÁMINAS DE MUESTRAS COLOREADAS / 189

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CUESTIONARIO / 191 COLORANTES Y COLORACIONES / 192 INTRODUCCIÓN / 192 CONCEPTO / 192 FUENTES DE OBTENCIÓN DE LOS COLORANTES / 192 COLORANTES NATURALES / 192 COLORANTES SINTÉTICOS / 193 CLASIFICACIÓN / 193 AFINIDADES TINTORIALES / 194 TOXICIDAD DE LOS COLORANTES. VENTAJAS Y DESVENTAJAS / 194 METODOS DE COLORACIÓN / 195 COLORACIÓN DE GRAM / 195 COLORACIÓN DE "ZIEHL NEELSEN / 199 CCOLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN (MODIFICADA PARA MYCROBACTERIUM LEPRAE) / 202 COLORACIÓN FRAGELAR DE LEIFSON (MODICFICACIÓN DE CLARK) / 203 COLORACIÓN DE CÁPSULAS / 204 COLORACIÓN DE ESPORAS / 205 CUESTIONARIO / 206 MEDIOS DE CULTIVO / 208 INTRODUCCIÓN / 208 OBJETIVOS DE LA NUTRICION MICROBIANA / 208 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO / 208 CONSISTENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO / 212 COMPUESTOS NUTRITIVOS BASICOS / 213 ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO / 217 DISTRIBUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO / 220 CONSERVACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO COMERCIALES / 222 CONSERVACIÓN DE MEDIOS ELABORADOS / 222 COMPROBACIÓN DE LA ESTERILIDAD DE LOS MEDIOS ELABORADOS / 223 CUESTIONARIO / 223 SIEMBRA E INCUBACIÓN / 225 INTRODUCCIÓN / 225 INSTRUMENTOS DE SIEMBRA / 225 DIFERENTES TIPOS / 226 MÉTODOS DE SIEMBRA / 227 INCUBACIÓN / 232 MANIFESTACIONES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO / 233 EN LOS MEDIOS DE CULTIVO / 233 CULTIVO PURO / 233 CULTIVO MIXTO / 233 RESIEMBRA / 233 CUESTIONARIO / 234 PRODUCTOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO / 235 INTRODUCCIÓN / 235

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HIDRATOS DE CARBONO / 235 INDICADORES / 236 SANGRE Y HEMODERIVADOS / 237 COLORANTES / 237 PRODUCTOS QUÍMICOS / 238 AMINOÁCIDOS / 238 ANTIBIÓTICOS / 238 SUEROS / 240 ANTÍGENOS / 240 LÁTEX / 241 CUESTIONARIO / 241 GARANTÍA DE LA CALIDAD / 243 INTRODUCCIÓN / 243 OBJETIVOS / 243 DIFERENTES TIPOS DE CONTROL / 244 PRUEBAS ESTADÍSTICAS / 245 PRINCIPALES FUENTES DE ERRORES / 245 MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS / 246 REGULACIONES DEL CONTROL DE CALIDAD / 247 EN BACTERIOLOGIA / 247 CONTROL DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS / 247 CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO / 248 CONTROL DE COLORANTES Y REACTIVOS / 248 CONTROL DE DISCOS PARA ANTIBIOGRAMA / 249 CONTROL DE ANTÍGENOS Y ANTISUEROS / 249 CONSERVACIÓN DE CEPAS PARA EL CONTROL BIOLÓGICO / 249 DEL LABORATORIO DE REFERENCIAALLABORATORIO QUE SERÁ EVALUADO / 251 DEL LABORATORIO DE LA UNIDAD AL LABORATORIO DE REFERENCIA / 251 CUESTIONARIO / 253 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS / 254

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PREFACIO Como parte de la política del estado cubano de universalizar la enseñanza, los cursos de técnicos medios de la salud que durante casi 4 décadas se impartieron, en más de 20 especialidades, en los institutos politécnicos, creados al efecto en todo el país, fueron diseñados como carreras universitarias, a partir del curso 2003-2004, mediante un nuevo modelo pedagógico que comprende dos niveles de formación intermedia: técnico básico y técnico medio, culminando la formación universitaria como licenciado en tecnología de la salud en diferentes perfiles. Los planes de estudio se han sustentado en la modalidad de estudio-trabajo, lo que permite a los estudiantes desarrollar progresivamente las habilidades en los propios escenarios donde se encuentran los diferentes servicios de salud, bajo la asesoría de profesionales y técnicos de experiencia, con lo que se pretende que adquieran la capacitación adecuada para brindar un servicio de excelencia a nuestra población, así como desempeñarse con eficacia y competitividad en cualquier otro país donde se requiera su colaboración. Como apoyo al diseño curricular del perfil de microbiología, hemos editado este libro de texto para que sea utilizado como bibliografía básica en el estudio de la asignatura Fundamentos y Principios Básicos del Laboratorio de Microbiología. Cada tema ha sido abordado con una proyección tecnológica, atendiendo a los contenidos del programa y el perfil de salida de los egresados, para lo cual se tuvo en cuenta precisar la particularidad utilitaria de cada equipo, instrumento, accesorios y otros materiales de trabajo, así como, todo lo concerniente a su descripción estructural estándar y sus variantes, la función de cada una de las partes y su interacción con el resto del sistema, el principio de su funcionamiento y el algoritmo de trabajo, además de todo lo concerniente a su cuidado y conservación. En los capítulos correspondientes a los procederes de laboratorio, cada aspecto ha sido explicado pormenorizadamente, de manera que, siguiendo al pie de la letra las instrucciones que se proporcionan, los estudiantes pueden realizar sin contratiempos los procederes en cuestión. 15

Al finalizar cada tema se ha incluido un cuestionario de preguntas, con el objetivo de que sea utilizado como guía de estudio individual o colectivo. Esperamos que este texto te sea de utilidad en el proceso de aprendizaje, no solo para alcanzar buenos resultados docentes, sino más bien, como una herramienta que te proporciona una capacitación perdurable, sobre el que se sustente tu desempeño profesional, que es, en definitiva, el objetivo esencial de tu formación. Los autores

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CAPITULO 1 EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INTRODUCCIÒN Los laboratorios son edificados especialmente diseñados, para la realización de experimentos, investigaciones científicas o el análisis de diferentes muestras, así como, para la producción de medicamentos, reactivos o la obtención de productos biológicos. Como parte del Sistema Nacional de Salud, en Cuba, existen diferentes tipos de laboratorios, por ejemplo:

Laboratorio Clínico La actividad básica que se realiza en este tipo de laboratorio es la de recibir las ordenes de análisis del médico de asistencia, tomar y recibir muestras biológicas, tales como: sangre, líquido cefalorraquídeo, jugo gástrico, orina, etc, a las cuales se les realizan análisis bioquímicos, hematológicos, serològicos, etc. Para determinar sus alteraciones en relación con sus valores de referencia. Realiza análisis de urgencia e informa los resultados.

Laboratorio de Medicina Transfusional El laboratorio de Medicina Trasnfusional, recibe indicaciones y solicitudes médicas, toma y recibe muestras biológicas, realiza sangrías a donantes, análisis inmunohematológicos y serológicos e informa los resultados. Transfunde sangre total o sus derivados. Y obtiene y procesa componentes de la sangre para uso terapéutico o de investigaciones. Cumple indicaciones de urgencia e informa los resultados.

Laboratorio de Rayos X El Laboratorio de Rayos X, recibe indicaciones médicas, administra contraste a los pacientes, para las investigaciones que así lo requiera, realiza exámenes radiológicos convencionales o mediante la utilización de técnicas modernas 17

de imagenología, para detectar alteraciones anatomofibiológicas en partes blandas u óseas del organismo asi como la presencia de cuerpos extraños. Cumple indicaciones de urgencia e informa los resultados.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. GENERALIDADES Actividades fundamentales El laboratorio de microbiología clínica, recibe indicaciones médicas, toma y recibe muestras biológicas a las que realiza investigaciones microbiológicas mediante exámenes microscópicos directos y por cultivos, con el objetivo de identificar a los agentes causales de las infecciones estudiadas, precisar su cuantía en los casos que así se requiera o demostrar la presencia de anticuerpos evocadores de la presencia del agente etiológico en cuestión. El servicio de microbiología, proporciona al medico de asistencia, información precisa relacionada con la sensibilidad o resistencia del agente infeccioso a los diferentes antibióticos, con lo cual aporta un dato de inestimable valor para la indicación del tratamiento También brinda apoyo especializado al Comité de Prevención y Control de las Infecciones Nosocomiales (infecciones intra hospitalarias) originadas en el hospital u otro establecimiento de atención de salud.

Recursos humanos El personal de los laboratorios de microbiología clínica, esta compuesto por profesionales universitarios; médicos especialistas de 1er o 2do. grado (microbiólogos), Ms.C. o Licenciados en microbiología, así como bioquímicos, biólogos y otros tecnólogos, ademas de técnicos medios, especializados o no, personal de oficina y auxiliares generales entrenados.

Estructura administrativa Todos los laboratorios están gerenciados por un jefe de servicio, cargo que ocupa generalmente un médico especialista o en su defecto otro profesional. Las diferentes secciones están dirigidas a su vez por diferentes profesionales. En la mayoría de los laboratorios, un técnico medio experimentado, se desempeña como jefe técnico, asumiendo determinadas funciones delegadas por el jefe de servicio. 18

IMPORTANCIA DEL TRABAJO DE LOS PROFESIONALES Y TÉCNICOS DE MICROBIOLOGIA Dado el incremento actual de las enfermedades emergentes y reemergentes, así como el desarrollo cada vez más creciente de cepas resistentes a los antibióticos de uso tradicional, el trabajo de los profesionales y técnicos de microbiología, adquiere cada día mayor protagonismo, al proporcionar datos exactos acerca de la identidad de los microorganismos en estudio, diagnósticados por procedimientos habituales o de diagnósticos rápidos, así como mediante técnicas serodiagnósticas de alta sensibilidad y por aportar el patrón de susceptibilidad a los antibióticos de los microorganismos en cuestión, todo lo cual amplia la capacidad del diagnóstico médico a magnitudes que están fuera del alcance de los métodos clínicos, posibilitando la indicación de un tratamiento mas eficaz. El perfeccionamiento del trabajo microbiológico se proyecta en dos direcciones: 1. La prestación de este servicio a toda la población del país, a nivel de la atención primaria, en policlínicos, así como en unidades hospitalarias o centros especializados, ya que ha sido y es política de la Revolución que los servicios médicos sean accesibles a todos los ciudadanos. Para ellos, casi todos los hospitales y policlínicos cuentan con servicios de microbiología y en la actualidad se esta concretando un proyecto de estaciones microbiológicas destinadas fundamentalmente al diagnostico mediante exámenes directores, en las investigaciones donde resulte factible, así como la toma y preservación de muestras en medios de transporte para su envió a los laboratorios de referencia. 2. Mejorar la calidad del servicio, mediante el acceso a las tecnologías más modernas, el perfeccionamiento en la formación de los profesionales del sector y la superación científico-técnica de los graduados a través de diplomados y cursos de post-grado, maestrías y doctorado.

ESTRATEGIA ORGANIZATIVA DE TRABAJO Para lograr una buena eficacia en la realización de los procederes de laboratorio, resulta indispensable sistematizar una estrategia de trabajo, que permita asegurar la calidad de los resultados, incrementar la productividad de las deter19

minaciones y al mismo tiempo que proporcione una adecuada protección contra posibles accidentes. Para el logro de estos propósitos el laboratorista debe cumplir con las siguientes indicaciones:

Disposición de los materiales de trabajo Seleccione todos los utensilios (escrupulosamente limpios o estériles) que se requieran para el trabajo a realizar (gradillas, tubos, pipetas, etc) y ubíquelos ordenadamente sobre la mesa de trabajo, de manera que queden al alcance de la mano. En este sentido es importante tener la certeza de que no falte ningún material que implique tener que interrumpir el procedimiento para su localización, ya que además de ocasionar una pérdida de tiempo innecesaria, la discontinuidad de la marcha analítica, puede en algunos casos, introducir causas de errores, por alteración del tiempo establecido en algún paso de la técnica y en consecuencia afectarse los resultados.

Certeza de los medios reactivos o medios a emplear a) Al seleccionar los reactivos, lea cuidadosamente la etiqueta del frasco para evitar errores, cerciórese del nombre del reactivo, su concentración y que la fecha de vencimiento no haya caducado. b) Verifique mediante un examen visual que no se encuentran alterados (precipitados, turbios, etc). c) Cerciórese de que se le haya hecho control de calidad. d) Colóquelos en la mesa de trabajo en el orden en que serán utilizados. e) Al destaparlos coloque cada tapa delante del frasco correspondiente para evitar errores al taparlo que impliquen su contaminación.

Ordenamiento de las muestras Coloque las muestras en la mesa de trabajo por orden numérico de izquierda a derecha.

Planificación del trabajo a realizar. Siempre que resulte pertinente conviene planificar el trabajo a realizar en el laboratorio, para aprovechar al máximo el tiempo disponible. Por ejemplo, si se 20

van a preparar exámenes microscópicos directos de heces fecales, para la búsqueda de protozoos, por los métodos eocina y lugol, es conveniente hacer las dos preparaciones por separados en una misma lamina portaobjetos, lo que facilita la operatoria microscópica sin pérdida de tiempo al no tener que intercambiar láminas.

Concentración en el trabajo Durante todo el tiempo que dure la ejecución del procedimiento, concentre su atención en cada paso de la técnica, evite interrupciones innecesarias y absténgase de mantener conversaciones ajenas a lo que esta haciendo. Trabaje con meticulosidad y esmero y aplique las medidas de asepsia cuando la determinación así lo requiera.

CUESTIONARIO 1. Especifique El concepto que Ud. tenga de lo que es un laboratorio. 2. Nombre diferentes laboratorios que pertenezcan al Sistema Nacional de Salud. 3. Refiérase a las actividades fundamentales que se realizan en un laboratorio de microbiología clínica. 4. Indique las diferentes categorías ocupacionales del personal que labora en un laboratorio de microbiología. 5. Explique la estructura administrativa de los laboratorios. 6. ¿En que radica la importancia del trabajo de los profesionales y técnicos de microbiología? 7. Explique cada uno de los indicadores establecidos para la estrategia organizativa del puesto de trabajo.

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CAPÍTULO 2 BIOSEGURIDAD INTRODUCCIÒN Los profesionales y técnicos de la salud que laboran en unidades hospitalarias, policlínicos, etc o en centros de investigaciones biomédicas, están expuestos, por la naturaleza de su trabajo, a diversos riesgos profesionales, que pueden clasificarse según su origen en:

Riesgos físicos Ocasionados regularmente por, traumas, exposiciones al calor, la electricidad, las radiaciones, etc.

Riesgos químicos Originados por el manejo con sustancia inflamables, corrosivas, tóxicas, cancerigenas, etc.

Riesgos biológicos Debido a la manipulación frecuente de pacientes infectados, el manejo de productos sépticos y el nivel de contaminación ambiental predominante en el ámbito hospitalario, especialmente en los laboratorios donde se realizan exámenes de sangre, líquidos corporales, excreciones y productos patológicos.

BIOSEGURIDAD. CONCEPTO Es la disciplina que se ocupa de la prevención y control del riesgo biológico al que están expuestas, directa o indirectamente las personas, los animales y las plantas como consecuencias de accidentes o negligencias, en los laboratorios de microbiología, clínicos, etc. Así como en la industria biotecnológica y el trabajo con organismo transgénicos. 22

DAÑO INDIVIDUAL Y COMUNITARIO. PRINCIPALES CAUSAS Los accidentes imprevistos y el deficiente desempeño del personal ocupacionalmente expuesto, son las principales causas del daño individual que bajo determinadas circunstancia, puede extenderse al entorno hospitalario o a la comunidad, ocasionando diversos grados de afectaciones médicas, veterinarias o fitosanitarias con el consiguiente perjuicio económico o ecológico.

NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO Cuadro 1: Diferentes niveles de riesgo biológico. Los niveles de riesgo para un laboratorio básico, son los de tipo I y II. RIESGO

CARACTERIZACIÒN DE LOS AGENTES PATÓGENOS INVOLUCRADOS

INDIVIDUAL COMUNITARIO I

ESCASO

ESCASO

TIENEN POCAS PROBABILIDADES DE PROVOCAR ENFERMEDADES EN LOS SERES HUMANOS Y EN LOS ANIMALES PUEDEN PROVOCAR ENFERMEDADES EN LOS SERES HUMANOS Y EN LOS ANIMALES. TIENEN POCAS PROBABILIDADES DE ENTRAÑAR RIESGOS GRAVES PARA EL PERSONAL DEL LABORATORIO, LA COMUNIDAD, LOS ANIMALES Y EL MEDIO AMBIENTE. SU EXPOSICIÓN EN EL LABORATORIO PUEDENPROVOCARINFECCIONESGRAVES.

II

MODERADO LIMITADO

III

ELEVADO

ESCASO

PUEDEN PROVOCAR ENFERMEDADES GRAVES EN SERES HUMANOS. GENERALMENTE LA INFECCIÓN NO SE PROPAGA DE UN INDIVIDUO A OTRO.

IV

ELEVADO

ELEVADO

PUEDEN PROVOCAR ENFERMEDADES GRAVES EN SERES HUMANOS Y EN LOS ANIMALES. PUEDEN PROPAGARSE FÁCILMENTE DE UN INDIVIDUO A OTRO, DIRECTA O INDIRECTAMENTE.

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PRINCIPIOS BÁSICOS Los principios básicos, regidos por las normas de bioseguridad para la prevención y control del riesgo biológico son los siguientes: 1. 2. 3.

La correcta realización de las técnicas de laboratorio. El empleo sistemático de los equipos y medios de seguridad. El diseño adecuado de los laboratorios.

Para dar cumplimiento a estos principios se establece en el reglamento un código practico, con las indicaciones y regulaciones a cumplimentar por el personal de laboratorio, que serán expuestas resumidamente a continuación.

Para la correcta realización de las técnicas de laboratorio a) Regulaciones básicas. - Aplicar rigurosamente las medidas de asepsia y antisepsia en todas las ocasiones en que la acción a realizar así lo requiera. - Los instrumentos de siembra de platino o nicròn, se deben esterilizar a la llama del mechero, antes y después de su uso. A los efectos de evitar salpicaduras del material residual empleado, el instrumento debe introducirse gradualmente en la llama del mechero hasta ponerse al rojo vivo. - Los frotis coloreados, así como los portaobjetos, cubreobjetos y pipetas utilizadas se depositaran en recipientes apropiados que contengan solución desinfectante. - Los procederes técnicos han de realizarse de manera que se evite en lo posible la formación de aerosoles siendo las causas mas frecuentes las siguientes. . Flameos de instrumentos de siembra contaminadas con productos biológicos infecciosos. . Pipeteo energético. . Retirar la aguja de las jeringuillas que contengan material contaminado. . Apertura de cultivos liofilizados en ámpulas. . Abrir la tapa de la centrífuga antes de que esta se detenga o de inmediato, cuando se ha centrifugado muestras biológicas o material contaminado. 24

. La caída brusca de las placas o tubos de cultivos, aún cuando no llegaran a romperse. Los tubos de ensayo que contengan cultivos, deben mantenerse siempre en posición vertical en una gradilla. Nunca dejarlos en posición horizontal, ya que el agua de condensación puede arrastrar los gérmenes del cultivo, humedecer los tapones de algodón y contaminar la mesa de trabajo. Los cultivos en placas deben mantenerse con la tapa hacia abajo en el interior de la incubadora o sobre la mesa de trabajo. b) Higiene del laboratorio y el personal. - Mantener el laboratorio escrupulosamente limpio, retirando del mismo material que no tenga relación con el trabajo. - Las superficies de las mesetas se descontaminaran al menos una vez al día y en caso de derramamiento de sustancia potencialmente peligrosas de inmediato. - Velar por el cumplimiento del programa de lucha contra insectos y roedores. - En las zonas de trabajo del laboratorio, no comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosméticos, realizando estas actividades solamente en las áreas autorizadas. - No humedecer las etiquetas de los frascos con la lengua. - Lavarse las manos después de haber manipulado pacientes, material contaminado, o animales y al retirarse del laboratorio (ver mas adelante, procedimiento para el lavado de manos).

Empleo sistemático de equipos y medios de seguridad - Utilizar bata sanitaria u otras prendas apropiadas cuando la envergadura del trabajo así lo requiera, como: batones, botas, nasobucos, etc. - Emplear guantes quirúrgicos en todo trabajo que entrañe contacto con sangre, material infecciosos o animales infectados. Los guantes se deben retirar asépticamente y ser esterilizados en autoclave. - Utilizar pipetas mecánicas para manipular líquidos infecciosos. Nunca pipetear con la boca esos productos peligrosos. - Siempre que sea necesario, proteger los ojos y la cara de salpicaduras e impactos mediante gafas de seguridad, viseras, pantalla facial u otros dispositivos de protección. - Cuando la naturaleza del trabajo a realizar así lo requiera, recurrir al empleo de campanas químicas, gabinetes, o cabinas de seguridad. 25

- Utilizar incineradas de asas microbiológicas.

Fig. 1 : Equipos y medios de seguridad: a) Incinerador de asas, b) Guantes de polietileno, Lentes de seguridad, d) Nasobuco.

El diseño adecuado de los laboratorios Debido a los diversos riesgos implícitos en las investigaciones microbiológicas, la construcción o adaptación de un laboratorio de microbiología clínica, requiere de condiciones especiales que propicien el establecimiento de una organización de trabajo, que permita al personal del laboratorio, el cumplimiento estricto de las normas de asepsia y antisepsia establecidas para la manipulación de los pacientes, el manejo y control de los microorganismos presentes en las diferentes muestras y cultivos durante el proceso de la investigación, así como, el de los gérmenes ambientales o contaminantes que por diversas vías pueden tener acceso a las áreas de trabajo. Dentro de los requerimientos esenciales del diseño constructivo se encuentran los siguientes. 1. Como medida de seguridad, la construcción de un laboratorio de microbiología se hará en un área separada de locales destinados a otros fines. 2. Las paredes, en especial la parte inferior, el piso y el techo, deben ser lisos, sin grietas o ralladuras donde se pueda acumular la suciedad y el polvo que dificulten su limpieza y desinfección. 3. Casi todas las salas o cubículos del laboratorio dispondrán de mesetas, generalmente empotradas en las paredes o instaladas en el centro del local. Las mesetas deben ser construidas con acero inoxidable u otro material simi26

lar que propicie un terminado de su superficie liso y sin poros y que sea al mismo tiempo muy resistente a la acción de los ácidos, álcalis y sustancias corrosivas, de manera que puedan ser desinfectadas o esterilizadas por métodos físicos o químicos sin que se deterioren. La superficie de estas mesetas no deben reflejar excesivamente la luz para que no interfiera la lectura de algunos exámenes ni afecte con el tiempo la vista del laboratorista.Las que sean destinadas para trabajar sentado, tendrán una altura de 75 a 80 cm de altura por 60 cm de ancho, no debiendo existir ninguna construcción debajo que dificulte la colocación de las piernas y solo de ser necesario podrá disponer de una gaveta. Las destinadas para trabajar de pie tendrán una altura de 85 a 90 cm de alto y el mismo ancho que la anterior. Estas mesetas generalmente están provistas de gavetas y estantes con anaqueles, destinados a la colocación de la cristalería, los frascos con reactivos colorantes, medios de cultivos, así como otros materiales e instrumentos.

Fig. 2 : Disposición de las mesetas en el laboratorio.

4. Las ventanas deben estar situadas a unos 30 cm, mínimo, por encima de la altura de las mesetas para evitar la exposición directa del aire y el polvo procedente del exterior. 5. El laboratorio dispondrá de instalaciones de : agua, electricidad, aire y gas. El grado de iluminación y ventilación se debe adecuar a las normas establecidas para locales cerrados o abiertos, atendiendo a la cantidad de personas previstas, que estarán presentes en un turno de trabajo. Caracteres estructurales La estructura de un laboratorio de microbiología, dependerá esencialmente de la disponibilidad de espacio. En aquellos laboratorios que cuenten con sufi27

cientes salas y cubículos, las actividades suelen ser compartimentadas en las siguientes áreas o secciones de trabajo: -

Sala de recepción y archivo. Cubículo para las tomas de muestras. Sala principal de trabajo. Cuarto de siembra. Cubículo para la preparación de medios de cultivo, reactivos y colorantes. Cubículo para la esterilización y preparación de materiales.

La sala de recepción y archivo, debe estar a la entrada de la edificación y el resto de las secciones de trabajo, se ubicará estratégicamente en el interior del laboratorio, de menor a mayor nivel de contaminación. (áreas bio limpias o bio sucias) con esta estrategia, los pacientes, familiares y visitantes no tendrán acceso a las áreas de riesgo, siendo limitado para el resto del personal del laboratorio y otros visitantes, no relacionados con la actividad que se realiza en esas secciones de trabajo, todo lo cual está encaminado a reducir la probabilidad de posibles propagaciones de agentes patógenos por todo el laboratorio y la comunidad. Sala de recepción y archivo En esta sección, un personal de oficina entrenado, recepciona las órdenes de análisis entregadas por los propios pacientes o enviadas desde las salas de la unidad hospitalaria, en caso de pacientes encamados, o procedentes de otras unidades de salud vinculadas al centro, donde se procederá a asentar en el libro de registro de entrada, el numero, que consecutivamente le corresponde a esa solicitud, la fecha de registro, los datos del paciente (nombre y dos apellidos y número de historia clínica), la procedencia (consulta externa, sala donde se encuentra hospitalizado o unidad de salud que hace la solicitud), y el tipo de investigación que se indica.

Fig. 3 : Libro de registro.

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En un pequeño cuadrante que se encuentra impreso en el ángulo superior derecho de la orden de análisis se notara el número asignado en el registro de entrada.

Fig. 4 : Orden de análisis.

Cuando la orden se entrega conjuntamente con la muestra (orina, heces, esputo, etc) en los frascos se anota con lápiz cristalográfico, el mismo número de registro. Como medida de seguridad, los frascos que contienen muestras no deben estar en contacto con las órdenes de análisis, dada la posibilidad de que se haya producido algún derramamiento durante su recolección en cuyo caso, la manipulación ulterior de las ordenes pueden propiciar una vía de contagio. Si se tratara de un tipo de muestra que deba ser tomada en el laboratorio (exudados, lesiones infecciosas en la piel, etc) después de registrada, la orden le será devuelta al paciente, quien la entregara al técnico que le vaya a tomar la muestra. Concluida la investigación, los resultados serán debidamente informados en la orden de análisis, por el técnico que realizó el examen, quien la firmará y anotara la fecha de realización, debiendo reintegrarla a la sección de recepción y archivo, donde se anotará los datos en el libro de registro de resultados, lo que permitirá en caso de extravío de la orden, emitir un duplicado. Las ordenes con los resultados serán enviadas al Dpto. de archivo de la unidad hospitalaria para que sean archivados en las historias clínicas o en el laboratorio cuando deban ser recogidas por los interesados. Si el examen no se puede realizar y se solicite su repetición, en la orden de análisis se especificaran las causas (muestras escasa, muestra contaminadas, suero hemolizado, etc). Además de estos datos primarios que se registran diariamente, la sección de archivo tiene la función de procesar un resumen bioestadístico mensual con los resul29

tados de cada tipo de investigación y adicionalmente llevar un control estadístico establecido por los programas de enfermedades de transmisión sexual y tuberculosis. Cubículos para las tomas de muestras En este local, el laboratorista dispondrá de los recursos necesarios (guantes, hisopos estériles, instrumentos de siembra, mechero, etc, etc) para la toma de las diferentes muestras (exudado faringeo, óptico, conjuntival, etc) debiendo contar con la privacidad requerida y las condiciones necesarias, para la toma del exudado vaginal, uretral, etc tales como parabanes, camillas ginecológicas, etc). Sala principal de trabajo Esta sala puede contar de uno o varios cubículos, constituyendo cada uno de ellos, una sección de trabajo independiente, en la que se realizan determinadas investigaciones, por ejemplo: Urocultivo, coprocultivo, misceláneas, tuberculosis, parasitología, serología, etc. En algunas unidades, particularmente, centros municipales o provinciales, pueden existir otras secciones especializadas para la investigación de lepra, leptospirosis, etc. Cada sección contará con los recursos necesarios para la realización de esas investigaciones especificas, tales como: preparación y cultivo de las muestras, tinciones, observaciones microscópicas, pruebas de identificación, etc. Estas secciones de trabajo deben estar climatizadas. Cuarto de siembra Generalmente los laboratorios pequeños que disponen de una sala principal en un único local tienen anexado un pequeño cubículo que es donde radica el cuarto de siembra. Este cuarto esta provisto de mesetas y de todos los materiales e instrumentos para la realización de siembras, resiembras y de aquellas actividades que requieran de una estricta asepsia, así como de una lámpara de luz ultravioleta para la esterilización del medio ambiente, o la superficie del inmueble y el mobiliario. Al igual que la sala principal de trabajo, debe estar climatizado. Cubículo para la preparación de medios de cultivos, reactivos y colorantes Este local estará equipado con balanzas, baño de María, potenciómetro, refrigerador, etc., así como de la cristalería y otros accesorios para estos fines. En sus estantes y anaqueles se almacenará el stok de productos químicos, medios de cultivos y otros reactivos y colorantes, debiendo contar con una colección de cepas microbianas certificadas para la realización del control de calidad. 30

Cubículo para la esterilización y preparación de materiales Este local se destina para la realización de diversas actividades, entre las que se encuentran las siguientes. . Limpieza y desinfección de la cristalería y otros materiales, incluyendo su secado. . Empaquetamiento y preparación de la cristalería y otros materiales para su esterilización. . Esterilización. . Destilación de agua. Limpieza y desinfección de la cristalería y otros materiales, incluyendo su secado En este local se instala una meseta con tres fregaderos colindantes; en el primero se friega la cristalería con detergentes especiales y agua abundante empleando hisopo de tamaño apropiado. En el segundo de enjuaga, con agua cruda y en el tercero con agua destilada. Las pilas de estos fregaderos deben estar lo suficientemente altas como para permitir el enjuague de las pipetas en posición vertical.

Fig. 5 : Hisopo para la limpieza de la cristalería.

En un área de este local se situara un recipiente grande con solución desinfectante o sulfocromica con el objetivo de sumergir la cristalería que asi lo requiera. Empaquetamiento y preparación de la cristalería y otros materiales para su esterilización La cristalería de trabajo y otros materiales que vayan a ser sometidos a un proceso de esterilización, en horno o autoclave, deben ser previamente taponados 31

con algodón y/o empaquetados con papel de estraza, para evitar su posterior contaminación una vez estériles, por las manipulaciones ulteriores y los microorganismos presentes en el medio ambiente. Esterilización El local debe estar dividido en dos áreas; una para esterilizar el material limpio y la otra para esterilizar el material sucio. Como se comprenderá se requieren de dos autoclaves. El área para el tratamiento del material limpio contará al menos con un horno que además de ser utilizado para la esterilización se puede emplear para el secado. Destilación de agua Generalmente, los laboratorios que disponen de destiladores metálicos, los instalan en este lugar (Área limpia) procediendo a la destilación y recolección del agua destilada en botellones con tapón de goma.

Fig. 6 : Destilador metálico de agua.

El flujo de trabajo en esta sección es el siguiente: entrada del material sucio, esterilización, fregado, preparación y esterilización del material limpio. 32

MEDIDAS DE PREVENCIÓN 1. El personal del laboratorio recibirá, a través de su director una minuciosa información acerca de: a) Las medidas de seguridad establecidas. b) La existencia y localización de un manual de seguridad y de operaciones en el que se identifiquen los riesgos actuales y potenciales y se indiquen los procedimientos para su reducción. c) Los riesgos mas probables que pueden ocurrir debido al tipo de investigaciones que se realizan en ese laboratorio. 2. A todos los miembros del personal del laboratorio y demás personas expuestas se les tomara muestras de sangre periódicamente y con el suero se realizaran determinaciones que servirán de referencia en función de los agentes infecciosos manipulados. 3. Durante el horario de trabajo las puertas del laboratorio permanecerán cerradas y solo tendrán acceso el personal del laboratorio y las personas autorizadas que hayan sido debidamente informadas sobre los posibles riegos y satisfagan cualquier requisito que se exija para tener acceso, como por ejemplo la inmunización actualizada. No se permitirá la presencia de niños en las zonas de trabajo del laboratorio. 4. No se permitirá tampoco la entrada en el laboratorio de animales que no tengan relación con el trabajo que se esté realizando.

PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA PARA LA DESINFECCIÓN DE JERINGUILLAS Y AGUJAS REUSABLES, ANTES DE SU ESTERILIZACIÓN 1. La manipulación se hará siempre con guantes quirúrgicos estériles observando un cuidado extremo para evitar pinchazos o cortaduras. 2. Dejar las agujas colocadas en la jeringuillas. 3. Sumergir la jeringuilla con la aguja ensamblada, en posición horizontal, en el interior de una bandeja que contenga solución desinfectante y exponerla a su acción por un espacio de tiempo no menor de 20 minutos. 4. Descargar la solución desinfectante contenida en la jeringuilla a través de la aguja. 5. Enjuagar la jeringuilla y la aguja con agua (llenar y vaciar). Observar que no queden restos de sangre ni manchas. 6. Examinar la aguja y la jeringuilla cerciorándose de que el ajuste de la boquilla de la aguja a la jeringuilla es adecuado y que las marcas volumétricas se mantienen legibles. 33

7. Secar y proceder a empaquetar las agujas y las jeringuillas por separado con doble envoltura para su esterilización en autoclave.

INDICACIONES EN CASOS DE ACCIDENTE En caso de derrame de muestras biológicas o material contaminado a) Colocarse guantes quirúrgicos. b) Cubrir la sustancia derramada con material absorbente (algodón, papel de filtro, etc). c) Aplicar solución desinfectante de hipoclorito de calcio o sodio al 1% alrededor del derrame y sobre el material absorbente esperar de 10 a 20 minutos. d) Remover el material absorbente y colocarlo en un contenedor destinado para materiales contaminados. e) Limpiar nuevamente el área contaminada con el desinfectante y posteriormente con detergente y agua abundante.

Fig. 7 : Desinfección de muestras biológicas o material infeccioso derramado accidentalmente: a)Cubrir el área con un material adsorbente, b)Aplicar solución desinfectante, c)Remover el material infeccioso, d)Aplicación nuevamente de desinfectante, e) y f) Limpieza con agua y detergente.

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En caso de lesiones o contacto no protegido con material contaminado o muestras biológicas a) Lavar de inmediato la lesión con agua y jabón. b) Estimular el sangramiento, para arrastrar mecánicamente a los agentes infecciosos. c) Aplicar una solución desinfectante débil de hipoclorito de sodio o calcio. Curar y cubrir la lesión. d) Para continuar el trabajo colóquese un débil o guante. e) En caso de salpicaduras de sangre en los ojos o la boca, debe irrigarse de inmediato con cantidades de agua abundantes o solución salina fisiológica. f) Los derrames accidentales, punturas, lesiones o exposiciones con muestras o material contaminado, deben ser comunicados lo antes posible al jefe del laboratorio, quien registrará el hecho en el libro de control que existe al efecto. g) El jefe de Dpto. verificara la procedencia de la muestra y si comprueba que el instrumental estaba contaminado con sangre o liquido corporal de un enfermo o portador de VIH, lo notificara al Dpto. de Epidemiología y orientará al trabajador que reporte cualquier síntoma febril agudo, sobre todo si es acompañado de rash, diarreas o adenopatías que ocurra dentro de las 12 semanas con posterioridad a la exposición. El personal accidentado debe ser puesto en observación epidemiológica que incluya pruebas para detectar anticuerpos contra el VIH que serán realizadas 6 semanas después de la exposición. Si la prueba es negativa, se repite a los 3 meses y con esa periodicidad durante un año. Si al cabo de ese tiempo continua negativa se da, el alta epidemiológica.

LAVADO DE MANOS Objetivo: Eliminar la micro biota transitoria y disminuir la residente o normal de las manos y los antebrazos. Justificación: La medida básica mas importante, relacionada con la higiene personal lo constituye sin lugar a dudas el lavado de manos. La manipulación de los pacientes o materiales, trae como consecuencia la contaminación de las manos y las muñecas pudiendo extenderse a los antebrazos, por lo que de no debe aplicarse con sistematisidad estas medidas higiénicas al personal de la salud puede propagar la infección de un paciente a otro y contribuir de esta manera al incremento de las infecciones nosocomiales. En el lavado de manos intervienen elementos mecánicos y químicos. El agua arrastra mecánicamente una parte de los microorganismo presentes en las 35

manos, mientras que el jabón emulsiona las materias extrañas y reduce la tensión superficial de los gérmenes presentes lo que facilita su lisis, conjuntamente con la eliminación de los ácidos grasos y la suciedad.

TIpos de lavado de manos . Lavado social. . Lavado higiénico. . Lavado quirúrgico.

Lavado social de las manos Concepto: Es la limpieza mecánica de las manos con agua y jabón convencional, que elimina todo tipo de suciedad visible. Empleo: Siempre que se perciban las manos sucias, al realizar actividades fisiológicas, personales o sociales que lo requiera y antes y después del contacto con pacientes en procederes no invasivos y sin riesgo. Procedimiento 1. Retire las prendas de las manos y las muñecas. 2. Abra la llave del agua y tome el jabón. Remoje las manos hasta las muñecas y haga una abundante espuma. 3. Con la punta de los dedos, enjuague el jabón y colóquelos en la jabonera. 4. Cierre la llave con una de las manos y enjabónelas. 5. Frote rigurosamente las manos con movimiento rotativo y haga que la espuma se extienda hasta las muñecas. 6. Abra la llave hasta que salga un chorro abundante de agua y enjuague las manos y manténgalas en un plano horizontal. 7. Junte las manos en forma de recipiente, llénelas de agua y enjuague la llave. 8. Cierre la llave y séquese las manos con servilletas, papel o paño para cada una, sin frotárselas.

Lavado higiénico o médico de las manos Concepto: Es la limpieza mecánica de las manos con agua y jabón convencional, las que se frotan de forma enérgica se enjuagan abundantemente durante un minuto y después del secado se aplica solución antiséptica.. Empleo: Se utiliza ante las maniobras semicriticas, con el objetivo de arrastrar suciedades, evitar infecciones cruzadas y proteger al personal de salud. 36

Procedimiento 1. Realice el lavado social de las manos hasta el paso en que se enjuaga la llave con las manos juntas en forma de recipiente. 2. Moje las manos y antebrazos (5 cm por encima de las muñecas) enjabónelas con jabón convencional o bacteriostático y haga una abundante espuma. 3. Frote las manos de la siguiente forma: a) Palma con palma. b) Palma derecha sobre dorso de la mano izquierda o viceversa. c) Palma con palma intercalando los dedos. d) Dorso de los dedos flexionados para cada mano. e) Pulgar derecho con la mano izquierda y viceversa. f) Frotación de las yemas de los dedos sobre las palmas. g) Frote en forma circular la superficie de los antebrazos 5 cm por encima de las muñecas. h) Realice un enjuague abundante y deje que el agua corra hacia los codos. i) Seque las manos y antebrazos con paños, servilletas o papel estéril (uno para cada mano) apriete suavemente la piel sin restregar, comience por las manos y finalice en los codos nunca regrese a las manos. j) Aplicar solución antiséptica y déjela actuar sobre las manos por un tiempo no menor de 2 minutos antes de la maniobra semicritica.

Lavado quirúrgico de las manos Concepto: Es la limpieza mecánica de las manos con agua, jabón y cepillo, con utilización de solución antiséptica después del secado. Empleo: Antes de cualquier maniobra critica. Procedimiento 1. Realice el lavado social de las manos hasta enjuagar la llave con las manos juntas. 2. Moje las manos y antebrazos hasta 2 pulgadas arriba del codo, enjabónelos con jabón convencional en forma circular y haga una abundante espuma. 3. Frote las manos igual que para lavado higiénico incluyendo los antebrazos. 4. Tomar un cepillo estéril para cada mano, aplíquele jabón y cepille bien las uñas, lechos ungueales y la yema de los dedos. 5. Enjuague bien sin dejar ningún residuo de jabón, mantenga las manos siempre levantadas para que el agua corra hacia los codos. 37

MANEJO DE DESHECHOS PELIGROSOS Se debe establecer un sistema de identificación y separación de los materiales contaminados (y de sus recipientes). a) Deshechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura. b) Objetos aguzados y cortantes (agujas, jeringuillas, etc). c) Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización. d) Material contaminado para su eliminación. Objetos aguzados y cortantes: Las agujas hipodérmicas deben ser colocadas en recipientes con paredes que no puedan traspasarse fácilmente. Cuando estos estén llenos se colocaran dentro de otros recipientes para desechos contaminados y se incineran, incluso cuando las normas de laboratorio consistan en esterilizarlos primero en autoclave. Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización: Este material se coloca en recipientes impermeables poco profundos que contenga una cantidad desinfectante suficiente para cubrir el contenido y se llevan al autoclave. No se efectúa ninguna acción previa; cualquier limpieza o reparación que se considere se hará después de esterilizados. Material contaminado para eliminación: Todos los cultivos y materiales contaminados suelen esterilizarse en autoclave, previamente introducidos en recipientes impermiables,antes de proceder a su eliminación. Después del tratamiento en autoclave puede colocarse el material en recipientes apropiados para el transporte al incinerador o a otro lugar de evacuación. Lo mejor es poner los deshechos en un saco plástico que se introduce en una caja de cartón, con lo que se puede incinerar el contenido y el continente. Si se utiliza recipientes especiales concebidos para el transporte, habrá que limpiarlos y desinfectarlos después de descargar transporte, habrá que limpiarlos y desinfectarlos después de descargar el contenido y antes de devolverlos al laboratorio. Estos recipientes deben ser impermeables y estar provistos de tapa herméticas.

CUESTIONARIO 1. 2.

Nombre los diferentes tipos de riesgo a los que están expuestos los profesionales y técnicos de microbiología en el ejercicio de su trabajo. Enuncie el concepto de Bioseguridad. 38

3. 4.

¿Cuáles son las principales causas del daño individual? Especifique que elemento biológico resultan vulnerables de ser afectados en la comunidad por negligencias o accidentes en un laboratorio que trabaja con agentes biológicos peligrosos. 5. Caracterice los diferentes niveles de riesgo, en cuanto a la afectación individual y comunitaria. 6. Mencione los principios básicos establecidos para la prevención y control del riesgo biológico. 7. Refiérase a las medidas establecida para evitar la formación de aerosoles. 8. Mencione las prohibiciones establecidas en el código practico o reglamento de estricto cumplimiento para el personal que labora en el laboratorio, que están encaminadas a evitar la ocurrencia de contagio infecciosos. 9. Describa como debe ser el diseño constructivo de un laboratorio de microbiología. 10. ¿Qué instalaciones debe tener el laboratorio para su buen funcionamiento? 11. Nombre las diferentes salas o cubículos con que se estructura un laboratorio de microbiología. 12. Especifique las característica constructivas que debe tener cada una de las salas o cubículo, y su equipamiento. 13. Indique cuales don las actividades que se realizan en cada sala o cubículo del laboratorio. 14. Precise las medidas de prevención que debe conocer el personal que labora en los laboratorios. 15. ¿Qué indicaciones se establecen en caso de accidente?. 16. ¿Cuáles son las indicaciones a seguir en el caso de que se produzcan derrames de muestras biológicas o material contaminado? 17. Describa pormenorizadamente las normas establecidas para efectuar las diferentes técnicas de lavado de manos. 18. ¿Cómo se clasifican los objetos peligrosos antes de ser deshechos? 19. Explique como usted procede con cada tipo de material u objeto contaminado, teniendo en cuenta su reutilización o eliminación.

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CAPITULO 3 ETICA MEDICA INTRODUCCION La sociedad está formada pro un conjunto de seres humanos que conviven dentro un mismo ámbito cultural, relacionándose de un modo u otro, para obtener los medios de subsistencia necesarios (alimentos, vestidos, vivienda, instrumentos de producción, etc.). En todo sistema social impera un modo de producción que determina la base económica de esa sociedad, cuya estructura responde a los intereses de la clase dominante, mediante el establecimiento de relaciones de producción basada en la propiedad sobre los medios de producción que va a delimitar el grado de accesibilidad a los bienes materiales y culturales de cada clase y/o capa social existente, lo que dependerá del lugar que ocupen en la escala social y el carácter privado o social de las fuerzas productivas. Como una necesidad de las sociedades divididas en clases, surge el Estado; una organización política de la clase dominante que tiene como finalidad mantener el orden establecido y aplastar la resistencia de las clases antagónicas, para lo cual crea organizaciones represivas o políticas e instituciones productivas y de servicio que responden a sus intereses económicos o tienen el encargo de influir ideológicamente con iguales propósitos sobre la conciencia común (estado de opinión, juicios, criterios etc.) de la población, mediante la inculcación de ideas, concepciones políticas, jurídicas, morales, estéticas,, religiosas, filosóficas, que en su conjunto forman la conciencia social. A diferencia de las relaciones de producción que se forman independientemente de la voluntad del hombre, las concepciones ideológicas pasan primero por la conciencia, antes de constituirse en patrones del comportamiento.

LA MORAL La moral puede definirse, como el conjunto de convicciones, fundadas o dogmáticas, que cada individuo incorpora a su escala de valores, debido a influencias socioculturales y que se expresa mediante opiniones, representaciones, normas y evaluaciones sobre la regulación de la conducta de los individuos, constituyendo obligaciones con respecto a otros individuos, la familia, su clase social, la patria y el Estado, evaluando estas relaciones de buenas o malas, de justas o injustas, de honestas o deshonestas etc. Y fijándolas en su conciencia como principios o normas morales. La moral está condicionada por la base 40

independencia de que la acción se haya producido de manera intencional o inconscientemente. El comportamiento bioético, está regulado básicamente pro 4 principios: la no maleficencia, la justicia, la beneficencia y la autonomía. En el primero se establece, no causar daño al paciente de manera intencional, por negligencia u omisión. El principio de beneficencia preconiza que todas las acciones y esfuerzos deben estar encaminados a beneficiar al enfermo. En cuanto al principio de justicia, establece la equidad, es decir, todos los pacientes tienen las mismas oportunidades de beneficiarse por igual, de los recursos y atención que presta la institución y por último, la autonomía, donde se respeta la decisión del paciente de someterse a acciones médicas o experimentales que puedan afectar su integridad físico, psíquica o moral. El carácter socialista del Sistema Nacional de salud de nuestro país, constituye la base material sobre la que se sustenta la moral y la ética de los trabajadores de la salud, basados en los siguientes principios: a) La voluntad política del estado cubano de crear una infraestructura que ha permitido llevar los servicios médicos a todo el país, aún en las zonas más apartadas y recónditas. b) El carácter gratuito de la atención médica, tanto preventiva como curativa en las instituciones de salud, con independencia del elevado costo que pueda tener para el Estado. c) La disposición los profesionales y técnicos de la salud de participar en misiones internacionalistas. Para brindar su colaboración en cualquier lugar del mundo. Es por ello que en el ejército de nuestra función social debemos observar principios éticos - morales de profundo contenido humano, ideológico y patriótico, tales como; dedicar todos nuestros esfuerzos y conocimientos científicos y técnicos al mejoramiento de la salud del hombre; trabajar consecuentemente allí donde la sociedad lo requiera; estar siempre dispuesto a brindar la atención necesaria, con el elevado espíritu internacionalista. Nuestra conducta en relación con el paciente y sus familiares, con el resto de los trabajadores y estudiantes del sector y con la sociedad, debe estar basada en la estricta observancia de los siguientes principios éticos:

En relación con el paciente y sus familiares - Dedicar nuestros esfuerzos a la prevención, recuperación, rehabilitación y promoción de la salud humana. - Evitar que se produzcan daños a personas sanas o enfermas en los trabajos de investigación que realicemos. 42

- Respetar el decoro, el pudor y la dignidad de las personas bajo nuestra atención. - Propiciar una adecuada relación personal con el paciente que le inspire un buen estado de ánimo y seguridad. - Escuchar las preocupaciones y dificultades del paciente y sus familiares, darles la atención requerida y esforzarnos por viabilizar las soluciones posibles. - Utilizar en todo momento de nuestras relaciones con los pacientes y familiares, un lenguaje claro, sencillo y comprensible, sin alardes de tecnicismos y erradicando cualquier expresión de mal gusto. - Conservar el secreto profesional, teniendo en cuenta los intereses del paciente siempre que ello no ocasione un perjuicio social ni ponga en peligro la salud de otras personas. - No divulgar aspectos de la enfermedad que puedan estar relacionados con la vida intima del paciente o sus familiares. - Mantener en los casos de enfermedades de curso fatal absoluta o relativa reserva sobre el diagnóstico y pronóstico en relación con el paciente. - Abstenerse de realizar trabajos investigativos con los pacientes sin su consentimiento. - Atender, de forma solícita, a toda persona que recabe nuestros servicios, sin mostrar prisa o indiferencia hacia sus padecimientos, ni hacer comentarios indiscretos en su presencia. - Evitar que lleguen a manos de los pacientes o de sus familiares las historias clínicas, informes de laboratorio o cualquier otro documento que pueda darle indebida o perjudicial información. - Exigir, de aquellos trabajadores que nos están subordinados, la conducta adecuada ante el paciente y sus familiares y en el mismo sentido actuar sobre aquellos que, aunque no estén subordinados, intervienen de una forma u otra en el trato con los pacientes. - Cuidar de no incurrir en el error técnico que resulta de una equivocación, aunque no exista mala fe, ni elementos de negligencia, despreocupación e ignorancia, evitando a toda costa que nuestro trabajo se afecte por el apresuramiento, la superficialidad o la rutina. - Los errores técnicos deben ser conocidos y analizados críticamente en reuniones del departamento con la libertad y profundidad necesaria que permitan derivar de ellas la experiencia que impidan su repetición. - Los profesionales y técnicos de la salud deben poseer la honestidad necesaria para reconocer sus errores y eliminarlos. 43

En relación con el resto de los trabajadores de la salud - Mantener, para con nosotros mismos y con los demás profesionales y técnicos de la salud, una actitud crítica y autocrítica sobre los asuntos referidos a la relación con los pacientes, cuidar que las opiniones y criterios se basen en el mas profundo análisis científico posible. - Evitar indiscreciones que menoscaben el prestigio de otros compañeros o instituciones del sistema de salud. - Poner en conocimiento de las autoridades correspondientes cualquier violación que nos conste, tanto de estos principios éticos como de los reglamentos establecidos en las Unidades de Salud Pública.

En las relaciones entre el docente y los educandos - El docente debe promover en sus alumnos los principios éticos, a través de la palabra y su ejemplo. - Propiciará que las relaciones entre el y sus educandos se enmarquen en la debida autoridad y respeto que se requieren en la actividad docente. - Prestar especial atención a su superación individual, teórica y práctica, como aspecto esencial para el cumplimiento de sus responsabilidades docentes. - Inducir en los alumnos la disposición de recibir entrenamiento especializado en aquellas disciplinas que lo demanden, a fin de satisfacer las necesidades de nuestro pueblo y las tareas internacionalistas que se requieran.

Como parte de la sociedad - Ejercer con altruismo las actividades propias de su esfera de trabajo, subordinando el interés personal al social. - Comportarse en todo momento con sencillez, modestia honestidad y dentro de las reglas de una elevada educación formal y política. - Estar siempre en disposición de cumplir las obligaciones que le correspondan como ciudadano, así como aquellas que, por razón del carácter excepcional de nuestro trabajo, exija el mayor esfuerzo, dedicación y sacrificio. - Actualizar y perfeccionar los conocimientos de forma continua, para lograr la optima calidad de los servicios que prestamos a la sociedad. - Procurar que la información que se ofrezca con propósitos de divulgación científica y educativa sea correcta y adecuada, absteniéndose de emitir conceptos u opiniones que pueden alarmar innecesariamente a la ciudadanía. - Mantener en todo momento un buen porte y aspecto personal, utilizando el vestuario adecuado en las diferentes áreas de trabajo. 44

LAS COMISIONES DE ÉTICA MÉDICA En todas las unidades del Sistema Nacional de Salud se crean las comisiones de Etica Medica, que de común acuerdo entre la administración y el sindicato, es elegida para un mandato de 2 años quedando integrado por 5 miembros, 3 en activo y dos suplentes, que serán seleccionados entre los compañeros de más prestigio laboral científico, moral y político del centro. Esta comisión es la encargada de conocer toda denuncia o quejas sobre violaciones de la ética, realizando las investigaciones pertinentes en el plazo de 20 días. En el caso de arribar al criterio de que se incurrió en violación de la ética, trasladará su criterio a la dirección y al sindicato, los que a partir de ese momento actuarán de acuerdo con la legislación laboral vigente.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

En su opinión ¿Qué cosa es la ética? ¿Cuáles son los aspectos generales de la ética médica? ¿Qué usted entiende por violaciones de la Bioética? ¿Cúales son los principios que regulan el comportamiento bioético? ¿Cúales son los principios éticos que regulan las relaciones entre el personal de la Salud con los pacientes y familiares? Refiérase a los principios éticos que se ponen de manifiesto en las relaciones con otros trabajadores del sector y con los estudiantes. ¿Cómo se materializa el comportamiento ético cuando el profesional o técnico se siente parte de la sociedad. ¿Qué son y cómo se crean las comisiones de ética médica? ¿Cuál es la competencia y el desempeño de los integrantes de las comisiones de ética médica en los centros de Salud?

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CAPÍTULO 4 EL AGUA INTRODUCCIÓN El agua es un líquido transparente, incoloro, inodoro e insípido. Se congela a 00c, pasando al estado sólido y hierve a 1000c, pasando al estado de vapor de agua. Químicamente está compuesta por 2 átomos de hidrógeno unidos a un átomo de oxígeno, formando la molécula una configuración especial no lineal, sino angular, por lo que se clasifica el enlace como polar, lo cual propicia que sobre el átomo de oxígeno exista una cierta densidad de cargas negativas y sobre el hidrógeno una densidad de cargas positivas, lo que determina sus propiedades disolventes.

IMPORTANCIA El agua es indispensable para la vida, por constituir el elemento esencial de todos los tejidos y líquidos orgánicos, siendo considerada como el solvente universal para la disolución de una gran cantidad de solutos y otros compuestos en estado líquido. En el laboratorio, el agua es el reactivo más empleado, desempeñando un protagonismo esencial en las reacciones químicas, debido a que al ionizarse se une a muchos óxidos, formando ácidos y bases con otros compuestos para formar hidratos.

CALIDAD DEL AGUA El agua tal y como se encuentra en la naturaleza no es pura. Durante las precipitaciones, el agua de lluvia se une a diversos elementos gaseosos presentes en el aire, como el nitrógeno, dióxido de carbono, helio, metano, etc. Al caer se disemina o se filtra en el suelo, contaminándose con los diversos compuestos orgánicos e inorgánicos que estén presentes. Posteriormente en los afluentes, ríos, represas o acueductos donde va a parar, continua el proceso de contaminación, que variará, dependiendo de los compuestos presentes en cada lugar, lo que unido al tratamiento con cloro a que es sometida en los acueductos para su potabilización, hacen que en conjunto pierda su pureza, pasando a ser un líquido que contiene múltiples sustancias en disolución. 46

PURIFICACIÓN DEL AGUA Para las determinaciones de laboratorio, resulta indispensable que el agua sea lo más pura posible, ya que de lo contrario algunos componentes, provocarían efectos indeseables distorsionando la fiabilidad de los resultados. Por ejemplo: el cloro libre, posee un gran poder de oxidación por lo que puede alterar la composición química de uno o varios compuestos del sustrato empleado. Por su parte el fluor y el cobre inactivan a las enzimas, mientras que las sales de mercurio las activan. Para lograr la purificación del agua se emplean dos métodos: la destilación y la desionización.

DESTILACIÓN La destilación consiste, en someter al agua a temperatura de ebullición en el interior de un destilador metálico o de vidrio, diseñado para que los vapores que se desprendan en este proceso, pasen por un sistema de enfriamiento que los condensan, haciendo que pasen nuevamente al estado líquido con una mejor calidad, ya que los contaminantes al no tener la capacidad de evaporarse, quedan retenidos en el destilador.

Fig. 8 : Destilador de vidrio.

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El agua destilada, obtenida por el procedimiento explicado no es totalmente pura, ya que el vapor de agua que se forma puede arrastrar mecánicamente partículas de agua que no estén en estado de vapor. No obstante, el agua destilada puede emplearse en el trabajo diario sin que introduzca errores apreciables. Si se quiere, para algunas determinaciones, una mayor calidad de pureza, el agua destilada, debe ser sometida nuevamente al proceso de destilación con lo que se obtiene el agua bidestilada. Si se sometiera a una tercera esterilización obtendríamos el agua tridestilada.

DESIONIZACIÓN La desionización consiste en hacer pasar el agua corriente por una columna de resinas, las cuales captan los aniones y cationes que la contaminan, con lo cual adquiere un buen estado de pureza, incluso, mejor que la del agua bidestilada, aunque tiene la desventaja, que como el proceso no lleva implícito su esterilización, debe ser renovada diariamente. Para el trabajo del laboratorio de microbiología, el procedimiento comúnmente empleado es la destilación.

PH DEL AGUA DESTILADA El ph del agua destilada oscila entre 4 a 5, debido a la presencia de dióxido de carbono atmosférico disuelto. Si se desea neutralizar ese pH ácido para que no interfiera en algunos procederes, como por ejemplo en la preparación de medios de cultivo, que requieren generalmente, un pH neutro o ligeramente alcalino, el agua destilada debe ser sometida a un proceso de descarboxilación, lo cual se realiza de la siguiente manera: 1.

Se vierte el agua en un erlenmeyer y se somete a temperatura de ebullición por espacio de 3 a 5 minutos. 2. Antes de apagar la fuente de calor, tapar el erlenmeyer con un tapón perforado de caucho, provisto de un tubo trampa con perlas de hidróxido de sodio. 3. Después que el agua se ha enfriado, se verterá en recipientes apropiados, donde se conservará hasta su empleo.

CONDUCTIVIDAD DEL AGUA Mediante la conductividad eléctrica se puede determinar el grado de pureza del agua, como se ilustra en la siguiente tabla: 48

Cuadro 2 : Grado de pureza de los distintos tipos de agua en correspondencia con su conductividad.

TIPO DE AGUA

CONDUCTIVIDAD ( ohms -1 cm -1 )

Corriente

300

Destilada

5

Bidestilada

1

Desionizada

0,2

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál Es la importancia del agua para los laboratorios? 2. ¿Cómo es la calidad del agua, tal como se encuentra en la naturaleza? 3. ¿Explique por qué causa el agua empleada en el laboratorio debe ser lo más pura posible? 4. ¿Cómo se denomina el método más empleado en los laboratorios para purificar el agua? 5. ¿En que consiste la destilación? 6. ¿Cuál es la diferencia entre el agua destilada y la bidestilada? 7. ¿Por qué se hace necesario bidestilar o tridestilar el agua? 8. Explique el proceso de desionización del agua. 9. ¿Cuál es la ventaja y la desventaja de la desionización sobre la esterilización del agua? 10. ¿Cuál es el pH del agua destilada? 11. ¿Mediante que procedimiento se puede determinar el grado de pureza del agua?

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CAPÍTULO 5 CRISTALERÍA DE LABORATORIO INTRODUCCIÓN Se denomina cristalería de laboratorio, al conjunto de objetos utilizados en la realización de diferentes procedimientos técnicos, que independientemente de su forma y tamaño están constituidos solamente por vidrio.

COMPONENTES DEL VIDRIO El vidrio se fabrica mediante la fusión de arena sílice con sales de sosa o potasa a una temperatura de 1, 0000c. El producto fundido, en ese estado líquido, se vierte en diversos moldes de acuerdo a los objetos que se requieran producir, debido a la propiedad de no cristalizarse cuando se enfría. Quedando como un cuerpo sólido, generalmente transparente. De esta manera se obtiene el cristal empleado para cubrir puertas o ventanas, así como para la fabricación de vasos, copas y otros objetos. Como se sabe, este tipo de cristal es muy vulnerable a los impactos mecánicos, exposiciones a elevadas temperaturas,. Etc., lo que no resulta apropiado para la fabricación de la cristalería de laboratorio la cual requiere del empleo de otros componentes como el borosilicato de sodio y el aluminio, cuya aleación le confiere una alta resistencia mecánica, térmica y química. La cristalería fabricada con estos componentes, se identifica por estar rotulada con el nombre de "Pyrex" (Pairex).

SUSTITUTOS MODERNOS DEL VIDRIO En la actualidad, los diversos objetos de vidrio que integran la cristalería de laboratorio, también se fabrican de material plástico, especialmente con teflón (tetrafluoruroetileno) un polímero de bajo costo, caracterizado por su dureza, lo que le confiere una alta resistencia contra impactos, además tiene la propiedad de permanecer inerte durante las reacciones químicas, lo que lo valida como un sustituto eficaz del vidrio, con la ventaja de que dado su bajo costo, algunos objetos, como por ejemplo: las jeringuillas utilizadas, pueden ser desechadas sin grandes afectaciones económicas para la institución. 50

CLASIFICACION La cristalería de laboratorio de clasifica de la siguiente manera: Cuadro 3: Clasificación de la cristalería de laboratorio. CLASIFICACION

SUB-CLASIFI CACIÓN

CARACTERIZACIÓN

DIFERENTES TIPOS

- Alta resistencia química

Todos los frascos o reciopientes destinados a contener o almace- Cierre hermético. nar, productos químicos - Fotorresistencia (materias primas) o soluciones y reactivos elaborados ________________________________________________________ - Utilización para la Frascos erlenmeyer realización de diverFrascos Kitasatos sos procedimientos Frascos para reactivos técnicos. Frascos de fondo plano DE - La mayoría se fabriFrascos goteros TRABAJO can de diferentes Vaso de Koplin tamaños y capaciTubos de ensayo dades. Vidrio reloj Placas de Petry Embudos Condensadores Láminas de portaobjetos Láminas cubre objetos Láminas excavadas DE ALMACE NAJE

G E N E R A L

TC (Para contener) - No revelan magnitudes volumétricas. DE MEDICION VOLUMETRICA

Pipetas de : Shali, Thoma o Westergreen (No utilizadas en el laboratorio de microbiología) _______________________________________________________

TD (Para distribuir)

- Expresan magnitudes volumétricas. - Pueden tener o no rotulada una escala de graduación - Se fabrican de diferentes tamaños. - Están calibradas para trabajar a 200c.

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Pipeta Probetas Beaker (Vaso de precipitado) Matraces Copa cónica Buretas Jeringuillas

CARACTERIZACIÓN DE LOS DIFERENTES TIPOS DE CRISTALERÍA CRISTALERÍA GENERAL DE TRABAJO Erlenmeyer

Fig.. 9 : Erelenmeyer

Los erlenmeyer son recipientes de forma cónica y fondo plano, que se caracteriza por tener un diámetro 3 ó 5 veces mayor en su porción inferior con respecto a su porción superior. Si lo colocamos sobre la mesa de trabajo y lo observamos de arriba hacia abajo podemos percatarnos que en el extremo superior presenta una abertura circular con rebordes, que corresponde a la boca, seguida de una porción cilíndrica de algunos cm a manera de cuello. Al concluir este espacio se va ensanchando progresivamente de forma oblicua adquiriendo la forma cónica que lo caracteriza. Aunque los erlenmeyer pueden emplearse para la preparación de diferentes reactivos, esta cristalería está diseñada específicamente para la preparación de compuestos que requieran ser sometidos a la acción del calor, como por ejemplo, la preparación de medios de cultivo, debido a que su forma cónica, hace que los vapores se condensen en el cuello, lo que propicia que no afecte significativamente el volumen de la preparación. Los erlenmeyer se fabrican de diferentes tamaños. Los más empleados en el laboratorio de microbiología son los de: 100, 250, 300,500 y 1 000 ml. Los de menor o mayor volumen de capacidad se utilizan con menor frecuencia. 52

Kitasatos

Fig.10 : Frasco de kitasato

Los frascos de Kitasatos, son similares a los erlenmeyer con la diferencia de que en el cuello tiene insertado un pequeño tubo corto en dirección horizontal abierto en su porción distal siendo las paredes de vidrio más gruesas, para soportar las diferencias de presiones externas e internas provocadas por las técnicas de filtración al vacío para los que básicamente son empleados. Al igual que los erlenmeyer se fabrican de diferentes tamaños. Frascos para reactivos

Fig.11 : Frasco para reactivos.

Los frascos para reactivos son de diferentes tipos y pueden contener de acuerdo a su tamaño entre 25 ml y 1 litro. La tapa del frasco puede ser de cristal esmerilado o plástica si el cierre es de rosca, lo que dependerá del tipo de reactivo que contenga. Con ambas variantes se consigue el cierre hermético del frasco. Esta cristalería puede ser incolora o ámbar para la protección de reactivos fotosensibles. 53

Frascos de fondo plano

Fig.12 : Frasco de fondo plano

Se utilizan para la preparación de determinadas disoluciones, fabricándose de diferentes tamaños, debiendo ser termorresistentes por si se requiere someterlos a la acción del calor. En el trabajo microbiológico se utilizan regularmente para la preparación del antígeno de cardiolipina, utilizado en las pruebas serológicas VDRL.

Frascos goteros

Fig.13 : Frascos goteros

Existen en el mercado diferentes modelos. Los de vidrio, tradicionalmente empleado son incoloros o ámbar. De acuerdo con su capacidad, pueden contener entre 25 y 100 ml. Estos frascos poseen una tapa de vidrio esmerilado provista de una ranura perpendicular, que cuando se rota la tapa y se hace coincidir con la ranura en el cuello del frasco, el contenido goteará si se inclina el frasco adecuadamente. Otros modelos consisten en frascos provistos de un gotero con tapón de caucho, similar a los empleados en los frascos de medicamentos, en tanto que otro están diseñados para que comiencen a gotear si el frasco es invertido. 54

Vaso de Koplin

Fig.14: Vaso de Koplin

Estos vasos se caracterizan por ser cuadrados con paredes rectangulares. Algunos están diseñados para ser utilizados en posición vertical y otros de forma horizontal, pero todos tienen, en dos de sus paredes inferiores que quedan frente a frente, 4 ó más salientes de vidrio de 1mm de grosor alineados a todo lo largo con una separación de 2 mm entre sí, lo que posibilita la insertación de varias láminas portaobjetos, de manera que quedan separados. Estos vasos están provistos de tapas de vidrio y se utilizan para fijar preparaciones sobre láminas portaobjetos y/o colorearlas. Tubos de ensayo

Fig.15: Tubos de ensayo

Son pequeños recipientes de vidrio o plástico, fabricados de diferentes tamaños, con capacidad variable. Todos son cilíndricos, aunque la forma de sus extremos varía en función de su empleo. Los utilizados comúnmente en análisis cualitativos y cuantitativos tiene el fondo ligeramente cóncavos, en tanto que los tubos para cultivo son similares, pero se diferencian en que están provistos en su extremo superior de aristas helicoidales por donde se enrosca una tapa de baquelita, resina sintética obtenida por polimerización del fenol y el formaldehído, 55

generalmente con estrías longitudinales para facilitar su sujeción cuando se van a desenroscar, mientras que los tubos de centrífuga se caracterizan por tener el fondo cónico, para acoplarse a los portatubos de la centrífuga, pudiendo tener impresa una escala de graduación en ml. Los tubos ordinarios y los empleados para cultivo, mayormente utilizados en los laboratorios de microbiología, son los de 12 x 75, 13 x 100, 15 x 125 y 16 x 150 mm, correspondiendo el primer valor al diámetro y el segundo a la longitud. Se utiliza esencialmente para contener, conservar y procesar muestras biológicas, cultivar microorganismos y realizar pruebas de identificación para el diagnóstico de laboratorio, de las especies investigadas. Vidrio reloj

Fig.16: Vidrio reloj

Es un tipo de cristalería circular y cóncava de aspecto transparentes, similar a las utilizadas para cubrir las esferas de algunos relojes despertadores. Se utilizan regularmente para efectuar pesadas de productos sólidos con excepción de aquellos que sean higroscópicos que absorben la humedad del aire o volátiles. Placas de "Petry"

Fig.17: Placas de "Petry"

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Están constituidas por una caja circular de vidrio de 11 ó más cm de diámetro con el fondo plano pudiendo o no estar tabicado con un borde de 1 cm de altura en todo su perímetro. La placa se completa con una tapa igualmente de vidrio con un diseño similar al de la caja, pero, ligeramente superior en diámetro. Cuando las dos partes se ensamblan, la superficie interior de la tapa queda descansando sobre el borde de la caja. En el trabajo microbiológico se utiliza comúnmente para contener algún medio de cultivo sólido. Embudos

Fig.18 : Embudos

Los embudos presentan la porción superior cónica y la posterior en forma de un tubo cilíndrico y delgado cortado oblicuamente en su extremo terminal, pudiendo tener una longitud, menor , igual o mayor que la porción cónica, cuya capacidad oscila entre 30 ml y 5 litros, teniendo las paredes internas, según el modelo, estriadas o lisas. Se emplean para traspasar líquidos.

Láminas portaobjetos

Fig.19 : Lámina potaobjetos

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Las láminas portaobjetos son planas, delgadas y lisas, de aspecto transparente y forma rectangular. Miden 7,5 cm de largo por 2,5 cm de ancho. Se utilizan esencialmente para colocar sobre su superficie pequeñas fracciones o volúmenes de muestras, que serán sometidas o no a un proceso de coloración, con la finalidad de ser observadas a través del microscopio. Este tipo de lámina se emplea igualmente como soporte para realización de pruebas serológicas de aglutinación. Láminas excavadas

Fig.20 : Lámina portaobjetos excavada

Son similares a las láminas portaobjetos ordinarias, con la diferencia de que presentan una excavación cóncava de algo más de 1 cm de diámetro en centro de la lámina en forma de pozuelo. Se utilizan para la preparación de la "gota colgante", una técnica mediante la cual se determina microscópicamente si la bacteria en estudio es o no móvil.

Láminas cubre objetos

Fig. 21: Láminas cubreobjetos

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Son laminillas muy delgadas, transparentes e incoloras. La forma varía de cuadradas a rectangular; cuando son cuadradas miden 22 x 22 mm y cuando son rectangulares 22 x 50 mm. Son empleadas para cubrir las muestras o preparaciones que han sido colocadas previamente sobre las láminas portaobjetos para ser observadas al microscopio.

Cristalería de medición Pipetas

Fig. 22: Pipetas

Son tubos de vidrio rectos, de longitud y grosor variable que se caracterizan por tener el extremo inferior ligeramente cónico. Se fabrican diferentes tipos, que han sido diseñados para diversos procederes de laboratorio, siendo utilizada básicamente para medir y/o transferir volúmenes exactos de líquidos. Las más utilizadas en los laboratorios de microbiología, son las pipetas graduadas, principalmente las de 1, 2, 5, y 10 ml. Este tipo de pipeta tiene impreso en la parte superior un número que equivale a su capacidad volumétrica y a todo lo largo una escala graduada en ml, que indica numéricamente los espacios en que se divide el volumen total. Cada espacio a su vez se divide en 10 líneas equidistantes que corresponden a las subdivisiones volumétricas. Por ejemplo: En una pipeta de 5 ml de capacidad, la escala queda dividida en 5 espacios iguales, cada uno de los cuales equivale a 1 ml. Cada especio a su vez se subdivide en 10 líneas, equivalente cada una de ellas a 0,1 ml. Las pipetas serológicas, son similares a las graduadas, pero su capacidad es de 1 ml o menos, estando dividida en 0,1 y/o 0,01 ml. En el trabajo microbiológico se utiliza en ocasiones un tipo de pipeta no graduada, denominada pipeta de Pasteur, que puede ser fabricada en el propio 59

laboratorio con tubos de cristal fusible mediante su exposición a la llama del mechero de gas. Este tipo de pipeta suele emplearse cuando no se requiere precisar con exactitud el volumen a pipetear. Procedimientos para el manejo de las pipetas graduadas: 1. Sostenga la pipeta por su parte superior mediante los dedos pulgar y medio.

Fig. 23 : Forma correcta de sostener la pipeta.

2. Haga penetrar la pipeta en el líquido que va a ser aspirado. 3. Introduzca el otro extremo en la boca y aspire suavemente, observando simultáneamente la escala graduada, hasta que la columna de líquido sobrepase ligeramente la marca deseada. 4. Retire la pipeta de la boca y de inmediato tape el orificio con la yema dedo índice, ejerciendo la presión suficiente para evitar que el líquido descienda por gravedad. 5. Manteniendo la presión del dedo índice, proceda a retirar el exceso de líquido de la parte exterior de la pipeta, con un paño, gasa o servilleta limpia. 6. Introduzca la pipeta en el frasco o tubo donde se extrajo el líquido y haga que la punta contacte con la pared interna. Estando la pipeta en posición perpendicular ir aflojando la presión del dedo índice para propiciar que la columna de líquido descienda del por gravedad, hasta observar que la 60

curvatura en la superficie del líquido (menisco) contacte justamente sobre la línea correspondiente que marca el volumen deseado. En ese momento exacto, proceda nuevamente a ejercer presión con el dedo índice para evitar que el líquido continúe descendiendo. Al realizar la lectura volumétrica, evitar incurrir en el error de paralaje, ocasionado por no estar el ojo del observador en el mismo plano horizontal con respecto al menisco, que ocasionaría errores en la lectura.

Fig. 24: Ubicación correcta del ojo para efectuar la lectura del menisco

7. Introduzca la punta de la pipeta en el frasco o tubo receptor, apoyando la punta, en la parte superior de la pared interna y nunca sobre el fondo, pues al retirar la pipeta parte del líquido trasegado quedarán adherido al exterior de la pipeta, siendo arrastrado al retirarla, afectando la exactitud del volumen pipeteado. 8. Proceda a aflojar la presión del dedo para distribuir el volumen deseado en cada tubo. 9. Al vaciarse el contenido de la pipeta, en el extremo de la punta quedará un pequeño volumen residual. Si la pipeta utilizada, tiene una banda esmerilada o coloreada en el extremo superior proceda a soplar para que salga y completar el volumen previsto. Si la pipeta carece de franja esmerilada o coloreada no se debe soplar ya que están diseñadas para desestimar ese residuo sin que se afecte el volumen deseado. En el caso de las pipetas serológicas, se soplarán las que estén marcadas en la parte superior con la letra "D" (to de livery) no debiendo soplarse las marcadas con la letra "C" (to contain). 61

Probetas

Fig. 25 : Probetas

Las probetas son recipientes cilíndricos y alargados de vidrio, de diámetro y tamaño variable, en correspondencia con su capacidad volumétrica. Las más utilizadas en el trabajo microbiológico están comprendidas en el rango de 50 a 1,000 ml. Están provistas de una base de fondo plano que posibilita que puedan ser colocadas en posición vertical sobre una superficie nivelada. En el borde del orificio, que se haya en la parte superior, presentan un pico, , similar al de las cafeteras, para facilitar verter el líquido que contiene sin que se produzcan derramamientos. Algunas probetas están provistas de tapa de vidrio esmerilado o plástica. La mayoría tienen rotulado en la parte superior un número que indica su capacidad volumétrica, la marca de 200C, que es la temperatura de trabajo de este tipo de cristalería, y al igual que las pipetas, una escala graduada a todo lo largo que divide y subdivide el volumen total. Se utilizan específicamente para medir volúmenes. Beaker (Vasos de precipitados)

Fig. 26 : Beaker

Los Beaker son recipientes transparentes e incoloros que presentan una forma cilíndrica teniendo una longitud de casi el doble de su diámetro. Al igual 62

que las pipetas tienen un pico en el borde la boca que propicia que se pueda verter el líquido que contiene sin que se produzca derramamiento. Al igual que otras cristalerías de medición, tienen rotulado, el número que indica su capacidad volumétrica, la temperatura de trabajo (200C) pudiendo tener o no una escala graduada en ml, al igual que las probetas y las pipetas. Matraces

Fig. 27 : Matraces

Las matraces son frascos de vidrio incoloros y transparentes que tienen una porción superior en forma de un fino tubo cilíndrico y alargado, la inferior piriforme con el fondo plano, lo que permite colocarlos en posición vertical. Algunos están provistos de tapa de vidrio esmerilado. Al igual que otros tipos de cristalería de medición, tienen grabado el número que indica su capacidad volumétrica, la temperatura de trabajo (200C) y una línea alrededor del cuello que indica la marca de aforo. Se emplean para preparar disoluciones donde se requiere exactitud.

Materiales de porcelana Además de los materiales de vidrio o de teflón, en los laboratorios se utilizan otros, fabricados de porcelana, siendo los más empleados las cápsulas y los morteros. Cápsulas

Fig. 28 : Cápsula de porcelana

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Son pozuelos de borde esférico, fondo redondeado y tamaño variable, caracterizándose generalmente por ser de color blanco y tener las paredes delgadas lisas y muy pulidas, con un doblez en forma de labio por un punto de su borde para facilitar verter su contenido, sin que se produzca derramamiento. Uso: Se utilizan regularmente como recipientes de disoluciones que van a ser sometidas a una medición de pH o para colocar medios de cultivo que se pretenden pesar. Morteros

Fig. 29 : Mortero

Los morteros son recipientes de porcelana, aunque también se fabrican de vidrio. A diferencia de las cápsulas, generalmente, son de mayor tamaño y están provistos de paredes más gruesas, pudiendo tener el fondo plano o redondeado. Al igual que las cápsulas presentan un doblez en forma de labio en el borde para verter su contenido. El mortero se complementa con una pieza cilíndrica adicional, del mismo material, con el extremo inferior redondeado, denominado mazo,. Similar a un pequeño bate de pelota. Uso: Para triturar compuestos sólidos con ayuda del mazo.

LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN La cristalería que vaya a ser utilizada en las investigaciones microbiológicas de laboratorio, debe ser sometida previamente a un proceso de limpieza y desinfección antes de esterilizarla. Si la cristalería es nueva: Debe pasarse previamente por agua caliente para eliminar la presencia de vestigios fábriles. Después se sumerge en una solución de ácido clorhídrico al 1%, dejando actuar el desinfectante por un espacio de tiempo no menor de 4 horas. Posteriormente se lava con detergente, se enjuaga con agua corriente y finalmente con agua destilada. Después de escurrida se deja secar al aire o si se desea secado con mayor rapidez se puede introducir en una incubadora. 64

Cuando la cristalería haya sido utilizada: Si mantiene material infeccioso, por haber estado en contacto directo con microorganismos o contiene cultivo de ésta, debe ser sometida previamente a un proceso de esterilización en autoclave a 1210C, durante 30 minutos, para evitar que el técnico o la persona encargada de la limpieza de la cristalería se contamine con microorganismos patógenos. Después de la esterilización, la cristalería se enjuaga para eliminar los restos groseros del material que contenía y se sumerge durante 10 ó 15 minutos en mezcla sulfocrómica, o más tiempo si la mezcla ya ha sido utilizada y mermada su efectividad. La cristalería así tratada, se friega con detergente, se enjuaga con agua corriente y finalmente con agua destilada, procediendo a su secado en la forma explicada. Desinfectantes más empleados (ver Capítulo 6)

PREPARACIÓN PREVIA DE LA CRISTALERÍA PARA SU ESTERILIZACIÓN Objetivo: Evitar que se vuelvan a contaminar con posterioridad a su esterilización y mantenerlas en esas condiciones hasta su utilización. Procedimiento: Después de desinfectadas, fregadas y secas: Tubos de ensayos: Se taponean con algodón y se envuelven con papel de estraza en grupos de 5 a 10 tubos.

Fig. 30 : Taponeamiento de tubos con asa y algodón

Placas de Petry: Después de ensambladas (tapa y caja) podrán ser colocadas dentro de un cilíndrico de metal inoxidable con tapa, fabricado específicamente para ese uso, o en su defecto, las placas serán empaquetadas con papel de estraza, individualmente, en parejas o en grupos de no más de 5 placas. 65

Fig. 31 : Placas de Petry: a)Empaquetadas con papel de estraza, b)Cilíndro de metal inoxidable para colocar las placas

Las pipetas: Se taponean de tal manera que no dificulte la succión, pero al mismo tiempo impida el paso hacia la boca del material que esté pipeteando. Posteriormente se enrollan en una franja de papel de estraza.

Fig. 32 : Pipetas: a)Taponeamiento con algodón, b)Empaquetamiento con papel de estraza

Los erlenmeyer, probetas y otras cristalerías similares: Se taponean con algodón y se retapan con papel de estraza, el cual se ata fuertemente con un lazo al cuello o porción anterior de la cristalería. 66

Fig. 33 : Erelenmeyer: a)Taponeamiento con gasa y algodón

El resto de los materiales se empaquetan igualmente e incluso, algunos, como las jeringuillas con doble envoltura.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué Ud. entiende por cristalería de laboratorio? 2. Explique cómo se fabrica el vidrio. 3. Nombre los componentes del vidrio "Pyrex". 4. ¿Qué es el teflón y para qué se utiliza? 5. ¿Cómo se clasifica la cristalería general? 6. ¿Cuáles son las características de la cristalería de almacenaje? 7. Nombre los diferentes tipos de cristalería de medición volumétrica? 8. ¿Cuáles son las características de la cristalería de medición volumétrica? 9. Mencione las cristalerías de medición volumétricas. 10. ¿ Cuáles son las diferencias entre en erlenmeyer y un frasco de kitasato? 11. ¿ Cómo es una bureta? 12. ¿Cómo funcionan los frascos goteros con tapa esmerilada? 13. Describa el vaso de Koplin. 14. Describa las características de los tubos de ensayo. 15. ¿Cómo son las placas de "Petry"? 16. ¿Cuánto miden las láminas portaobjetos y las cubreobjetos? 17. Explique en orden cronológico los pasos que deben efectuarse durante la realización del pipeteo. 18. Explique las diferentes causas de error en que puede incurrirse durante el pipeteo. 19. ¿Para qué se utilizan regularmente los vasos de precipitado o Beaker? 20. ¿Qué otros recipientes además de los de vidrios se fabrican de porcelana? 21. Precise semejanzas y diferencias entre una cápsula y un mortero. 22. Explique cuáles son los procederes establecidos para la limpieza y desinfección de la cristalería. 23. Describa cómo Ud. prepara la cristalería para que se mantenga estéril después de la esterilización. 67

CAPITULO 6 ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN INTRODUCCIÓN La esterilización y desinfección son los métodos esenciales empleados en los laboratorios de microbiología, para destruir, inhibir o separar a los microorganismos presentes en los diferentes objetos, compuestos orgánicos, medio ambiente, etc., donde se requiere su eliminación. La mayoría de los métodos y agentes empleados, ocasionan específicamente la desnaturalización de las proteínas celulares. Destruyen las diversas estructuras o inhiben su funcionamiento, lo cual a mediano plazo resulta letal para el microorganismo.

Términos empleados relacionados con la esterilización y la desinfección Sepsis: infección pútrida (putrefacto, corrompido, etc.) Séptico: que produce la sepsis. Asepsia: método encaminado a prevenir la infección mediante la destrucción o evitación de los agentes infectivos. Específicamente mediante el empleo de métodos físicos. Antisepsia: conjunto de procedimientos prácticos destinados a destruir o alejar los gérmenes patógenos, en especial por medio de agentes químicos. Aséptico: libre de toda materia séptica o infecciosa. Bactericida: agentes destructor de bacterias. Bacteriostático: agente que inhibe las funciones de las bacterias.

ESTERILIZACIÓN Concepto: Esterilización significa: destrucción o eliminación de todas las formas de vida, no limitándose exclusivamente a la estructura vegetativa, sino incluyendo además a sus esporas. Diferentes agentes empleados en la esterilización: Para la esterilización se emplean diferentes agentes físicos y químicos, los agentes físicos más utilizados son: el calor, las radiaciones y la filtración. En relación con los agentes quími68

cos, solamente algunos, como por ejemplo. El formaldehído y el óxido de etileno ejercen un efecto letal sobre las esporas.

El calor El calor resulta un método muy eficaz para lograr una adecuada esterilización, siempre y cuando el objeto o producto no sea termolabil, y se cumpla con los parámetros de eficacio, como son: la aplicación del nivel de temperatura requerido y el tiempo de exposición al calor, en dependencia de la magnitud del material a esterilizar. El calor se utiliza de tres maneras diferentes: calor húmedo, calor seco y la incineración. Calor húmedo El calor húmedo es la variante más empleada. Debido a que las bacterias resultan más vulnerables en la medida en que estén más húmedas. Bajo estas condiciones, el calor generado provoca la desnaturalización y coagulación de las proteínas, de manera similar que cuando se cocina un huevo duro, en consecuencia los puentes de hidrógeno de la membrana citoplasmática, son destruidos, inactivando su función osmótica, lo que trae como resultado la emigración incontrolada de los constituyentes intracelulares, como aminoácidos, potasio, etc. que ocasionan la muerte del microorganismo. El calor húmedo se emplea en los laboratorios de tres maneras diferentes. Calor húmedo a presión, calor húmedo a 1000 C. Calor húmedo a presión El calor húmedo a presión se obtiene mediante el empleo del autoclave, un equipo metálico provisto de un cierre hermético, diseñado para resistir la presión generada por la acumulación de vapor de agua, con lo cual la temperatura aumenta, alcanzando valores de 121 C requeridos para la eliminación de las esporas para lograr una adecuada esterilización. En el mercado se comercializan diferentes modelos de autoclave: verticales, horizontales, de doble cámara, etc., pero todos tienen en común una estructura similar. 69

Fig. 34: Autoclave. Vista frontal y lateral: 1.Llave que comunica la cámara externa con la interna; 2.Lave de escape de vapor; 3.Manómetro que indica la presión de la cámara externa; 4.Manómetro que indica la presión de la cámara interna; 5.Válvula termostática; 6.Válvula de seguridad; 7. Respiradero; 8.Puerta de seguridad; 9.Cierre hermético de la puerta; 10.Cámara externa; 11.Cámara interna; 12.Termómetro; 13 y l4.Tanque de agua; 15.Quemador de gas; 16.Escape de agua de condensación; 17.Llave de paso para suministrar agua al tanque; 18.Llave de paso para sacar el agua del tanque; 19.Llave de paso de gas; 20.Entrada de aire; 21. Llave que controla el nivel del agua.

Prototipo standard del autoclave Cámara La cámara del autoclave consiste en un cuerpo cilíndrico de aproximadamente un metro de largo x 50 a 60 cm de diámetro, siendo el lugar destinado para la colocación de los objetos y materiales que sé desean esterilizar. Algunos modelos disponen de una segunda cámara denominada externa, que debido a su mayor diámetro rodea a la cámara interna en toda su longitud, quedando las paredes de ambas separadas entre sí por varios cm. En este espacio se acumula el vapor de agua procedente de la caldera que posteriormente pasa a la cámara interna. Puerta La puerta está articulada con bisagras en la parte anterior del equipo, a unos pocos cm de la cámara interna estando provista de un número variable de metálicas en posición radial que al ser cerrada mediante el de una manivela 70

ubicada centralmente, penetran en un reborde periférico situado en la parte frontal del autoclave propiciando un cierre hermético. Válvulas Los autoclaves poseen dos válvulas, una para extraer el aire que quedó en el interior del equipo al cerrarse y la otra para propulsar la salida del vapor cuando la presión sobrepasa los límites admisibles. Esta última se denomina "válvula de seguridad". Caldera Según el modelo de que se trate, la caldera puede estar ubicada junto o separada de la cámara. En su interior se deposita el agua (destilada) hasta alcanzar el nivel adecuado. Fuente de calor La fuente de calor empleada para calentar el agua contenida en la caldera y se produzca vapor de agua, puede ser eléctrica o de gas. Instrumentos de medición Estos equipos disponen de un termómetro y un manómetro que permiten ir monitoreando la temperatura y la presión existente en el interior del autoclave, durante su funcionamiento. Uso del autoclave El autoclave se utiliza regularmente para la esterilización de ropas, medios de cultivo, material quirúrgico, etc.

Manipulación del autoclave a) Revise el nivel del agua de la caldera y en caso de ser insuficiente, proceda a echar la cantidad requerida. b) Revise la válvula de seguridad, y límpiela si estuviera sucia u obstruida. c) Introduzca en la cámara los objetos y materiales que se van a esterilizar y cierre herméticamente la puerta. d) Proceda a abrir la válvula de salida del aire. e) Encienda la fuente de calor. 71

f) Manténgase atento a la válvula de salida de aire. Cuando el vapor salga mediante un chorro continúo y sin intermitencia, cierre la válvula, pues será indicativo de que el aire acumulado dentro del autoclave ha salido y que todo el espacio de la cámara está ocupado exclusivamente por el vapor de agua. g) Espere a que el termómetro marque 1210 C y el manómetro 15 lb/pgda3 de presión, para comenzar a contar el tiempo de esterilización, que generalmente es de 15 a 20 minutos, aunque puede extenderse a 30 minutos si el objeto o producto a esterilizar es demasiado grande, si se diera el caso, de que la temperatura no se corresponde con la presión, es indicativo de que no se sacó todo el aire de la cámara, recomendándose en ese caso aumentar un poco la presión para que el equipo alcance la temperatura requerida. h) Transcurrido el tiempo de esterilización, desconecte la fuente de calor (hay modelos donde la fuente se apaga automáticamente) y espere hasta que el manómetro marque "O". No trate de reducir la presión abriendo la válvula de seguridad o la de salida de aire, ya que esta acción puede provocar que los medios de cultivo que aún tengan más de 100 C al serle retirada abruptamente la presión, asciendan, expulsen los tapones de algodón y se derramen dentro del equipo. i) Cuando el termómetro y el manómetro marquen "O" proceda a abrir la válvula de salida de aire y espere a que salga el vapor residual. A continuación, abra la puerta el autoclave con sumo cuidado, ya que los restos de vapor que queden aún dentro de la cámara, al salir por la puerta, pueden ocasionar quemaduras al manipulador.

Calor húmedo a 1000 C El calor húmedo a 1000 C. se obtiene de dos maneras diferentes: 1. Por ebullición: El líquido en cuestión es sometido a la acción del calor hasta alcanzar temperaturas de 100 C, siempre que la acción calórica se prolongue por 5 a 10 minutos, mediante este método se logra la destrucción de todas las formas vegetativas y de algunas esporas. Otras esporas resisten la temperatura de ebullición por más de una hora, por lo que no puede garantizarse una esterilización eficaz con este método. 2. Vapor fluente: El vapor fluente se utiliza para la esterilización de compuestos y medios de cultivo elaborados con determinados azúcares, gelatina, urea, etc. Que se deterioran a temperaturas superiores a 1000C, no debiendo por lo tanto ser esterilizados en auto clave. El principio de este método consiste en someter el compuesto o medio de cultivo a esterilizar a una corriente de vapor a 1000C para lo cual se emplea el esterilizador de Arnold, que consiste en un equipo similar al autoclave, con la diferencia de que no es hermético, ya 72

que el vapor producido por el calentamiento del agua, va saliendo por un condensador que lo traslada en forma de agua, nuevamente a la caldera. Al no acumularse el vapor, no aumenta la presión y por consiguiente la temperatura se mantiene en 1000C. La exposición al vapor fluente del material a esterilizar será de 20 a 30 minutos.

Fig. 35: Esterilizador de Arnold: 1.Resistencia eléctrica; 2.Soporte; 3.Tapa; 4.Termómetro; 5.Tuberia de escape de vapor; 6.Recuperador; 7.Agua destilada.

Como ya se explicó en acápite de ebullición, la temperatura de 1000C resulta insuficiente para la destrucción de algunas esporas, por lo que se requiere aplicar la esterilización fraccionada, conocida como "tyndalización", que consiste en exponer el material a esterilizar al vapor fluente durante tres días consecutivos por espacio de 30 minutos, para que las esporas que resistieron la primera exposición germinen en células vegetativas muy vulnerables a la temperatura de 1000C. De quedar alguna espora germinará y la célula vegetativa será destruida en la 3era. Exposición. El autoclave puede sustituir al equipo de Arnold, siempre que se deje la válvula abierta para que el vapor no se acumule, con lo cual la temperatura se mantiene estable a 1000C. 73

Calor húmedo a menos de 1000C La aplicación del calor húmedo a menos de 1000 C, es un método conocido con el nombre de pasteurización, ideado en el siglo XIX por Luis Pasteur, que está basado en el efecto de la temperatura sobre los microorganismos y sus enzimas. Consiste básicamente en calentar el producto de 62 a 650 C durante 30 minutos o a 710 C durante 15 segundos, seguido de un enfriamiento inmediato. Con este método se eliminan los patógenos que con alguna regularidad puedan estar presentes en productos como la leche y bebidas alcohólicas, etc. Sin que pierdan su sabor natural, debido a las bajas temperaturas empleadas y el corto tiempo de exposición.

Calor seco El calor seco, es utilizado con regularidad en los laboratorios de microbiología, con el objetivo de determinados objetos y materiales. Su acción provoca la desnaturalización y coagulación de las proteínas, así como la oxidación de ciertos componentes de la célula microbiana. El calor seco se obtiene por medio del horno, un mueble metálico de forma rectangular o cuadrada, 40 % de aproximadamente 80 cm cúbicos, aunque se comercializan otros de menor o superior tamaño. En su parte inferior o base, está situada la fuente de calor; una resistencia eléctrica que ocupa todo el área del fondo del horno, la cual queda cubierta por una tapa metálica perforada, por cuyos orificios pasa el calor, que se disemina por todo el interior del horno, por medio de un ventilador ubicado en una de las paredes laterales. A diferentes niveles de altura están situadas las parrilladas en posición horizontal, donde serán colocados los materiales a esterilizar.

Fig. 36: Horno: 1.Termómetro; 2.Salida de aire; 3.Tapa; 4.Botón del termostato; 5.Ventilador; 6. Bombillo; 7.Fuente de calor; 8.Puerta.

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En la parte superior externa se encuentra un orificio ocupado por un regulador, encargado de expulsar el exceso de aire del interior del horno. En la parte anterior, debajo o al lado de la puerta presentan un panel donde se encuentra el interruptor, el botón para regular el termostato, el termómetro y un bombillo piloto. Casi todos los hornos tienen dos puertas; una interna de vidrio que se halla dentro de un marco metálico y otra externa metálica forrada de amianto, con la cual se cierra firmemente el equipo.

Uso del horno El horno se utiliza para esterilizar cristalería de laboratorio, objetos de metal, aceites, grasas sólidas o productos en polvo, que debido al bajo porciento de agua que contienen no son penetrados suficientemente por la humedad generada por el vapor de agua de los autoclaves. Manipulación del horno 1. Coloque en las parrillas los materiales a esterilizar, debidamente preparados cuidando de que queden separados entre sí y de las paredes del horno, que por ser metálicas adquieren un mayor grado de temperatura y pueden quemar el material comburente empleado, y para que el aire caliente circulante, tenga acceso por igual en toda la superficie del material a esterilizar. 2. Cierre firmemente la puerta. 3. Encienda la fuente de calor (automáticamente el ventilador comenzará a funcionar y el bombillo piloto se encenderá) 4. Gire el botón del termostato hasta que indique la temperatura deseada y espere a que el termómetro registre de 160 ó 180 C (en ese momento se apagará automáticamente el bombillo piloto). 5. Comience a contar el tiempo de esterilización, que en este equipo debe ser de 90 minutos a 2 horas. 6. Transcurrido el tiempo de esterilización, apague la fuente de calor, accionando el interruptor y espere hasta que el horno se enfríe para extraer el material. La esterilización en horno requiere de una temperatura superior a la utilizada con el autoclave, así como un tiempo de exposición más extenso, ya que el calor seco no se distribuye uniformemente por todo el equipo como lo hace el vapor de agua, garantizando de esta manera que en el área del horno donde se alcance menos temperatura, exista la suficiente para que el material quede estéril. Advertencia Cuando el horno haya alcanzado una elevada temperatura no debe abrirse para introducir o sacar algún material, ya que los paños, algodón etc. Empleados 75

pueden inflamarse por la penetración abrupta de oxigeno y ocasionar quemaduras al manipulador.

Incineración La incineración se logra, exponiendo directamente a la acción de la llama, a los microorganismos contenidos en las muestras y otros materiales contaminados que se determine carbonizar, para este propósito se utilizan el incinerador y el mechero. El incinerador se emplea básicamente, para llevar al estado de cenizas materiales contaminados, que por su peligrosidad deben ser destruidos totalmente, en tanto que los mecheros son utilizados como fuente de calor para diversos propósitos y comúnmente en el trabajo diario para esterilizar, mediante la incineración, a los instrumentos de siembra.

Mecheros Los mecheros son instrumentos de laboratorio diseñados para obtener una llama calorífica a partir de la combustión del alcohol o del gas. Los mecheros de alcohol, consisten, en un pequeño recipiente de vidrio de forma redondeada, con el fondo plano, estando provisto por su parte superior de un pequeño saliente cilíndrico por donde se enrosca un pequeño tubo metálico de unos pocos mm de diámetro a través del cual se inserta una mecha cuyo extremo posterior queda en contacto con el alcohol contenido en el recipiente. Una pequeña capucha cilíndrica de metal con el extremo superior redondeado, se utiliza para tapar el mechero y que no se evapore el alcohol.

Fig. 37 : Mechero de alcohol: 1.Tapa; 2.Alcohol.

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Mecheros de gas Son los mas empleados. Existen diferentes modelos, pero todos están estructurados básicamente por tres partes separables: La base, el tubo quemador y el regulador de aire.

Fig. 38 : Mechero de gas

1. La base: Es una pieza metálica de forma circular y fondo plano, lo que permite mantener el tubo quemador en posición vertical. Tiene un diámetro de 4 a 6 cm y presenta en la parte superior un pequeño tubito en posición horizontal de unos 6 mm de diámetro denominado tobera, donde se inserta ajustadamente, con una presilla de seguridad, una fina manguera que se inserta por su otro extremo a una llave de gas. 2. Tubo quemador: El tubo quemador puede tener un diámetro variable, en dependencia del modelo de que se trate. El mechero de "Bunsen" convencional, tiene aproximadamente 6 ó 7 mm de diámetro x 6 ó 7 cm de largo, en tanto que el mechero de "Fisher" es mucho más grueso con una longitud también mayor y está provisto en su extremo superior de un quemador que propicia una llama grande e intensa. En ambos tipos de mecheros, muy próximo al extremo donde se enrosca a la base, el tubo presenta un orificio de un diámetro similar al del collarín que regula la entrada de aire. 3. Regulador de aire: El regulador de aire está compuesto por un collarín metálico de forma anular, semejante a una alianza, que se inserta calibradamente en el extremo inferior el tubo quemador, quedando en contacto con la base. Está provisto de un orificio circular de un diámetro similar al del tubo quemador. 77

Fig. 39: a) Mechero de Bunsen; b) Mechero de Fisher

Manipulación del mechero 1. Revise que las diferentes partes del mechero, estén debidamente acopladas y ajustadas. 2. Abra ligeramente la llave de gas. Cuando esta operación se realiza, el gas que atraviesa la manguera y la tobera se dirige al centro de la base, donde hay un dispositivo provisto de un fino orificio, calibrado a décimas de mm que regula el paso del gas hacia el tubo quemador. 3. Aproxima la llama de un fósforo o de una fosforera al orificio del tubo quemador por donde sale el gas para encender el mechero. 4. Regule la salida del gas en dependencia de la intensidad de la llama. 5. Ajuste la entrada de aire hasta obtener la llama deseada, para lo cual se hará girar al collarín hasta hacer coincidir su orificio con el del tubo quemador. Al realizar esta operación, en mayor o en menor grado se producirá la entrada de aire en el tubo quemador lo que propiciará la mezcla gas - aire (combustible y comburente). En la medida en que se enriquezca el gas con el aire. Así será la llama. Una mezcla rica en aire produce una llama azulosa, no luminosa y de gran poder calorífico. Si empobrecemos la llama cerrando la entrada de aire, obtendremos una llama de color amarillo rojizo, luminosa y poco calorífica.

Fig. 40: Diferentes zonas de la llama del mechero

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Uso del mechero El mechero tiene una función utilitaria muy diversa: se emplea a diario para esterilizar los instrumentos de siembra de nicrón o platino, mediante su exposición directa a la llama, que los calentarán al rojo vivo en pocos segundos. Para flamear la boca de los tubos de ensayo y otras cristalerías estériles. Por su parte externa con el objetivo de eliminar los microorganismos contaminantes, como paso previo a la realización de siembras, resiembras, distribución de medios de cultivo en placas y otros procederes. El mechero también es utilizado para fijar frotis en láminas portaobjetos y calentar medios de cultivo durante su preparación. Advertencia - El empleo del mechero entraña un peligro potencial de quemaduras en la piel o en la ropa, por lo que se debe tener sumo cuidado con su manejo. Se recomienda retirar de su alrededor, durante su uso, papeles (utilizados para la esterilización de la cristalería) así como, líquidos inflamables (alcoholes para coloraciones) y otros materiales similares. Por las mismas razones debe mantenerse el pelo recogido y concentrarse totalmente en la actividad que se esté realizando. - Los instrumentos de siembra (asas o agujas de platino o nicrón) que contengan restos de muestra o de cultivos, deben ser introducidos gradualmente en la llama del mechero de la siguiente manera: de inicio se expondrá el extremo del instrumento a la zona azul de la llama y tan pronto se ponga al rojo, se introduce gradualmente el resto del alambre hasta que también se ponga al rojo vivo. La introducción total del instrumento en la llama tiende a aumentar la intensidad de la formación de aerosoles, potencialmente peligrosos para el manipulador. Lo idóneo cuando se trabaja con muestras o cultivos, es disponer de un recipiente con arena humedecida en fenol, para introducir previamente el asa, con los restos de inoculo, antes de flamearla a la llama del mechero.

LAS RADIACIONES Las radiaciones empleadas en microbiología como método de esterilización son esencialmente de dos tipos: - Radiaciones ionizantes. - Radiaciones no ionizantes.

Radiaciones ionizantes Deben su acción a la capacidad de producir partículas que al interaccionarse ceden la energía suficiente para producir ionización; fenómeno mediante el cual, 79

una molécula, átomo o ion estrictamente neutro, se ven privados de uno o mas electrones mediante la acción de un campo eléctrico. Los rayos gamma, rayos x y rayos catódicos, ejercen una acción letal sobre las diversas estructuras, el ADN y las proteínas celulares, no solo por sus propiedades ionizantes, sino además, por su elevada capacidad de penetración. Aplicación: Se utilizan regularmente para la esterilización de inyectables, equipos médicos, catéteres, jeringuillas plásticas y alimentos. Advertencia: La exposición a las radiaciones ionizantes son nocivas para las células del cuerpo humano, por lo que si su empleo es reiterado deben emplearse las medidas de protección radiológicas establecidas.

Radiaciones no ionizantes A diferencia de las radiaciones ionizantes, las no ionizantes tienen poca capacidad de penetración. Su efecto esterilizante depende de que la energía propagada, procedente de sus radiaciones electromagnéticas (luminosas) sean absorbidas por la célula microbiana, oxidando las proteínas y los ácidos nucleicos, para dar lugar a la inactivación de las enzimas, mutación genética o muerte. Las radiaciones no ionizantes más empleadas en los laboratorios de microbiología y en determinadas áreas del ámbito hospitalario, son las producidas por lámparas de luz ultravioleta cuyo expectro está comprendido en rango de longitud de onda de 2600 a 2700 . Aplicación: El poco poder de penetración de estos rayos lo hacen inefectivos para esterilizar compuestos o medios de cultivo, además de que son agentes catalizadores de la oxidación de las grasas, lo que acarrearía numerosos trastornos, sin embargo su aplicación resulta efectiva para la esterilización del ambiente de quirófanos, cuartos de siembra, etc. Así como para las paredes, piso y techo del inmueble o la parte externa del mobiliario, siempre y cuando se cumpla la indicación referida al tiempo de exposición y se tenga en cuenta la distancia entre la ubicación de la lámpara y el objeto o espacio a esterilizar. Las radiaciones de luz ultravioleta además de ser germicidas, son muy efectivas contra las esporas. En el trabajo diario la lámpara se debe encender 2 ó 3 horas antes de comenzar a trabajar en el local. Advertencias - No se debe entrar ni permanecer en ningún local que tenga encendida la lámpara de luz ultravioleta, pues ocasiona daños en la vista e incluso pueden producir quemaduras cuando la exposición es prolongada, por lo que el interruptor debe estar ubicado fuera del local. - Debe chequearse periódicamente la lámpara para determinar su estado de agotamiento, que en caso de ser significativo reduciría su capacidad germicida. 80

FILTRACIÓN La filtración es un método mediante el cual, se hace pasar un líquido contaminado a través de un filtro, con el propósito de que los microorganismos que contiene sean retenidos y el líquido filtrado quede estéril. La eficacia de este método depende del tipo de filtro empleado, ya que algunos de los tradicionalmente utilizados no pueden retener el paso de los virus, por lo que de hecho, no es una verdadera esterilización, aunque en la práctica, retienen a la mayoría de los microorganismos.

Características de los filtros Los filtros se fabrican con diversos materiales: amianto, vidrio poroso o porcelana, los cuales tienen en común ser muy compactos, y provistos de porosidades microscópicas de un diámetro menor que la talla promedio de los microorganismos, algunos como los de amianto se comercializan en forma de discos de algunos cm de diámetro por varios mm de grosor. En la actualidad se están empleando discos de membrana de celulosa para filtros, tipo millipore, que se fabrican con diámetros tan pequeños que imposibilitan el paso de los virus, así como filtros HEPA que se utilizan para retener las partículas presentes en el aire durante la aplicación del flujo laminar. Empleo: La filtración se utiliza para esterilizar compuestos termolábiles como: el plasma, medios azucarados, urea, vitaminas, etc., para los que no debe emplearse el calor como método de esterilización por ser termolábiles.

Preparación de los filtros

Fig. 41: Filtros: a) Filtro Seitz; b) Bujia de Charberland.

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Cuando se emplean filtros en forma de disco, el procedimiento para su montaje consiste, en colocarlo en posición horizontal en el interior de un soporte metálico de forma cilindra, de unos 6 cm de diámetro aproximadamente 12 cm de largo, denominado filtro "Seitz" que presenta en la parte superior una tapa de rosca metálica y en la inferior un tubo recto, fino y delgado que se encuentra insertado en el centro de la base presentando una escotadura oblicua en su extremo distal que le proporciona una terminación puntiforme que se utiliza para insertarlo en el orificio de caucho que se encuentra tapando a un frasco de kitasato. El filtro y el frasco de kitasato, una vez ensamblados se empaquetan con papel de estraza y son esterilizados en autoclave a 1210C durante 20 minutos. No se debe esterilizar en horno, ya que el calor seco puede dañar el tapón de caucho.

Fig. 42 : Filtro Seitz ensamblado en el kitasato

Preparación previa Cuando vaya a ser utilizado, se le retira la envoltura de papel y se inserta el extremo de una manguera al tubo del frasco de kitasato y el otro extremo se acopla a una de vacío. Procedimiento 1. Destapar el filtro "Seitz" y verter en su interior el líquido que se desea esterilizar, procediendo a taparlo con la tapa de rosca. 2. Conectar la bomba de vacío: La comprensión centrífuga axial (de su eje) transformará la energía cinética en energía de presión, originando una pre82

sión negativa en el interior del frasco de kitasato al serle extraído todo el aire acumulado, lo que provocará la succión del líquido, el cual pasará a través del filtro, quedando retenidos los microorganismos en su superficie acumulándose estéril en el kitasato.

Fig. 43: Proceso de filtración: a) Ensamblar el kitasato a la bomba de vacio; b) Verter el líquido a filtrar; c) Cerrar el filtro; d) Accionar la bomba de vacio para que se produzca la succión y el líquido pase estéril al kitasato

Advertencia: Los discos de amianto se utilizan una sola vez, pero los de vidrio poroso o porcelana se pueden limpiar con facilidad, lo que permite su reutilización.

DESINFECCIÓN La desinfección es un método utilizado en los laboratorios de microbiología para provocar la muerte de los microorganismos. Mediante el empleo de productos químicos denominados desinfectantes, que determinadas concentraciones pueden ser letales, debido a los efectos tóxicos que producen sobre las estructuras y los procesos metabólicos de la célula microbiana, la efectividad de los desinfectantes depende de su accesibilidad sobre el objeto o material a des83

infectar y que las condiciones ambientales sean favorables para la desinfección así como que la exposición se prolongue durante el tiempo predeterminado. Los desinfectantes actúan sobre la estructura vegetativa de los microorganismos de diferentes maneras. Desnaturalizando las proteínas, provocando la ruptura de la membrana citoplasmática o la pared celular, removiendo los grupos sulfhídricos libres, interfiriendo las reacciones enzimáticas o afectando el funcionamiento de ADN, pero solo algunos son capaces de destruir las esporas. La mayoría de los desinfectantes son muy nocivos para los tejidos, estando restringido su empleo para la desinfección de objetos, materia orgánica o ambientes, debiendo manipularse con sumo cuidado ya que el contacto accidental con algunos de ellos, puede ocasionar lesiones tisulares o dermatitis y su aspiración, intoxicación respiratorias o toxemias. Algunos desinfectantes como por ejemplo, el alcohol y otros compuestos químicos, pueden ser empleados como productos tópicos, gargarismos o colirios, siempre y cuando cumplan con el principio de toxicidad - selectiva, determinado porque siga siendo tóxico para los microorganismos pero que al mismo tiempo, sean relativamente inocuos para las células del paciente.

Selección de los desinfectantes El hecho de que todos los desinfectantes tengan la capacidad de matar a los microorganismos, no significa que pueda emplearse cualquiera sin una previa selección. Lo primero que hay que hacerse, es la caracterización del objeto, material o ambiente que se desea desinfectar, lo segundo, seleccionar el desinfectante que resulte mas eficaz para ese objetivo, teniendo en cuenta su poca o suficiente capacidad de penetración en el tratamiento de las sustancias orgánicas y tercero, cerciorarse de que su empleo no produzca deterioro del objeto a desinfectar. Los desinfectantes mas empleados en las instituciones de salud, son los siguientes: -

Fenol del 2 al 5 % Alcohol etílico de 70-90 % Alcohol isopropílico del 40-80 % Formaldehído al 4 % Gluraldehido al 2 % Peróxido de hidrógeno al 6 % Sales de iones pesados (mercurio, cobre, zinc, etc.) Detergentes catiónicos (compuesto de amonio o cloruro de benzalconio) Bicloruro mercúrico al 1: 1000 Otros... 84

La aplicación de estos productos químicos se realiza de manera diferente, de acuerdo con lo que se quiera desinfectar: 1. Desinfección por sumersión.: Consiste en sumergir los objetos en un recipiente apropiado hasta cubrirlos con la solución desinfectante. 2. Desinfección por aplicación directa: Aplicar con ayuda de un algodón, gasa o paño, el desinfectante a la superficie del objeto de que se trate: mesa, puesto de trabajo y en menor grado las paredes y el suelo. 3. Desinfección por gasificación: Algunos desinfectantes como el formaldehído, se pueden emplear en su estado gaseoso, para la desinfección de ambientes especiales, ropas, mobiliarios y otros artículos. Advertencia: Debido a que muchos desinfectantes tienen poca actividad sobre las sustancias orgánicas, resulta pertinente que sean removidos previamente del el objeto que se vaya a desinfectar con agua y detergente. Las sustancias antisépticas más utilizadas en el laboratorio para uso externo son las siguientes: -

Alcohol etílico de 70-90 % Alcohol isopropílico al 70 % Formoaldehído al 1 % Hexoclorofeno al 2 % Yodopuvidona al 4 % Hipoclorítico de sodio o calcio al 1 %.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

¿Qué es la esterilización? ¿Cuáles son los diferentes efectos que se producen sobre los microorganismos sometidos a procesos de esterilización? Mencione los agentes físicos empleados en la esterilización. Cuáles son las diferentes formas en que se emplea el calor como agente esterilizante? ¿Cuál es el agente esterilizante que se pone de manifiesto en el calor húmedo a presión? ¿Cómo se denomina el equipo empleado en los laboratorios para producir calor húmedo a presión? Durante la esterilización en autoclave ¿cómo Ud. determina la temperatura y la presión del equipo? 85

8.

¿Por qué causa el agua empleada para la esterilización en autoclave debe ser destilada? 9. Explique paso a paso el funcionamiento del autoclave 10. ¿Cuáles son las precauciones a tener en cuenta al concluir la esterilización en autoclave. 11. ¿Cómo se denomina el equipo a utilizar en la esterilización con calor seco? 12. ¿Por qué la temperatura del horno y el tiempo de esterilización deben ser mayores que cuando se emplea el autoclave? 13. ¿Cuál es la fuente de calor del horno? 14. Explique paso a paso el funcionamiento del horno. 15. Mencione las diferentes partes del mechero de gas. 16. ¿Cuál es la diferencia entre el mechero de "Bunsen" y el de "Fisher?" 17. ¿Cómo Ud. regula la entrada de aire al mechero? 18. Para qué se utiliza regularmente el mechero de gas. 19. ¿Cómo se denomina la lámpara utilizada en los laboratorios para esterilizar? 20. ¿De qué depende el efecto esterilizante de las radiaciones no ionizantes? 21. ¿En qué lugares se aplica la esterilización con luz ultravioleta. 22. ¿Qué cuidados debe tenerse en cuenta con el empleo de la luz ultravioleta? 23. ¿Que tipo de materiales se deben esterilizar con filtros? 24. Explique cómo usted realiza una esterilización con filtro 25. ¿Cuál es la diferencia entre esterilización y la desinfección? 26. ¿Cuáles son los efectos nocivos que provocan los desinfectantes sobre los microorganismos? 27. Mencione los diferentes métodos de desinfección. 28. Nombre los desinfectantes empleados con mayor frecuencia y sus respectivas concentraciones.

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CAPÍTULO 7 EQUIPOS CALORIFICOS INTRODUCCION Son equipos diseñados para producir y distribuir calor. Las autoclaves, hornos y otros instrumentos similares, empleados en la esterilización mediante el calor, se incluyen dentro de este concepto, pero en este capítulo nos referiremos específicamente a otros equipos que también producen y distribuyen calor, pero que son empleados para otros menesteres. Entre los mas utilizados en el laboratorio de microbiología se encuentran: 1. La incubadora o estufa 2. El baño de María.

INCUBADORA El diseño industrial de las incubadoras es similar al del horno, en lo referente a su forma, estructura y tamaño. Se trata de un mueble rectangular o cuadrado de unos 80 cm3 , provisto de múltiples paneles, calentadores y doble puerta, la interna de cristal y la externa metálica, con excepción de algunos modelos ya en desuso construidos de madera. Al igual que el horno, el lado o debajo de la puerta externa, dispone de un panel donde se encuentra el interruptor, el botón para regular la temperatura, el cuál está rodeado de una escala metrada y un bombillo piloto que indica mediante su apagado o encendido de forma automática, el funcionamiento del termostato. En su interior, la incubadora está provista de un número variable de parrillas metálicas intercambiables, donde se colocan los materiales a incubar. La diferencia sustancial con respecto al horno radica en que el nivel máximo de temperatura no excede de los 60 a 700 C, siendo ajustada generalmente para que produzca de 35 a 370 C, lo cuál puede comprobarse mediante la observación de un termómetro acoplado al equipo con una escala de 0 -700 C.

Requerimiento de temperaturas Cada especie de microorganismo se desarrolla óptimamente en un rango, temperatura específica (termofília). Sobre la base de esos requerimientos se clasifican de las siguientes maneras: 87

Cuadro 4: Clasificación de los microorganismos de acuerdo a su termofilia. CLASIFICACIÓN

RANGO DE TEMPERATURA ÓPTIMO PARA EL CRECIMIENTO

PSICRÓFILOS MESOFILOS TERMOFILOS

DE 15 A 20 C DE 30 A 37 C DE 50 A 60 C

La mayoría de los microorganismos patógenos al hombre, así como otros que forman parte de la microbiota residente o transitoria, son mesófilos, por lo que logran establecerse sin grandes dificultades en diferentes áreas anatómicas del organismo, debido entre otros factores, a que la temperatura corporal resulta compatible con su temperatura optima de desarrollo. Cada uno de estos grupos se subdivide a su vez en obligados y facultativos. Los primeros requieren obligatoriamente, disponer de la temperatura que se especifica en cada clasificación, mientras que los facultativos son capaces de desarrollarse, aunque menos óptimamente, por debajo o por encima de ese rango. Además de una temperatura óptima que favorezca el aceleramiento de su crecimiento, la incubación debe proporcionar además, condiciones adecuadas de aereación, acorde a las necesidades de oxígeno de cada microorganismo. En ese sentido se clasifican en: aerobios, microaerofílicos, anaerobios y facultativos. Cuadro 5: Clasificación de los microorganismos de acuerdo a sus necesidades de oxígeno. CLASIFICACIÓN

AEREACCIÓN

Aerobios estrictos Microaerofílicos Anaerobios Facultativo

Requieren oxígeno a una tensión similar a la del aire ordinario. Requieren de una tensión de oxígeno inferior a la del aire. Requieren de un ambiente privado totalmente de oxígeno. Pueden adaptarse a vivir en presencia o ausencia de oxígeno.

Clasificación de los microorganismos de acuerdo con sus necesidades de oxígeno De ahí, que deban emplearse diferentes métodos de incubación que propicien las necesidades específicas del microorganismo en estudio. 88

Incubación de bacterias aerobias estrictas: Las bacterias aerobias estrictas no requieren que la incubadora tenga ninguna adaptación especial, ya que ellas utilizan el oxígeno presente en el aire ordinario que se encuentra en el interior del equipo. Incubación de bacterias microaerofílicas: Como estas bacterias requieren de una baja tensión de oxígeno para poderse desarrollar, aunque pueden emplearse procedimientos físicos oxirreductores para este propósito, el método más empleado para propiciar esas condiciones, consiste en sembrar las muestras en medios de cultivo que contengan Fe2Co4, metabisulfíto de sodio o piruvato de sodio, que proporcionan a los microorganismos microaerofílicos una mayor tolerancia al oxígeno. Incubación de bacterias que requieren de CO2 : Todos los microorganismos requieren carbono en forma de CO2 y la mayoría utilizan el que está presente en el aire, pero aquellas especies que necesitan este elemento en mayor proporción, se le debe suministrar durante la incubación, para lo cual existen diversos todos: a) Método de la vela: Es muy sencillo de realizar. Consiste en colocar en el interior de un frasco de cristal de tamaño apropiado y provisto de tapa de rosca, las placas o tubos sembrados, conjuntamente con los cultivos se introduce un pedacito pequeño de algodón humedecido en agua, para que mantenga la humedad necesaria y una vela, la cual se encenderá procediendo de inmediato a cerrar el frasco. La llama utilizará como comburente parte del oxigeno que quedó encerrado dentro del frasco. Cuando este proceso haya concluido la llama se apagará y en el interior del frasco producto de la combustión quedará una atmósfera con un 10 % de CO2. Seguidamente el frasco con los cultivos será colocado en el interior de una incubadora ordinaria.

Fig. 44: Método de la vela

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b)Incubadora de CO2: Son incubadoras especiales, diseñadas para extraer un % de 02 deseado e intercambiarlo por un gas sustituto (CO2).

Incubación de bacteria anaerobias La incubación de bacterias anaerobias se puede efectuar por diferentes métodos: a) Siembra en medios oxirreductores. b) Empleo de la jarra de "Brewer". c) Incubadora para anaerobios.

Siembra en medios de cultivo oxirreductores En medio de cultivo líquido: El medio empleado contiene un compuesto oxireductor; tioglicolato sódico que consume él oxigeno, estableciendo condiciones anaerobias. Después de realizada la incubación se efectuará en la misma incubadora que se emplea para los cultivos aerobios. En medio de cultivo sólido: Un medio de cultivo especial, agar anaerobio al glicolato u otro similar se vierte sobre la caja de una placa de "Petry" corriente y después de solidificado se le coloca encima una tapa especial de vidrio denominada cubierta de "Brewer", la cual está diseñada para quedar apoyada sobre los bordes de la caja interior y sobre el perímetro externo del medio de cultivo de manera que en el área central del cultivo queda encerrado un espacio de aire.

Fig. 45 : Placa de Brewer

Realizada la siembra, se cubre con la apa de "Brewer". El tioglicolato consume el oxigeno en el pequeño espacio de aire, estableciendo condiciones anaerobias, procediéndose a su incubación en una incubadora común para cultivos aerobios. 90

Empleo de la jarra de "Brewer": Es un recipiente cilíndrico, provisto de una tapa que propicia un cierre hermético mediante un tornillo ubicado en su porción central. La jarra tiene un diámetro y altura que permite colocar en su interior (una encima de la otra), unas 10 placas con cultivo. La tapa tiene instalada un elemento de calefacción rodeado de un catalizador platinado.

Fig. 46: Jarra de Brewer

Funcionamiento Después de introducidas las muestras de cultivos, se produce a colocar la tapa, de manera que no quede herméticamente cerrada, para lo cual se enroscará el tornillo lo cual evitará que se produzca una explosión cuando se le suministre hidrógeno. La tapa dispone de dos válvulas. En una de ellas se instala una manguera conectada a una bomba de vacío para extraer el aire acumulado en el interior de la jarra. Por la otra válvula se le suministra el hidrógeno para reemplazar el aire. Cuando la capacidad de la jara es completada con este gas, se aprieta el tornillo para hermetizarla. La primera dosis de hidrógeno se debe botar para que salga el aire de la manguera. El poco oxigeno que puede quedar aún en el interior de la jarra es eliminado por el catalizador platinado que al activarse hace que se combine con el hidrógeno para formar agua o agua y dióxido de carbono, estableciendo finalmente condiciones anaerobias. En estas condiciones la jarra es colocada en el interior de la incubadora para que le proporcione a los cultivos el calor necesario, no debiendo abrirse antes de las 48 horas. 91

En la actualidad se comercializan diversos productos oxirreductores que se introducen en la jarra con los cultivos y suplen la función de esta, es decir, sin ser necesario hacer vacío para extraer el aire ni inyectar hidrógeno.

Incubadora para anaerobios Se trata de un moderno equipo, con similar capacidad que las incubadoras para cultivos aerobios que funciona bajo el mismo principio que la jarra de Brewer, con la ventaja que nos permite disponer de mas espacio y estudiar una mayor cantidad de cultivos.

Baño de agua caliente. (Baño de María) El baño de agua caliente, comúnmente conocido como "baño de Maria" es utilizado en diversos procederes de laboratorio. Mediante este método se pueden alcanzar valores por encima de la temperatura ambiente hasta un máximo de 1000 C con o sin regulación termostática. Baño de agua caliente sin regulación termostática Cuando se recurra a esta variante se debe emplear un recipiente metálico o de vidrio de fondo plano, dentro del cual se verterá agua destilada hasta alcanzar el nivel necesario, de manera, que el material a examinar depositado dentro de un tubo de ensayo, quede por debajo del nivel del agua. Conjuntamente con la muestra será introducido en el baño un termómetro de mercurio colocado previamente dentro de un tubo de ensayo, debiendo quedar a la misma altura que la muestra. En estas condiciones, el recipiente se coloca sobre una fuente de calor, que puede ser de gas o eléctrica. Cuando se utiliza el mechero de gas debe situarse sobre el trípode una malla de amianto, para que el calor se distribuya lo mas uniformemente posible por todo el fondo del recipiente, debiendo bajarse la llama o incluso apagarla cuando el termómetro marque dos o tres grados por debajo de la temperatura deseada, volviendo a encenderla cuando la columna de mercurio comience a descender manteniendo este control, durante todo el tiempo que dure la exposición de la muestra al calor. Cuando se emplean hornillas eléctricas, faltando 2 ó 30 C, el recipiente puede ser separado de esa fuente de calor, ya que aún después de apagada, mantiene por algunos momentos la intensidad calorífica. Como se puede apreciar el empleo de este procedimiento es engorroso por lo laborioso que resulta y la imposibilidad de mantener estable el nivel de temperatura de la muestra. En la práctica el baño de agua sin regulación termostática se emplea casi exclusivamente cuando se requiere temperatura de ebullición. 92

Baño de agua con regulación termostática Se trata de un equipo diseñado con material inoxidable que tiene la forma de un cajón rectangular. De acuerdo al modelo su tamaño será variable, pero con la capacidad suficiente, como para permitir la colocación en su interior de varias gradillas.

Fig. 47 : Baño de agua

Funcionamiento En el interior del equipo se vierte agua destilada hasta alcanzar el nivel pertinente. A continuación se introducen las gradillas con los tubos que contienen las muestras, las cuales deben quedar por debajo del nivel del agua. Estos equipos siempre son eléctricos. Después de accionar el interruptor se gira el botón hasta que indique la temperatura deseada y se hace girar igualmente el botón del "Timer" para indicar el tiempo requerido de exposición al calor. El calor es suministrado por una resistencia eléctrica, ubicada generalmente en la base del equipo, la cual es regulada por un termostato que mantiene automáticamente el grado de temperatura al nivel deseado. Algunos modelos están provistos de un aditamento similar a un pequeño ventilador, ubicado generalmente en el extremo posterior, sumergido en el agua. Al ser encendido el equipo, las aspas comienzan a girar agitando constantemente el agua, lo que propicia que la temperatura se mantenga homogénea. Algunos modelos cuentan con un termómetro de mercurio acoplado, que va registrando la temperatura del agua. En su efecto se debe introducir un termómetro dentro de un tubo de ensayo, y colocarlo en la gradilla debiendo quedar el vástago al mismo nivel que las muestras. Importante El agua a emplear para el baño de agua caliente, debe ser siempre destilada, ya que las sales que el agua cruda al evaporarse tiende a formar capas sobre las paredes internas y el fondo del depósito pueden deteriorar al equipo. 93

Uso El baño de agua caliente, tiene diversos usos. En el laboratorio de microbiología se emplea frecuentemente para inactivar el complemento de sueros que van a ser sometidos a procedimientos serológicos.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

¿Cuales son las diferencias y semejanzas entre el horno y la incubadora? Describa el diseño o modelo de una incubadora. ¿Para que se utiliza la incubadora? ¿Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo al rango de temperatura óptima para su desarrollo? ¿Por qué causa los microorganismos mesófilos son los que con mayor frecuencia infectan al hombre? ¿Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo a sus necesidades de oxigeno? ¿Cómo Ud. puede proporcionar una atmósfera microaereofílica? ¿Cómo Ud. puede proporcionar un 10 % de CO2 a las bacterias que así lo requieran? Describe el método de la vela. Mencione los diferentes métodos de incubación anaeróbica. ¿Para que se utiliza la jarra de "Brewer?" Explique cómo es el funcionamiento de una jarra de "Brewer" ¿Cuántos tipos de baño de agua Ud. conoce? ¿Cuál es la fuente de calor de los baños de agua con regulación termostática? ¿Por qué causa se debe emplear agua destilada en los baños de agua? ¿Cuál es la función de las aspas que poseen algunos baños de agua? ¿Cómo se regula la temperatura del baño de agua?

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CAPITULO 8 MICROSCOPIO INTRODUCCIÓN La tierra se formó hace miles de millones de años y desde sus albores se desarrollaron los primeros microorganismos a partir de las estructuras pre-biológicas existentes, originadas por la interacción de los compuestos orgánicos, que al evolucionar dieron lugar a la biogénesis de las bacterias primitivas, correspondiendo por lo tanto a los microorganismos haber sido los primeros seres vivos del planeta. Con el decursar del tiempo, algunos fueron afectados por la acción de diversos agentes mutagénicos que alteraron su expresión fenotipal, transformándose en otros tipos de microorganismos más evolucionados, como: protozoarios, hongos y algas, diseminándose gradualmente en el aire, los suelos y las aguas, hasta poblar todo el globo terráqueo, de ahí que los microorganismos patógenos, hayan sido durante siglos y sean en la actualidad, los agentes infecciosos causales de la morbi-mortalidad en plantas y animales, afectando igualmente a la especie humana desde el surgimiento del hombre primitivo hasta nuestros días. A pesar de que los microorganismos ya existían antes que el hombre y de haber sido durante milenios los causantes de diversas enfermedades infecciosas, grandes epidemias y de pandemias que diezmaron poblaciones enteras, los conocimientos que el hombre tuvo durante siglos, acerca de las causas que originaban las enfermedades infecciosas eran meramente especulativos y por consiguiente carentes de rigor científico, debido esencialmente al tamaño microscópico de los diversos gérmenes que imposibilita su observación a simple vista y no disponerse en esas épocas de instrumentos técnicos como el microscopio que dieron esa posibilidad, lo que impidió a los hombres de ciencia ver sus respectivas morfología y estructuras, estudiar su comportamiento y asociarlos después como los agentes causales de los procesos morbosos y/o letales. El invento del microscopio fue el punto de partida, que dio lugar el surgimiento de la microbiología como ciencia, estando su desarrollo ulterior influido, en gran medida, por el perfeccionamiento de las técnicas microscópicas. El microscopio compuesto fue diseñado y construido por el inglés Robert Hooke, en el año1665, basándose en el principio funcional del telescopio astronómico, inventado a principios de ese siglo por el físico-matemático, italiano, Galileo Galilei. El microscopio de Hooke, consistió en un tubo cilíndrico de unos 15 cm de longitud, al que insertó en cada extremo, una lente de aumento. El tubo a su vez 95

fue acoplado a un soporte previsto de platina para colocar las preparaciones a observar. Este instrumento se complementaba con una fuente de luz accesoria. Como se puede apreciar la estructura básica del microscopio diseñado por Hooke, no difiere esencialmente de la de los microscopios luminosos que se utilizan en la actualidad. A pesar de que los lentes empleados por Hooke, podían proporcionar una ampliación suficiente, solo logró observar, algunos insectos de ínfimos tamaños, así como diversos tejidos vegetales y hongos microscópicos y algas, que como se sabe, constituyen los microorganismos de mayor talla, no logrando observar a otros más pequeños como protozoarios y bacterias. Probablemente sus limitadas observaciones se debieron a imprecisiones técnicas, relacionadas con el grosor de las preparaciones o el empleo deficiente de iluminación. En 1668, Antón Van Leeuwenhouek, un comerciante holandés, fabricante de gafas, tomando como referencia el invento de Hooke, fabricó un microscopio al cual dotó de poderosos lentes de aumentos y empleando técnicas más efectivas, logró observar todo lo visto por Hooke, así como bacterias y protozoarios, en muestras examinadas de: sangre, pus, semen, heces, etc., denominando a estos microorganismos en su conjunto como "animálculos".

MICROSCOPIO. CONCEPTO La palabra microscopio, proviene del prefijo micro que significa pequeño y del sufijo skope, que quiere decir, examinar o ver. Los microscopios son instrumentos ópticos o electrónicos con un elevado poder resolutivo, que posibilita la observación de los microorganismos, células y otras estructuras microscópicas, al proporcionar una imagen aumentada virtualmente del tamaño real a total magnitud que posibilitan su observación a través de su empleo.

DIFERENTES TIPOS Se fabrican dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. De cada tipo se comercializan diferentes modelos y aditamentos especiales para proporcionar determinados efectos, aunque todos tienen respectivamente el mismo principio.

Microscopio óptico Concepto: Son instrumentos de laboratorio, diseñados básicamente con una sola lente o mediante un sistema de lentes de aumentos, que son ubicados 96

alineadamente en el eje óptico del microscopio para que proporcionen una imagen virtual ampliada de los objetos microscópicos examinados, lo que hace posible su observación, siempre que se utilice una adecuada iluminación.

Clasificación Los microscopios ópticos se clasifican en: simples y compuestos. Microscopios simples Están formados por una sola lente convergente, que proporciona una imagen virtual, no invertida, varias veces mayor que el tamaño real del objeto observado. Debido a su limitada capacidad de ampliación, no se puede observar con ellos objetos microscópicos, quedando restringido su empleo para el examen de diversas estructuras u organismos microscópicos muy pequeños, cuyos detalles escapan a la agudeza visual del ojo humano, como por ejemplo: colonias muy pequeñas, desarrolladas en los cultivos, vermes de poca longitud, como el Necator americanus o el Enterovirus vermicularis, etc. Entre los dispositivos utilizados se encuentran las lupas empleadas en las prácticas de disección.

Fig. 48 : Lupa

Para su manejo, se debe colocar la lente de manera que su cara plana o menos curva, quede hacia el objeto a examinar y observando por la cara opuesta, aproximar el instrumento gradualmente, hasta una distancia focal menor que la empleada si se fuera a observar directamente. Microscopio compuesto A diferencia de los microscopios simples, los compuestos funcionan mediante la combinación de varias lentes, que conjuntamente con una fuente de iluminación, forman parte de un sistema óptico, que tiene como soporte a un 97

sistema mecánico, provisto de diversas piezas y aditamentos que deben ser manipulados para lograr y mantener el enfoque de la preparación, recorrerla y observar la cantidad de campos microscópicos que sean pertinentes.

Fig. 49 : Microscopio óptico compuesto

Sistema mecánico El sistema mecánico consta de las siguientes partes: 1. Base o pie. 2. Brazo. 3. Tubo óptico. 4. Revolver portaobjetivos. 5. Platina 6. Tornillos. Base o pie Es la parte del microscopio que queda en contacto con la superficie de la mesa de trabajo. Su fondo plano y acentuado peso le proporcionan estabilidad al microscopio y constituyen a aminorar los efectos de las vibraciones que causan distorsiones durante la observación. La base es el sostén donde se asientan todas las restantes partes del microscopio. Algunos modelos están provistos de una charnela (pasador) que permite la inclinación hacia el observador de la parte superior del microscopio. Brazo Es una columna sólida y rectangular que se haya articulada por su extremo inferior a la base. En su trayectoria hacia la parte superior, algunos modelos 98

forman una curvatura, mientras que en otros su trayectoria es recta hasta más allá de la mitad de su longitud en que se dobla en dirección frontal, formando una inclinación oblicua o un ángulo recto de 900. En su parte superior, el brazo está articulado al tubo óptico o al cuerpo binocular, mientras que la porción media de su cara frontal sirve de asiento al extremo posterior de la platina. Tubo óptico En los microscopios monoculares, consiste en un tubo cilíndrico de 2,3 cm de diámetro, con una longitud de varios cm que varía según el modelo, encontrándose rodeado por un tubo de mayor diámetro, denunciado fusil que articula a la parte superior del brazo. El orificio superior se emplea para insertar la lente ocular, mientras que en el inferior se encuentra acoplado al revolver portaobjetivos. En los microscopios binoculares, el extremo superior del tubo óptico no termina recto, sino que forma un cuerpo binocular, que consiste en una cajuela rectangular ubicada en posición horizontal que puede estar ligeramente inclinada hacia el observador. En la superficie frontal presenta 2 tubos cortos de 2,3 cm de diámetro donde se insertan los dos lentes oculares. En algunos modelos, uno de los tubos, al menos, es giratorio al ser accionado se desplaza hacia arriba o hacia abajo, lo cual permite sincronizar la distancia de ambos lentes a las diferencias de potencialidad de cada ojo. Este cuerpo binocular, tiene ubicado en el punto de contacto con el tubo óptico un prisma o espejo que refracta la imagen por igual hacia ambas lentes, disponiendo además, por la misma cara donde se hayan los tubos para insertar los lentes oculares, un mecanismo de desplazamiento, consistente en dos tapas de corredera, que se accionan lateralmente para ampliar o reducir la distancia entre ambos lentes, hasta hacerlos coincidir con la de los ojos del, observador, lo cual se logra cuando éste deje de ver dos campos microscópicos separados o superpuestos y vea uno solo. Revolver portaobjetivos El revolver portaobjetivos es un disco plástico o metálico de unos 7 cm de diámetro que se encuentra atornillado por su eje a una pieza que rodea al tubo óptico denominado fusil, estando provisto de una tapa metálica giratoria de superficie cónica, provista de 3 ó 4 orificios de 2 cm de diámetro con rosca interna, ubicados equitativamente alrededor de su entorno a menos de un cm de su borde. En cada uno de estos orificios se enroscará un lente objetivo, cuya secuencia aproximada será de menor o mayor potencia de aumentos. Cuando se requiera un mayor o menor aumento se hará girar, manualmente el revolver hacia la derecha o hacia la izquierda hasta ubicar el lente deseado 99

sobre el orificio de la platina, quedando la parte posterior del lente frente al tubo ocular. El disco fijo tiene en su extremo frontal una pequeña hendidura y el giratorio presenta un pequeño saliente frente al orificio donde se enrosca cada lente objetivo. Al rotar el disco y ubicar el lente deseado sobre el orificio de la platina, coincide con que el saliente se introduce en la hendidura produciendo un ligero sonido audible al acoplarse que indica que la lente está ubicada correctamente.

Fig. 50 : Revólver portaobjetivos

La platina

Fig. 5l: Diferentes formas de platinas y pinzas

La platina es una doble plataforma metálica de color negro o gris de aspecto mate. Generalmente es de forma cuadrada y mide unos 15 cm2 de superficie x 1 a 2 cm de grosor, pudiendo en algunos modelos ser circular. Presenta en su porción central un orificio circular de unos 5 cm de diámetro, por donde pasa la luz procedente de la fuente de iluminación. En algunos modelos el orificio es ovoide. La platina está provista de pinzas, que se utilizan para sujetar las láminas portaobjetos que contiene la preparación a observar. Estas pinzas, en algunos modelos son fijas, mientras que en otros, se encuentran articuladas a un sistema de rodamiento formado por dos cremalleras y dos tornillos, engranados respectivamente a cada una de ellas. Mediante movimientos de rotación que se imprimen a uno de los tornillos se propicia el desplazamiento de la pinza hacia uno u otro lateral y con el accionar del otro se desplaza la plataforma superior de la platina hacia delante o hacia atrás. 100

La mayoría de los microscopios que se emplean en la actualidad, tienen grabada sobre el borde frontal de la platina una escala graduada de 0 a 80 mm, junto con un nonio, y en el borde lateral derecho otra con el rango de 80 a 110 mm provista igualmente de un nonio. Estas escalas permiten al microscopista ubicar la posición de un campo microscópico que desea posteriormente volver a ver, para lo cual anotará las coordenadas que le proporcionan ambas escalas, lo que facilitará la localización del campo con rapidez sin tener que rastrear toda la preparación. Tornillos Además de los tornillos de la platina, los microscopios están provistos de otros 3 tornillos; el macrométrico, el micrométrico y el del elevador del condensador. Es la parte superior del brazo, algunos microscopios presentan dos orificios, uno debajo del otro, que lo atraviesan de lado a lado. En el que está ubicado en la parte superior se inserta el tornillo macrométrico (uno por cada lado) y en el orificio inferior, de similar manera el tornillo micrométrico. Estructuralmente ambos tornillos son iguales, con la única diferencia de que el tornillo micrométrico es más pequeño. Cuando los tornillos son introducidos en sus orificios respectivos solo quedan externamente sus cabezas, las cuales son de forma circular con un tamaño de varios cm de diámetro por 1 ó más de ancho, con el borde estriado transversalmente para facilitar el agarre manual al imprimirle movimientos de rotación. El vástago helicoidal de cada tornillo que penetra en el orificio termina en un pequeño piñón (rueda dentada) que se engrana a la cremallera del tubo óptico, lo que propicia al accionar el tornillo, transformar el movimiento rotatorio del piñón en movimiento rectilíneo del tubo óptico en dirección ascendente o descendente para hallar la distancia focal. El piñón del tornillo macrométrico tiene separado los dientes a la misma distancia que los de la cremallera, lo que propicia imprimirle movimientos rápidos de desplazamiento al tubo óptico con lo que se consigue con prontitud el enfoque grosero de la preparación. En cambio el piñón del tornillo micrométrico tiene los dientes más unidos, lo que no le permite engranarse directamente a la cremallera, sino a través de un piñón similar al del tornillo macrométrico que tiene acoplado un uno de sus laterales a otro más pequeño con los dientes a igual distancia que los del tornillo micrométrico. Esta diferencia mecánica propicia un desplazamiento muy lento del tubo óptico, con el que se logra la nitidez del enfoque. En otros modelos de microscopios el tubo óptico es fijo y la distancia focal se consigue, mediante el desplazamiento ascendente o descendente de la platina, 101

por un mecanismo similar, mediante los tornillos macrométricos y micrométricos, mientras que en otros, ambos tornillos están acoplados, quedando el micrométrico insertado en el centro del macrométrico. El funcionamiento para subir o bajar el condensador tiene el mismo mecanismo que el empleado para los tornillos macrométricos. Este tornillo queda muy próximo al condensador y se acciona en uno u otro sentido según sean los requerimientos de iluminación de acuerdo al tipo de microscopía que se vaya a realizar. Sistema óptico. Diferentes partes El sistema óptico está formado por las diferentes partes provistas de lentes y de las que intervienen en la iluminación, siendo las siguientes: _ Lentes oculares _ Lentes objetivos _ Condensador _ Diafragma _ Espejo _ Fuente de luz _ Filtros Los lentes Los lentes empleados en la fabricación de los microscopios son discos pulidos y transparentes, siendo al menos, una de sus dos superficies, convexa. Miden desde unos pocos mm hasta varios cm y tienen la propiedad de proporcionar una imagen del objeto observado aumentada de tamaño. Lentes oculares

Fig. 52: Lentes oculares

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Antiguamente los lentes oculares disponían de una sola lente, pero desde hace años se viene utilizando un sistema de 2 lentes colocados en el interior de un pequeño tubito cilíndrico de 2,2 cm de diámetro x 3 ó más cm de largo, que le sirven de soporte, quedando separados entre sí, por un diafragma anular en forma de arandela, que se haya insertado en la porción media del tubo. La lente ubicada en el extremo superior mide 1,7 cm de diámetro, es plano-convexa, teniendo el lado plano dirigido hacia el interior del tubo. La segunda lente es biconvexa, mide 2,1 cm de diámetro y está ubicada en el extremo posterior del tubito, el cual dispone de una tapa de rosca de color negro provista de un criterio central de 1,9 cm, que al ser enroscada suavemente la lente inmovilizándola, pudiendo ser observada a través del orificio. En algunos modelos esta lente se encuentra empotrada en la misma tapa. La tapa tiene grabado en su superficie un número seguido de una "x", que indica su poder de ampliación. Por ejemplo: 10x, lo que significa que esa lente aumenta virtualmente el tamaño real del objeto observado en una imagen 10 veces mayor. Los lentes oculares que se utilizan con mayor frecuencia, son los que proporcionan los siguientes aumentos: 6x, 8x, 10x, 12,5x y 15x. Este pequeño tubo, portador de las lentes, está calibrado para que pueda ser insertado en el interior del tubo óptico, quedando retenido en su descenso por el borde de la tapa que tiene un mayor diámetro. Los microscopios monoculares están diseñados para trabajar con un solo lente ocular y los binoculares con dos. La función de los lentes oculares es la de ampliar virtualmente, la imagen formada ampliada por el lente objetivo y corregir las aberraciones cromáticas y de esferidad debidas a la curvatura de la lente, mediante la combinación de varias lentes con distintos radios de curvatura o suprimiendo por medio del diafragma anular los rayos que atraviesan la porción periférica de la lente. Lentes objetivos Los lentes objetivos constituyen la parte más importante del sistema óptico del microscopio, ya que mediante su poder de resolución es posible observar separados dos objetos microscópicos muy próximos entre sí. Al igual que los lentes oculares, los lentes objetivos, están formados por un sistema de varias lentes, colcadas en el interior de un pequeño tubito cilíndrico, que a diferencia del que porta las lentes oculares... está formado por tres piezas desarmables; la primera es un fino tubito que contiene las lentes, provisto de rosca en su extremo posterior, mientras que el extremo frontal o inferior, a pocos mm de su terminación se va estrechando cónicamente, para finalmente terminar plano, como si se hubiera cortado la punta del cono, quedando la aber103

tura del tubo con un diámetro reducido de 1 a 5 mm, por donde se puede observar la cara plana de la lente plano convexa que está en contacto con el pequeño orificio. Esto se debe a que las lentes oculares deben ser pequeñas, ya que entre menor sea su diámetro, mayor será su capacidad de ampliación. La segunda, es la base, una especie de unión universal, de 2,2 cm de diámetro x 2 ó 3 mm de grosor, estriada transversalmente como algunas monedas, teniendo por ambos lados un saliente anular adjunto de menor diámetro de 2 ó 3 mm de longitud, los cuales están diseñados con rosca externa y uno solo de ellos, además, con rosca interna, por donde se enrosca el tubito portador de las lentes. La tercera pieza, es una cánula cilíndrica que se ensambla a la base por la rosca externa del mismo saliente donde se enroscó el tubito portador de las lentes por su rosca interna. Al quedar ensamblado el lente objetivo, la cánula rodeará a todo el tubito menos por extremo cónico. En estas condiciones el lente objetivo podrá ser colocado en uno de los orificios del revolver portaobjetivos, mediante la rosca que se encuentra en el lado opuesto. Diferentes tipos de lentes objetivos

Fig. 53 : Lentes objetivos: a) Objetivos secos; b) Objetivo de imersión

Existen dos tipos de lentes objetivos; los secos y los de inmersión. Los objetivos secos alcanzan la distancia focal a varios cm por encima de la preparación, quedando un espacio de aire entre la lámina cubreobjetos y la lente. Este tipo de objetivo se fabrica, con diferentes potencias de aumento. El de menor aumento (5x ó 6x) es el más corto de todos y se caracteriza por proporcionar la observación de un área extensa de la preparación, por lo que se le conoce también como lente explorador. Debido a su baja potencia de ampliación no es posible observar con este lente a las bacterias, protozoarios y otro microorganismos de dimensiones microscópicas muy pequeñas. Los lentes objetivos de 10x ó 20x, son más largos, proporcionan un aumento mayor que el explorador, aunque todavía insuficiente para observar con nitidez microorganismos 104

muy pequeños como las bacterias, aunque pueden ser factibles a microscopistas con experiencia para identificar huevos de helmintos y otros elementos de interés de tamaño similar. Este lente se le conoce también como seco débil. El más largo de los tres es el de 40x ó 45x, que abarca un área más reducida de la preparación, pero proporciona un aumento lo suficientemente amplio, como para permitir la observación detallada de algunos microorganismos como protozoarios y hongos, así como: huevos y larvas de helmintos, células, artefactos y otros elementos de interés de tamaño similar, resultando aún insuficiente para la observación pormenorizada de bacterias, particularmente de las cocáceas por su íntimo tamaño. Este lente se conoce también como seco fuerte. Lente de inmersión se diferencia de los secos, no solo por ser más largo, sino además, por tener, generalmente, una franja de color negro a su alrededor y grabadas en su cánula la sigla HI(Homg Inmersión) u OI(Oil Inmersión), así como su potencia de aumento (90x a 100x) que depende enteramente del grado de ampliación que proporcione la lente frontal, ya que las demás ubicadas dentro del tubito son de corrección. En el orificio anterior del tubito, se haya la lente frontal, mide escasamente 1 mm de diámetro, de ahí, que para poder captar los rayos luminosos procedentes del condensador, que han atravesado la preparación, que tenga que estar situado a 1 ó 1,5 mm de la misma. Como el espacio de la distancia focal es tan reducido se corre el riesgo de incurrir en la impericia de presionar la preparación con el lente, provocando no solo la ruptura de la lámina, sino además pudiendo ocasionar daños, en ocasiones irreparables a la propia lente. Para evitar estos accidentes, generalmente, el tubito portador de las lentes se diseña de forma retráctil, está estructurado por dos tubitos de diámetro ligeramente diferentes, lo que propicia que el ponga las lentes pueda introducirse calibradamente dentro del otro, disponiendo además de un pequeño resorte que mantiene fija a las dos partes, pero posibilitando que cuando la parte inferior que contiene la lente frontal sea presionada sobre la lámina, se introduzca unos mm dentro de la externo, volviendo a su posición normal cuando cesa la presión, como si fuera un pistón. Los rayos de luz al pasar de un medio a otro con diferente índice de refracción tiende a desviarse por reflexión. Cuando se emplean objetivos de inmersión, a pesar de que la distancia que separa a la lente de la preparación sea escasamente de 1 mm, este fenómeno ocurre. Para evitarlo, se debe colocar sobre la preparación una gota de un líquido cuyo índice de refracción sea más elevado que el del aire y muy próximo al vidrio de la lente, que es de 1.52, en el que quede inmersa la lente. El líquido empleado tradicionalmente ha sido el aceite de cedro, cuyo índice de refracción es de 1.52. Al cubrirse el espacio de aire por el aceite los rayos de luz que han atravesado la preparación asciende perpendicularmente hacia la lente sin refractarse significativamente, lo que sí, ocurre, cuando se utilizan lentes objetivos secos. 105

El aceite de cedro tiene el inconveniente de oxidarse con el aire, adquiriendo una consistencia muy viscosa, que con el tiempo afecta la calidad de la lente, aunque se limpien adecuadamente después de su uso, por lo que, en la actualidad se emplean otros aceites para microscopios más estables, con las mismas ventajas, pero dañando menos las lentes. La función de los lentes objetivos es formar la imagen del objeto observado y ampliarla virtualmente de acuerdo a su potencial de aumento. Aumento total que proporciona el microscopio: Para conocer el número de diámetro en que se amplia virtualmente el objeto observado, se procede a multiplicar el valor de ampliación que está grabado en el lente objetivo, por el valor de ampliación del lente ocular. Ejemplo: si la ampliación del lente objetivo fuera de 20x y el del ocular 10x, entonces, 20.10=200. Por lo tanto el aumento total sería de 200x. Condensador

Fig. 54: Condensador luminoso

El condensador de campo claro o brillante, está compuesto por 2 lentes convergentes de desigual, tamaño, ubicadas en el interior de un dispositivo cilíndrico de 3 cm de diámetro, que tiene la parte superior ligeramente cónica, con el extremo de su vértice cortado, donde se encuentra un orificio de menos de 1 cm de diámetro, ocupado por la cara plana de la lente más pequeña que es planoconvexa. La segunda lente es biconvexa, siendo de mayor tamaño, encontrándose ubicada por su lado menos curvo a corta distancia de la lente más pequeña. El condensador se introduce de abajo hacia arriba, dentro de un dispositivo anular, que se haya justamente debajo del orificio de la platina, siendo inmovilizado mediante un fino tornillo, quedando ambas lentes en posición perpendicular 106

con respecto al lente objetivo. Este dispositivo a su vez, está articulado a una pieza angular que lo fija a la parte inferior del brazo, muy próximo a la base, estando provisto de un tornillo engranado a una cremallera, que se utiliza como elevador del condensador al propiciar con su accionar su desplazamiento vertical ascendente o descendente, según sea necesaria una mayor o menor intensidad de luz. La función del condensador es hacer los rayos luminosos procedentes directamente de la lámpara e indirectamente por reflexión del espejo, se refracten (desvíen) al atravesar las lentes convergentes, formando un cono de luz, en cuyo vértice se intensifica un foco luminoso, por la convergencia de los rayos de luz que al atravesar todo el sistema, salen paralelos al eje principal incidiendo sobre el objeto a observar, para después atravesarlo y seguir su trayectoria perpendicularmente, sino divergen, hacia la lente frontal del objetivo. Su colocación, muy próxima a la cara posterior del portaobjetos reduce la divergencia de los rayos de luz, con lo que se logra una mayor iluminación que resulta imprescindible cuando se hacen observaciones a grandes aumentos. Diafragma de Iris

Fig. 55: Diafragma: a) Diafragma iris; b) Diafragma anular.

Es un accesorio del condensador, consistente en un fino disco metálico, diseñado con múltiples laminillas planas superpuestas consecutivamente que adoptan el aspecto de un abanico plegable, encontrándose acoplado en el extremo del orificio posterior del condensador, debajo de la lente biconvexa, cubriendo todo ese diámetro. El condensador presenta, muy próximo a su base, una ranura que los bordea horizontalmente, de cuyo interior sale una pequeña palanquita plana, que puede ser desplazada hacia delante o hacia atrás de la ranura. Cuando el movimiento se produce hacia delante, las laminillas del diafragma se despliegan hacia el entorno del cilindro, lo que da lugar, al recogerse, a la formación de un orificio de diámetro variable en el centro del diafragma. Si la palanquita fuera hacia atrás, sucedería todo lo contrario, ya que las laminillas se desplazarían 107

hacia el centro, cerrándose, para reducir progresivamente el diámetro del orificio. El diafragma se utiliza para regular la cantidad de rayos luminosos que deben pasar al interior del condensador. Cuando pretendemos realizar una microscopía donde el exceso de iluminación, lejos de beneficiar, afectan la calidad de la observación se cierra total o parcialmente el diafragma y cuando necesitamos más intensidad de luz se va abriendo hasta obtener la requerida. Espejo

Fig. 56 : Espejo

El espejo de los microscopios es circular, mide unos 5 cm de diámetro y consta de dos espejos adosados por su reverso, uno de los cuales tiene la superficie plana y el otro cóncava. La primera se utiliza cuando la fuente de luz es natural y la segunda cuando se emplea iluminación artificial. Ambos espejos se encuentran montados conjuntamente dentro de un fino aro metálico de unos 5 mm de ancho que les sirven de marco, teniendo por cada lateral de su línea ecuatorial, un fino orificio de 1 mm de diámetro por donde se articula a dos pequeños salientes puntiformes que se hayan en cada extremo de una planchuela curva acoplada por su centro a un pequeño vástago cilíndrico, dándole un aspecto de horquetilla. El extremo posterior del vástago se introduce en un orificio presente en el extremo inferior del brazo donde se fija. De esta manera el espejo puede ser movido por rotación, mediante las articulaciones laterales, para seleccionar la cara a emplear o conjuntamente, mediante la rotación del vástago, para hallar el ángulo adecuado que propicie la reflexión del espectro luminoso procedente de la lámpara hacia el condensador. Lámpara Las lámparas utilizadas, como parte del módulo del microscopio óptico, deben proporcionar para la microscopía ordinaria, una luz monocromática de corta longitud de onda. En los microscopios modernos, la lámpara está acoplada en la base aunque todavía se utilizan modelos, donde se encuentra separada. En ambos casos la lámpara forma parte de un soporte diseñado para proyectar me108

diante un reteden sus emanaciones como un cono de luz, de manera similar a como lo hace una linterna. La mayoría de dichos soportes se fabrican con diversos aditamentos para optimizar el empleo de la iluminación, tales como: portafiltros, diafragma y reóstato, este último para regular la intensidad de la luz.

Fig. 57 : Lámpara

Cuando la lámpara está separada del microscopio, debe proyectarse el haz de luz de manera que incida directamente sobre el espejo, para que los rayos sean dirigidos por reflexión hacia el condensador. Filtros

Fig. 58 : Filtros

Son dispositivos de vidrio, que se caracterizan por ser transparentes, esféricos y planos, miden de 2 a 3 cm de diámetro y tienen un determinado color. Su función es la de absorber las longitudes de ondas de determinados colores para proporcionar una luz que mejore la observación microscópica.

Principios básicos Los principios básicos en que se sustenta el empleo utilitario de los microscopios son esencialmente de: _ Su poder de resolución. _ La capacidad de formar imágenes. 109

Poder de resolución El poder de resolución es equivalente a la potencia de observación, lo cual está delimitado por la menor distancia entre dos puntos muy próximos entre sí, en que es posible observarlos separadamente. Si la distancia se acortara y el poder de resolución del observador ya hubiera llegado a su límite , no podrá distinguir la separación entre ambos puntos y para su percepción estarán unidos. Por ejemplo, el ojo humano no puede distinguir la separación de dos puntos que estén a menos de 0,2 mm de distancia, por lo tanto su poder de resolución es de 0,2 mm, por lo que cualquier objeto con un tamaño inferior a esa medida le resultará imperceptible. Como el microscopio está estructurado con lentes que amplían virtualmente la imagen del objeto real, su poder de resolución será mayor, en dependencia del aumento, pudiendo alcanzar hasta 0,2 (micrómetros) estando limitada su potencia a esa magnitud, las limita cuando el tamaño de la longitud de onda de la luz. Formación de imágenes En dependencia del grosor y la densidad óptica que tenga cada parte del objeto a observar, los rayos de luz que lo atraviesan sufren un retraso proporciona en su trayectoria con respecto a los que siguieron directamente hacia el lente objetivo. Al reunirse en la lente todos los rayos, el brillo ocasionado por los que no tuvieron interferencia, las sombras producidas por la densidad óptica de cada parte del objeto y la oscuridad proporcionada por su grosor, darán lugar a una diversidad de tonos y matices con los que se produce la formación de imagen. Percepción de la imagen Los rayos del haz de luz empleados en la microscopía, no ascienden perpendicularmente a través del sistema óptico, ya que al atravesar en su trayectoria, las diferentes lentes y la preparación , así como los espacios de aire, que tienen diferentes densidades ópticas se refractan (desvían) en cada ocasión, dispersando o concentrándose, entrecruzándose entre sí, lo que da lugar a que la imagen del objeto llegue a la retina del ojo con una ubicación invertida, observándose los elementos que están a la izquierda de la preparación, a la derecha del campo microscópico y los que están arriba se observan debajo o viceversa. 110

Fig. 59 : Percepción de la imagen microscópica

Indicaciones para el manejo del microscopio óptico El requisito primordial para efectuar una adecuada microscopía es, el de disponer de condiciones mínimas de confort para su realización. Cuando éstas no existen o son deficitaria la tendencia es el apresuramiento, con lo que afecta la calidad de los resultados . en este sentido la superficie de la mesa o meseta donde esté colocado el microscopio debe ser lisa y sólida, preferentemente de color negro y aspecto mate para que no se refleje la luz. La silla o banqueta utilizada por el microscopista debe tener un altura adecuada en relación con la mesa, que resulte cómoda para la manipulación y observación a través del microscopio, debiendo tener respaldar. Pasos a seguir 1. Cerciorarse de que el aumento del lente ocular es el pertinente para el tipo de microscopía que va a realizar. 2. Rote el revolver portaobjetivos y coloque sobre el hueco de la platina el lente objetivo de menor aumento. 3. Accione el tornillo del elevador y suba el condensador. 4. Mueva la palanquita y abra el diafragma. 5.- Si requiere utilizar el espejo, seleccionar la cara plana o cóncava, según sea el tipo de iluminación a emplear (natural o artificial). 6. Si el microscopio fuera monocular, mirando por la lente ocular, proceda a mover convencionalmente el espejo de manera que los rayos de luz procedentes de la fuente de iluminación se reflejen y los desvíen hacia el condensador, lo cual se podrá constatar cuando el campo microscópico se observe completamente iluminado. Si el microscopio carece de espejo por disponer de una lámpara acoplada en su base, Bastará con encenderla. Si fuera un microscopio binocular, previamente, mueva lateralmente los lentes hasta Hacerlos coincidir con la distancia intrapupilar, que logrará con exactitud cuando vea un solo campo, procediendo a manipular el espejo en la forma explicada. 111

7. Coloque la lámina portaobjetos con la preparación sobre la platina y fíjela con las pinzas. 8. Con ayuda de los tornillos de desplazamientos laterales o frontales mueva la preparación hasta situarla debajo del lente objetivo. 9. Ladeando la cabeza, para observar directamente la operación, aproxime, con ayuda del tornillo macrométrico el lente objetivo seco, hasta que quede a 4 ó 5 mm de la preparación. Si fuera a utilizar el lente de inmersión, coloque previamente sobre la preparación una gota de aceite de cedro y al aproximar la lente haga que ésta contacte con la gota de aceite, quedando aproximadamente a 1mm de la lámina. 10. Mirando por el lente ocular, proceda a separar lentamente el lente objetivo de la preparación con ayuda del tornillo macrométrico hasta que logre avizorar la imagen microscópica. Seguidamente gire el tornillo micrométrico hasta que el enfoque sea nítido. 11. Si el enfoque se realizó con objetivo seco de poco aumento y se requiere un objetivo de más aumento, rote el revolver portaobjetivos y sitúe sobre la preparación el lente requerido. Si el microscopio está debidamente ajustado, al cambiar el lente objetivo debe quedar enfocado el mismo campo pero con menos radio de observación. 12. Ajuste la altura del condensador y la abertura del diafragma a las necesidades de iluminación de la microscopía que vaya a efectuar. 13. Para recorrer la preparación y observar los campos necesarios, accione con su mano derecha los tornillos de la platina y desplace la lámina en diferentes direcciones, y con su mano izquierda accione el tornillo micrométrico para ir corrigiendo el enfoque cuando la lámina esté en movimiento. Nota. Si está utilizando un microscopio monocular, alterne los ojos durante la observación y mantenga el que no esté utilizando abierto. Si la microscopía a realizar requiere de filtro, utilice el correcto.

Otras variantes del microscopio óptico El microscopio óptico de campo brillante es el que se utiliza corrientemente en el trabajo cotidiano del laboratorio, pero no siempre resulta eficaz para la realización de determinados exámenes, requiriéndose otras variantes microscópicas con las que se pueda obtener los resultados requeridos. Entre las más empleadas en el laboratorio de microbiología se encuentran las siguientes: _ Microscopía de campo oscuro. 112

_ Microscopía de contraste de fase. _ Microscopía de fluorescencia. En la actualidad las empresas dedicadas a la fabricación de microscopios, comercializan modelos multipropósitos, diseñados de tal manera que puedan ser intercambiables; tubos ópticos, condensadores, etc. Microscopía de campo oscuro Para la realización de este tipo de microscopía se procede a retirar del microscopio óptico, el condensador de "Abbe", colocando en su lugar uno de campo oscuro.

Fig. 60 : Condensador de campo oscuro

Este tipo de condensador está provisto de un aditamento circular opaco, de menor diámetro que el orificio posterior que se encuentra ubicado debajo de la lente, teniendo la función de impedir el paso del haz de luz hacia el área central del condensador posibilitando solamente la entrada de los rayos periféricos, los que al refractarse en su interior, atraviesan la lámina portaobjetos en forma oblicua como un cono hueco de luz con su vértice hacia abajo. Cualquier objeto colocado en la trayectoria de los rayos luminosos será atravesado por éstos o iluminados indirectamente. Como el rayo de luz no penetra en el tubo óptico, no ilumina por lo tanto los ojos del observador, que vera como resultado un campo microscópico de color negro (campo oscuro). Los rayos que atraviesan las partículas que se hayan en la preparación, o las iluminan indirectamente, crean un efecto que proporcionan la observación de las partículas con un aspecto brillante sobre fondo oscuro, de similar manera, que cuando se observan las estrella en la noche. 113

La microscopía de campo oscuro se utiliza para la observación de microorganismos y otros elementos de interés que no resultan factibles de ser coloreados. Al no sufrir efectos tóxicos de las sustancias colorantes se mantienen viables, lo que permite estudiar su motilidad. Microscopía de contraste de fase Las diferentes partes de las células, no cambian significativamente la amplitud de los rayos de luz que las atraviesan, pero al tener diferencias en la densidad de sus respectivas estructuras, obviamente, sí cambian diferenciadamente la fase (dirección) de la onda luminosa. Como el ojo no es sensible a los cambios de fase por ser muy imperceptibles, la microscopía ordinaria no posibilita que se pueden detectar las diferencias. El método de contraste de fase proporciona que se pongan en evidencia cambios de fase mediante su amplitud lo que hace posible distinguir por contraste las estructuras celulares entre sí y diferenciar a estas de su entorno. Para la realización de la microscopía de contraste de fase se requiere acoplar dos aditamentos al microscopio ordinario: un diafragma anular y una placa de cambio de fase. Diafragma anular: Es un disco opaco, de unos 2 cm, que presenta en su diámetro medio un aro transparente. Este disco se acopla en la parte inferior del condensador, de manera que al haz de luz que lo atraviesa pasa al condensador como un aro hueco de luz. Placa de cambio de fase: Es una placa transparente de forma circular, que tiene en su diámetro medio un aro de vidrio óptico. Esta placa se sitúa debajo del lente ocular.

Fig. 6l: Aditamentos para la microscopía de contraste de fase: a) Diafragma anular; b)Placa de cambio de fases

Funcionamiento: Debido a la forma anular del diafragma, la luz pasa al condensador en forma de aro. Al atravesar el objeto, prosigue su trayectoria por el tubo óptico hacia el lente ocular, mientras que los rayos no pasan alrededor del objeto se dispensan. Al proseguir su trayectoria estos rayos atraviesan el aro 114

de vidrio óptico de la placa de cambio de fase. Como resultado los rayos que se refractan para luego pasar por el anillo óptico de la placa de cambio de fase, sufren un notable retraso en su velocidad de traslación con respecto a los rayos que transitaron normalmente después de atravesar el objeto, lo que ocasiona un acentuado contraste de brillo y oscuridad que propicia distinguir por contraste los componentes de la estructura celular. Empleo: Cuando no existen marcadas diferencias en la densidad óptica de las diversas estructuras celulares o el índice de refracción entre las células y los líquidos circundantes no están suficientemente contrastados en cuanto a brillo, sombra u oscuridad, que posibilitan su observación con una microscopía ordinaria.

Fig. 62: Trayectoria del haz de luz en la microscopía de contraste de fase

La placa de contraste de fase amplía significativamente las diferencias entre las ondas luminosas refractadas y las que no lo están, haciendo factible la realización de exámenes directos en fresco, sin la aplicación de colorantes, para observar microorganismos presentes en líquidos igualmente transparentes. Microscopía de fluorescencia El principio de este método, difiere del de otras formas de microscopía óptica, en que no utiliza directamente la luz incidente, sino que emplea fuentes indirectas de energía luminosa, obtenida mediante la aplicación de ciertos compuestos denominados fluocromos, que tienen la propiedad de absorber la luz 115

ultravioleta de onda corta y emitirla posteriormente, durante algún tiempo, en forma de luz fluorescente (fosforescente) a mayor longitud de onda. Entre los fluocromos más empelados se encuentra la auramina y la naranja acridina que se utilizan para la tinción directa de microorganismos y otros como el isotiocinato de fluoresceína que pueden ser conjugados a anticuerpos y se emplean en técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFA). La estructura del microscopio de fluorescencia es similar a la del microscopio óptico común, diferenciándose en que dispone de los siguientes aditamentos: 1. Fuente de luz: Consiste en una lámpara de mercurio o xenón de alta presión que produce con firmeza y fuerza sostenida ondas luminosas en el espectro ultravioleta. 2. Filtro primario: Este filtro se sitúa entre la fuente de luz y el condensador y su selección debe estar en correspondencia con el fluorocromo empleado ya que tiene la función de eliminar las longitudes de ondas de la luz, que no sirvan para exitarlo. 3. Condensador de campo oscuro: Para concentrar la luz ultravioleta sobre la muestra y lograr un mayor grado de Fluorescencia, dando como resultado que la imagen del objeto enfocado se vea, a través del lente ocular, fluorescente sobre fondo negro. 4. Filtro de barrera: Está situado en el interior del tubo óptico, teniendo la función de absorber la longitud de onda de la luz ultravioleta, sin interferir el paso de la luz emitida por el objeto, con un cambio de longitud de onda, después de haber interactuado con la luz ultravioleta de onda corta. Mediante este filtro se protege la vista del observador de los efectos de la exposición a las Radiaciones ultravioleta. Funcionamiento -

-

En el caso en que se utilice luz refleja, el espejo debe estar debidamente alineado con el eje del microscopio, para que no haya pérdida de energía luminosa. La luz ultravioleta, procedente de la lámpara, después de atravesar el filtro primario seleccionado, penetra en el condensador de campo oscuro y al salir se refleja oblicuamente sobre el objeto teñido o conjugado con fluocromo el cual absorbe las radiaciones y posteriormente se propaga en una longitud de onda más larga que es visible (fluorescencia). Tanto, los rayos incidentes de luz ultravioleta como la fluorescencia generada por los fluocromos, atraviesan la lente frontal del objetivo en el tubo ocular, donde los rayos ultravioletas son absorbidos por el filtro de barreras, mientras que la luz fluorescente lo atraviesa y la imagen virtual 116

del objetivo es observado a través de la lente ocular con un aspecto fluorescente. Precauciones -

Se pueden emplear lentes oculares y objetivos de uso común, siempre que se tenga la certeza de que no estén fabricados con material fluorescentes, que alterarían los resultados. Para las observaciones con objetivos de inmersión se debe utilizar un aceite especial, ya que el aceite de cedro es fluorescente.

Empleo Este tipo de microscopio posibilita examinar, microorganismos difíciles de colorear, como las espiroquetas y otros agentes microbianos como: Chlamydia trachomatis, Cryptosporidium sp, Giardia lamblia y otros, así como para la detección rápida de antígenos virales. Observaciones Mediante este tipo de microscopía se pone de manifiesto, diferencias de coloraciones de diversos tejidos, sin ningún tratamiento con fluorocromo, por ser los mismos fluorescentes.

MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO El microscopio estereoscópico difiere del microscopio óptico convencional, no solo en su diseño, sino además, en el principio de su poder de aumento y en la finalidad de su empleo. Diseño Durante muchos años se ha venido utilizando, un prototipo de microscopio estereoscópico consistente en el ensamblaje de dos tubos ópticos independientes, diseñados para que cada ojo del microscopista observe la imagen ampliada por un lente objetivo común, desde posiciones diferentes, lo que propicia una visión estereoscópica o tridimensional del objeto. En la actualidad se fabrican modelos más modernos, provistos de un prisma que refleja la imagen, desde ángulos diferentes hacia ambas lentes. 117

Fig. 63 : Microscopio estereoscópico

Los lentes objetivos, generalmente dos, se encuentran montados en el interior de un revolver tubular y se caracteriza por tener un bajo poder de aumento (2x o 4x), mientras que el de los lentes oculares oscila de 5x a 10x, lo que proporciona un aumento potencial total, entre 10x y 40x. Estos microscopios no poseen condensador ni diafragma, estando estructurado por una base de 4 ó 5 cm de altura que le sirve al mismo tiempo de platina, en cuya porción central se encuentra un orificio de unos 7 cm de diámetro cubierto por un cristal nevado. El sistema de iluminación consiste en dos lámparas, una que se haya en la base del microscopio, cuyos rayos atraviesan el cristal nevado de la platina, proporcionando una iluminación tenue y otra instalada en la articulación que sostiene al sistema de los lentes, que proyecta la luz en dirección oblicua sobre el objeto dando la posibilidad de observar cuerpos opacos. Este microscopio está provisto de un tornillo único, articulado a una cremallera, que se utiliza para aproximar o alejar al lente objetivo del objeto a examinar. Principio El principal funcionamiento del microscopio estereoscópico no está basado como en el microscopio óptico en el poder de resolución, sino en su capacidad directa de aumento, por lo que la imagen ampliada se observará en el campo microscópico en el mismo plano que el objeto real, no invirtiendo su posición como sucede con el microscopio de uso común. 118

CUIDADO, LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO Los microscopios son equipos que requieren de un cuidado esmerado para su buen funcionamiento y prolongación de su vida útil, no solo por su elevado costo, sino porque resultan imprescindibles en el laboratorio para el examen de diferentes muestras, que no puede ser resuelto por ningún otro procedimiento que no sea la microscopía. Las causas que afectan con mayor frecuencia su óptimo estado de funcionamiento y por consiguiente su eficacia son: el polvo, la suciedad, los fuertes impactos, la humedad y los inadecuados métodos de limpieza. Cuidado 1. Durante su empleo - Ubique el microscopio sobre una mesa o meseta sólida de superficie nivelada, separándolo ligeramente de la orilla para evitar que accidentalmente pueda caer al piso y dañarse. - Antes de instalarlo a la red eléctrica, cerciórese de que el voltaje de la toma, se corresponda con el requerido para ese microscopio, ya que un error en este sentido ocasionaría la ruptura de la lámpara y en el mejor de los casos se produce una disminución de la intensidad lumínica con la consiguiente pérdida de nitidez de la imagen. - Si accidentalmente se produce derramamiento de agua, reactivos u otros compuestos orgánicos sobre la platina, no permita que se sequen por evaporación ya que pueden formarse costras o sufrir efectos oxidantes que deterioran su construcción y en consecuencia su funcionamiento. Cuando suceda, seque de inmediato la platina con material absorbente y seguidamente límpiela con un paño de lino fino o gamuza. 2. Al concluir su utilización. - Apague la lámpara. Si se trata de un modelo con regulador de intensidad, reduzca la luz antes de apagarla. Con esta acción se protege al filamento que puede quebrarse por cambios bruscos de la temperatura si no se toma esa medida. - Antes de retirar la lámina, separe el lente objetivo de la preparación con el tornillo macrométrico, para evitar roces con la lente frontal que pueden dañarla. Se utilizó lente de inmersión, remueva el aceite empleado con papel para lentes o un paño de tela fina que no ocasione ralladuras. No utilice el alcohol para estos menesteres, pues pueden desprender la lente del cemento que la fija al dispositivo tubular inutilizable. En caso de em119

plear xilol, por estar muy impregnado el aceite, humedezca ligeramente el paño, no lo empape, para evitar que se produzca el mismo efecto que con el empleo del alcohol. - Coloque la tapa a cada lente ocular para evitar que se afecte por el polvo, y cubra el microscopio con un tapacete de nylon con el mismo propósito. - Si tuviera que trasladar el microscopio para otro sitio, cerciórese de que el tornillo del cuerpo binocular lo mantiene fijo. Sujete el microscopio con una mano por la base y con la otra agarre firmemente el brazo, realizando el traslado todo el tiempo con el equipo en posición vertical, para evitar que se salgan los lentes oculares y puedan dañarse. Limpieza 1. Del sistema óptico. - El vidrio con que se fabrican las lentes es blando, de ahí, que sean muy susceptibles a la erosión. Cuando se requiera su limpieza se debe emplear, para remover el polvo, un pincel fino y plano, de ser posible de pelo de camello, que se utilice exclusivamente para eso o un paño de lino fino o gamuza para la suciedad, que de manera frecuente está ocasionada por la grasa de la pestañas y los cosméticos. La remoción del aceite de inmersión ya fue tratada en el acápite de cuidado. - Para detectar la presencia de polvo o suciedad en las lentes oculares, basta con observar a través de ellas el campo microscópico; si se detectan manchas, haga rotar el lente sin sacarlo del tubo ocular, las manchas rotan con la lente, es que está sucia. Después de realizada la limpieza de la manera explicada colóquela nuevamente en el tubo ocular y compruebe que las manchas han desaparecido, si persisten, puede deberse a una insuficiente limpieza o que el polvo ha penetrado el interior del lente, en ese caso, desenrosque el tubito portador de las lentes y proceda cuidadosamente a su limpieza, volviendo a colocar las lentes en la misma posición en que estaban, absteniéndose de contactar con el diafragma anular que se haya en su interior. Si después de realizada esta operación la suciedad persiste, limpia la lente frontal del lente objetivo, cuyo soporte no debe abrirse nunca, correspondiendo, solo a un personal especializado, pues de lo contrario se corre el riesgo de que sufran un daño irreparable. - La limpieza de las lentes del condensador se hará, con igual cuidado externamente, sin desarmar el dispositivo. - El espejo se limpiará con un paño fino, no requiriendo cuidados especiales. 2. Del sistema mecánico. 120

-

La base, brazo, platina, etc. Se limpiarán con un paño, con el que se removerá el polvo y la suciedad de sus superficies. - No debe utilizarse alcohol para limpiar el microscopio pues tiende a deteriorar la pintura. 3. Mantenimiento. - Los lentes que no estén en uso, deben ser colocados en dispositivos con tapa de rosca para preservarlos del polvo. - Si desea guardar los microscopios en sus cajas, cerciorarse de que éstas no tenga humedad que creará un ambiente muy propicio para que las lentes se contaminen con hongos que resultan muy difíciles de remover. - La grasa vieja que se ha solidificado o adherido, removerla con xilol o gasolina. - Lubricar periódicamente las cremalleras con grasa de buena calidad libre de ácidos. - Para pulir las partes metálicas lustrosas, utilizar un paño fino impregnado ligeramente con aceite de máquina exentos de ácidos. - El equipo debe recibir asistencia técnica especializada cada 6 meses.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO Como ya se explicó en la parte inicial de este capítulo, la ampliación del objeto real, se logra con el microscopio óptico, a través de una imagen virtual, proporcionada mediante una combinación de lentes y luz visible con un alcance máximo de 2000x. ¿A qué se debe esta limitación?. Aunque se emplearan lentes de vidrio, cuya combinación, pudiera proporcionar más de 2000x, la longitud de onda de la luz visible que es de 400 a 700 m/µ , limita esa posibilidad, ya que partículas separadas por menos de 200 m/µ escapan a su poder de resolución. Sin embargo los electrones de alta energía tienen una longitud de onda muchísimo más corta que no exceden 0,5 m/µ lo cual le proporciona un poder de resolución que permite la observación de partículas por menos de una millonésima de mm. El principio del microscopio óptico y el electrónico es el mismo; proporcionar una imagen ampliada del objeto real para hacer posible su observación a través del ojo humano, pero se diferencian en que el microscopio electrónico en lugar de luz incidente o reflejada utiliza electrones y en el de lentes de vidrio campos magnéticos.

Estructura del microscopio electrónico En la actualidad se fabrican diferentes modelos de microscopios electrónicos, pero todos están constituidos básicamente por tres partes: 121

1. Un tubo de rayos catódicos. 2. Un panel de mandos. 3. Una bomba de vacío.

Fig. 64: Microscopio electrónico: a) Filamento de tungsteno; b) Condensador magnético circular; c) Bomba de vacio; d) Portamuestras; e) Muestra; f) Proyector de imagen intermedia; g) Tubo óptico con lente ocular; h) Pantalla fluorescente; i) Panel de mandos.

Tubos de rayos catódicos Consiste en un tubo cilíndrico de más de 1 metro de largo por aproximadamente 50 cm de diámetro, que se haya colocado en posición vertical. En su interior se encuentran instalados, de arriba hacia abajo, los siguientes componentes que constituyen su sistema funcional: -

Filamento de tungsteno. Condensador magnético circular. Porta muestra. Objetivo magnético circular. Proyector de imagen intermedia. Pantalla fluorescente.

Por la parte externa, el tubo presenta en el tercio superior un soporte de atril para la colocación de la preparación y en dirección descendente, diversas pa122

lancas y manivelas que se emplean para corregir el enfoque, el ajuste de los campos magnéticos y el funcionamiento de la bomba de vacío. En la parte inferior del tubo, muy próximo a la base, se encuentra acoplado un anteojos binocular centelleante, para observar la pantalla fluorescente. Papel de mandos Está ubicado sobre la mesa de trabajo, muy próximo a la base del tubo de rayos catódicos, donde ambas partes se encuentran instaladas. En la pared frontal presenta una pizarra con diversas escalas metradas que permiten monitorear y ajustar el funcionamiento del equipo. Bomba de vacío Está instalada en el tercio superior del tubo.

Funcionamiento 1. Se coloca la preparación sobre el porta muestras, la cual debe ser extremadamente fina (menos de 0,1 mm), de lo contrario resultaría opaca a los electrones no pudiendo ser atravesadas por éstos. 2. Se extrae el aire que se encuentra en el tubo, mediante la bomba de vacío, para hacer factible la movilización de los electrones, los cuales se encuentran impedido de desplazarse en su presencia. 3. Encender el equipo, sometiendo el filamento de tungsteno a una potencia de 30 a 150 kv, con lo que se propicia que los electrones generados por el calentamiento del filamento se propaguen, penetrando en el condensador magnético, para seguidamente concentrarse sobre el objeto y atravesarlo, ampliando su imagen hasta 2000x en forma análoga a como lo hace el lente objetivo del microscopio óptico. 4. El proyector de imagen intermedia, con un funcionamiento similar al del lente ocular del microscopio óptico, amplia la imagen unas 250,000 veces o más. 5. La imagen puede finalmente observarse directamente sobre la pantalla fluorescente o proyectarse sobre una placa fotográfica si se desea el registro permanente de la imagen. 6. La imagen formada por la pantalla fluorescente es ampliada de 4 a 6 veces por el anteojos binocular, con lo que se obtiene un aumento total de 1.000,000x o más, sin pérdida excesiva de detalles. 123

Empleo 1. Para la observación de partículas víricas. 2.Para la observación de estructuras bacterianas y de otros microorganismos. Desventajas En contraposición a su elevado poder de resolución, la microscopía electrónica tiene la ventaja de que la acción de los electrones resulta letal para los microorganismos por lo que no es posible observarlos en estado viable.

CUESTIONARIO 1. Nombre las diferentes partes del sistema mecánico del microscopio óptico. 2. Relacione en el mismo orden en que se encuentran, las diferentes partes del sistema óptico. 3. ¿Cuál es la función del revolver? 4. Precise cuál es la diferencia funcional entre el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. 5. Describa la forma de los lentes que se encuentran en el interior del condensador de campo brillante. 6. ¿Cuál es la función del diafragma? 7. Clasifique los diferentes tipos de lentes objetivos. 8. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión? 9. Describa la forma que tienen las dos caras del espejo y especifique cuando se utiliza cada uno de ellas. 10. ¿Con qué objetivo se utilizan los filtros? 11. ¿Qué Ud. Entiende por poder de resolución? 12. ¿Cuál es el poder de resolución del microscopio óptico? 13. Describa como se forma la imagen del objeto observado con el microscopio óptico. 14. Describa la trayectoria que específicamente va siguiendo el haz de luz al atravesar el condensador, el objeto a observar y los lentes objetivo y ocular. 15. Describa paso a paso, como Ud. monta una preparación en láminas en el microscopio óptico y la enfoca. 16. Sí Ud. emplea primero un lente objetivo de 20x y posteriormente un lente objetivo de 40x ¿Cuál de los dos le proporcionará un campo microscópico más amplio? Fundamente su respuesta. 124

17. ¿Describa las características estructurales y funcionales del condensador de campo oscuro? 18. ¿Cuáles son las funciones que respectivamente tienen el diafragma anular y la placa de cambio de fase en la microscopía de contraste de fase? 19. Explique las funciones del filtro primario y el filtro de barrera que se utiliza en la microscopía de fluorescencia. 20. Describa la estructura del microscopio estereoscópico. 21. ¿Con qué particularidad se observa la imagen del objeto a través del microscopio estereoscópico? 22. ¿Con qué finalidad se realiza la observación a través del microscopio estereoscópico? 23. ¿Cuál es la diferencia estructural entre un microscopio óptico y microscopio electrónico? 24. ¿Cuál es la ventaja y la desventaja más significativa del empleo de la microscopía electrónica?

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CAPÍTULO 9 INSTRUMENTOS MECÁNICOS INTRODUCCIÓN La cantidad y variedad de investigaciones que se realizan diariamente en los laboratorios de microbiología clínica , han tenido una marcada tendencia a incrementarse progresivamente en los últimos años, en la misma medida en que estos servicios se han ido extendiendo a todas las unidades del sistema Nacional de Salud. La introducción de instrumentos mecanizados y automatizados para la realización de los diferentes procederes han venido a suplir en alguna medida los métodos tradicionales, con lo cual se ha logrado no sólo una mayor productividad, precisión y ahorro de recursos materiales y humanos, sino que su aplicación, interpone una barrera de bioseguridad que reduce significativamente los riesgos potenciales a los que se ven expuestos los manipuladores. La mecanización sustituye la labor del hombre, mediante el empleo de instrumentos técnicos, regulados por éste, mientras que la automatización comprende además un control intrínseco del instrumento mecanizado que ha sido diseñado para que se autorregule. En los laboratorios de microbiología se utilizan diversos instrumentos de este tipo, pero sin lugar a dudas uno de los empleados con mayor frecuencia es la pipeta mecánica.

PIPETAS MECÁNICAS En la actualidad se comercializan varios tipos y modelos de pipetas mecánicas. Entre las más empleadas en los laboratorios de microbiología se encuentran: la pipeta de pistón clásica del tipo "Marbung", la del tipo "Jena" y la "Multicanal", que forman parte del sistema micro analítico Eppendorf. En estos tipos de pipetas el líquido se carga y descarga, mediante el accionar manual de la pipeta a una boquilla finamente cónica y puntiaguda de material plástico, que se inserta en el extremo inferior de la pipeta, de manera que el líquido aspirado pasa a la boquilla, pero no entra en ningún momento en la pipeta lo que permite su empleo reiterado, mediante el intercambio en cada ocasión de la boquilla plástica deshechable. 126

El índice de error, dado por los fabricantes, para este tipo de pipeta es de sólo un 1%. Estas pipetas se emplean para medir volúmenes de líquidos en el rango de microlitros. Un microlito es equivalente a la millonésima parte de un litro o la centésima parte de 1 mL.

PIpeta tipo Marburg Este tipo de pipeta es de pistón fijo, estando diseñada para cargar o descargar solamente, un volumen determinado en microlitros, el cual está indicado mediante un número impreso en la parte superior de la pipeta. Como cada pipeta de este tipo, está limitada para aspirar o dispersar exclusivamente, un volumen fijo para el que ha sido diseñada, los fabricantes la comercializan en serie de: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900 y 1000 mL. Estructura externa

Fig. 65 : Pipeta mecánica tipo Marburg

Está estructurada con una cánula cilíndrica de material plástico de unos 2 cm de diámetro, estriada transversalmente para facilitar la sujeción manual. La parte superior de la cánula tiene insertada una anilla plástica prevista lateralmente de un pequeño saliente plano en posición horizontal, que sirve de tope al dedo índice, una vez que la pipeta esté empuñada. Por encima de la anilla, la pipeta se estrecha ligeramente en forma de un cono cortado por su vértice, en cuya pared se encuentra impreso un número que indica el volumen fijo que carga esa pipeta y sobre el número una franja que circula su diámetro, de color amarillo o azul, de varios mm de ancho. La franja de color amarillo distingue a las pipetas diseñadas para cargar 100 microlitros o menos y las de 127

color azul a las que se cargan más de 100 y hasta 1000 microlitros, teniendo esta última mayor diámetro. En el extremo superior de la pipeta se encuentra un botón cilíndrico insertado calibradamente en el orificio que se haya en la parte más estrecha del extremo distal cónico. Por debajo de la cánula se encuentra insertado un fino vástago cilíndrico, ligeramente cónico de material plástico, de unos 5 mm de diámetro, por cuyo extremo se inserta la boquilla plástica deshechable, cuyo color será igual al de la franja que circula la parte superior de la pipeta. Estructura interna

Fig. 66: Estructura interna de la pipeta mecánica tipo Marburg: a) Botón; b) Pistón cilíndrico; c) Muelle; d) Cerrador circular; e) Cilíndro; f)Pieza que cierra herméticamente la pipeta

En el interior de la pipeta se encuentra el sistema mecánico que hace posible, al ser accionado, su funcionamiento, interaccionando las diferentes piezas que lo conforman, de la siguiente manera: el botón que se encuentra externamente en la parte superior de la pipeta, contacta internamente con la parte superior de un pistón cilíndrico que se encuentra rodeado por un muelle flexible, cuyo extremo inferior contacta con el cerrador circular, una especie de zapatilla circular, que por su lado opuesto queda junto a una pieza cilíndrica que en las pipetas de menor calibre tiene insertado centralmente un mandril (aguja), para finalmente terminar en una pieza tubular que completa el sistema. Principio de su funcionamiento 1. Se procede a insertar ajustadamente una boquilla plástica deshechable en el extremo del vástago que sea del mismo color (amarillo o azul) que el que tiene la franja que circula el extremo superior de la pipeta. 128

Fig. 67: Ajuste de la boquilla plástica deshechable a la piapeta

2. Se empuña la cánula, de manera que el borde del dedo índice quede en contacto con el saliente de la anilla que se haya sobre la cánula y la yema del dedo pulgar sobre el botón que se encuentra en el extremo superior de la pipeta.

Fig. 68: Manera de empuñar la pipeta

3. Al presionar con el dedo pulgar el botón hacia abajo, hace que se comprima el muelle, lo que provoca, que el pistón y el resto del sistema mecánico desciendan. 4. Sin dejar de presionar el botón, se introduce la punta de boquilla deshechable, varios mm en el interior del líquido que se desea extraer y se procede a aflojar suavemente la presión del dedo. Esta acción hace que todo el sistema asciende hasta ocupar su ubicación normal, provocando la succión que hace que pase al interior de la boquilla, un volumen exacto de líquido, que será específico para cada pipeta de pistón fijo. 129

5. A continuación se introduce la punta de la boquilla en el tubo de ensayo de manera que quede sobre la pared interna del tubo, procediendo a presionar el botón para verter el volumen fijo de líquido. 6. Si se desea tomar una muestra diferente, basta con intercambiar la boquilla deshechable y repetir la operación.

Fig.. 69: Procedimiento para verter el líquido en el tubo receptor Nota: El intercambio de boquilla debe realizarse con la mano enguantada, depositando la utilizada en un vaso de precipitado con solución desinfectante.

Pipeta del tipo Jena

Fig. 70: Pipeta tipo Jena: a) Botón giratorio; b) Ventanilla con escala en microlitros

130

El principio funcional es similar al de la pipeta del tipo Marburg, aunque difieren en el diseño, comercializándose distintos modelos. La particularidad estructural que tiene este tipo de pipeta es que está provista de un botón giratorio en su parte superior, mediante el cual se hace descender o ascender al sistema mecánico, con lo que consigue variar su nivel de ubicación, lo que propicia que se pueda ajustar el grado de succión de la pipeta dentro de un determinado rango, para que aspire o disperse un volumen deseado. Esta pipeta dispone además en su parte superior, muy próximo al botón giratorio, de una ventanilla rectangular provista en su interior de una escala numérica que va aumentando o disminuyendo el valor de los dígitos en la medida en que el botón sea girado hacia delante o hacia atrás. De esta manera se ajusta previamente la pipeta para que trabaje a un volumen deseado en números externos y décimas de microlitros. Pipeta del tipo multicanal Este tipo de pipeta se sustenta en el mismo principio funcional, pero difieren en que, en lugar de una sola boquilla deshechable, están diseñadas para que se le puedan insertar 8 o más boquillas, ubicadas unas al lado de las otras, lo que le da un aspecto de rastrillo. Cuando se acciona la pipeta, cada una de las boquillas succiona o dispersa el mismo volumen de líquido de manera simultánea.

EQUIPOS ELECTROMECÁNICOS Los equipos electromecánicos son utilizados en el laboratorio para la preparación de diferentes muestras o como parte de la realización de diversos procederes, teniendo en común, que son accionados mediante energía eléctrica. Entre los más empleados se encuentran los siguientes: - Las centrífugas. - El rotor. - El agitador.

Las centrífugas La centrifugación es un procedimiento mecánico mediante el cual se pueden separar de un líquido, partículas sólidas, células, microorganismos, etc. que se encuentre en suspensión, compactándolos, mediante una sedimentación forzada en el fondo de un tubo de ensayo. También puede servir para separar líquidos miscibles mezclados entre sí, con pesos específicos diferentes, como 131

las emulsiones, donde los compuestos que lo forman, no pueden ser separados mediante la gravedad (sedimentación) o la filtración. Diseño industrial de las centrífugas

Fig. 71: Esquema de las centrífugas

En la actualidad se fabrican diversos modelos de centrífugas, pero todas tienen el mismo principio funcional. La mayoría de las centrífugas son eléctricas y solo algunos modelos ya en desuso se accionan manualmente. Partes de la centrífuga

Fig. 72: a) Cabezal; b) Portatubos.

1.Cabeza: Es una pieza metálica, en forma de barra más o menos plana, que se inserta mediante un orificio central al eje del motor, formando una cruceta cuando se trata de centrífugas de dos tubos. Como la centrífuga puede estar diseñada para 4, 6, 8 ó más tubos (siempre en número par) el cabezal adoptará la forma que tienen los rayos de una carreta con tantas barras fijas en posición horizontal, como tubos pueda centrifugar. En el extremo de cada 132

barrera se inserta un porta tubo el cual puede ser de angulación o de suspensión. Los porta tubos de angulación son fijos, quedando en posición oblicua respecto al eje, en tanto que los segundos, quedan articulados al cabezal, en suspensión, lo que le permite adoptar una posición horizontal cuando la centrífuga alcanza altas velocidades. 2. Porta tubos: Son tubos metálicos, que se utilizan para introducir los tubos de vidrio que contienen el material que va a ser centrifugado. Estos porta tubos tienen colocado en el fondo, por su parte interna, un taco de goma que sirve de amortiguador a los tubos de vidrio durante la centrifugación. 3. Motor eléctrico: Tiene la función de imprimir movimientos de rotación al cabezal mediante velocidades controladas por medio de un reóstato que varía la intensidad del flujo eléctrico. 4. Tacómetro o velocímetro: Se utiliza para ir registrando la velocidad de rotación del cabezal en revoluciones por minutos (r.p.m). 5. Reloj de intervalo: Se utiliza para regular el tiempo de cada centrifugación. 6. Bombillo piloto: Es un pequeño bombillo, generalmente de color rojo, que indica cuándo el equipo está encendido.

Principio técnico Está determinado por la fuerza centrífuga, que se sustenta que en todo el cuerpo que se mueve en torno a un punto central, se desarrolla una fuerza que tiende a separarlo de dicho centro, la cual será directamente proporcional a su masa.

Balance de los tubos Para el buen funcionamiento de la centrífuga es indispensable que los tubos queden colocados en una posición diametralmente opuesta, tengan el mismo peso, ya que de lo contrario, la fuerza centrífuga sería desigual, lo que ocasionaría un desbalance que provocaría vibraciones y sacudidas de la centrífuga con la consiguiente ruptura de los tubos y el desajuste del equipo. Para lograr un buen balance de los tubos se puede utilizar un nivelador de tubos; que es una especie de balance, diseñada para colocar dos tubos, uno a cada lado, determinándose la igualdad en peso mediante la sincronización de su equilibrio. Cuando no se disponga de este instrumento, deberá emplearse el mismo tipo de tubo y asegurarse de que el volumen de líquido en ambos sea similar. Si se va a centrifugar una sola muestra, se deberá llenar en segundo tubo con agua, con similares requisitos y ser colocado en el punta tubo que se encuentra en el lado opuesto que fuerza el que purza la muestra. 133

Fig. 73 : Nivelador de tubos

Funcionamiento 1. 2.

Abrir la tapa de la centrífuga. Introducir los tubos con las muestras en el interior de los porta tubos, teniendo especial cuidado de que quedan diametralmente apuestos (uno frente al otro) están debidamente balanceados en peso. 3. Cerrar la tapa de la centrífuga. 4. Conectar el equipo a la red eléctrica 5. Cerciorarse de que el botón que regula la velocidad del tacómetro o velocímetro este en "0". 6. Accionar el interruptor para encender el equipo. 7. Girar el botón del reloj de intervalo, hasta que indique el tiempo de centrifugación deseado. 8. Girar el botón del velocímetro lentamente, de manera que vaya marcando gradualmente la velocidad (r.p.m.) en el tacómetro hasta alcanzar la deseada. 9. Si la centrífuga no tuviera reloj de intervalo, proceda a apagarlas tan pronto concluya el tiempo previsto de centrifugación. 10. Espere a que la centrífuga se detenga, lo cual se puede determinar observando el velocímetro. Si se hubiera centrifugado material contaminado, espere 2 ò 3 minutos antes de abrir la tapa, para evitar la exposición a los aerosoles. 11. Extraiga los tubos, apague la centrífuga, desconéctela de la red eléctrica y ciérrela. Medidas de cuidados y conservación 1. 2.

Llenar los tubos hasta 1 cm por debajo del borde superior. Los tubos colocados en lados apuestos, deben tener el mismo tamaño y peso. 134

3. 4.

5.

Cualquier material que se derrame sobre la centrífuga debe ser eliminando de inmediato. Cuando se produzcan rupturas de tubos, los porta tubos serán extraídos, procediendo a la eliminación de los restos de vidrio y limpiándolos escrupulosamente. Periódicamente debe limpiarse el interior de la centrífuga con un paño húmedo para eliminar el polvo y la suciedad.

EL ROTOR El rotor se utiliza para mezclar mecánicamente las muestras con los reactivos, lográndose una mejor homogenización, que la que se puede conseguir por procedimientos manuales. En el laboratorio de microbiología se utiliza regularmente para mezclar el suero con la emulación de antìgeno para las pruebas serologícas de V.D.R.L.

Diseño del equipo

Fig. 74: El rotor: a) Superficie plana giratoria; b) Botón del "timer"; c) Botón del velocímetro

El rotor es un pequeño equipo eléctrico que tiene la forma de un cajón. Mide aproximadamente 30 cm2 x 15 cm de altura, estando provisto de una superficie plana de unos 35 cm2, sobre la cual se encuentra una plataforma giratoria de unos 30 cm2. 135

En la pared frontal del equipo, se encuentran insertados dos botones, rodeados en todo su perímetro por una escala numérica; el primero corresponde al "timer" o reloj de intervalos y el segundo al velocímetro. Muy próximo a estos botones se encuentra un pequeño bombillo, generalmente de color rojo, que indica cuando el equipo está encendido.

Funcionamiento 1. 2. 3. 4. 5.

Conecte el equipo a la red eléctrica. Coloque la cristalería con la muestra sobre la superficie de la plataforma giratoria. Accione el botón del "timer", hasta hacerlo coincidir en la escala numérica con el tiempo deseado de rotación. Accione gradualmente el botón del velocímetro hasta hacerlo coincidir en la escala con la velocidad de rotación por minutos (r.p.m.). Concluido el tiempo, el equipo se apagara automáticamente, procediendo a retirar las muestras, llevar el botón del velocímetro a "0" y desconectar el equipo de la red eléctrica.

Cuidado y conservación 1. 2.

3.

Cualquier material que se derrame sobre la superficie de la plataforma giratoria o el equipo, debe limpiarse de inmediato. Como la plataforma giratoria no queda fija, para evitar su desplazamiento por colisiones accidentales, algunos modelos disponen por uno de sus laterales de una presilla, que al ser colocada adecuadamente, impide que esa situación ocurra. Se debe verificar sistemáticamente que las rotaciones de la plataforma giratoria se correspondan con la indicada en el velocímetro. Cuando se detecte alguna diferencia se debe engrasar el equipo y si eso no resuelve el problema solicitar el servicio de un especialista.

EL AGITADOR El agitador se utiliza para mezclar muestras muy difíciles de homogenizar por procedimientos manuales debido a su densidad o mucosidad. En el laboratorio de microbiología tiene diversas aplicaciones, entre las empleadas se encuentra la homogenización de esputos. 136

Diseño del equipo

Fig. 75: El agitador: a) Plataforma oscilante; b) Botón del "timer'; c) Botón del velocímetro

Este equipo se fabrica de diferentes tamaños. La mayoría de los modelos tienen forma rectangular, con capacidad suficiente para que puedan ser colocados en su superficie varias gradillas. Al igual que el rotor, presenta en su superficie una plataforma, que en lugar de rotar , se desplaza con movimientos cortos, frontales y de retroceso en forma continua a velocidad regulable, propiciando mediante las sacudidas que ocasiona, la mezcla u homogenización de las muestras. Posee igualmente un "timer", un velocímetro para determinar el desplazamiento por minuto y un bombillo piloto.

Funcionamiento 1. 2.

3. 4. 5.

Conecte el equipo a la red eléctrica. Coloque las gradillas con las muestras sobre la plataforma oscilatoria y fíjelas con los dispositivos que dispone el equipo para que las gradillas no se vayan a caer cuando se le aplique el movimiento propio del equipo. Gire el botón del "taimer" hasta hacerlo coincidir con la escala que indique el tiempo de agitación deseado. Gire, lentamente, el botón del velocímetro hasta hacerlo coincidir con la velocidad deseada. Concluido el tiempo de agitación, retirar las gradillas de la plataforma, haga un girar en retroceso el botón del velocímetro hasta ubicarlo en "0" y desconecte el equipo de la red eléctrica.

Cuidado y conservación Similar a las que se aplican al rotor. 137

POTENCIOMETROS Los potenciómetros o pHmetros, son instrumentos eléctricos que se utilizan para medir el pH de una disolución, por estar diseñados para determinar las concentraciones de iones hidronios que posea, lo que permite conocer con precisión su grado de acidez o basicidad. En el trabajo microbiológico, la determinación del pH de una disolución, resulta primordial en diversos procederes, como por ejemplo: en la elaboración de medios de cultivo, donde el pH debe ser ajustado de acuerdo a los requerimientos de los diferentes grupos y géneros bacterianos que pretendamos cultivar, puesto que el grado de tolerancia a la acidez o a la basicidad resulta diferente para cada uno de ellos, para lograr su desarrollo óptimo.

Estructura

Fig. 76 : Potenciómetro: a) Eléctrodos; b) Galvanómetro

Los potenciómetros tienen la forma de una caja rectangular, midiendo unos 30 cm2 x 8 cm de ancho, aunque el tamaño varia de acuerdo al modo comercializado por los diferentes fabricantes. En la pared frontal o sobre la superficie se haya un galvanómetro provisto de una escala impresa del 0 al 14 que se complementa con una aguja insertada por su parte posterior a un pequeño eje situado en su centro y borde inferior. Debajo del galvanómetro se encuentran articulados al menos tres botones giratorios: 1. Botón para mover la aguja e indicar en la escala el pH de la solución buffer. 2. Botón indicador de la temperatura del potenciómetro. 3. Botón de lectura. Este botón se hace girar según se requiera hacia la posición STD.BY (En espera) o hacia la posición indicada con la palabra READ (Lectura) 138

Por el lateral derecho, el pHmetro tiene articulado en posición vertical un soporte universal metálico, provisto de una presilla habilitada para la colocación y sujeción de dos electrodos.

Electrodos Concepto: Los electrodos no son mas que el polo (Positivo: Ánodo-Negativo: cátodo) de una pila eléctrica. Estructura de los electrodos del potenciómetro o pHmetro: Consisten básicamente en un tubo de vidrio de unos 10 ò 12cm de largo x 1 o 1,5cm de diámetro, cuya porción terminal inferior puede ser redondeada, mas afinada o en forma de un pequeño bulbo redondeado similar a un densímetro. El tubo es atravesado longitudinalmente por un alambre de platino, cuyo extremo terminal queda en contacto con el material sensible o indiferente a los cambios de pH. El otro extremo del alambre queda empalmado a un cable eléctrico que se conecta en el fondo del equipo.

Tipos de electrodos 1. 2.

Electrodo indicador: En su extremo distal, en contacto con el alambre se encuentra el material sensible a los cambios de pH, como por ejemplo: hidrógeno, quinhidrona. Etc. Electrodo de referencia: Generalmente presenta un mayor diámetro y se fabrica con calomel (Hg2 Cl + K Cl) un material estable, permaneciendo inalterado independientemente de la concentración de iones hidrontes o hidroxilos que contengan la disolución.

Ambos electrodos se unen mediante puentes salinos (K CL o NH4 NO3) cuando se acciona el equipo

Principio funcional Se basa en la medición de las fuerzas electromagnéticas (f.e.m.() de las disoluciones a investigar, mediante el empleo de las pilas voltais preparadas con los electrodos que marcan la diferencia de potenciales entre ambos. El electrodo transforma la energía química en energía eléctrica, en consecuencia la fuerza electromotriz por la celda electroquímica es comparada con la del potenciómetro y la diferencia es medida en voltios, para ser convertida y presentada por el galvanómetro con un valor de pH. En los pHmetros modernos, el galvanómetro ha sido sustituido por una escala digitalizada. 139

Medición del pH La medida del pH es una forma convencional de indicar la concentración de iones hidrionios o de iones hidroxilo en una escala del 0 al 14. Cuadro 6: Gráfico de logaritmo inverso de iones hidrógeno. 0

1

2

3

4

5

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13

12

11

10

9

6

7

8

7

8

6

9

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11

12

13

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4

3

2

1

0

10-14 _________________________10-9________________________10-0 Ácido Alcalino

Por lo tanto, el pH no es otra cosa que el logaritmo inverso de la concentración de iones hidrógenos en una disolución. Una disolución es ácida cuando la cantidad de iones hidrionios (H30+) es mayor que la de iones hidroxilo (0H-) y viceversa, ya que las sustancias ácidas ceden electrones y por consiguiente retienen hidrógeno en tanto que las básicas son capaces de aceptar protones. Solución Buffer: Las soluciones buffer o amortiguadores o tampón como también se les conocen están compuestas por dos o más sustancias que evitan la producción de cambios significativos en la concentraciones de iones hidrionios, aun cuando a dicha solución se le agregue un ácido o una base fuerte.

Procedimiento para el manejo del potenciómetro Estandarice el aparato 1. Conecte el equipo a la red eléctrica y asegúrese de que el botón se encuentre en la posición STD.BY. 2. Sumerja los electrodos en una solución buffer de pH conocido. (por ejemplo: pH 7). Accione el botón y haga coincidir la aguja en el número 7 de la escala de pH. 3. Extraiga los electrodos de la solución buffer y proceda a enjuagarlos en un recipiente que contenga agua destilada. 140

4. Tome la temperatura de la solución donde se medirá el pH y accione el botón indicador de temperatura del potenciómetro. También, si lo prefiere utilice como referencia la temperatura ambiente, en lugar de tomar la de la solución. Lectura 1. Proceda a sumergir los electrodos en la solución cuyo pH se desea determinar. 2. Accione el botón cambiándolo de la posición STD.BY a READ. La aguja oscilará, hacia la izquierda o la derecha indicando en la escala, el pH. Si se requiere realizar una nueva lectura lave los electrodos previamente con agua destilada.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

¿Cuáles son las ventajas de la mecanización y la automatización sobre los métodos tradicionales de laboratorio?. Nombre los diferentes tipos de pipetas mecánicas que usted conozca. Describa la estructura de la pipeta mecánica tipo Marburg. ¿Qué relación existe entre la banda coloreada de la parte superior de la pipeta Marburg y el de la boquilla desehechable? Describa como se activa el sistema mecánico de la pipeta cuando se ejerce presión sobre el botón que se haya en la parte superior de la pipeta. Describa como opera la pipeta Marburg cuando se retira la presión del dedo sobre el botón que se haya en la parte superior de la pipeta. ¿Cuál es la diferencia funcional entre la pipeta tipo Marburg y la pipeta tipo Jena? ¿Qué característica particular presenta la pipeta multicanal? Fundamente porque causa el empleo de las pipetas mecánicas, resulta favorable para la bioseguridad del laboratorio. ¿Con qué objetivo se utilizan las centrífugas en el laboratorio? ¿En qué radica la fuerza centrífuga? Describa la estructura del cabezal de las centrífugas. ¿Cuál es la función de tacómetro? ¿Qué requisitos deben tenerse en cuenta al colocar los tubos en la centrífuga? Explique en orden cronológico, los pasos que usted debe dar para realizar una centrifugación. 141

16. Haga referencia a los cuidados que debemos observar para el buen funcionamiento y cuidado de la centrífuga. 17. ¿Para que se utiliza el rotor en el laboratorio? 18. ¿Cómo es el movimiento de la plataforma del rotor? 19. ¿Qué mide el velocímetro del rotor? 20. ¿Para qué se utiliza el agitador en el laboratorio? 21. ¿Cómo es el movimiento de la plataforma del agitador? 22. ¿Para qué se utiliza el potenciómetro en el laboratorio? 23. ¿Cuál es la diferencia funcional entre los diferentes tipos de electrodos del pHmetro? 24. ¿Qué es lo que marca el galvanómetro del pHmetro? 25. Explique como usted estandariza el potenciómetro 26. Describa los pasos que debe efectuar para determinar el pH de una disolución con el empleo del pHmetro.

142

CAPÍTULO 10 BALANZAS INTRODUCCIÓN Las balanzas son instrumentos que se utilizan para medir el peso relativo de los cuerpos, mediante la comparación, con piezas de peso certificado denominadas pesas. Existen en el mercado múltiple tipos y modelos de balanzas, los cuales están diseñados para diversas aplicaciones, que van desde las que se utilizan para medir el peso en tonelada hasta las que se emplean para medir con precisión fracciones de Mg. Unidades de medición micrometricas. Unidad básica (Gramo) Unidad micro métrica

Equivalente a la Milésima parte de un ...

Ejemplo para pesar la masa de ...

Miligramo Microgramo Nanogramo Picogramo Fentogramo Atogramo

Gramo Miligramo Microgramo Nanogramo Picogramo Fentogramo

Tabletas de medicamentos. Grano de polvo o gota de un liquido. Estructura bacterianas Un virus Una molécula Un átomo

PRINCIPIO El funcionamiento de las balanzas se sustentan en el principio físico de las palanca de primer grado, en las que el punto de apoyo se encuentra exactamente entre el punto de potencia y el punto de resistencia. Ejemplo:el cachumbambé.

DIFERENTES TIPOS DE BALANZAS Las balanzas que se utilizan corrientemente en los laboratorios de microbiología clínica son las granatarias y las analíticas digitales, ya que las de precisión o analíticas de tipo mecánico o eléctrica se emplean solo ocasionalmente. 143

Balanzas granatarias Se denomina así, al tipo de balanza, con la que se puede determinar mecánicamente, el peso de un cuerpo que se encuentra entre 0,1 a 500g o más. Cualquier objeto que se pretenda pesar con este tipo de balanza, de menos peso que el señalado, los resultados que se obtengan serán dudosos, ya que por ser demasiado ínfimo, determinados factores como: las corrientes de aire, las vibraciones o el polvo circulante puede influir en la determinación del peso real, las balanzas granatarias son empleadas cuando no se requiere conocer con precisión el peso del objeto, como por ejemplo: para determinar el gramaje de un medio de cultivo deshidratado en polvo. Se fabrica dos variantes de balanzas granatarias; las de dos platillos y las de un platillo. Balanza de dos platillo (Balanzas de Roberval)

Fig. 77: Balanza granataria de dos platillos(Balanza de Roberval)

Esta estructurada por dos planchuelas paralelas de acero, en posición horizontal, de unos 30 cm de largo, articuladas por sus respectivos extremos a una barra metálica, plana o cilíndrica, en posición vertical, formando un paralelogramo rectángular. Las barras horizontales quedan articuladas exactamente por su posición media, mediante un pasador al extremo superior de una columna sólida, ubicada en el centro de la balanza, que le sirve de punto de apoyo. Sobre el extremo superior de las barras verticales se encuentran atornilladas dos planchuelas metálicas de unos 2 cm de ancho, formando una cruz con los extremos ligeramente curvados hacia arriba, que sirven de soporte para la colocación de los platillos, mientras que su extremo inferior, queda introducido en un orificio existente en ambos extremos de la base, que al no estar topados en su interior posibilitan que la barra vertical penetre aun mas, si el peso del objeto es superior al de las pesas que se hayan en el otro platillo. 144

La barra o planchuela que queda frente al manipulador esta grabada con una escala metrada en gramos, provista de una pesa deslizante para ser movida hacia la izquierda o hacia la derecha hasta hacerla coincidir en la escala con el peso que se desea medir. El fiel en forma de aguja esta articulado por su extremo inferior a las barras horizontales, quedando en posición vertical, perpendicularmente a la columna de la balanza. La parte superior de la aguja queda junto a una escala grabada en cuyo centro esta el "0" y hacia ambos lados, presenta de 5 a 10 líneas verticales equidistantes, que permiten determinar las oscilaciones de la aguja hacia la derecha o la izquierda de la escala. Algunos modelos de este tipo de balanza, en lugar de dos barras horizontales tienen una sola carente de grabación en g, siendo el resto de la estructura similar.

Funcionamiento Antes de efectuar la pesada: 1. 2. 3.

Cerciórese de que los platillos estén limpios, vacíos y colocados correctamente sobre las crucetas. Mueva la pesa deslizante de la barra graduada hacia la extrema izquierda, hasta que marque "0" g. Ajuste el fiel de la balanza a "0", para lo cual debe observar como la aguja oscila libremente sobre la escala a ambos lados del "0". Desestime las 2 o 3 primeras oscilaciones y posteriormente compare las que se producen hacia la izquierda del "0". Si las oscilaciones son coincidentes, por ejemplo 5-5 ò 4-4, la aguja del fiel al detener su movimiento lo hará justamente en el "0". Si las oscilaciones fueran desiguales, proceda a accionar las tuercas de los tornillos de ajuste que se hayan a ambos extremos de la balanza, hasta conseguir que las oscilaciones sean parejas.

Procedimientos para efectuar la pesada Una vez que el fiel de la balanza se haya ajustado a "0" proceda de la siguiente manera: 1.

Si va a pesar algún material en polvo o líquidos, utilice un recipiente adecuado (Papel, cápsula de porcelana, vidrio reloj, vaso de precipitado, etc) pesándolo previamente, para tener en cuenta ese dato al determinar el peso del material (tara). Nunca coloque los materiales directamente so145

2.

bre el platillo, a menos de que se trate de sólidos limpios, como por ejemplo, una barra metálica, una sortija, etc. Para efectuar la pesada, mueva hacia la derecha de la barra grabada la pesa deslizante, hasta que indique el peso adecuado. Si fuera insuficiente, extraiga de la caja de pesas las necesarias y colóquelas sobre el platillo de la derecha. A continuación coloque el recipiente seleccionado sobre el platillo del lado izquierdo y vierta poco a poco en su interior el material que desea pesar, hasta que la aguja del fiel marque "0".

Caja de pesas

Fig. 78 : Caja de pesas

Consiste en un pequeño cofre cuadrangular provisto de una tapa articulada con bisagras en su parte superior. Internamente se encuentra tapizado de terciopelo, presentando linealmente unos 20 orificios de diferentes diámetros donde se introducen las pesas. En los orificios que están situados de la mitad hacia atrás del estuche se colocan las de mayor peso. Estas pesas son cilíndricas, pulidas y brillantes, estando provistas de una pequeña prominencia en su parte superior, por donde se toman con una pinza de disección. Cada una de estas pesas tiene grabado el peso (1,2,3,4,5,10,20,30,40,50 o 100g) las cuales pueden combinarse para obtener cualquier peso en ese rango. En los orificios de la parte anterior del estuche, se colocan las que tienen menor peso que las referidas. Este tipo de pesas consiste en una laminilla plana de metal con forma cuadrada o rectangular, que presenta uno de los bordes doblados en un ángulo de 900 por donde se toman con las pinzas. Al igual que las cilíndricas tienen grabado el peso, que como es obvio sera menor (0,01,0,02,0,03,0,05,0,1,0,2,0,3 y 0,5g). Todas estas pesas se fabrican básicamente con latón, acero inoxidable o aleaciones no magnéticas. Conjuntamente con las pesas, dentro del estuche se encuentra una pinza que es utilizada para extraerlas del estuche, colocarlas sobre el platillo y posteriormente reintegrarlas, por su orden en la caja. 146

PRECAUCIONES 1. Coloque la balanza sobre una superficie nivelada en un lugar donde no se produzcan vibraciones y que la temperatura así como la humedad relativa sean estables. 2. Mantenga las balanzas escrupulosamente limpias, en especial los platillos. 3. Conserve limpias las piezas, las cuales no deben ser colocadas en otro lugar que no sea los platillos. Cuando se efectúan pesadas de productos en polvo, antes de guardarlas en la caja cepíllelas con un pincel de pelo de camello, parra evitar que el polvo o la su ciedad puedan afectar la fiabilidad del peso.

Balanxa de un solo platillo (tipo Ohaus)

Fig. 79 : Balanza granataria de un solo platillo (tipo Ohaus)

A diferencia de la balanza de dos platillos, esta balanza tiene la columna que sirve de punto de apoyo, no en el centro, sino en el extremo izquierdo. Las barras horizontales son dos o tres, según el modelo, y están grabadas con diferentes escalas en gramos, teniendo cada una de ellas una pesa deslizante. Generalmente estas barras están provistas ,en su parte superior ,de una muesca sobre cada numero de la escala para fijar la pesa en el punto exacto. El fiel de estas balanzas ,no es en forma de aguja, sino de flecha y la escala se encuentra en el extremo derecho y no arriba con en la de dos platillos. Los tornillos de ajustes,generalmente, se encuentran debajo de los platillos. El procedimiento para efectuar la pesada es similar, con la diferencia de que esta balanza no utiliza las piezas certificadas de la caja de pesas.

BALANZA DE PRECISION O ANALÍTICA Este tipo de balanza se utiliza cuando se requiere determinar con precisión el peso de pequenas cantidades de materiales u objetos, cuyo peso sea de décimas o centésimas de gramos o pocos gramos. 147

De acuerdo a su diseno se clasifican en: mecánicas, eléctricas y digitales.

Balanza de precisión mecánica

Fig. 80: Balanza de precisión mecánica: a) Columna; b) Cruz; c) Fiel; d) Platillos; e) Dispositivos para subir o bajar la cruz; f) Soportaplatillos; g) Chapa; h) Cuchilla

Para evitar inexactitudes durante la pesada, debido a la influencia de las corrientes de aire, el polvo circulante o la humedad, este tipo de balanza se estructura por el fabricante dentro de una vitrina de cristal , incoloro y transparente, de unos 40cm cúbicos, sobre una base de varios cm de altura,que al igual que los marcos que sirven para fijar las paredes y la parte superior de cristal, generalmente es de madera o material plástico. En la pared anterior que queda frente al manipulador se encuentra incertada la puerta de la vitrina, la cual está provista de un marco independiente, que posee en el centro de su parte inferior un pequeño tirador que se utiliza para subir o bajar la puerta por un mecanismo de corredera (similar al de una guillotina) diseñado para que la puerta se quede fija, sin caerse, en cualquier altura en que sea detenida. La base está sostenida por un tornillo en cada uno de su ángulos , que son utilizados para nivelar la balanza, lo cual se comprueba mediante la observación de uno de los dos niveles de agua circulares que se encuentran en la superficie Partes de que consta l. Columna: La columna sirve de base al punto de apoyo de la balanza. Consiste en un tubo de metal inoxidable de unos 20 cm de largo x l,5cm de diámetro, que se encuentra atornillado por su base en el centro del piso de la urna,quedando debidamente nivelado en posición vertical. El extremo de su parte superior esta estructurado con una planchuela metálica en posición horizontal, en dirección al manipulador. La superficie de la planchuela tiene 148

forma de cajuela en U ,en cuya cavidad se inserta una placa de acero o ágata , denominada "chapa", caracterizada por su dureza e inalterabilidad al contacto con el aire, teniendo su superficie plana y muy pulida. 2. La cruz: Es una barra plana , de unos l6cm de longitud,que adopta una forma triangular con el vértice hacia abajo en cuyo extremo distal presenta un corte cóncavo. Esta barra se caracteriza por tener varias perforaciones simétricas , suficientes para aligerar su peso sin que por ello pierda rigidez a la flexión. A todo lo largo del margen superior tiene grabada una escala en mm, donde se observa el 0 en el centro y numeraciones iguales hacia ambos lados. Debajo del semicírculo que forma la concavidad, tiene insertado un prisma de ágata de forma triangular, denominado "cuchilla", cuyo vértice se apoya sobre la chapa de la columna, quedando de esta forma la cruz en equilibrio. La cruz en ambos extremos laterales presenta dos salientes en forma de horquetilla angular denominada estribo ,por donde se cuelgan los platillos. Los salientes ubicados en la parte inferior tienen insertada respectivamente una cuchilla con la arista dispuesta hacia arriba y apoyadas en una pequena placa del mismo material contenidas en los estribos. Las aristas de las tres cuchillas deben estar situadas en el mismo plano, el cvual será horizontal cuando el fiel de la balanza esté en 0. En el extremo lateral de cada estribo, se encuentra articulado un fino tornillo en posición horizontal, cuyas tuercas se utilizan cuando se requiere nivelar la balanza. 3. Fiel: Sobre el centro de la concavidad de la cruz se encuentra atornillada una chapilla que sostiene por su extremo posterior a una larga y fina aguja que es el FIEL de la balanza, quedando en posición vertical, perpendicularmente a la columna. El extremo inferior es puntiforme y oscila como un péndulo,junto a una escala graduada desprovista de números cuyo centro representa al 0. 4. Los platillos: Son dos piezas metálicas planas, de forma circular,semejantes a un plato,provisto de una saliente por cada lateral, por donde se inserta un alambre acerado rígido que describe una parábola algo angosta para factibilizar su colocación en los estribos de la cruz, que hace que los platillos queden suspendidos. 5. Dispositivos para subir y fijar la cruz : Es una fina planchuela metálica muy rígida que tiene por la superficie de cada lateral, una pequena pieza cilíndrica proyectada hacia fuera y en cada extremo un gancho semicircular del mismo material similar a la forma de las herraduras. Este dispositivo queda ubicado por debajo y muy próximo a la cruz, estando unido por su porción media a un eje que se encuentra introducido a todo lo largo de la columna, el cual se haya articulado por su porción posterior a un botón giratorio que se encuentra en la parte externa de la base de la urna en su porción central. Un medio giro del botón hacia la derecha, hace que el eje que atraviesa la columna se eleve,provocando que las piezas cilíndricas de la planchuela metálica 149

contacten con la parte inferior de la cruz y la eleve,separando la cuchilla de la chapa para finalmente quedar estática debido a la presión del dispositivo. Resulta indispensable realizar esta acción cuando no se esté realizando la pesada,para evitar que la cuchilla esté innecesariamente en contacto con la chapa, con el objetivo de que no pierda el filo, lo cual afectaría su exactitud. 6. Soportaplatillos :Son dos discos articulados respectivamente a un fleje metálico recubierto de fieltro, los cuales quedan ubicados debajo de los platillos, estando separados de estos, aproximadamente por lcm . Del lado izquierdo del botón para fijar la cruz, se encuentra el utilizado para accionar los portaplatillos,con el cual; se consigue que éstos suban y entren en contacto con los platillos, impidiendo que oscilen cuando se le esté añadiendo algún peso,propiciando que el filo de la cuchilla no roce innecesariamente con la chapa durante esta acción. Cuando el material a pesar y las pesas estén colocados sobre los platillos, se bajan los portaplatillos para que oscilen libremente y se pueda determinar el peso.

PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA PESADA l. Cerciorese de que la balanza esté nivelada, para lo cual observe la ubicación de la burbuja de aire en el nivel; de agua que se encuentra en la superficie de la base de la balanza. Si se encuentra en una posición excéntrica, proceda a girar convenientemente los tornillos donde se apoya la balanza hasta lograr que la burbuja esté en el centro del nivel. 2. Determine el punto "0" de la balanza, para lo cual haga bajar la cruz con los platillos vacios y observe las oscilaciones del "fiel" junto a la escala graduada. Si se percata de que son diferentes hacia uno u otro lado del cero, proceda a accionar los tornillos de nivelación de los extremos de la cruz, hasta que las oscilaciones sean iguales. 3. Suba los portaplatillos. 4. Deposite el material a pesar en un recipiente apropiado (previamente pesado) y colóquelo en el centro del platillo de la izquierda,seguidamente tome con la pinza las pesas y situelas por orden de peso (de mayor a menor) sobre el platillo de la derecha, teniendo la precaución de colocar en el centro la pieza de mayor peso y a su alrededor las de menos peso. Cierre la balanza, baje los portaplatillos y observe las oscilaciones del fiel, procediendo a quitar o poner las pesas o anadir o quitar producto en dependencia de los objetivos de la pesada. 5. Si se quiere determinar el peso de un objeto que tenga un peso inferior al mg, utilice los hilos de platino, denominados jinetillos , con peso cerificado, que tienen forma de gancho,los cuales se deslizan a lo largo de la regla grabada que se encuentra en la cruz. 150

6. Al concluir la pesada procesa a subir los portaplatillos,retire el material ya pesado y con el empleo de la pinza retire las pesas por su orden de menor a mayor peso. Suba la cruz,baje los portaplatillos y cierre la balanza.

PRECAUCIONES - Garantice que la balanza sea ubicada sobre una mesa o meseta nivelada, donde no existan vibraciones, cambios de temperaturas o humedad. - Limpie el interior de la balanza, en especial los platillos, antes y después de su uso. - Cerciorase de que las pesas estén limpias y manipúlelas siempre con la pinza, no las toque con los dedos, ya que éstos le comunican humedad y suciedades que alteran el peso. - Exclusivamente los sólidos se pueden colocar directamente sobre el platillo. - La lectura de las pesadas deben efectuarse siempre con la puerta cerrada. - En los ángulos de la urna coloque un pequeño recipiente que contenga un desecador con el objetivo de que absorba la humedad y mantenga secas la atmósfera en el interior de la urna, como por ejemplo: lana de vidrio embebida en ácido sulfúrico concentrado o pequeños gránulos de cloruro de calcio anhidro.

BALANZA DE PRECISIÓN ELÉCTRICA

Fig. 8l: Balanza de precisión eléctrica: a) Botón para el ajuste de la compensación de tara; b) Botón para el ajuste del punto "0"; c) Platillo; d) Indicador digital; e) Botón para la graduación de la precisión del indicador digital; f) Botones de ajustes de las pesas de cambio; g) Palanca de retención; h) Orientador de la dosificación.

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Este tipo de balanza se utiliza al igual que la balanza analítica mecánica,cuando se requiere determinar con precisión el peso de un objeto, pero difiere de ésta, tanto en el tamaño como en su diseño, generalmente es más pequeña aunque al igual que la mecánica, la caja o urna donde se encuentra estructurada tiene forma rectángular y se haya en posición vertical sobre su base. Aproximadamente, la mitad inferior de la pared frontal, sin incluir la base, es de cristal. Las paredes laterales están provistas, respectivamente, de una ventana de corredera, tambien de cristal, que ocupa la mitad del ancho de la caja. La parte posterior, así como la porción inferior de los laterales y la cubierta superior son generalmente de material plástico. Un tabique en posición horizontal divide la urna internamente en dos partes; la superior ocupa aproximadamente un tercio de todo el espacio y en ella se encuentra instalado parte del sistema eléctrico y otros dispositivos interconectados con el resto del sistema que se encuentra en la parte posterior de la balanza. En la parte inferior (Rodeada por la pared de cristal y las ventanas laterales) se encuentra colgado centralmente el único platillo que posee este tipo de balanza. Principales partes de que consta 1. Indicador de nivel : Consiste en un aditamento circular de no más de 2 cm de diámetro, que generalmente se localiza empotrado centralmente en la superficie de la balanza muy próximo al borde anterior, estando cubierto por una tapa de vidrio, provista de un círculo concéntrico de unos 7 mm de diámetro. Al igual que la balanza mecánica, el nivel se regula, haciendo girar convenientemente en una u otra dirección los tornillos, hasta lograr que la burbuja de aire del agua que contiene quede en el mismo centro del circulo concéntrico. 2. Botón para el ajuste de la compensación óptica de tara : Este botón se encuentra articulado en el ángulo superior derecho de la pared frontal de la balanza. Es de formas circular, teniendo la superficie plana provista de una letra "T" impresa, muy próximo a su borde y un grosor de menos de 2 cm estriado transversalmente, para facilitar su manipulación . En la parte superior de la periferia donde gira este toirnillo, la pared de la caja tiene grabada una pequeña linea vertical, que sirve para indicar donde ser detenido el giro del botón para hacer coincidir la letra "T"con la línea de referencia. 3. Botón de ajuste del punto cero: Es un botón igualmente igualmente cilíndrico de menor tamaño, aunque más grueso, que se caracteriza por tener un diámetro mayor en su base que en la parte anterior, lo que le da una configuración ligeramente cónica . Se encuentra articulado en el centro del botón para 152

el ajuste de la compensación óptica de tara, ya explicado, estando provisto de una tapa, que tiene grabado en su centro un "0"con un (.) en su periferia. 4. Botón para la graduación de la precisión del indicador digital :Tambien denominado botón micrométrico. Es un botón grande, ubicado en el lateral derecho de la base. 5. Botones de ajuste de las pesas de cambio : Son dos. Se encuentran ubicados en la parte frontal de la base, por su lado izquierdo. El ubicado a la izquierda tiene grabado en su tapa un # l0 y el de la derecha un #1 . Al ser girados hacia la derecha van colocando las pesas o al ser girados hacia la izquierda las levantan, lo cual se va registrando en el contador o indicador de pesas de cambios que se haya en el lado derecho de la base..El botón marcado con el # 10, produce el cambio de pesas de l0 en 10, o sea: 10, 20, 30… etc. Lo que equivale a 10g, 20g, 30g,…etc y el botón marcado con el #1, produce el cambio de pesas de l en l o sea: l, 2, 3,…hasta el 9, lo que equivale al lg, 2g, 3g..etc. 6. Indicador de pesas de cambio :Consiste en una pequeña pantalla que se haya en la parte frontal de la base, por su lado derecho, donde se van registrando en una doble escala, el peso originado por el accionar de los botones de ajustes de las pesas de cambio. En el centro de las dos escalas se haya un indicador óptico, denominado tambien placa mate,provisto de una escala numérica. 7. Palanca de retención :Es una pieza rígida de forma lanceolada (como la punta de una lanza) que se encuentra articulada por su extremo más grueso, en el centro de la base. Alrededor de la palanca se encuentran grabado 3 números: . En la parte superior el "0". En esta posición la balanza se encuentra frenada y la iluminación apagada,no debiendo poner ni quitar del platillo el objeto a pesar. . Hacia la derecha se encuentra grabado ½. En esta posición se puede leer el peso aproximado en gramos en la escala proyectada. . Hacia la izquierda, el # 1. En esta posición se lee el resultado de la pesada. 8. Orientador para la dosificación : Debajo del indicador de las pesas de cambio se haya una pequeña escala graduada, con los números 0,500 y 1000, provista de una línea oscura que indica aproximadamente el peso.

Funcionamiento Acciones previas l. Verifique que la balanza este debidamente nivelada, de no ser así, haga girar en uno u otro sentido'los tornillos de la base de la balanza, hasta lograr que la 153

burbuja de aire del nivel de agua quede ubicada exactamente en el centro del círculo concéntrico. 2. Conecte la balanza a la red eléctrica para propiciar su funcionamiento e iluminación, incluyendo el encendido del bombillo piloto. Ajuste al punto cero l. Haga girar la palanca de retención hacia el "0". 2. Si el indicador de pesas de la izquierda y el contador micrométrico de la derecha no están marcando respectivamente "00", haga girar los botones de ajuste de las pesas de cambio y el botón para la graduación de precisión , en contra de las manecillas del reloj hasta que marquen "00". En este momento la balanza está frenada y la iluminación apagada. 3. Mueva lentamente la palanca de retención hacia el # l. La balanza se iluminará y proyectará la escala numérica. Haga coincidir la marca índice con la raya "00" proyectada, haciendo girar el botón para la graduación de la precisión.

PESADA 1. Compensación de tara - Haga girar el botón para el ajuste de compensación de tara, en contra de las manecillas del reloj hasta hacer coincidir la letra "T": con la línea de referencia, que se encuentra en la parte superior. - Proceda igualmente con el botón del ajuste a "0". - Gire la palanca de retención en dirección a ½ (semiretención) - Abra la ventana lateral y coloque sobre la superficie del platillo el recipiente vacio (tara) donde se va a depositar el material a pesar. - Cierre la ventana de la balanza. - Gire hacia la derecha gradualmente el botón de ajuste de las pesas que se encuentra del lado izquierdo (marcado con el # 10) y vaya observando simultáneamente la escala del indicador de la izquierda hasta que aparezca un signo menos (-) o se trabe el avance . Detenga la rotación y proceda a girar el botón una graduación hacia atrás , por ejemplo: si la escala marcó 50g, retroceda hasta 40g. Repita la operación con el botón de la derecha (marcado con el # l). Por ejemplo: si la escala se detiene en 5g, retroceda una unidad o sea hasta 4g, lo que dará lugar a un peso total de 44g.. - Gire la palanca de retención hacia el # 1 y deje oscilar la escala. - Retrase la escala a "0"haciendo girar el botón de compensación de tara. - Haga girar en contra de las manecillas del reloj, los botones de ajuste de las pesas hasta situar la escala en "00"(de esta manera queda anulado el peso del recipiente (tara) - Girar finalmente la palanca de retención hasta el "0" 154

DETERMINACIÓN DEL PESO - Poner nuevamente todos los elementos de mando en "0" - Cerciorese de que la palanca de retención esté en "0" - Depositar el producto a pesar en el interior del recipiente y cerrar la ventana. - Girar la palanca de retención hasta ½ (semi retenida) durante la preselección del peso - Proceda igual que para determinar el peso de la tara, utilizando los botones de ajuste de las pesas de cambio. - Haga girar la palanca de retención hacia el "0"para retener la balanza y seguidamente soltar lentamente la retención haciendo girar la palanca hacia el # 1 - Haga girar hacia atrás el botón para la graduación de la precisión del indicador digital hasta hacer coincidir la placa mate del indicador óptico con la raya proyectada. Al mismo tiempo el contador micrométrico registrará las dos últimas cifras del resultado de la pesada. - Haga girar hacia atrás el botón para la graduación de la precisión del indicador digital,hasta que la escala quede inmóvil y el trazo inmediato inferior se encuentre exactamente en la rendija de la horquilla índice,accionando el botón para hacerlo coincidir con la raya proyectada. Al mismo tiempo el contador micrométrico registrará las dos últimas cifras del resultado de la apesada en la escala de la derecha del indicador de pesas de cambio. - Leer el resultado. Por ejemplo, si el indicador de pesas de cambio registra 42g , el indicador digital marca 20 y el contador micrométrico de la derecha marca l4, el peso será el siguiente ; 42.2014 g. - Colocar la palanca de retención en "0", abrir la ventana y extraer el material ya pesado.

Fig. 82 : Lectura de una balanza analítica eléctrica

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BALANZA ANALITICA DIGITAL

Fig. 83 : Balanza analítica digital

La balanza analítica digital simplifica todas las operaciones explicadas a los largo de este capítulo, ya que basta con conectarla a la red eléctrica, colocar el material a pesar sobre un platillo externo, accionar un botón y el peso podrá observarse digitalizado en una pequeña pantalla. La dificultad que presenta, es cuando se produce algún desperfecto, lo cual no puede ser resuelto internamente por el personal del laboratorio experimentado, requiriendose de un servicio especializado. Este tipo de balanza tiene un alto grado de precisión.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Explique en que consiste el principio funcional de las balanzas ¿ A que denominamos pesas ¿ ¿Cual es el rango de pesadas de una balanza granataria? ¿Cuántos tipos de balanzas granatarias Ud. conoce? ¿Qué se entiende por peso de tara? ¿A que denominamos fiel de la balanza? Describa en orden cronológicos que Ud. debe efectuar para realizar una pesada en una balanza granataria de un solo platillo? 8. ¿En que orden se deben colocar las pesas sobre el platillo? 9. Explique por que causa las pesas se deben tomar con una pinza de disección y no con la mano. 10. Argumente por que causa los platillos deben estar limpios? 11. ¿Con que objetivo se utilizan las balanzas de precisión? 12. ¿Cuál es la función de la cuchilla de la balanza de precisión 13. Con que objetiovo se debe subir y fijar la cruz de la balanza? 156

14. Explique las causas por lo que las balanzas de precisión deben estar en el interior de una urna 15. Describa el orden cronológico,como Ud. efectua una pesada con una balanza de precisión mecánica. L6. ¿Cómo Ud. regula el nivel de una balanza de porecisión 17. Explique como Ud. realiza la depreciación del peso de tara en una balanza de precisión elaéctrica. 18. ¿Cómo se colocan las pesas en la balanza de precisión eléctrica? 19. Explique lo que indican las tres posiciones que tiene la palanca de retención. 20. ¿Cómo Ud. realiza el ajuste al punto cero,con una balanza de precisión eléctrica? 21. Describa paso a paso como usted determina el peo de un objeto en una balanza de presición elaéctrica 22. Diga lo que usted sepa en relación con la balanza analítica digital.

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CAPÍTULO 11 INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN NO VOLUMÉTRICOS INTRODUCCIÓN Los instrumentos de medición no volumétricos se emplean en las investigaciones de laboratorio para medir específicamente magnitudes de tiempo, temperatura o densidad.

INSTRUMENTOS. DIFERENTES TIPOS Relojes Se emplean dos tipos de relojes: los cronómetros y los de intervalo.

Fig. 84: Relojes: a) Cronómetros; b) Reloj de intervalo.

Cronómetros Son relojes manuales, eléctricos o de cuerda, provistos de uno o dos botones de control que se utilizan para accionarlos o detenerlos. Empleo: para medir el tiempo en minutos y/o segundos. Relojes de intervalos Estructuralmente son similares a un reloj despertador doméstico y al igual que los cronómetros pueden ser accionados por energía eléctrica o cuerda, caracterizándose por hacer sonar una alarma cuando concluye el tiempo previsto. 158

Este tipo de reloj se encuentra tambien articulado en algunos equipos de laboratorio, como por ejemplo. Centrífuga, rotor, etc, haciendo que se detenga automáticamente su funcionamiento al concluir el período de tiempo en que fue ajustado. Empleo: para medir el tiempo en horas y minutos.

Termómetros

Fig. 85: Termómetros.

Los termómetros empleados en el laboratorio consisten en un tubo de vidrio de paredes gruesas de longitud y diámetro variable, provisto de una escala impresa en grados Celsius (ºC y/o grados Fahrenheit º F). Su extremo anterior está sellado como un ámpula, y el posterior, generalmente, más estrecho está ocupado por un bulbo, lleno de un producto químico dilatable por el calor. Este bulbo se continúa con un fino capilar ubicado a todo lo largo del termómetro, paralelamente a la escala, denominado columna indicadora. Cuando el bulbo es expuesto al calor, el producto químico que contiene se dilata y asciende por el capilar. Al detenerse se confrontará con la escala para determinar el grado de calor, ya sea en grados Celsius o Fahrenheit. Diferentes tipos de termómetros Se utilizan dos tipos de termómetros: el clínico y el químico. 1.Termómetro clínico: En este tipo de termómetro el reservorio se encuentra lleno de mercurio. Debido a que el capilar que forma la columna indicadora está unido al reservorio por una especie de sifa en forma de "S" cuando la columna de mercurio alcanza el grado máximo, en correspondencia con la exposición al calor a que ha sido sometido. Al disminuir su intensidad se mantendrá indicando ese valor, por lo que hay que "sacudirlos" para que se concentre nuevamente en el reservorio. 159

2. Termómetro químico: La estructura de este tipo de termómetro es similar a la del termómetro clínico, con la diferencia que generalmente tiene una mayor longitud y la escala de temperatura es de un rango mucho mayor. En lugar de mercurio el reservorio de estos termómetros está lleno de alcohol o xilol teñidos. Otro aspecto que lo distingue del clínico es que al carecer de la sifa, ya explicada, la columna del alcohol o xilol, ascenderá o descenderá, en el capilar en correspondencia con las oscilaciones de temperatura. Este tipo de termómetro se encuentra insertado en los equipos termoregulados como: el horno, la incubadora, el autoclave, etc, pudiendo tener una estructura diferente a l explicada, pero basada en el mismo principio. Para convertir temperaturas de una escala a otra se procede de l siguiente manera: - De grados Fahrenheit a Celsius (ºF-32). 0,555=ºC - De grados Celsius a Fahrenheit (ºC. 1.8)+32=ºF Existen otras dos escalas para medir la temperatura, que son: la Kelvin y la Rankine. Para convertir grados Celsius en grados Kelvin basta con adicionar la constante 273 a los grados Celsius obtenidos. Por ejemplo: 3200C+273=3020K Para convertir grados Fahrenheit a grados Rankine, se procede de igual manera, pero empleando la constante 460.

Densímetros Son instrumentos que se emplean para medir la densidad o peso específico de soluciones compuestas por diferentes solutos y solventes. El peso específico es la relación entre el peso de una sustancia con respecto al peso de un volumen igual de una sustancia de referencia, que usualmente es el agua. Como la densidad del agua es de 1,0g/mL a 4ºC, el peso específico de los líquidos, en g/cm3 o en g/mL es numéricamente igual a sus densidades. Estructura

Fig. 86: Densímetro.

Los densímetros son tubos de vidrio que miden de 15 a 20 cm de largo, estando estructurados por tres partes diferentes entre sí. la parte superior consiste en un fino tubo de vidrio, alargado y cilíndrico, encontrándose sellado como un ámpula en su extremo distal. Mide aproximadamente algo más de un tercio de la longitud total del densímetro, teniendo impreso a todo lo largo una escala graduada 160

en cuya parte superior se puede observar el número 1.000 (que es la densidad del agua). La escala va descendiendo dividida en partes iguales y el valor mayor, variará, en dependencia del tipo de densímetro de que se trate, como por ejemplo: 1.060 en los urodensímetros, que se utilizan para medir la densidad de la orina. La porción media es más gruesa y de mayor longitud, consistiendo básicamente en un bulbo lleno de aire. En su extremo posterior el bulbo se estrecha y a continuación se dilata, formando un bulbo pequeño y redondeado, lleno de bolitas de metal,, semejantes a municiones, que proporcionan peso al densímetro, para propiciar que se mantenga en posición vertical cuando sea introducido en el líquido al que se le va a medir la densidad. Procedimiento 1. Deposite en una probeta de tamaño apropiado (preferentemente no graduada) la solución a la que se le desea medir la densidad y colóquela sobre una superficie nivelada. 2. Tome el densímetro específico por la parte superior con los dedos índice y pulgar e introdúzcalo en la solución, colocándolo en el centro del diámetro de la probeta en posición vertical. 3. Haga girar el densímetro, mediante el accionar de los dedos y cerciorarse de que al rotar, no entre en contacto con las paredes de la probeta. 4. Espere a que se detenga el movimiento de rotación y proceda a realizar la lectura, para lo cual debe observar en qué graduación de la escala se encuentra el nivel de la solución, cuidando de no incurrir en el error de paralelaje.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

¿Cómo se denominan los dos tipos de relojes empleados para el trabajo de laboratorio? ¿Cuál es el principio funcional de cada uno de los relojes? Describa la estructura de un termómetro clínico y uno químico. ¿Cómo se denomina el producto químico que se utiliza en cada tipo de termómetro para llenar sus respectivos reservorios? Especifique las diferencias funcionales entre el termómetro clínico y el químico. ¿Cómo usted debe proceder para convertir grados centígrados en grados Fahrenheit y viceversa? ¿Para qué se utilizan los densímetros en el laboratorio? ¿Qué usted entiende por peso específico? ¿Cuál es la densidad del agua? Describa la estructura de un densímetro . ¿Con qué objetivo el bulbo redondeado que se encuentra en la parte inferior de los densímetros se encuentra lleno de municiones? Describa el procedimiento a seguir para determinar la densidad de un líquido? 161

CAPÍTULO 12 ACCCESORIOS, INSTRUMENTAL QUIRÚRGICO Y MATERIALES DE CURACIONES INTRODUCCION Bajo el término de accesorios, se agrupan diversos objetos, utilizados con carácter auxiliar en el trabajo de laboratorio al igual que algunos instrumentales quirúrgicos, mientras que determinados materiales de curaciones son empleados para diversos usos.

ACCESORIOS Entre los accesorios que se utilizan con mayor frecuencia, se encuentran los siguientes:

Fig. 87: Gradilla

Gradillas Son soportes diseñados para la colocación de tubos de ensayo u otros tipos de cristalería, fábricadas de metal, madera o plástico. Generalmente son rectángulares y están estructuradas por dos o tres planchas, en posición horizontal, separadas entre sí, provistas de perforaciones, por donde se coloca la cristalería en cuestión. Teniendo en cuenta que los tubos de ensayo tienen diámetros diferentes, los orificios de las gradillas también serán de tamaño variable, lo que permite seleccionar la adecuada para cada tipo de tubo. Además de facilitar el acceso al tipo de cristalería con que se esté trabajando o el ordenamiento secuencial de las muestras, las gradillas factibilizan además el que se puedan escurrir los tubos después de ser fregados, insertándolos en los orificios boca abajo. 162

Cestos

Fig. 88: Cesto metálico.

Al igual que las gradillas, los cestos son soportes, no compartimentados, que se utilizan para la colocación de tubos de ensayo y otros tipos de cristalería. Generalmente son cilíndricos o cuadrangulares y están fabricados de alambres entrelazados o chapas de metal inoxidable perforado. Los cestos son utilizados para depositar la cristalería para su secado o esterilización.

Soporte universal

Fig. 89: Soporte universal

Está constituido por una base metálica sólida y pesada, lo que le proporciona estabilidad, sobre la que se erige una varilla recta de hierro de 1,5cm de diámetro, que se utiliza para colocar pinzas de sujección o aros metálicos. 163

Pinzas de sujección

Fig. 90: Pinzas de sujeción: a) Pinza de tres dedos; b) Pinza de bureta; c) Pinza de Mohr.

Se fabrican diferentes tipos de pinzas de sujección, algunas de las cuales, diseñadas para fijarlas a la varilla de fierro del soporte universal y otras para operarlas manualmente. Entre las más empleadas se encuentran: los modelos de tres dedos, los de bureta, los de vasos de precipitado, así como las pinzas para tubos de ensayo y la pinza de Mohr, estas dos últimas de utilización manual. En ambos casos, el principio de su funcionamiento es similar al de un palito de tendedera, es decir, cuando se aprietan con ayuda de los dedos índice y pulgar, las respectivas pinzas se abren, y cuando se retira la presión se cierran. La pinza de Mohr se utiliza para obstruir el paso de un líquido que fluya a través de una manguera de goma flexible de más o menos un cm de diámetro. Otro tipo de pinzas igualmente empleadas para el manejo de objetos pequeños como las pesas y los diversos especímenes son de acero inoxidable, teniendo la punta curva o recta.

Trípode

Fig. 91: Trípode.

Se trata de un accesorio metálico, formado por tres varillas metálicas de igual longitud, separadas entre sí a una misma distancia y soldadas por su extremo superior a un aro también de metal. Cuando el trípode es colocado sobre la mesa de trabajo, podemos percatarnos de que las patas no quedan en posición 164

vertical, sino ligeramente oblicuas, con los extremos que contactan con la mesa más separados que los que están soldados en el aro.

Malla de amianto

Fig. 92: Malla de amianto

Es una malla plana de alambre entrejido, similar a un colador, de forma cuadrangular o circular que mide unos 15cm2 o de diámetro, que posee en su centro una circunferencia de unos 10 cm de diámetro de amianto fundido en la malla. Esta malla se utiliza cuando se va a calentar un líquido contenido en frascos de vidrio, directamente a la llama de mechero, para lo cual se coloca sobre el aro del trípode, y sobre ésta el frasco de cristal, de manera que el recipiente queda aislado de la llama directa y el calor se distribuye uniformemente a través del amianto.

Instrumental quirúrgico

Fig. 93: Instrumental quirúrgico: a) Bisturí; b) Tijeras; c) Pinzas de disección; d) Agujas de disección

Además de los trocars y las agujas hipodérmicas de diferentes calibres en el trabajo de microbiología, ocasionalmente se requiere del empleo de diferentes agujas, bisturí y tijeras de disección, así como de charolas, una especie de bandeja donde, se realiza la disección de determinados especímenes de experimentación. 165

MATERIALES DE CURACIONES Entre los materiales de curaciones más empleados en el trabajo microbiológico, se encuentran los siguientes: 1. 2. 3. 4. 5.

Algodón Gasa quirúrgica Aplicadores Depresores Soluciones y tinturas desinfectantes

Algodón El algodón se utiliza para taponear la boca de los tubos y otras cristalerías que van a ser sometidas a un proceso de esterilización y conjuntamente con los aplicadores de madera en la confección de hisopos finos y gruesos. Gasa quirúrgica Se utiliza para la preparación de torúndas que posteriormente son empaquetadas en papel de 3 a 5 unidades para ser esterilizadas en autoclave antes de su empleo. Aplicadores y depresores Los aplicadores, además de ser utilizados en la confección de hisopos, se emplean también para la toma de algunas muestras, como por ejemplo: heces fecales, para su preparación en láminas destinadas a la investigación parasitológica. Los depresores, de madera o plástico, se utilizan para deprimir la lengua en la toma de muestras de exudado faríngeo y también, pueden emplearse para extraer medio de cultivo de sus frascos, para efectuar la pesada o como sustituto de los aplicadores en las preparaciones de heces en láminas para examen parasitológico.

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CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Describa la estructura y el material con que se fabrican las gradillas. Especifique los diferentes usos que se les dan a las gradillas en el laboratorio. Describa la estructura de los cestos y el material con que se fabrica. ¿Para qué se utilizan los cestos? ¿Cuál es la finalidad utilitaria del soporte universal? Describa los diferentes tipos de pinzas de sujección que usted conozca. Describa la estructura de los trípodes. ¿Para qué se utiliza la malla de amianto? Mencione los instrumentales quirúrgicos que se utilizan en el laboratorio. ¿Para qué se utilizan materiales de curación en el laboratorio?

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CAPÍTULO 13 TOMA DE MUESTRAS INTRODUCCIÓN El diagnóstico microbiológico de laboratorio, se sustenta en el estudio de las muestras obtenidas del paciente o portador, que propicia la identificación directa o indirecta de los agentes casuales de la infección o enfermedad infecciosa y en determinadas investigaciones información complementaria acerca de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en cuestión a la acción de los fármacos antimicrobianos, lo cual aporta al médico de asistencia un dato valioso que le permite indicar un tratamiento antimicrobiano mucho más eficaz.

MUESTRA. CONCEPTO Se denomina MUESTRA a la porción o volumen de: líquidos corporales, material excrementicio, exudados, etc. que obtenemos del paciente o portador, como por ejemplo: sangre, orina, heces, etc., donde presuntivamente se encuentran microorganismos patógenos o los anticuerpos inducidos por sus componentes antigénicos. Además de las fuentes ya referidas se obtienen del paciente muestras de los productos patológicos, como el esputo y el pus, que son producidos por algunos microorganismos en su interacción con los tejidos.

Muestra representativa Para que el diagnóstico de laboratorio sea fidedigno, es indispensable entre otros requisitos, que las especies patógenas que se encuentran en los líquidos corporales, tejidos, etc. del paciente sean las mismas que contiene la muestra y su cuantía relativamente proporcional. Visto así, pudiera pensarse que esta paridad, resulta suficiente para considerarla como una muestra representativa, sin embargo determinados factores y procederes como: la demora en realizar la siembra de la muestra, los inadecuados métodos de conservación, la insuficiente o excesiva cantidad de muestras a utilizar para el cultivo, la mala calidad de su obtención y la no observancia de las precauciones de asepsia, pueden en algunos casos afectar la viabilidad del germen y en otros su cuantía, además de propiciar contaminaciones que en su conjunto afectan la calidad de los resultados al perder la muestra representativa. 168

Demora en realizar la siembra En principio todas las muestras deben ser sembradas lo antes posible en los medios de cultivo que favorezcan el desarrollo de las especies patógenas que presuntivamente contienen procediendo a su inmediata y adecuada incubación. Cuando esto no sea posible, el proceder a seguir dependerá de la muestra de que se trate, por ejemplo: la Neisseria meningitidis (meningococos) que con elevada frecuencia se aísla en la muestra de L.C.R es muy sensible a los cambios de temperatura, por lo que el frío y la temperatura ambiente provocan su lisis, ocurriendo similar situación con algunos virus, como los Mixovirus y Hirpesvirus, que no sobreviven mas allá de tres horas si la muestra en que se encuentra no es inoculada antes de ese tiempo en los medios apropiados. En cambio , con la muestra de orina (urocultivo) sucede todo lo contrario; los componentes nitrogenados, hidratos de carbono y otros residuos minerales presentes en la muestra son utilizados por la mayoría de las especies, que comúnmente están presentes en la orina, como nutrientes, que favorecen su desarrollo y multiplicación. En este caso la pérdida de representatividad sería por exceso y no por defecto como suele suceder en los ejemplos anteriores.

Métodos de conservación a) Refrigeración a 4 0C (en las parrillas). Fundamento: el frío enlentece el proceso de multiplicación. Ejemplo, para conservar muestras de orina para el urocultivo. b) Incubación a 370 C. Fundamento: mantener a los microorganismos en una temperatura similar a la corporal. c) Formol al 10 %. Fundamento: mata a los microorganismos sin deteriorarlos significativamente, lo que permite identificarlos mediante la observación de su morfología. Ejemplo: para la conservación de muestras que contienen protozoarios, larvas o huevos de helmintos. d) Medios de transporte. Cuando la muestra no puede ser sembrada de inmediato, por haberse tomado en lugares distantes, se siembran en este tipo de medio y se envían a la mayor brevedad posible, a temperatura ambiente, al laboratorio de referencia. Los medios de transporte se emplean generalmente, para la siembra de exudados caracterizándose por mantener la viabilidad del microorganismo, pero al mismo tiempo sin favorecer significativamente su desarrollo, debido a que son muy reductores, caracterizándose por inhibir las reacciones enzimáticas autodestructoras y aminorar los efectos de la oxidación. 169

Cantidad de muestras a tomar En algunas determinaciones, como por ejemplo: el hemocultivo, está normado que la cantidad de sangre total a sembrar sea de un 10 % en relación con el volumen de medio de cultivo a utilizar. Cantidades menores o mayores son objetables, ya que afectan la calidad de los resultados. Si el volumen de sangre fuera menor que el indicado, reducirá proporcionalmente la expresión de crecimiento en los cultivos y si fuera mayor, la cantidad de anticoagulante que se adiciona al medio de cultivo, resultaría insuficiente, lo que traería como consecuencia la formación indeseable de coágulos de sangre que interfieren delimitan las manifestaciones de crecimiento (turbidez). Otro ejemplo donde la cantidad de muestra a emplear, resulta indispensable, es en la de esputo para investigar B.A.A.R (bacilos ácido alcohol resistentes) requiriéndose no menos de 2ml, ya que por las características mucoides de este producto patológico los bacilos se encuentran distribuidos desigualmente en la muestra.

Calidad de la muestra Para que la muestra sea de buena calidad, a de tenerse en cuenta en algunas ocasiones el momento idóneo y en general delimitar con precisión el área anatómica para su obtención. Momento idóneo En algunas muestras como el esputo, debe ser recogido por el paciente, en ayunas, al levantarse, que es el momento en que mayor cantidad de expectoración se encuentra acumulada y en otras muestras, como por ejemplo, la sangre para hemocultivo o gota gruesa, se recomienda esperar el momento del pico febril, que es cuando se encuentra en sangre la mayor cantidad de microorganismos. En otras ocasiones, el momento más adecuado, va a depender del cuadro clínico del paciente y del tiempo de evolución de la enfermedad. Por ejemplo: en la fase inicial de la fiebre tifoidea, el agente causal, la Samonella tiphy se encuentra en la circulación sanguínea por lo que resulta procedente tomar muestra de sangre para hemocultivo, pero cuando la enfermedad lleva unas dos semanas de evolución el microorganismo emigra al intestino, por lo que en ese momento lo adecuado es obtener muestras de heces fecales para coprocultivo. La lectospirosis, transcurre por una evolución similar en los primeros 10 días (periodo de leptospiremia) la leptospiras se encuentran en sangre y posteriormente invaden diferentes vísceras y el sistema renal, (leptospiuria) debiendo 170

obtenerse en la primera fase sangre para hemocultivo y en el segundo momento orina para urocultivo. Delimitación del área anatómica Una vez determinado en que órgano o tejido se va a realizar la toma de muestra, se debe delimitar el área exacta para su obtención por ejemplo: la toma de muestra de lesiones purulentas debe realizarse en la región subyacente y no del pus que se encuentra en el orificio de salida, donde la mayoría de los microorganismos están muertos. Cuando la muestra ha sido recolectada por el paciente, la porción que se tomará para el cultivo, será la mas evocadora de contener la mayor cantidad de microorganismos, por ejemplo, en el esputo, se utilizará la parte mas purulenta, no la saliva y en las muestras de heces fecales las porciones mucosanguinolentas. Precauciones de asepsia Son las acciones encaminadas a evitar que la muestra se contamine durante su obtención, con especies microbianas ajenas al proceso infeccioso, por ejemplo: para obtener muestras de sangre para hemocultivo, L.C.R, lesiones en la piel, etc. Se debe remover previamente los m.o. de la microbiota residente, del sitio donde se va a realizar la punción, hisopado o raspado, con alcohol etílico al 70 % con yodo, para evitar que estos contaminen la muestra y se desarrollen en el cultivo, creando confusión en el momento de establecer el diagnóstico. El cumplimiento de estos requisitos, favorece, que el diagnóstico de laboratorio se corresponda con los agentes infecciosos, que tenia el enfermo o portador en el momento en que fue obtenida la muestra. Las deficiencias en este sentido, traen como consecuencia una serie de contratiempo como son: 1. 2. 3. 4.

Molestias innecesarias al paciente que debe someterse nuevamente a la obtención de la muestra. Demora en la información del diagnóstico al médico de asistencia para iniciar o modificar el tratamiento. Afectaciones económicas por gastos de materiales e insumos. Y lo que puede ser mas perjudicial, la información de un diagnóstico erróneo, con implicaciones para la evolución del paciente y el cuestionamiento sobre la calidad del servicio. 171

INSTRUCCIONES AL PACIENTE El paciente que tiene indicado uno o varios exámenes microbiológicos debe ser instruido por su médico de asistencia o por el personal del laboratorio a los efectos de que recojan la muestra con la calidad requerida, o concurran al laboratorio en condiciones favorables para su obtención. Las instrucciones son de dos tipos: generales y específicas. Instrucciones generales 1.

2.

Suspender cualquier tratamiento con antibióticos 48 horas antes de la toma de la muestra, lo cual favorecerá, que en el momento de su obtención, la cantidad de microorganismos sea suficiente para que puedan ser observados en los exámenes microscópicos y aislados en los cultivos. Suspender cualquier tratamiento local con medicamentos antimicrobianos, tales como: productos tópicos (pomadas, lociones etc.), colirios, gotas nasales, óvulos, gargarismos etc. Al menos 12 horas antes de la toma de la muestra.

Instrucciones específicas Variarán en dependencia del tipo de muestra de que se trate.

DIFERENTES TIPOS DE MUESTRAS Exudados Concepto: es la materia mas o menos fluida salida de los vasos pequeños o capilares por exudación, en los procesos inflamatorios y que se deposita en los intersticios de los tejidos o en la cavidad de una serosa. Se clasifican en: albuminoso, fibroso, hemorrágico y seroso. Diferentes tipos de exudados a. Exudado faríngeo: Indicaciones específicas: antes de concurrir al laboratorio el paciente debe realizar el aseo matutino habitual, para reducir la probabilidad de que la muestra se contamine con la microbiota normal. Procedimiento: estando el paciente sentado, inclínele ligeramente la cabeza hacia atrás, solicitándole que abra la boca y emita un ¡ahhh! sostenido. Observe la zona faríngea con ayuda de una lámpara de cuello que proporcione 172

una luz intensa, con la finalidad de detectar evidencias patológicas, como pueden ser: mucosas enrojecidas o edematosas, marcada exudación o la presencia de anginas (placas de diferentes formas y tamaño, de color blanco o blanco grisáceo, adheridas a las mucosas) Deprima la lengua con un depresor y con la otra mano introduzca el hisopo en la cavidad bucal, cuidando de no tocar los labios, los carrillos o la lengua y frótelo sobre cada región amigdalina y la pared posterior de la faringe, en particular en las áreas con evidencias patológicas. Al retirar el hisopo, cuide igualmente de que no entre en contacto con la lengua, labios u otra zona bucal. Si el médico presume que el paciente está infectado con Corynebacterium diphteriae (agente causal de la difteria) indicar al laboratorio, mediante una orden de análisis que se realice la investigación pertinente, en cuyo caso la toma de muestra se hará levantando el borde de la angina y pasando el hisopo por debajo de la misma para contactar con los microorganismos diftéricos, situados en ese lugar, el hisopo podrá estar seco si la siembra se hace de inmediato, en caso contrario deberá humedeserse previamente en solución de glicerina, telurito e introducido después de la toma en medio de transporte para su conservación.

Fig. 94: Toma de muestra de exudado faríngeo: a) Amígdalas; b) Pared posterior de la faringe

b) Exudado nasal: Indicaciones específicas: No instilarse ningún tipo de gotas nasales 12 horas antes de la toma de la muestra. Procedimiento: al igual que para la toma del exudado faríngeo, el paciente debe estar sentado y con la cabeza ligeramente flexionada hacia atrás. Con el dedo índice presione la base de la nariz, de manera que posibilite la obser173

vación de los dos orificios, para lo cual se auxiliará de una lámpara. Introduzca el hisopo en ambas fosas nasales, imprimiéndole movimientos de rotación en ambos sentidos, para facilitar la recogida de la secreción.

Fig. 95: Toma de muestra de exudado nasal.

c) Exudado nasofaríngeo: Indicaciones específicas: similar a las explicadas para exudado faríngeo y nasal. Procedimiento: para la toma del exudado nasofaríngeo, se utiliza un hisopo especial consistente en un alambre de cromo o acero inoxidable curvado en su extremo terminal. Después de observar la zona faríngea y las fosas nasales con buena iluminación se procede a introducir suavemente el hisopo por una de las fosas nasales hasta la nasofarínge. Si no fuera posible, introducir el hisopo por la cavidad bucal hasta la nasofarínge, con los mismos cuidados ya explicados en al toma del exudado faríngeo.

Fig. 96: Toma de muestra de exudado nasofaríngeo.

174

d) Exudado ótico: Indicaciones específicas: no instilarse gotas óticas de ningún tipo, durante las 24 horas precedentes a la toma de la muestra. Procedimiento. Después de indicar al paciente que se siente, el técnico se ubicará por el lateral que corresponda al oído que será objeto de la toma de la muestra, procediendo a ladear ligeramente la cabeza del paciente para el lado opuesto, con una torúnda o algodón estéril humedecido en alcohol etílico al 70 %, limpiar el pabellón auricular, especialmente la entrada del orificio del conducto auditivo. Disponiendo de una buena iluminación, sujetará la oreja por la parte superior con ayuda d los dedos índice y pulgar, imprimiéndole un movimiento hacia arriba y hacia atrás, lo cual favorecerá la observación del conducto auditivo externo. Manteniendo la oreja en esa posición, introducir el hisopo suavemente en el conducto, imprimiéndole movimientos de rotación con el propósito de recoger la mayor cantidad posible de secreción (otorrea)

Fig. 97: Toma de muestra de exudado ótico: a) Manipulación del pabellón auricular; b) Introducción del hisopo en el conducto auditivo externo

e) Exudado conjuntival: Indicaciones específicas: durante las 48 horas precedentes a la toma de la muestra, no irrigar los ojos con colirios, pomadas oftalmológicas ni anestésicos conjuntivales que tienden a desalojar a los microorganismos del saco conjuntival. La noche anterior, el paciente se debe limpiar el ojo afectado con suero fisiológico o agua previamente hervida. Se puede tapar o no, el ojo en cuestión con un apósito estéril fijado con esparadrapo, ya que se ha demostrado que no influye en los resultados la contaminación ambiental, la mañana en que concurra al laboratorio para que le sea tomada la muestra no debe realizarse nigun lavado facial. Procedimiento: para la toma de muestra del exudado conjuntival, se puede utilizar un hisopo de algodón fino (estéril) o un asa de platino empleada exclusivamente para ese fin, esterilizada en autoclave. 175

Indicar al paciente que se siente y retirar el apósito, con ayuda del dedo índice baje el párpado inferior y proceda de inmediato e introducir con sumo cuidado el hisopo o el asa, evitando tocar las pestañas, o el margen de los párpados, hasta la superficie del ángulo interno (próximo al lagrimal) del "culde- sac" fondo del saco inferior deslizando suavemente el instrumento en dirección al ángulo externo del ojo. También se pueden tomar muestras de las márgenes parpebrales (membranas que tapizan los párpados. En el caso de que el paciente presente furúnculos de las glándulas pilosebáceas anexas a una pestaña (orzuelo) se procederá a obtener un poco de pus, mediante la punción con una lanceta estéril.

Fig. 98: Toma de muestra de exudado conjuntival

f) Exudado uretral: Indicaciones específicas: El o la paciente deben de abstenerse de orinar durante las 4 horas que preceden a toma de la muestra, para evitar que los microorganismos sean arrastrados mecánicamente durante la micción. Debiendo concurrir al laboratorio sin previo aseo matutino de los genitales externos. En mujeres: Se le indicará que se desnude de la cintura hacia abajo y se acueste bocarriba en una camilla ginecológica con estribos, adoptando una posición ginecológica, de manera que los glúteos queden muy próximos al extremo de la camilla, en estas condiciones con la palma de la mano hacia arriba se introduce en la vagina el dedo índice el cual se arquea hacia arriba para comprimir la uretra a través de la sínfisis que le separa de la vagina desplazar el dedo, hacia atrás, sin dejar de comprimir la sinfigis para inducir la salida del pus por la uretra. Conjuntamente se introduce el hisopo, 1cm en el interior de la uretra, haciéndolo girar suavemente para que recoja la mayor cantidad posible del exudado. 176

Fig. 99: Toma de muestra de exudado uretral en mujeres.

En los hombres: La muestra se tomará permaneciendo el paciente parado. Se le indicará manualmente el prepucio hacia atrás y a continuación haga presión hacia delante del pene con el objetivo de "ordeñar" la uretra. Seguidamente se le introduce unos mm el asa de platino estéril en la uretra por unos segundos retirándola finalmente.

Fig. 100: Toma de muestra de exudado uretral en hombres.

g. Exudado vaginal. Indicaciones específicas: Suspender cualquier terapéutica por vía local 2 o 3 días antes de que le sea tomada la muestra. Debe concurrir al laboratorio sin previo aso vaginal desde la noche anterior, aunque puede, efectuar lavado matutino de genitales eternos. Se recomienda no realizar coito vaginal en ese periodo de tiempo. Procedimiento: Se le indicará a la paciente que se desnude de la cintura hacia abajo y se acueste en posición de cúbito supino (boca arriba) sobre una camilla con estribos, adoptando una posición ginecológica (las corvas sobre los estribos y los glúteos muy próximos al borde de la camilla. Antes de proceder a la toma de la muestra se hará una inspección de la región vulvar con el objetivo de detectar inflamación o erosión en las glándulas anexas Skéne o Bartholin, la primera, dos pequeñas glándulas situadas dentro del meato de la uretra femenina, consideradas homologas de las vesículas seminales y la segunda, situadas a ambos laterales del 177

orificio vaginal, cuya secreción tiene la función de lubricar el área para facilitar la penetración del pene. Con el empleo de una torúnda estéril humedecida en alcohol al 70 %, sujeta por una pinza de disección, desinfectar la región vulvar. Seguidamente se procederá a insertar un espéculo estéril de tamaño conveniente sin lubricantes, ya que puede ser tóxico para algunos microorganismos.

Fig. 101: Toma de muestra de exudado vaginal. Paciente en posición ginecológica con el espéculo incertado.

En los casos de niñas se realiza un exudado vulvar y en pacientes vírgenes se realiza también un exudado vulvar y si el orificio del himen lo permite se puede emplear un espéculo pequeño. En los casos de pacientes con cistocele (protución de vejiga en la vagina) la incertación del espéculo debe ser realizada por un personal con experiencia. A continuación se procede a introducir un hisopo estéril hasta el fondo del saco posterior de la vagina el cual será embebido con el exudado. Se recomienda utilizar hisopos con algodón sintético, ya que los ácidos grasos presentes en algodón vegetal puede resultar tóxico para algunos microorganismos. Además del hisopo se puede emplear para obtener la muestra una pipeta de Pasteur estéril con un dispositivo en su parte posterior como el que tienen los goteros para factibilizar la aspiración del exudado. Al momento de tomar la muestra se realiza la medición del pH al exudado. h) Exudado endocervical.Indicaciones específicas: Abstenerse de realizar el coito durante las 12 horas precedentes a la toma de la muestra. Procedimiento. Después de colocada la paciente en posición ginecológica e insertado el especulo (sin lubricantes) en forma similar que para exuda178

do vaginal, se procederá a retirar el moco cervical del cuello del útero con ayuda de una torunda estéril, sujeta por una pinza de disección. Seguidamente se introduce un hisopo estéril, que se hace comprimir suavemente sobre el cervix, imprimiéndole movimientos de rotación durante varios segundos para que se embeba en el exudado.

Líquidos orgánicos Concepto: Los líquidos orgánicos, son fluidos serosos, portadores de compuestos orgánicos e inorgánicos, así como de células leucocitarias. Son producidos por las membranas que recubren los diferentes órganos, por tratarse de espacios anatómicos cerrados, estos líquidos son normalmente estériles, por lo que, el aislamiento de microorganismos en cualquiera de ellos es evocador de infección. Los líquidos orgánicos que con regularidad se investigan en los laboratorios de microbiología clínica, son los siguientes. Cuadro 7: Localización de los líquidos orgánicos DIFERENTES LIQUIDOS

REGION ANATOMICA DONDE SE LOCALIZA

TOMA DE MUESTRA (por punción)

L.C.R.

Canal raquídeo (espacio delimitado por las membranas sub aracnoideas o meníngeas, que recubren la médula espinal, la región sub - occipital y los ventrículos cerebrales

Lumbar

PLEURAL

Delimitado dentro del espacio que separa las dos membranas pleurales que recubren el tejido pulmonar

Intercostal

SINOVIAL

Se encuentra entre las sinovias o membranas que recubren los tendones

Articular

ASCITICO

Se encuentra entre las membranas peritoneales que delimiten al abdomen

Peritoneal

179

Cuadro 8. Datos para la obtención de las muestras de líquidos orgánicos y características de su aspecto.

LÍQUIDOS CANTIDAD DISTRIBUCCIÓN ORGÁNICOS (ml) EN TUBOS ESTERILES

ASPECTO XXX NORMAL PATOLÓGICO

L.C.R

3 a 10

3

Incoloro y transparente

TURBIO, hemorrágico o satocrómico (amarillento)

PLEURAL

2 a3

Uno con heparina

Incoloro y transparente

Turbio y purulento

SINOVIAL

2a3

Uno sin heparina

Amarillo claro, transparente y viscoso

Turbio y purulento

ASCITICO

2a3

Uno con heparina

Seroso

Purulento

Recolección de la muestras Serán tomadas por un especialista, previo riguroso lavado de manos y colocación asépticas de guantes quirúrgicos estériles. Procedimiento: -

-

Desinfectar con tiomersal (timerosal) u otro desinfectante apropiado el área de la piel, donde se va a efectuar la punción. Realizar la punción con trocar o aguja apropiada hasta donde se encuentra el líquido en cuestión. Retirar el mandril del trocar, lo que propiciará que fluya el líquido a través de la cánula o si la punción se realiza con aguja, insertar una jeringuilla y succionar el líquido. Recolectar el líquido en tubos de ensayo, con y sin anticoagulante (heparina) según se trate. 180

Sangre Concepto: La sangre es un líquido rojo que circula por las arterias, venas y capilares. Estando formada por elementos figurados como los hematies, leucocito y plaquetas, así como una parte líquida denominada plasma, que contiene diversas sustancias nutritivas e inmunológicas. Indicaciones específicas La toma de muestra debe realizarse cuando el paciente presente fiebre superior a 38 C, solo eventualmente se procede a tomar la muestra, en el momento que presente hipotermia. Procedimiento -

-

La sangre se obtendrá por venipunción, mediante jeringuilla de vidrio estéril y seca (que no esté caliente) a la cual se le acopla una aguja No. 20 estéril, pudiendo utilizarse igualmente jeringuillas y agujas estériles desechables, después de comprobar el tiempo de caducidad, la jeringuilla acoplada a la aguja se colocan posteriormente en el interior de un tubo de ensayo de tamaño apropiado. Después de estar la ligadura por encima del codo del paciente, se procederá a verificar el pulso, para comprobar que la circulación arterial no ha sido interrumpida. Se le pedirá al paciente que abra y cierre la mano varias veces con el objetivo de inducir el aumento de la circulación y le llene las venas, palpe el área y seleccione la vena mas prominente con ayuda de la inspección visual. Desinfecte la zona a puncionar, mecánicamente, primero con agua y jabón y químicamente después con tintura de yodo al 1 % en pacientes (no alérgicos) y posteriormente con alcohol etílico al 70 %. Deje secar el alcohol y efectúe la punción, para ello solicite al paciente cerrar la mano y extender el brazo, tome la jeringuilla de tal manera que el dedo índice quede colocado sobre el cabo de la aguja para guiarla durante su introducción en la vena. Con la mano opuesta sujete el antebrazo del paciente, unos 5cm por debajo del sitio que puncionará y estire la piel hacia abajo con el pulgar con lo cual se inmovilizará la vena. Inserte la aguja en la piel adyacente paralelamente a la vena y hágala penetrar en el lumen, un ligero cese de la resistencia indicará que la aguja ha penetrado en la vena, la sangre fluirá espontáneamente dentro de la jeringuilla. En caso de que la presión de la vena sea baja, retire el émbolo, para asegurarse de que la aguja se encuentre en el interior de la vena. Extraiga la cantidad de sangre necesaria suelte 181

la ligadura y coloque una torunda o un pedazo de algodón seco sobre el sitio de la punción y saque la aguja, pídale al paciente que abra la mano y presione la torunda o algodón por espacio de 2 a 3 minutos con el brazo doblado. Para sembrar la sangre, proceda del siguiente modo: 1. Retire el círculo central de la retapa metálica del frasco que contiene el medio de cultivo, desinfecte con alcohol etílico al 70 % la tapa perforable y flaméela. 2. Cambie la aguja utilizada por otra estéril del mismo calibre. 3. Puncione la tapa perforable del frasco y empujando el embolo de la jeringuilla vierta un 10% de sangre en relación con el volumen del medio de cultivo empleado. Retirando la jeringuilla con la aguja y el volumen de sangre sobrante. 4.Invierta el frasco inoculado, 4 o 5 veces para que el anticoagulante que contiene el medio impida que se formen coágulos. Observaciones: Durante el proceso de toma de muestra, absténgase de palpar la vena seleccionada con los dedos, después de desinfectada la piel.

Linfa Concepto: La linfa es un líquido claro, y transparente de color ligeramente amarillento, pH alcalino y salobre, que llena los vasos linfáticos. Está constituida por agua, albúmina, fibrina y sales. Indicaciones al paciente: Las generales. Procedimiento: La muestra de linfa se obtiene específicamente de los lóbulos de las orejas y de los pliegues de la piel de los codos. 1. Con el empleo de torundas o motas de algodón humedecidas en alcohol al 70 %, desinfecte ambos lóbulos y los pliegues de la piel de cada codo. 2. Coloque una pinza en cada uno de los lóbulos, de manera que ejerzan la suficiente presión para que la sangre contenida en los capilares sea excluida, lo cual se evidenciará por un aclaramiento de la zona (zona de isquémia). 3. Con un bisturí haga una incisión de unos 5mm de largo por 2 mm de ancho y raspe la zona con su superficie, rápidamente, antes que la sangre infiltre el corte, proceda a recoger con el borde del bisturí la linfa que emane, depositándola en la lámina portaobjetos habilitada al efecto. Esta operación se debe realizar en ambos lóbulos y en los pliegues cutáneos de los dos codos. 182

Fig. 102: Toma de muestra de la linfa auricular: a) Colocación de la pinza en el lóbulo de la oreja; b) Incisión con el bisturí en la zona isquémica.

Excreciones Concepto: Compuestos excretados por las glándulas (saliva, sudor, lágrimas) o producidos en el reservorio donde se han acumulado (heces, orina, etc.) Heces fecales Concepto: Material que se forma en el intestino básicamentea partir de los residuos del material ingerido no digerido. Indicaciones al paciente: las generales. Procedimiento: En el caso de heces destinadas para examen parasitológico. Se indicará al paciente recoger 10 ó 20g de heces sólidas (aproximadamente del tamaño, equivalente a un 1/3 de un tabaco) y sí fueran sólidas unos 30 ml (una onza fluida) en un frasco limpio y seco, sin vestigios de sustancias antisépticas, provisto con tapa de rosca, preferentemente incoloro y transparente. En todos los casos las heces deben ser recién emitidas. Si el examen de una muestra resulta negativo, no correspondiéndose este resultado con el cuadro clínico, se debe realizar un examen seriado, consistente, en el análisis de varias muestras (6 a 8) enviadas al laboratorio en días alternos, ya que en ocasiones los resultados negativos estando el paciente parasitado debido a que diversas especies presentan las llamadas fases negativas, durante las cuales no aparecen sus elementos de diagnóstico, aunque existan en el tracto digestivo, por lo que el examen de varias muestras en periodos de tiempo diferentes aumentan las probabilidades de localizar e identificar la especie. La primera muestra debe recogerse por defecación espontánea y las sucesivas; algunas mediante la inducción con laxantes y otras, al igual que la primera de forma espontánea, con el empleo del laxante (sulfato de magnesia) se logra evacuaciones de heces líquidas o al menos blandas que permiten detectar con 183

mayor frecuencia la presencia de quistes y huevos de helmintos, contrario a lo que ocurre con las heces sólidas. En el caso de heces destinadas para coprocultivo: Indicar al paciente, que recoja la muestra en un frasco, con similares características que el empleado para el examen parasitológico, pero estéril, el cual debe ser solicitado en el laboratorio. Orina (para urocultivo) Concepto: La orina es un líquido secretado por los riñones, que se caracteriza por tener un color amarillo, ser ligeramente ácida, tener un olor peculiar y un sabor salino. Está compuesta principalmente por agua en la que se encuentran en disolución diversos compuestos, como, urea, glucosa etc. y otros componentes como, ácido urico, ácido hipúrico, etc. Además de células epiteliales leucocitos y eventualmente hematies. Indicaciones específicas: 1. No orinar después de las doce de la noche. 2. Aseo matutino de genitales externos con agua y jabón, y enjuagar con agua previamente hervida y yodada. Para realizar con efectividad el aseo, los hombres se deben retirar bien el prepucio y las mujeres separar los labios. En todos los casos la muestra debe ser recogida en frascos estériles entregados por el laboratorio. Procedimiento: 1. Comenzar a orinar desechando el primer chorro. Aguantar la micción. 2. Destapar el frasco estéril y depositar con cuidado de 10 a 20ml de la porción media, desechando el resto de la orina. 3. Tapar el frasco inmediatamente y enviar la muestra al laboratorio antes que transcurran dos horas. Nota: -

Las mujeres deben orinar paradas y recoger la orina "al vuelo", ya que orinar sentadas, como es lo habitual, las probabilidades de contaminación con los gérmenes procedentes de la microbiota residente o transitoria aumentan. En los casos de niños pequeños, se emplean colectores estériles que deben ser cambiados si la misción se demora o si se contamina con heces.

184

Faneras Concepto: Término general aplicado a las infecciones persistentes en la superficie de la piel, el pelo o las uñas. Indicaciones específicas: Suspender cualquier tratamiento local, 48 horas antes de la toma de la muestra. La noche anterior a la toma de la muestra, el paciente debe asearse la zona de la lesión con agua y jabón, enjuagándose con solución salina fisiológica estéril cubriendo la lesión con apósito estéril, el cual le será retirado en el laboratorio. Procedimiento: a) Lesión abierta en piel. Con hisopo estéril, fino, tomar la muestra en el entorno del borde sin tocar la piel. b) Absceso subcutáneo. En los abscesos calientes, previa desinfección de la piel, se toma la muestra, puncionando la lesión con una aguja insertada a una jeringuilla. En los accesos fríos se toma igualmente con aguja y jeringuilla, pero específicamente en el punto mas elevado de la colección purulenta. c) Lesión seca. (escamosa en piel). Previa desinfección de la zona con una torunda estéril, humedecida en alcohol etílico al 70 %, raspar la lesión con un bisturí, recolectando la descamación en el interior de una placa de Petry estéril. d) Lesión grasienta o purulenta. Tamponar la lesión con solución salina fisiológica estéril, para seguidamente tomar la muestra con hisopo. e) Fístula. Desinfectar previamente el orificio y tomar la muestra con hisopo fino estéril en profundidad. f) Uñas. Al igual que para la toma de muestra de la lesión seca en piel, la de muestra de la uña infectada se realiza mediante raspado de la superficie y debajo de la uña con un bisturí, recobrando el material en el interior de una placa de Petry estéril. g) Observar la cabellera del paciente bajo la luz de una lámpara de Wood. Con una pinza de disección arrancar varios cabellos que se observen fluorescentes, y colocarlos en el interior de una placa de Petry estéril.

PRODUCTOS PATOLÓGICOS Concepto: Producto resultante de la actividad de algunos microorganismos al interactuar con los tejidos. Los más comunes son el pus y el esputo: - Pus (ya explicado en la toma de muestras de piel) - Esputo. Materia densa y viscosa, que es expectorada por las vías respiratorias superiores, mediante el esfuerzo de tos profunda, eliminándose por la boca o siendo deglutido. 185

Indicaciones específicas: 1. 2. 3. 4.

Al levantarse en horas de la mañana, retirar las prótesis y realizar aseo matutino bucal, adecuado. Recoger en un frasco estéril con tapa de rosca y color ámbar la primera expectoración de la mañana, mediante inspiración, seguida de tos profunda, tratando de no recoger saliva. Enviar lo antes posible la muestra al laboratorio (separada de la orden de análisis). Durante la recolección del esputo evitar que se produzca derramamiento del mismo, por la parte externa del frasco. Para la recepción ver capítulo de Bioseguridad.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

En su opinión que es una muestra? ¿Que usted entiende por muestras representativas? Refiérase a las diferentes causas que pueden afectar la representatividad de una muestra. ¿Que implicaciones puede tener la demora en la realización de la siembra? Explique los diferentes métodos empleados para la conservación de las muestras. ¿Que importancia tiene para usted. La cantidad de muestra a tomar? ¿En que momento se debe tomar la muestra? ¿Porque es importante delimitar el área anatómica de donde se va a tomar la muestra? ¿En que consiste las precauciones de asepsia? ¿Que instrucciones generales debemos dar al paciente que tiene indicado un examen microbiológico? ¿Que es un exudado? Nombre los diferentes tipos de exudado que podemos tomar del paciente. Nombre los diferentes líquidos orgánicos que se obtiene del paciente para investigaciones microbiológicas. Describa el procedimiento a seguir para obtener del paciente una muestra de sangre para hemocultivo. ¿Como usted procede para obtener una muestra de linfa para el paciente? ¿Cómo se le indica al paciente recoger las muestras de heces fecales para examen parasitológico? ¿ Que instrucciones debe seguir el paciente para recoger muestras de orina para urocultivo? ¿Como usted toma las muestras de las faneras? ¿Que indicaciones le daría al paciente para recolectar una muestra de esputo con calidad? 186

CAPÍTULO 14 PREPRACIÓN DE MUESTRAS EN LÁMINAS PARA EXÁMENES MICROSCÓPICOS INTRODUCCIÓN La microscopía, constituye junto con el cultivo y las pruebas de identificación, los procederes básicos, sobre los cuales se sustenta el diagnóstico microbiológico de laboratorio. Para la realización del examen microscópico, las muestras a investigar deben ser preparadas previamente sobre láminas portaobjetos escrupulosamente limpias, sin rayaduras ni manchas. El procedimiento a emplear para el montaje de las muestras en láminas, variará en dependencia de los objetivos que se pretenden con la microscopía y de la muestra de que se trate. En los exámenes microscópicos, esencialmente se pretende observar: la morfología de los microorganismos y/o sus diferentes estructuras, la manera de agruparse y sus afinidades tintoriales, así como, detectar la presencia de células, leucocitos y otros elementos de interés como pueden ser, larvas, huevos de hemintos, etc.

DIFERENTES MÉTODOS Preparación de muestras en láminas para examen microscópico en fresco Para la realización de este montaje, la muestra a emplear se utiliza, tal y como se obtuvo, sin la adición de ningún reactivo, ni procesamiento previo, aunque en algunas ocasiones resulta pertinente centrifugarla para concentrar los elementos, que presuntivamente contiene y facilitar su localización durante la realización de la microscopía. Procedimiento: 1. Empleando un asa de platino previamente flameada, el propio tubo que contiene el sedimento o una pipeta estéril, deposite una gota de la muestra en el centro de la lámina portaobjetos. 187

Fig. l03: Preparación de muestras en láminas para exámenes microscópicos: a) Depositar una gota de muestra en el centro del portaobjetos; b) Colocación encima de la muestra de una lámina cubre objetos.

2. Coloque sobre la gota de la muestra o sedimento una lámina cubreobjetos. Si el volumen de la gota fue el adecuado, debe quedar, exactamente debajo de toda el área del cubreobjetos. Si quedara algún espacio sin cubrir se incurriría en error por defecto, debido a insuficiente cantidad de muestra y si se derrama por fuera del cubreobjetos, el error en el montaje sería por exceso. En ambos casos se debe repetir el montaje. Para evitar que queden espacios con burbujas de aire, la colocación del cubreobjetos debe efectuarse suavemente.

Método de la gota colgante Este método se emplea específicamente para constatar mediante la observación microscópica si el microorganismo en estudio es o no móvil. Procedimiento: 1. Coloque sobre la mesa de trabajo una lámina portaobjetos excavada y auxiliándose de un aplicador unte petrolado en todo el perímetro de la excavación. 2. Proceda a flamear al rojo un asa de platino y una vez fría, tome una asada del cultivo germinado en medio de cultivo líquido y deposítela en el centro de una lámina cubreobjetos. Si el microorganismo a examinar se hubiera desarrollado en un medio sólido se procederá a colocar previamente sobre la lámina cubreobjetos una gota de suero fisiológico y posteriormente se tomará con asa de platino estéril y fría, una pequeña porción de la colonia, procediendo a emulsionarla en la gota de suero fisiológico. 3. Coloque la lámina excavada sobre el cubreobjetos, de manera que la preparación quede justamente debajo de la excavación y ambas láminas queden pegadas por el petrolado. 188

4. Con un movimiento suave voltee sin temor la preparación, de manera que el cubreobjetos quede encima con la preparación la cual quedará colgando. En estas condiciones se coloca en el microscopio para su observación.

Fig. 104: Esquema de una preparación de gota colgante: a) Portaobjetos con una excavación central rodeada de un anillo de petrola to; b) Cubreobjetos con una gota de cultivo; c) Ensamblaje de la lámina excavada con el cubreobjetos; d) Viraje de la preparación.

Preparación en láminas de muestras coloreadas Este método se utiliza cuando se requiere teñir a los microorganismos y/o su entorno, para su mejor observación o para determinar sus afinidades tintoriales. Debido al ínfimo tamaño o la composición bioquímica de las diferentes estructuras, se requiere en cada caso técnicas de tinción especiales para la coloración de cada una de ellas. La preparación en láminas se efectúa por dos procederes diferentes: la adición del colorante a la muestra o la preparación de frotis. Adición de colorantes a la muestra Se procede exactamente igual que para la preparación en fresco con la diferencia de que la muestra es emulsionada con el colorante en cuestión, antes de ser colocada la lámina cubreobjetos. Ejemplo: Examen directo de heces fecales, con el empleo del colorante Eosina. 189

Preparación de frotis El frotis consiste en una extensión de la muestra con hisopo o asa de platino sobre la lámina portaobjetos, de manera que al sacarse quede formando una capa. Procedimiento:

Fig. 105: Preparación de una preparación sobre láminas portaobjetos.

Si la muestra o el cultivo fueran líquidos, deposite sobre la lámina portaobjetos una cantidad suficiente, que le permita hacer un frotis grueso con ayuda de un asa de platino estéril. Debe ser grueso, ya que los microorganismos cuando se hayan en un medio líquido tienden a estar muy dispersos, lo cual dificulta su localización en el examen microsocópico en la medida en que el frotis sea demasiado fino. Si el frotis se fuera hacer empleando una colonia germinada en medio de cultivo sólido, se debe echar previamente en el centro de la lámina portaobjetos una gota de solución salina fisiológica y posteriormente emulsionar la colonia con un asa de platino estéril con la que se hará la extensión. Debido a que en las colonias, los microorganismos están muy conglomerados, el frotis debe hacerse muy fino para que se pueda distinguir adecuadamente su agrupación característica. Después de realizado el frotis, déjelo sobre la mesa de trabajo hasta que el agua residual que contiene se evapore y se seque. Si desea acelerar este proceso puede introducirlo en una incubadora pero nunca, en la llama del mechero para acelerar el proceso ya que los gérmenes pueden deformarse y generar confusiones al microscopista. Una vez seco el frotis, tome la lámina por los bordes con los dedos índice y pulgar, de manera que la extensión quede hacia arriba. Pase la lámina directamente por la llama del mechero dos o tres veces, de manera que la parte posterior de la lámina sea lamida por la llama. La exposición al calor directo provocará que las estructuras de naturaleza proteíca, se coagulen, lo que provocará que la preparación quede adherida a la lámina y no sea desprendida después de la coloración por el agua que se utilice para eliminar el exceso de colorante. 190

Fig. 106: Fijación de un frotis a la llama del mechero.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Describa el procedimiento para el montaje de muestras para la observación de examen en fresco ente cubre y portaobjetos. Especifique para qué se realiza el método de la gota colgante. ¿En qué consiste un frotis? Explique las diferentes maneras de preparar los frotis de acuerdo al tipo de muestra de que se trate. ¿Cómo usted fija los frotis? ¿Con qué objetivo se fijan los frotis?

191

CAPÍTULO 15 COLORANTES Y COLORACIONES INTRODUCCIÓN Las bacterias, levaduras y protozoarios, en su estado natural, carecen de color, teniendo un aspecto semitransparente, por lo que resulta muy difícil su observación en las preparaciones acuosas sobre láminas portaobjetos, sometidas a la intensa iluminación que se requiere en los exámenes microscópicos de campo brillante, siendo necesario colorearlas por diferentes métodos de tinción que factibilicen su observación y distinguir las características morfológicas y estructurales que sirvan de datos para su identificación genérica.

CONCEPTO Los colorantes son sustancias de origen químico o biológico, generalmente tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración de tejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al menos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir.

FUENTES DE OBTENCIÓN DE LOS COLORANTES Atendiendo a la fuente de obtención, los colorantes se clasifican en naturales y sintéticos.

Colorantes naturales Los colorantes naturales son básicamente histológicos, encontrándose entre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes: 1. Índigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigófera que contiene indican, el cual se fermenta para producir el colorante. 2. Carmín: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales metálicas a hembras del insecto cochinilla "Coccus castis". 3. Orceína y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de líquenes de los géneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria. 192

4. Hematoxilina: Este colorante se extrae con éter de la madera de un árbol oriundo de México y de algunos paises suramericanos denominados Hematoxilium campechianum.

Colorantes sintéticos Se obtiene de la anilina, o es mas exactamente del alquitrán de hulla siendo todos derivados del benceno. Atendiendo a su estructura química se agrupan de la siguiente manera: Cuadro: 9. Clasificación de los colorantes. GRUPO

SUB-GRUPO

C O LO RAN T E

QUINONIMINA

TIACINA

Azul de metileno Toluidina Rojo neutro Safranina C Nigrosina

ACINAS

FENILMETANO

DIAMINOTRIFENILMETANO

Verde malaquita Verde Brillante Violeta cristal

XANLEIRO

FLUORANA

Eosina B e Y Mercuro Cromo 220

Rosa de bengala SULFONSFTALEINA Azul de bromofenol Verde bromocresol Azul de bromotimol Rojo cresol Fenolftaleina Rojo fenol Azul timol Acriflavina Naranja de acridina

ACRIDINA

CLASIFICACIÓN Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial se encuentra en el aniòn o el catiòn de su estructura química. Sobre esta base se pueden dividir en tres grupos: básicos, ácidos y neutros. 193

Colorantes básicos: La acción colorante está a cargo del catión, mientras que el anión no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+. Colorante ácido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante esta a cargo del anión, mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+ Colorantes neutros: Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus componentes ácidos y básicos, por ejemplo: la giemsa.

AFINIDADES TINTORIALES En el proceso de la coloración, ocurre una combinación de reacciones físicas y químicas. Reacción física Ocurre un fenómeno de absorción similar al que tiene lugar en las materias porosas, considerando que el colorante penetra en los intersticios del cuerpo coloreable y se mantiene allí por la cohesión molecular. Reacción química Las células microbianas son ricas en ácidos nucleicos que portan cargas negativas en formas de grupos fósfato combinándose como colorante básicos cargados positivamente. Los colorantes ácidos que tienen la acción colorante en el anión no tiñen la célula, empleándose como colorante de contraste para colorear su entrono, como por ejemplo: la tinta china o la eosina que no colorea al microorganismo, pero si el fondo del campo microscópico.

TOXICIDAD DE LOS COLORANTES. VENTAJAS Y DESVENTAJAS Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo tanto el proceso de la tinción generalmente resulta letal para los microorganismos, provocando su inmovilización, lo cual puede significar una ventaja o desventaja para el investigador según sean los objetivos con la sustancia colorante. Veamos algunos ejemplos: 1. Al ocasionar la muerte de los microorganismos sometidos al proceso de tinción se reducen las posibilidades de contaminación para el manipulador. 194

2. Los colorantes pueden ser tóxicos para el manipulador, algunos incluso han resultado cancerigenos por lo que ha habido la necesidad de retirarlos del mercado. 3. Algunos colorantes solo tienen afecto letal para determinadas especies o géneros bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de cultivo selectivo para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables y favorecer el desarrollo de las especies que nos interesa estudiar. Por ejemplo: el verde de malaquita. 4. Otros se emplean como desinfectantes microbianos, mas que para teñir, con fines de microscopia, por sus propiedades bacterianas o bacteriostáticas. 5. Algunos tipos de colorantes son empleados no para teñir, sino como indicadores de pH, formando parte de la composición de los medios de cultivo para indicar los cambios de basicidad o acidez que se vayan produciendo en el medio como consecuencia de su actividad metabólica. Ejemplo: rojo fenol, azul de bromotimol, etc.

METODOS DE COLORACIÓN Atendiendo a los objetivos que se persigan, los métodos de coloración se clasifican en: Tinción simple, tinción compuesta y tinción especial. Tinción simple En la tinción simple se utiliza un solo colorante con el que se tiñe rápidamente el microorganismo, utilizándose fundamentalmente para observar su morfología y tamaño. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo de tinción son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fuscina fenicada, entre otros. Tinción compuesta En este tipo de tinción, se utiliza más de una sustancia tintórea. Los colorantes se aplican, a la preparación, separados o juntos, formando parte de una solución. En consecuencia se puede determinar algunas características propias de diversos géneros que permiten diferenciarlo de los demás, por lo que reciben también el nombre de coloraciones diferenciales. Entre los métodos mas utilizados se encuentran: La coloración de Gram. y la de Ziehl Neelsen.

Coloración de Gram En 1884, el danés Hans Chistian Gram, ideó un método de coloración, que es en la actualidad, el más empleado en los laboratorios de bacteriología, me195

diante el cual, la bacteria sometida a esta tinción, en dependencia de la composición químico de la especie, queda teñida de color violeta o de color rojo. Colorantes y reactivos 1. Solución violeta de genciana al 1% - Violeta de genciana ................................... 1g - Cristales de ácido carbólico....................... 2g - Alcohol absoluto........................................10 mL - Agua destilada .......................................... 100 mL Preparación ( en un mortero): . Diluir los cristales de violeta de genciana en alcohol, con ayuda del brazo del mortero. . Agregar los cristales de ácido carbólico y mezclar. . Agregar poco a poco las dos terceras partes del agua destilada. Revolviendo constantemente. . Echar la mezcla en una probeta graduada de 100 ml de capacidad. . Con el resto del agua, enjuagar el mortero y añadir este residuo con cuidado en la probeta. . Añadir el resto del agua, hasta enrasar en 100 ml. " Dejar la preparación en reposo durante 24 horas y filtrarla con papel de filtro. . Envasar en frasco ámbar o plástico no transparente con tapa de rosca y rotular.. 2. Lugol de Gram. . Cristales de yodo ......................... 1g . Yoduro de potasio ....................... 2g . Agua destilada ............................. 300 ml Preparación (en un mortero): . Mezclar los cristales de yodo con los de yoduro de potasio. . Agregar poco a poco el agua destilada, revolviendo constantemente con el brazo del mortero. . Envasar en frascos de vidrio de color ámbar con tapa de rosca o preferiblemente con tapa de vidrio esmerilado. Rotular. 3. Alcohol etílico 95 % o alcohol acetona al 20 % . Alcohol etílico 95 % ........................ 80 mL . Acetona ...................................................... 20 ml Preparación . Después de diluida la acetona en el alcohol, envasar en frascos de vidrio o plástico con tapa de rosca. 196

4. Solución de Safranina al 1 % . Safranina ........................... 1g . Agua destilada .................. 100 ml Preparación ( en un mortero): . Echar la safranina en un mortero y añadirle poco a poco al agua destilada hasta diluir el colorante. . Dejar en reposo durante 24 horas y filtrar con papel de filtro. . Envasar en frascos de vidrio o plástico. Rotular.

Fig. 107: Juego de colorantes y reactivos empleados en la coloración de Gram.

Procedimiento Después de fijado el frotis a la llama del mechero, colocar la lámina sobre el puente de coloración. 1. 2. 3. 4. 5.

6. 7. 8.

Verter la solución de violeta de genciana, hasta cubrir el frotis, dejando que el colorante actué por espacio de 30 segundos. Lavar la preparación ligeramente con agua corriente. Echar sobre la preparación el lugol de Gram., hasta cubrir el frotis dejando que actué durante 30 segundo. Lavar la lámina con agua corriente. Echar sobre la preparación el alcohol etílico 95 % o el alcohol acetona al 20 %, hasta que se evidencie que este solvente no extrae mas el colorante violeta. Esta operación debe durar aproximadamente de 1 a 2 minutos. Lavar la lámina con agua corriente. Echar sobre la preparación la solución de safranina, dejándola actuar por espacio de 30 segundo. Lavar con agua corriente.

Secado de lámina Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de canto para que se escurra. Debe tenerse en cuenta que el agua y en especial, el agua 197

destilada, es un agente decolorante, por lo que si se deja sobre el portaobjetos después de teñirlo demasiado tiempo quita parte del colorante. Lo ideal es escurrir la lamina poniéndola de canto y seguidamente secarla con papel de filtro. Principios A pesar de que esta técnica de coloración se ha venido empleando desde hace mas de un siglo, aún no se ha podido determinar con exactitud la base molecular de la reacción, existiendo controversias al respecto. El criterio mas generalizado es que la violeta y el lugol forman un complejo que reacciona con los componentes bioquimicos de la pared celular deshidratada, fijándose en esta. Teniendo en cuenta que la composición química de la pared, no es igual en todos los géneros, la reacción resultante será obviamente diferente, lo que da lugar, que mientras algunos géneros retienen firmemente el colorante al resultar el complejo impenetrable para el decolorante, en otros géneros la barrera que se produce es más permeable, lo que permite al solvente penetrar y extraer el complejo violeta-lugol, dejando a la bacteria nuevamente incolora. Fundamento técnico En el primer paso de la coloración, cuando los microorganismos presentes en el frotis son expuestos a la acción colorante de la violeta de genciana, todos los géneros que se encuentran en el frotis se tiñen de color violeta. Al adicionar el lugol, no se produce ningún cambio de color, ya que el lugol no es un colorante, sino un mordiente, que se adiciona con el objetivo de formar un complejo violeta-lugol, para fijar el color en la bacteria. Al adicionar el decolorante (alcohol etilicio o alcohol acetona) algunos géneros no son afectados por estos solventes, reteniendo por consiguiente el color violeta aplicado inicialmente, en tanto que otros son decolorados quedando la bacteria nuevamente incolora. Al echar finalmente la solución de safranina (que es de color rojo ) las especies que no fueron decoloradas, mantienen la coloración violeta ya que la safrania es un colorante mas débil que la violeta y su adición no influye significativamente en cambio de color, en tanto que los géneros que fueron decolorados por el alcohol, se tiñen con la safrina, adquiriendo un color de rosado o rojo. Diagnóstico microscópico Las bacterias que se observan de color violeta se clasifican como Gram positivas y las que se observan de color rojo, como Gram negativas. 198

Coloración de "Ziehl Neelsen Algunos géneros microbianos dentro de los que se incluyen las microbacterias, tienen la propiedad de retener el colorante con que han sido teñidas, aunque sean sometidos a la acción de solventes tan fuertes como los ácidos para su decoloración, el primer método de coloración para este tipo de microorganismo, fue concebido y aplicado por Robert Koch, descubridor del agente causal de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis o Bacilo de Koch. Fue modificada y perfeccionada posteriormente por Ziehl y Neelsen. Este método se utiliza hoy en dia, con alguna que otra modificación en función de las particularidades de la especie en estudio.

Fig. 108: Juego de colorantes y reactivos empleados en la coloración de Ziehl Neelsen.

1. Colorantes y reactivos . Fucsina básica ...................... 1g . Cristales de fenol ................. 5g . Alcohol absoluto .................. 10 ml . Agua destilada ...................... 100 ml Preparación: . Disolver los 5g de fenol en 100 ml de agua destilada. Echar 50 ml de la solución en una probeta graduada de 100 ml de capacidad. . Moler en un mortero 1g de fucsina y añadir en la probeta que contiene los 50 mml de la solución del fenol. . Lavar el mortero con la solución de fenol y añadir ese residuo en la probeta. . Añadir el resto de la solución de fenol hasta enrasar a 100 ml. . Dejar la preparación en reposo por espacio de 24 horas y filtrar con papel de filtro. . Envasar en frascos de vidrio de color ámbar y rotular. 2. Alcohol clorhidrato al 3 % . Alcohol etílico .................... 97 ml . Ácido clorhídrico concentrado......3 ml 199

Preparación . Agregar los 3ml del ácido clorhídrico a los 97ml de alcohol etílico. . Envasar en frascos de vidrio con tapa de rosca. Rotular. 3. Solución de ácido sulfúrico al 20 % . Agua destilada ............................ 80 ml. . Ácido sulfúrico............................ 20 ml. Preparación. . Agregar poco a poco, con cuidado, los 20 ml de ácido sulfúrico a los 80 ml de agua destilada. (Nunca a la inversa). . Envasar en frasco de vidrio con tapa de rosca. Rotular. 4. Solución de azul de metileno (Colorante de contraste) . Cloruro de azul de metileno ............................ 0,1g . Agua destilada................................................. 100,0 ml El cloruro de azul de metileno es hidrosoluble, por lo que su dilución se realiza sin ningún tipo de contratiempo Preparación. . Una ves diluido, dejar en reposo por 24 horas y filtrar con papel de filtro. . Envasar en frascos de vidrio o plástico con tapa de rosca. Rotular. Procedimiento: Después que el frotis se ha secado colocar la lamina sobre el puente de coloración. 1.

Cubrir el frotis con fucsina fenicada y oscilar suavemente la llama del mechero por debajo de la lamina, hasta que el colorante calentado comience a emitir vapores. Retirar el mechero y dejar que el colorante actué sobre el frotis por espacio de 5 minutos. Si en ese tiempo el colorante se secara, añadir más, pero sin volver a calentarlo.

200

2. 3.

4. 5. 6. 7.

Verter el exceso de colorante de la lámina, ladeando la lámina y lavarla con agua corriente. Echar sobre frotis la solución de alcohol clorhídrico o en su defecto la solución acuosa de ácido sulfúrico, dejando actuar el decolorante, hasta que se observe que el solvente no extrae mas colorante de la preparación. Esta operación debe durar aproximadamente unos 2 minutos. Lavar la lámina con agua corriente. Añadir la solución acuosa de azul metileno, dejando actuar el colorante de 30 segundos a un minuto. Lavar la lámina con agua corriente. Dejar que la lámina se seque al aire sin aplicar papel de filtro para acelerar el secado.

Principio: Las microbacterias, como el Mycobaccterium tuberculosis y otras especies susceptible de ser coloreadas por esta técnica, se caracterizan por tener una alta proporción de ácido micolico (lípidos) en su pared celular. La acción del calor, introducido en este método, hace que la misma se permeabilice y haga accesible la penetración de la fucsina, tiñéndose la pared celular. Al normalizarse la temperatura de la preparación, el compuesto lipidico impermeabiliza la pared a la acción del decolorante ácido, con lo cual el microorganismo se mantiene teñido. El resto de las especies, así como las células epiteliales y otros artefactos, que no disponen de ácido micólico en su pared o membrana, son decolorados, después de teñidos por la fucsina. Fundamento técnico Al someter el frotis a la acción de la Fucsina, todos los microorganismos, independientemente de que dispongan o no de ácido micolico en sus respectivas paredes celulares serán coloreados de rojo. Al aplicar el decolorante ácido, las especies que posean el ácido micolico en la pared, resisten la acción decolorante y se mantienen teñidas de rojo, en tanto que las demás se quedan incoloras. Al aplicar la coloración de contraste (azul de metileno) las bacterias que retuvieron el color proporcionado por la fuscina, no sufren ninguna alteración permaneciendo de color rojo, pero las especies que si fueron decoloradas, se tiñen de azul, al igual que las células epiteliales y otros artefactos presentes en la preparación. Diagnóstico microscópico Los bacilos que se observan coloreados de rojo están diagnosticados como B.A.A.R. (Bacilos ácidos alcohol resistentes) 201

Ccoloración de Ziehl Neelsen (modificada para Mycrobacterium leprae) Justificación: La capacidad de acidorresistencia del M.leprae, es diferente a la del M.tuberculosis. lo que ha dado lugar a una modificación del metodo de tinciòn clásico, para hacer mas efectiva su tinciòn. Procedimiento: Después que el frotis se ha secado al aire, proceda de la siguiente manera: 1. 2.

Pase la lámina 3 veces por la superficie de la llama del mechero. Coloque en el fondo de un vaso de koplin, una pequeña mota de algodón impregnado con 3 gotas de formol al 40 % 3. Intriouzca la lamina en el vaso de Koplin y tapelo. Dejar actuar los vapores de formol por espacio de 3 minutos. 4. Sacar la lamina del vaso de koplin y pasarla nuevamente 3 veces por la llama del mechero. 5. Repetir el paso 3. 6. Coloque la lamina sobre el puente de coloración y cubrala con fuscina basica. Dejar actuar el colorante por espacio de 20 minutos 7. Lavar la lamina con agua cruda. 8. Colocar nuevamente la lamina sobre el puente y cubrirla con alcohol clorhídrico al 1%. Dejar actuar el decolorante por espacio de 2 minutos. 9. Lavar la lamina con agua cruda. 10. Colocar la lamina sobre el puente de coloración y cubrirla con azul de metileno, verde de malaquita o hematoxilina. Dejar actuar el colorante de contraste por espacio de 1 a 2 minutos. 11. Lavar la lamina con agua corriente escurrir y dejar secar al aire. NOTA: Estos colorantes se comercializan ya elaborados por diferentes empresas.

Tinciones especiales: Existen decenas de metodos de coloraciones especiales, destinadas a la tinciòn de las diferentes estructuras de la celula microbiana, tales como flagelos, capsulas, esporas, granulos, etc, generalmente no susceptible de ser coloreados por los metodos anteriormente explicados. En este tema haremos referencia solo a algunos metodos empleados con mayor frecuencia. 202

Coloración Fragelar de Leifson (modicficación de Clark) Los flagelos son estructuras, cuyo diámetro no excede de los 30mm, lo cual esta muy por debajo del poder de rersouciòn del micrososcopico optico. Para hacer visibles a los flagelos se requiere aumentar su grosor, para lo cual se emplea una suspensión de acido tanico que al precipitarse sobre su cubierta forman una capa que aumenta aparentemente su diámetro. Lo que propicia que al ser posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposición con respecto al bacilo se hagan visibles al microscopista. Colorantes y reactivos Solución A: - Fuscina basica (certificada para colores flagelos) ...........1,2g - Alcohol etílico 95% ......................................................... 100.0 ml Mezclar y dejar a temperatura ambiente Solución B - Acido tanico.................................... 1,5g - Cloruro de sodio............................. 0,75g - Agua destilada................................ 100,0 ml

1. 2.

Preparación: Mezclar a volumen iguales A y la B. Ajustar el pH con NaOH/1N. Envasar en alícuotas de 50 ml. Guardar congelado en refrigeración (Tiempo de conservación: 1 mes).

Requisitos a tener en cuenta Para que la tinciòn de los flagelos sea efectiva se requiere cumplir con los siguiente requisitos 1. 2. 3. 4.

Los medios de cultivo empleado para el desarrollo de las cepas deben ser adecuados. Los cultivos tienen que ser jóvenes. Las laminas portaobjetos y cubreobjetos deben estar escrupulosamente limpias sin el mas minimo vestigio de grasa. Las laminas a emplear deben calentarse previamente y enfriarse a la temperatura corporal, para que los frotis se sequen con rapidez. Procedimiento 1.Coloque sobre la mesa de trabajo 3 láminas portaobjetos limpias y acabadas de calentar. 203

2.Deposite una gota grande de una suspensaiòn bacteriana joven, procedente de un cultivo líquido o del agua de condensación de un cultivo sólido, casi al extremo de cada una de las tres láminas e inclínelas suavemente para que la gota se deslice (no extender con asa). 3.Espere a que las laminas se sequen al aire. 4.Eche sobre cada lámina portaobjetos 1mL del colorante de Leifson y déjelo actuar con un tiempo diferente para cada preparación. Una de las láminas por espacio de 8 minutos, la segunda por espacio de 10 minutos y la tercera 15 minutos. 5.Lave con agua corriente. 6.Cubra cada frotis con solución de azul de metileno 1:1,000 en solución acuosa 1:2,000 de borax y deje actuar el colorante por espacio de 10 minutos. 7.Lave con agua corriente y espere a que las preparaciones se sequen al aire.

Coloración de cápsulas La cápsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la sintetizan a partir de polipéptidos, polímeros de glucosa u otros aminoazucares que contienen nitrógeno, que después de combinarse con el agua es segregada por todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la cápsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreado por el método de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se requiere ver la cápsula con más detalle o inducir su producción se recurre a coloraciones especiales. Coloración de Hiss -Colorante capsular de Hiss. Mezclar 5 mL de solución alcohólica satura de violeta de genciana en 95 mL de agua destilada. Procedimiento. 1. 2. 3. 4.

Sobre una lámina portaobjetos mezcle partes iguales del material a teñir con suero específico. Haga un frotis fino y déjelo secar al aire. Fije la preparación a la llama del mechero. Cubra el frotis con el colorante de Hiss. Proceda a pasar la llama del mechero por debajo de la lámina hasta que el colorante se caliente y empiece a emitir vapores. Esperar de 5 a 10 segundos. 204

5. 6.

Lavar el colorante con solución acuosa de sulfato de cobre al 20%. Dejar que la preparación se seque al aire y examinar al microscopio.

Resultado Las bacterias, así como otras células y el fondo del campo se tiñen de rojo intenso en tanto que las cápsulas se observan incoloras y en ocasiones con un matiz azul muy tenue.

Coloración de Esporas Coloración de Dorner. En un tubo de ensayo haga una suspensión densa del microorganismo en estudio con 3 o 4 gotas de agua destilada. - Agregar 3 o 4 gotas de fucsina fénica de Ziehl Neelsen. - Hervir de 10 a 15 minutos, en baño de agua de ebullición. -

Colorante. Solución de nigrosina de Dorner. -Nigrosina .................................................................................... 10g -Agua destilada .............................................................................100 ml Preparación 1. 2. 3. 4.

Hervir la solución en erlenmeyer durante 30 minutos. Agregar 0,5 mL de formol al 40 % (como preservo) Filtrar dos veces con papel de filtro doble. Distribuir en tubos de ensayo serológico, unos 5 mL por tubo procediendo a taponearlos con tapas de corcho, retapándolos finalmente con papel de aluminio.

Procedimiento -

Coloque en el centro de una lámina portaobjetos un asa de la preparación y mézclela con un asa de nicrosina de Dorner, haciendo un frotis delgado. Dejar secar y observar a microscopio a 700x con lente de inmersión.

Resultado Las esporas se observan de color rojo. Las células vegetativas no se colorean y el fondo del campo adquiere un tono gris. 205

Coloración de gránulos. Colorante. Azul de metileno. Preparación. Azul de metileno ........................................................................... 1,5g Alcohol etílico 95 % .................................................................. 100,0 mL Preparación Mezclar el azul de metileno en un mortero, añadiendo poco a poco el alcohol y revolviendo. Dejar en reposo durante 24 horas y filtrar con papel de filtro. Procedimiento 1. 2. 3. 4.

Hacer frotis finos y dejar secar al aire. Cubrir con el colorante y dejar actuar durante tres minutos . Lavar con agua corriente. Dejar secar al aire y observar con lente de inmersión a 700x.

Resultados Los gránulos se tiñen de azul oscuro y el cuerpo de la bacteria de azul claro.

CUESTIONARIO 1. 2. 3.

En su estado natural ¿qué color y aspecto tienen las bacterias? ¿Qué usted entiende por colorantes? ¿Cuáles son las diferentes fuentes a partir de las cuales se obtienen los colorantes? 4. Mencione tres tipos de colorantes naturales. 5. Nombre los colorantes sintéticos de uso frecuente en microbiología. 6. Caracterice a los colorantes de acuerdo a su clasificación. 7. ¿Cómo tiene lugar la reacción física en el proceso de tinción? 8. ¿Cómo tiene lugar las reacciones químicas en el proceso de tinción? 9. ¿Cuáles son las ventajas y las desventajas de la toxicidad que ocasionan los colorantes a los microorganismos? 10. ¿En qué consiste el método de coloración simple? 11. ¿En qué consiste el método de coloración compuesta? 206

12. ¿Cómo se denominan los colorantes empleados en la coloración de Gram? 13. ¿Cuál es la función del lugol en la coloración de Gram? 14. ¿Cómo reacción las bacterias al ser sometidas a la coloración de Gram cuando se le adiciona el alcohol? 15. De acuerdo al color con que quedan teñidas después de la coloración de Gram, ¿cómo son clasificadas las bacterias? 16. ¿Cómo se denominan los colorantes empleados en la coloración de Ziehl Neelsen? 17. ¿Por qué se debe calentar la fucsina en el proceso de tinción? 18. ¿De qué color quedan los B.A.A.R. después de ser sometidas a la coloración de Ziehl Neelsen? 19. Describa el procedimiento para la realización de una coloración de Ziehl Neelsen modificada. 20. ¿Con qué objetivo son tratadas con ácido tánico las bacterias, antes de aplicar una coloración de flagelos? 21. ¿Qué requisitos han de tenerse en cuenta para realizar una coloración de flagelos? 22. Describa el procedimiento para la coloración de cápsula. 23. ¿Para qué se utiliza la coloración de Dorner? 24. ¿Cómo se observan las esporas y las células vegetativas coloreadas con nigrosina? 25. Explique como usted realiza una coloración de gránulos.

207

CAPÍTULO 16 MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN Los medios de cultivo son compuestos o preparaciones alimenticias elaboradas en los laboratorios de microbiología con los nutrientes requeridos para cada género en particular, que conjuntamente con las codiciones ambientales adecuadas propician su desarrollo, constituyendo de hecho el micromundo de los microorganismos en condiciones de laboratorio. Para que un medio de cultivo resulte eficaz, sus componentes deben responder a las exigencias nutricionales de las especies que se pretenden cultivar. Debido a que existen diferencias en los elementos constitutivos de cada género o especie, así como en sus actividades metabólicas y los mecanismos para obtener los nutrientes, se comprenderá que no haya un medio de cultivo standard que posibilite el desarrollo de todas las especies, existiendo por lo tanto una amplia variedad.

OBJETIVOS DE LA NUTRICION MICROBIANA Cuando los microorganismos son colocados en medio de cultivo apropiados, metabolizan los nutrientes para sintetizar macromoléculas que suplan el desgaste natural de sus estructuras en cuyo proceso se libera energía que es empleada en el desarrollo de las actividades fisiológicas, tales como respirar, moverse, reproducirse, etc. Así como para controlar el paso de los gradientes químicos a través de la actividad osmótica de la membrana celular. Por lo tanto la nutrición microbiana cumple dos objetivos fundamentales: la biosíntesis para la renovación de los compuestos de su estructura celular y la producción de energía.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. 2.

Los medios e cultivo se clasifican: Atendiendo a su composición Atendiendo a los objetivos de su empleo.

Atendiendo a su composición, se clasifican a su vez en: simples, sintéticos y vivos. 208

Medios simples En este tipo de medio no es posible conocer la proporción exacta de sus componentes nutricionales por ser muy variable. Se utilizan en su forma natural, tal y como se encuentran en la naturaleza, siendo prácticamente imposible preparar dos lotes idénticos con productos iguales de distinta procedencia. Ejemplo: la leche, las carnes, la papa, jugos vegetales, etc. Cuando un medio simple natural sufre algún tipo de modificación, como por ejemplo: someter la carne o los vegetales a un proceso de cocción para obtener un caldo nutritivo, pierde su condición de medio simple natural y se convierte en un medio simple artificial. Medios sintéticos A diferencia de los medios simples, los sintéticos están compuestos por un conjunto d nutrientes definidos cuyas proporciones son constantes, lo que permite reproducir el mismo medio de cualquier otro lote con exactitud. Se puede decir que son verdaderas fórmulas químicas o recetas de cocina. Cada uno de estos medios responde a las necesidades específicas de grupos microbianos determinados. La literatura informa cada año un número cada vez mayor de medios sintéticos recomendados para cultivar todo género de microorganismos, existiendo en la actualidad mas de un centenar de diferentes medios sintéticos, ejemplo: Agar Saboreaud, Agar SS, Kligler, etc. Este tipo de medio se comercializa en forma deshidratada por diferentes empresas cubanas y extranjeras que se dedican a la elaboración de medios de cultivo.

Fig. 110: Frasco con medio de cultivo deshidratado.

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Medios vivos Los medios vivos están constituidos por animales o capas de tejidos que son utilizados para el cultivo de virus y rickettsias, que no se desarrollan en los medios simples o sintéticos por requerir de la presencia de células vivas para reproducirse en su interior (parásitos intracelulares obligados). Estos medios no tienen utilidad práctica para el cultivo de las bacterias y los hongos. Ejemplos: hámster (curieles jóvenes), ratones blancos lactantes, huevos fértiles de gallina de 7 a 10 días, cultivo de tejidos, etc.

Fig. 111: Medios de cultivos vivos: a) Hamster; b) Huevo de gallina con embrión de pollo de 7 a 10 dias; c) Cultivo de tejidos

Atendiendo a los objetivos de su empleo Se clasifican a su vez en: medios de enriquecimiento, medios de aislamiento, medios selectivos y medios diferenciales. Medios de enriquecimiento Son medios generalmente líquidos, que se utilizan con el propósito de favorecer el desarrollo de una especie determinada que por encontrase en pequeñas cantidades en la muestra, conjuntamente con otras especies que se hayan en mayor proporción, se encontrarían en desventaja si la colocamos en un medio de cultivo, donde ambas se puedan desarrollar, ya que las que se encuentran predominando consumirían prácticamente casi todos los nutrientes lo que traería como resultado un pobre desarrollo o incluso ningún desarrollo del germen que nos interesa estudiar. Los medios de enriquecimiento satisfacen los requerimientos nutricionales del germen objeto de estudio, al mismo tiempo que no favorecen las necesidades esenciales del resto. Ejemplo: el caldo Selenito utilizado en la investigación del coprocultivo que 210

favorecen el desarrollo de los géneros Salmonella y Shigella, dificultando al mismo tiempo el de otras bacterias entéricas predominantes en el bolo fecal. Medios de aislamiento Por lo regular resultan específicos para un solo tipo de germen al no poder desarrollarse en ellos ninguna de las demás especies, por las características del medio. Ejemplo: el medio "Chapman" denominado también Agar Manitol Salado. Este medio se caracteriza porque uno de sus componentes, el CI Na, se encuentra a una elevada concentración, lo que imposibilita el desarrollo de las especies bacterianas con excepción de los Estafilococos, que puede desarrollarse y multiplicarse en este medio salino. Otro ejemplo lo constituye el medio Agar, verde brillante, que se utiliza para el aislamiento e identificación de la Salmonella sp/ en materiales patológicos. En este caso se aprovecha la resistencia de esta especies a ciertos agentes químicos, como el colorante verde brillante, que sin embargo, inhibe el crecimiento de otras enterobacterias, especialmente la Escherichia coli, que generalmente se encuentra predominando en las muestras empleadas. Medios diferenciales En este tipo de medio de cultivo se pueden desarrollar sin dificultad diferentes especies microbianas. Se utiliza para diferenciar la especie desarrollada por las reacciones bioquímicas que genera su actividad metabólica, lo cual es determinado por cambios y reacciones evidentes que de manera específica produce cada especie en el medio de cultivo, cuyas diferencias permiten encaminar la investigación hacia su identidad. Ejemplo: el medio Kligler, que es utilizado en la investigación de las enterobacterias. Después de 14 a 16 horas de incubación se puede observar que el medio de cultivo cambia de color, de rojo a amarillo en la parte inferior o en todo el medio, así como la presencia o no de manchas de color negro o evidencias o no de producción de gas.

Fig. 112: Medio diferencial (Kligler); a) Medio sin sembrar (rojo); b) Cambio de color de rojo a amarillo en el fondo del medo; c) Cambio de color de rojo a amarillo en todo el medio; d) Formación de manchas de color negro desde el medio hacia abajo; e)Manifestación de formación de gas

211

CONSISTENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Atendiendo a su consistencia los medios se clasifican en: líquidos semisólidos y sólidos. La consistencia del medio de cultivo se logra con la adicción a la fórmula, de un compuesto denominado AGAR. El agar en malayo significa jalea. Es una sustancia mucilaginosa que se obtiene de algas de color purpúreo. Perteneciente al grupo Agarofíto que comprende los géneros: Gellidium, Pteroclaida, Gracilaria, y Acanthopeltis, que proliferan principalmente a lo largo de las costas de Japón, China, Ceilán, Malasia y California meridional. Las paredes de la planta posee una capa interna, de celulosa y otra más eterna de sustancias pécticas. Para la producción de agar se extraen las capas pécticas ricas en agarosa y agaropectina, para ser procesadas industrialmente, siendo comercializado en forma deshidratada. Bioquímicamente se trata de un éster sulfúrico de una molécula lineal galáctano que es insoluble en agua fría pero soluble en agua caliente. Una solución de 1,5 % de agar forma un gel firme entre 32 y 390 C que no se funde por debajo de 850 C. Como lo atacan muy pocas bacterias se emplea básicamente como solidificante. Medios líquidos Los medios líquidos no contienen agar, siendo trabajados en forma de caldo. Los microorganismos desarrollados en medios líquidos, se mueven con libertad y su desarrollo provoca la formación de un enturbamiento difuso o sedimento visible. Ejemplo: Caldo Selenito, agua, peptonada Alcalina, caldo lactosado, etc.

Fig. 113: Diferentes formas de crecimiento en medios de cultivo líquidos.

212

Medios semisólidos Estos medios contienen un % de agar menor que el empleado para los medios sólidos, lo que facilita una mayor migración de sustancias y la movilidad de los gérmenes. Ejemplo: medio de "Cary - Blair" y agar semisólido para motilidad. Medios sólidos Son medios de cultivo que contienen en su composición alrededor de 1,5 % de agar, cantidad suficiente para la gelificación del medio. La solidez proporcionada por el agar impide a los microorganismos su migración en el cultivo por lo que se multiplican en un mismo sitio dando lugar a un cúmulo de millones de descendientes que forman sobre el cultivo estructuras macroscópicas denominadas colonias de diferentes formas, aspectos y tamaños. Cada género y especie producirá un tipo de colonia con caracteres culturales diferentes, que permitirán al investigador orientarse hacia la identificación ulterior de la especie. Teóricamente cada colonia se genera a partir una o varias bacterias de la misma especie, aunque ocasionalmente pueden desarrollarse a partir de dos especies distintas, lo que da lugar a la formación de colonias atípicas. Ejemplo: Agar Saboreaud Dextrosa, Agar Violeta Rojo Bilis, Agar Sangre, etc.

Fig. 114: Medio de cultivo sólido distribuidos en placas de Petra: a) Medio sin sembrar; b)Medio sembrado; c)Después de 24 horas de incubación (presencia de colonias).

De lo anterior expuesto se deduce que la cantidad de Agar añadida al medio de cultivo será directamente proporcional al grado de solidez que adquiera el medio.

COMPUESTOS NUTRITIVOS BASICOS Como fue explicado anteriormente, uno de los objetivos de la nutrición microbiana es la biosíntesis, mediante la cual el microorganismo degrada los 213

nutrientes presentes en el medio de cultivo y posteriormente lo sintetizan en el interior de la célula, transformándolos en los diferentes compuestos que conforman su estructura, por lo tanto los ingredientes con que se elabora un medio de cultivo deben responder a las necesidades específicas de la especie que deseamos que se desarrolle en él. Veamos el siguiente ejemplo, donde se indican pormenorizadamente los componentes químicos de las diferentes estructuras de la Escherichia coli: Cuadro 10. Componentes químicos de las diferentes estructuras de la E. coli. ELEMENTOS

% PESO SECO

Carbono Oxigeno Nitrógeno Hidrógeno Fósforo Azufre Potasio

50 20 14 8 3 1 1

ELEMENTOS Sodio Calcio Magnesio Cloro Hierro otros

% PESO SECO 1 0,5 0,5 0,5 0,2 0,3

Por lo tanto si pretendemos que se desarrolle una Escherichia coli, los compuestos empleados en la preparación del medio de cultivo deben aportar todos y cada uno de esos elementos. A continuación haremos referencia a las distintas fuentes a partir de las cuales se pueden elaborar los medios de cultivos, con los componentes que aporten a la nutrición los elementos químicos de referencia: Fuente de oxigeno e hidrógeno El solvente de todos los medios de cultivo es el agua, siendo por lo tanto la principal fuente de obtención, por parte de la bacteria de oxigeno y nitrógeno mediante su ionización y en menor grado a través de la actividad catabólica que desarrollan sobre los compuestos orgánicos, como las proteínas, los lípidos y los carbohidratos, que en el proceso de degradación liberan en alguna proporción estos elementos. Algunas bacterias utilizan el oxígeno y el hidrógeno que forman parte de la composición de aire. Fuente de carbono Las formas aprovechables van desde el CO2 atmosférico altamente oxidado hasta complejas formas orgánicas. 214

Para los microorganismos fotosintéticos y litotróficos, el CO2 es la única fuente de carbono. Otros microorganismos (heterótrofos) emplean fuentes orgánicas como las proteínas, carbohidratos y lípidos, así como productos derivados de estos compuestos como aminoácidos, ácido cítrico o glicerina, para obtener el carbono que los provea de energía. La mayor proporción del carbono presente en el sustrato orgánico entra en la vía metabólica para producir energía y se excreta como CO2, el cual es empleado para la carboxilación del fosfornolpivurato para formar intermediarios biosintéticos como el carbamilfósfato como precursor de arginina, pirimidinas y para la síntesis de anillos purínicos. Especies del género Pseudomonas, utilizan alrededor de 90 compuestos orgánicos diferentes como fuente de carbono y energía. Fuente de nitrógeno Es obtenido por los microorganismos de las proteínas y sus derivados, tales como: peptonas, urea o compuestos amoniacales así como a partir de fuentes inorgánicas como el nitrato, el cual es utilizado por la mayoría de los microorganismos fotosintéticos. Algunos géneros son incapaces de reducir los nitratos, por lo que deben obtener el nitrógeno a partir de las sales de amonio que se adicionan al medio de cultivo. Hay bacterias que fijan el nitrógeno mediante su reducción preliminar a amoniaco, en tanto que otras, mas exigentes, requieren de la presencia de proteínas, tales como: carnes, leche, huevo etc. O en forma de peptonas un producto intermedio del metabolismo de las proteínas, transformándolas por hidrólisis en aminoácidos. Independientemente de, la fuente de obtención para ser asimilados por la bacteria, el nitrógeno debe estar en forma de amonio, es decir, si está en forma de N2, NO3 o nitrógeno orgánico debe ser transformado extracorporeamente en amonio para poder ser incorporado a la célula bacteriana. Fuente de iones inorgánicos Son obtenidos por los microorganismos de la materia orgánica que se encuentra formando parte de la composición del medio de cultivo, ejemplo: el azufre lo obtienen de los grupos, sulfhídricos de las proteínas, específicamente del aminoácido, cisteína y del fósforo que está presente en los ácidos nucleicos y los nucleóticos. Estos dos elementos y otros como: hierro, magnesio, potasio, cinc y cobalto, son suministrados a los microorganismos, en la composición del medio de cultivo, en forma de sales minerales, ya sea como cloruros, sulfatos o fosfatos, ejemplo: cloruro de calcio, sulfato de cobre, fosfato de magnesio, etc. 215

Cuadro 11: función de los elementos químicos en la nutrición microbiana FUNCIONES ESPECÍFICAS DE CADA ELEMENTO ELEMENTOS

FUNCION FISIOLOGICA (ACTUA COMO...)

OXIGENO

- constituyente del agua celular y de transporte - constituyente de los compuestos celulares orgánicos - Como aceptor de electrones en la respiración aerobia. - Constituyentes del agua celular y de transporte, así como de materias orgánicas celulares. Los m.o. fotosintéticos, lo usan como fuente de electrones en forma de donadores de hidrógeno. - Como aceptor de hidrógeno en las reacciones REDOX - Constituyentes de materiales celulares orgánicos. - Constituyentes de intermediarios biosintéticos y precursores. - Constituyentes en la síntesis las proteínas, ácidos nucleicos y co- encimas formadas por la célula bacteriana. - Constituyentes de algunos aminoácidos, como la metionina, y la cisteína derivados del metabolismo de las proteínas. - Componente de algunas coenzimas como Co A y otros. - Constituyentes de ácidos nucleicos, coenzimas, fosfolípidos y ATP. - Sustancia tampón para mantener el pH del medio en un rango de 4,5 a 8. - Catión celular, cofactor de algunas enzimas. - Participante en la permeabilidad celular. - Catión celular, cofactor inorgánico para reacciones inorgánicas, incluyendo aquellas con ATP. - Participante en la unión enzima - sustrato. - Constituyente de la clorofila. - Catión celular, cofactor de algunas enzimas, Ej. Proteínasas. - Excretor de las enzimas. - Los gramnegativos lo utilizan para la síntesis de la pared celular. - Componente principal de las esporas. - Cofactor inorgánico de varias enzimas, a veces remplazando el magnesio. - Constituyentes de los citocromos (imprescindible en la respiración celular). - Como parte de las hemoproteinas. - Como cofactor de varias enzimas. - Constituyente de la vitamina B12 y sus coenzimas derivadas. - Constituyentes inorgánicos de determinadas enzimas. - Constituyentes inorgánicos de enzimas especiales. - Útil en la fijación de nitrógeno y en la reducción de nitratos. - Activador de determinadas enzimas. - Regulador del grado de asociación de las partículas ribosómicas. - Estabilizador osmótico. - Participa en la permeabilidad celular.

HIDROGENO

CARBONO NITROGENO AZUFRE

FOSFORO POTASIO MAGNESIO

CALCIO

MANGANESO HIERRO

COBALTO COBRE / ZINC MOLIBDENO MAGNESIO SODIO / CLORO

216

ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO Elaborar un medio de cultivo es un procedimiento relativamente fácil, pero su calidad dependerá esencialmente del cumplimiento estricto de los pasos establecidos, atendiendo a las particularidades del medio de cultivo en cuestión. La premura, así como obviar determinados requisitos pre establecidos son causas frecuentes de su mala elaboración, con todos los efectos negativos que eso entraña, no solo desde el punto de vista económico, teniendo en cuenta que la mayoría de los medios son de importación, sino por lo que resulta mas importante, los errores en el diagnóstico de laboratorio ocasionado por el empleo de medios deficitarios que menoscaban la fiabilidad de la institución, por ocasionar demoras evitables en el tratamiento del paciente. Como ya se explicó, existen centenares de medios de cultivo diferentes, cada uno de los cuáles, formado por diversos compuestos en proporciones fijas que constituyen su fórmula particular. La variabilidad de los medios responde a los requerimientos nutricionales de los distintos grupos microbianos, por lo que la elección de un determinado medio de cultivo estará en correspondencia con el microorganismo que presuntivamente esperamos que se desarrolle durante la investigación al respecto, que realicemos en el laboratorio. Un medio de cultivo, se puede elaborar a partir de los componentes que se indican en la fórmula o empleando medios comerciales deshidratados. Elaboración a partir de sus componentes 1. 2.

3.

4. 5. 6.

Localizar en el formulario existente en el laboratorio, la fórmula del medio que se desea preparar (generalmente indicada para un litro). Seleccionar de los estantes cada uno de los componentes del medio serciorandose de que no hayan sobrepasado la fecha de caducidad y que se observen en buen estado sin cambios organolepticos ostensibles como: resequedad, hidratación, precipitación, cambio de color, etc. Con rigurosa precisión, pese por separado cada uno de los productos sólidos, a emplear en una balanza adecuada, teniendo especial cuidado en desestimar el peso de "tara". Mida con precisión cada uno de los productos líquidos a los volúmenes exactos que se indican en la fórmula. Mida en una probeta graduada el agua destilada a emplear, la cual debe tener un pH y conductividad adecuada. Vierta en una cristalería (erlenmeyer, matraz, etc.) de tamaño suficiente aproximadamente a las ¾ partes del volumen de agua contenido en la probeta. Y proceda a colocarla sobre una fuente de calor con el objetivo de tibiar el agua. 217

7.

Retire la cristalería de la fuente de calor una vez que el agua esté tibia y colóquela sobre la mesa de trabajo 8. Proceda a adicionar en el agua tibia los compuestos pesados y medidos previamente, en el orden que se establece en la fórmula, dándole en cada ocasión un movimiento de rotación al frasco para que los ingredientes se mezclen. 9. Si quedara algún residuo, en la cristalería donde fue pesado (Ej. Cápsula de porcelana, vidrio reloj, etc.) o medido, se enjuagará con parte del volumen de agua que queda en la probeta, procediendo a continuación a verterlo en el resto del medio para que la proporción estipulada en la formula no se altere. 10.Adicionar el agua que pudiera quedar en la probeta para completar el volumen de medio previsto. 11. Si se observa que los componentes no quedan disueltos, someter el medio nuevamente a la acción del calor, por unos minutos imprimiendo intermitentemente movimiento de rotación al frasco. Para determinar que el medio se ha diluido, observe las paredes del recipiente durante su agitación, mientras presenta gránulos es evidente que aún no se ha disuelto. Elaboración a partir de medios comerciales deshidratados En la actualidad diversas empresas dedicadas a la fabricación de medios de cultivo, lo comercializan en forma deshidratada (pulverizados) que contienen la totalidad de los ingredientes, con lo que se evita el tener que pesar o medir previamente cada uno de sus componentes. Estos medios se expenden en frascos de tamaño variable con tapa de rosca hermética estando provistos de una etiqueta en la que se encuentran impresos los siguientes datos: 1. 2. 3. 4.

5.

El nombre del medio de cultivo. Ejemplo: "Agar Saboreaud Dextrosa", "Kligler", "Mac Conkey" "S.S." etc. La fórmula del medio de cultivo, donde se relaciona cada uno de sus componentes y las proporciones respectivas. El pH a que debe ajustarse e medio después de hidratado y antes de su esterilización. Las instrucciones para hidratar el medio donde se precisa la cantidad de medios deshidratados que debe pesarse para preparar un litro. En el caso que no se requiera preparar ese volumen se harán los cálculos pertinentes. Coloque sobre el plato de una balanza granataria una cápsula de porcelana o un vidrio reloj limpio y proceda a determinar su peso (tara) 218

Fig. 115 : Datos que se encuentran en la etiqueta de los frascos de medios de cultivo.

6. 7.

8.

9. 10.

11.

12.

Sume el peso de la "tara" y el de cantidad de medio de cultivo a pesar y mueva las pesas hasta que indiquen en la barra el peso total. Con el empleo de un depresor o cuchara plástica extraiga del frasco el medio de cultivo deshidratado y deposítelo en el recipiente que se encuentra en el plato de la balanza hasta que la punta de la barra coincida con el "fiel". Mida en una probeta graduada el volumen de agua destilada a emplear y vierta aproximadamente las ¾ partes d ese volumen en un erlenmayer o matraz de tamaño suficiente. Coloque el recipiente sobre una fuente de calor durante dos o tres minutos para que el agua se tibie. Baje el recipiente de la fuente d calor y proceda a verter en su interior, con sumo cuidado, el medio deshidratado ya pesado que se encuentra en la cápsula d porcelana o vidrio reloj, con ayuda de un depresor plástico. Deposite un poco del agua destilada que quedó en la probeta en el interior de la cápsula de porcelana. Revuelva con el depresor plástico e incorpora este residuo en el erenmeyer que contiene el medio , añadiendo el resto del agua que pudiera quedar en la probeta para completar el volumen total previsto. Coloque nuevamente el recipiente sobre la fuente de calor, imprimiéndole movimientos de rotación cada 30 ó 40 segundos hasta observar que en las paredes de la cristalería no se detecta la presencia de granulaciones lo cual será sugerente de que el medio no se ha diluido adecuadamente. Debe evitarse el recalentamiento excesivo que provocaría la caramelización de los azúcares y el deterioro de otros compuestos nutritivos básicos. 219

Determinación del pH del medio Una vez que el medio ha sido diluido o fundido se extrae con pipeta una alicuota y se deposita en un tubo de ensayo que será utilizada como muestra representativa de todo el volumen de medio para determinar su pH, para lo cual, se utiliza tiras de papel tornasol o mediante el empleo del pHmetro. Para determinar el pH con tira de tornasol se cortan 4 ó 5 cm de la cinta d papel del carrete y se introduce una de las puntas en el medio de cultivo por 4 ó 5 segundos. Al extraer la tira se compara el color que ha tomado la punta después de contactar el medio con la escala que tiene por sus laterales el carrete cuyos colores se corresponde con pH diferentes. Si se desea una mayor precisión se empleará el pH metro (ver capitulo 9). Ajuste de pH En el caso de que el pH medido no se corresponda con el indicado en la fórmula del medio de cultivo deberá ser ajustado para lo cual se emplean soluciones patrones con diferentes niveles de concentración, las utilizadas para acidificar el medio y bajar el pH son generalmente HCL o H2SOA y las utilizadas para alcalinizar el cultivo y subir el pH son NaOH o KOH. Tanto las soluciones ácidas como las alcalinas se emplean a concentraciones 5N, 1N y 0, 1N. Para ajustar el pH se utiliza la alicuota empleada para medirlo, a la cual se le adiciona cuidadosamente gota a gota, la disolución ácida o alcalina según corresponda hasta obtener el pH deseado, conociendo el volumen de la solución patrón empleada para ajustar el pH de la alicuota se procede a hacer los cálculos pertinentes para determinar la cantidad requerida para todo el volumen del medio de cultivo.

Distribución de los medios de cultivo El medio de cultivo que vaya a ser trabajado en tubos de ensayo se distribuye en los mismos con pipeta, un volumen determinado, antes de su esterilización, mientras que el medio que vaya a ser distribuido en placas de "Petry", se esteriliza en un erlenmeyer taponeado con algodón y retapado con una capucha de papel de estraza, siendo distribuido en las placas con posteridad a su esterilización, después que la temperatura del medio haya descendido de 50 a 55 C, para evitar que el exceso de calor produzca agua de condensación que se adhiera, en el reverso de la placa. Al depositar el medio en las placas la altura del volumen no debe sobrepasar los 3 ó 4 mm. Cuando el medio se haya solidificado, la caja que lo contiene se coloca boca abajo sobre el borde de la tapa hasta que se refresque, en que se 220

tapa para ser guardado en el refrigerador, sin la presencia en el interior de la tapa de agua de condensación.

Fig. 116: Manera de colocar la placa, una vez que el medio se ha solidificado hasta que se enfríe, para que no se acumule en su reverso agua de condensación.

Si el medio es distribuido en tubos con tapas de rosca, estas deben quedar flojas durante la esterilización, para permitir el flujo de aire, debiendo ser apretadas al concluir la esterilización. Cuando las instrucciones indiquen la adición d un reactivo o compuesto estéril, en el medio después de autoclaveado, se debe realizar esta operación con sumo cuidado, observando minuciosamente todas las precauciones de asepsia, por ejemplo en la preparación del medio de cultivo denominado "Agar Sangre", se debe esperar a que la temperatura del medio descienda entre 45 a 50 C, para adicionar el volumen de sangre lo cual requiere que sea vertida poco a poco, imprimiéndole simultáneamente movimientos de rotación al frasco para asegurar una aereación adecuada de la sangre. Observaciones 1.Algunos medios de cultivos elaborados básicamente con hidratos de carbono, como el "Dulcitol" 10 %, así como otros medios elaborados con sueros no deben ser sometidos a la esterilización en autoclave pues se deterioran, en estos casos se emplea la Tindalización. 2.Evitar refundir los medios de cultivo pues en la medida en que esto ocurre, se hacen mas propensos a la precipitación y sufren una disminución en su potencial nutricional. Cuñas de medios agaranizados Los medios de cultivo agaranizados (que contienen Agar) distribuidos en tubos generalmente se utilizan en forma de cuña. Para lograr que estos medios adopten esa forma deben ser colocados oblicuamente sobre la mesa de trabajo estando aún fundidos para que cuando solidifiquen, al bajar la temperatura, mantengan esa forma, aunque el tubo se coloque en posición vertical. De acuerdo al medio de que se trate la inclinación será mas o menos acentuada en interés de los objetivos que se persiguen con los cultivos que se desa221

rrollen en los mismos. Por ejemplo, en el caso del medio "Kligler" la inclinación es menos acentuada para propiciar que el fondo del tubo quede lleno de medio de cultivo a una altura aproximada de 2 cm de altura, quedando en su superficie una cuña de menos de 2cm. Si se tratara el medio "Citrato de Simmons", la inclinación debe ser mas acentuada, ya que el objetivo del empleo de este medio es que se produzca el desarrollo bacteriano en toda la superficie de la cuña (slam) por lo tanto al no ser de interés que quede un fondo como en el medio "Kligler", prácticamente toda la superficie será de slam.

Fig. 117: Cuñas de medios agarinizados en tubos de ensayo: a) Kligler; b) Citrato de Simmons

Conservación de medios de cultivo comerciales Los frascos con medios de cultivos nuevos, deben ser ordenados en los estantes por lotes y fecha de vencimiento. Una vez abierto el frasco se debe escribir en la etiqueta, la fecha en que ocurrió su apertura para que sea de conocimiento de otros que ese frasco está en uso. Deben ser almacenados en lugares frescos y lejos de aparatos térmicos y de ventanas.

Conservación de medios elaborados Alcanzada la temperatura ambiente después de esterilizados,l os medios serán conservados de diferentes maneras atendiendo al medio de que se trate. Por ejemplo: 1. Saboreaud, Agar semisólido para motilidad, tioglicolato, etc. Serán colocados en gradillas y mantenidos hasta su empleo a temperatura ambiente. 2.Los medios distribuidos en placas de "Petry" serán colocados en las parrillas del refrigerador boca abajo tan pronto se hayan solificado. 222

3.Los que contienen colorantes o indicadores se deben proteger de la luz durante su almacenamiento. 4.Los que tienen propiedades REDOX, como por ejemplo "selenito" se deben conservar en las parrillas del refrigerador. 5.Los medios como el "Lowestein - Jensen, se almacenarán en refrigeración para prolongar su tiempo de duración.

Comprobación de la esterilidad de los medios elaborados De cada medio de cultivo preparado y almacenado se seleccionan dos o tres placas o tubos y se colocan en la incubadora durante 24 a 48 horas para comprobar su esterilidad. Empleo de los medios Los medios preparados que han estado conservados en refrigeración, deben extraerse varias horas antes e incubarlos durante 30 minutos, antes de su empleo. Cuando se obvia este paso se puede demorar la iniciación del crecimiento al ser colocado el inóculo en una superficie fría. Observación El agua de condensación y la opacidad que se produce en algunos medios conservados en tubos, al sacarlo de su almacén frío y colocarlo a una temperatura ambiente, facilita su contaminación. No se deben preparar medios de cultivo en exceso, ya que si están mucho tiempo en almacenamiento se pueden resecar de manera imperceptible y ocasionar reacciones inexactas y fallas en el crecimiento.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5.

6.

¿Qué usted entiende por medio de cultivo? Cuales son los objetivos de la nutrición microbiana? ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a su composición? ¿Que es un medio artificial? ¿Cómo se denominan los medios de cultivo que están constituidos por una variedad de ingrediente fijos con gramaje y volumen predeterminados? ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a los objetivos de su empleo? 223

7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

¿Qué información aportan los medios diferenciales? ¿Cómo se denomina el producto que se añade a los medios de cultivo para sodificarlos? ¿Cuales son los compuestos nutritivos básicos? A partir de que fuentes, las bacterias obtienen el oxigeno y el nitrógeno. ¿Que compuestos podemos incorporar al medio de cultivo que le sirva a la bacteria como fuente de nitrógeno? ¿Que compuesto nutritivo aporta el carbono que le sirve a la bacteria para obtener energía? ¿Que aporta a la nutrición bacteriana el magnesio y el calcio. Explique como usted realiza la pesada de un medio de cultivo deshidratado. Describa como se hidrata el medio de cultivo una vez pesado. ¿De cuantas maneras se puede ajustar el pH del medio de cultivo? ¿Cómo se distribuye el medio de cultivo antes de su esterilización? Explique como se preparan las cuñas en tubo de medios de cultivo sólidos. ¿Como se conservan los diferentes medios una vez elaborados? ¿Cómo se comprueba la esterilidad de los medios de cultivo recién elaborados? ¿Que proceder debe seguirse cuando se va a realizar la siembra en un medio que está conservado en refrigeración?

224

CAPÍTULO 17 SIEMBRA E INCUBACIÓN INTRODUCCIÓN La siembra microbiológica es un procedimiento técnico que consiste en colocar una pequeña fracción o volumen de la muestra, sobre o dentro, de uno o varios medios de cultivo que contengan los nutrientes necesarios par las especias que presuntivamente contiene, con la finalidad de que puedan desarrollarse adecuadamente, para factibilizar su estudio y posterior identificación. El número de células microbianas que se encuentran en el volumen o fracción sembrada se denomina inóculo. Este tipo de siembra, guarda estrecha relación con la siembra agrícola convencional, donde la semilla es equivalente a la bacteria y el terreno fértil al medio de cultivo, ; de la misma manera, los aperos de labranza, tales como la guataca, el azadón, etc, son sustituidos por los instrumentos de siembras, tales como: el asa, la aguja de platino, etc. Para comprender debidamente esta analogía, analicemos el siguiente ejemplo: Si sembramos una semilla de naranja en un terreno fértil, al transcurrir un período de tiempo determinado, veremos que emerge de ésta una pequeña postura, la que posteriormente se desarrollará hasta convertirse en un árbol con las características de esa especie de naranja el cual fructificará, en decenas o cientos de naranjas, portadoras del mismo tipo de semilla que las generó. Si sustituimos la semilla de naranja, por una especie bacteriana y la sembramos en un medio de cultivo apropiado, podremos observar un proceso similar, aunque más dinámico, ya que al transcurrir solamente algunas horas, la bacteria comenzará a multiplicarse, hasta alcanzar una cifra exorbitante de descendientes que puede calcularse por millones. Este agregado de bacterias se denomina colonia, y llega alcanzar tal magnitud que se hace visible microscópicamente al observador. Todo lo cual será equivalente a la obtención de un árbol frondoso, sin las características físicas de éste, aunque si, colmado de millones de bacterias de la misma especie.

INSTRUMENTOS DE SIEMBRA Los instrumentos de siembra son los objetos empleados para tomar el volumen o fracción de la muestra y sembrarla en el medio de cultivo. 225

Fig. 118: Instrumentos de siembra: a) Asa de platino; b) Aguja de platino; c) Espátula de Drigalski; d) Pipeta; e) Hisopo

Diferentes tipos 1. La aguja. Consiste en un fino alambre recto, de platino o nicrón, que tiene aproximadamente una longitud de 7cm, el cual se encuentra insertado por uno de sus extremos a un cabo metálico, el cual sirve para que el manipulador pueda tomar en su mano este instrumento de siembra. Tanto el platino como el nicrón tienen la propiedad de calentarse rápidamente y ponerse a al rojo vivo, cuando son expuestos directamente la llama del mechero y de enfriarse a los pocos segundos, después de haber sido retirados de esa fuente de calor. Esta característica se aprovecha en el trabajo diario del laboratorio, para esterilizar en pocos segundos este instrumento en cada ocasión en que se requiera su uso. 2. El asa. Es similar en todos los aspectos a la aguja, con la diferencia de que el extremo terminal del alambre de platino o nicrón, en lugar de ser recto, forma un pequeño círculo en el extremo con un diámetro de 4 a 5 mm. El método de esterilización es igual al empleado para la aguja. 3. Espátula de Drigalski. La espátula de Drigalski puede ser metálica o de vidrio fusible. Al igual que la aguja y el asa, cuando son metálicas, consisten en un alambre de platino o de nicrón, insertado a un cabo metálico, pero con la particularidad de que el extremo terminal tiene la forma de un triángulo. Se esteriliza a la llama del mechero de igual manera que la aguja y el asa. Las de vidrio fusible, consisten en un tubo fino de varios mm de diámetro por unos 12cm de largo, el cual está doblado por uno de sus extremos en forma 226

de un triángulo equilátero, que mide unos 2 cm por cada uno de sus lados. Para su esterilización la parte triangular de la espátula se introduce en un recipiente que contenga alcohol y de inmediato se aproxima a la llama par que se encienda y flamee el triángulo de la espátula. Cuando la llama se apague, se debe esperar unos segundos para que se enfríe y en esas condiciones utilizarlas en la realización de la siembra. 4. Pipeta. Las pipetas utilizadas como instrumentos de siembra, deben ser previamente esterilizadas en autoclave y estar provistas de un bulbo de caucho, por su parte posterior, similar las empleadas en los goteros. Las más utilizadas en el trabajo ordinario son: las de "Pasteur", que se elaboran con cristal fusible careciendo de escala graduada y las de 0,2 mL, graduadas en centésimas y milésimas de mL. 5. Hisopos. Consiste en un fino aplicador, generalmente de madera, con una pequeña mota de algodón adherida en uno de sus extremos.. los hisopos, una vez confeccionados, deben ser colocados en el interior de tubos de ensayo de tamaño apropiado, taponeados y retapados antes de proceder a su esterilización en autoclave. Cuando se emplean para tomar las muestras, casi siempre se utilizan a continuación para realizar la siembra en el medio del cultivo.

MÉTODOS DE SIEMBRA El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno, los métodos de siembra más empleados son los siguientes: 1. 2. 3. 4.

Siembra por estrías. Siembra por punción. Siembra volumétrica. Siembra masiva.

Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, deben ser calentados en la llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el objetivo de destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento. Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear ésta debe realizarse en las proximidades de la llama del mechero y a que el 227

calor emanado reduce el número de microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor del proceder aséptico. Siembra por estrías Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo sólidos distribuidos en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña.(Slam) Instrumentos de siembra a emplear. Para la siembra por estría se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunas ocasiones, como explicaremos más adelante, se utilizan ambos instrumentos en la misma siembra. Procedimientos Cuando se utilice exclusivamente el asa de platino o nicrón. 1.Coger el asa por el cabo, en forma similar, a cuando tomamos el lápiz para escribir. 2. Introduzca el asa de alambre de platino o nicrón directamente en la zona de color azul de la llama del mechero, hasta que se ponga al rojo vivo. Seguidamente, proceda a introducir lentamente el resto del alambre para lograr el mismo efecto. 3. Retire el instrumento de la llama y espere de 4 a 5 segundos con el objetivo de que el asa se enfríe. 4. Con el asa estéril y fría tome el volumen o fragmento de la muestra que será sembrado y trasládelo de inmediato para el medio del cultivo seleccionado. 5. Si la siembra se fuera a producir en un medio solidificado en forma de cuña en tubo de ensayo, proceda del siguiente modo: a) Con la mano opuesta a la que sujeta el asa, tome el tubo por l porción inferior. b) Con el dedo meñique de la mano que sostiene el asa, retire del tubo el tapón de algodón o la tapa de rosca y reténgala(no colocar el tapón o la tapa sobre la mesa de trabajo) c) Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasándola una o dos veces por la llama del mechero, con el objetivo de eliminar por incineración, los microorganismos contaminantes que se encuentran en esa zona, por la parte externa del tubo. Esta acción calórica, provoca además una convección del movimiento del oxígeno presente en el interior del tubo hacia afuera, debido a la desigualdad de calor, lo cual favorece que decrezca el riesgo de contaminación. 228

d) Introduzca el asa con el volumen o fracción de la muestra en el tubo, hasta el fondo de la cuña. A partir de este momento, la siembra puede realizarse de diferentes maneras, en dependencia del tipo de microorganismo que pretendemos que se desarrolle en ese medio de cultivo:

Fig. 119: Siembra microbiológica en medios de cultivos distribuidos en tubos de ensayo: 1) y 2) Retirar el tapón del tubo; 3) Flamear la boca del tubo; 4) Introducir el instrumento de siembra con la muestra y realizar la siembra; 5) Retirar el instrumento y flamear nuevamente la boca del tubo; 6) Taponar el tubo.

- Deslizando el asa, desde el fondo hacia arriba, por toda la superficie de la cuña, trazando una línea longitudinal. - Deslizando el asa por la superficie de la cuña desde el fondo hacia arriba, imprimiéndole un movimiento de zigzag. - Motiando toda la superficie de la cuña con hisopo. - Efectuando cualquiera de las tres variantes explicadas pero adicionalmente roturando el medio con el asa, haciendo un pequeño corte longitudinal. - Al concluir la siembra se flamea la boca y se taponea nuevamente el tubo procediendo a esterilizar el asa en las llama del mechero.

Fig. 120: Siembra en medios sólidos en cuñas (tubos de ensayo): a) Trazando una línea perpendicular desde el fondo hacia arriba; b) Deslizando el instrumento con el inóculo de abajo hacia arriba en forma de zigzag; c) Roturando el medio

229

Si la siembra se fuera a realizar en la superficie de un medio solidificado en placa de Petry, proceda de la siguiente manera: a) Con la mano opuesta a la que sujeta el asa de platino, tome la placa de Petry, de manera que la tapa quede hacia arriba. Con ayuda del dedo pulgar abra parcialmente la placa.

Fig. 121: Apertura manual de la placa de Petra con medio de cultivo.

b) Introduzca el asa con la muestra y proceda a deslizarla suavemente en forma de zigzag, desde la pared, hasta cubrir aproximadamente un tercio de toda la superficie. c) Cierre la placa y gírela varios cm, en contra de las manecillas del reloj, procediendo a abrirla nuevamente por igual procedimiento. d) Introduzca nuevamente el asa y haga un segmento similar al anterior, de manera que las bacterias sembradas en el primer segmento sean removidas para el segundo. e) Repita esta operación una o dos veces más.

Fig. 122 : Método de siembra por estrias en medios de cultivo sólidos distribuidos En placas de Petra

230

f) Finalmente cierre la placa y colóquela sobre la mesa de trabajo boca abajo. g) Esterilice el asa de platino a la llama del mechero, en la forma explicada antes de dejarla en el puesto de trabajo. Cuando la muestra es tomada con hisopo. 1. Si la siembra se va a producir en una cuña de agar, se procede en forma similar que la siembra con asa en este tipo de medio de cultivo. 2. Si la siembra se fuera a producir en medios sólidos en placas, el primer segmento se hace con el mismo hisopo con que se tomó la muestra y los restantes se realizan con asa estéril, para lograr una diseminación por agotamiento, que posibilite el desarrollo aislado en los últimos segmentos del microorganismo en estudio. Otra variante es la diseminación cruzada, en este caso, en lugar de hacer un primer segmento en zig zig con el hisopo, se procede a trazar en el centro de la plaza una letra "Z" y a continuación con el asa esteril se procede a deslizarse con un movimiento ondulatorio sobre la "Z".

Fig. 123: Siembra por diseminación cruzada: a) Trazar con el hisopo que contiene el inóculo una "Z"en la superficie del medio; b) Completar la siembra con un asa de platino estéril, imprimiendo movimientos ondulatorios sobre la "Z"

Siembra por punción Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de cultivo. 231

Fig. 124: Siembra por punción

Siembra volumétrica Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que este tipo de pipeta carece de escala de graduación, sin embargo, la orina empleadas en el urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla respectivamente el volumen que será sembrado. Siembra masiva Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.

Fig. 125: Siembra masiva con espátula de Drigalski

INCUBACIÓN Una vez realizada la siembra, atendiendo a los requerimientos de los géneros o especies que presuntivamente se encuentran en la muestra, se debe proporcionar a los cultivos la temperatura y las condiciones de aereación que favorezcan su desarrollo, durante un tiempo predeterminado que será variable para cada grupo de microorganismo.. 232

Algunos tipos de microorganismos (como la mayoría de los hongos) se desarrollan sin dificultad a temperatura ambiente y en condiciones de aerobiosis, por lo que basta con dejar los tubos o las placas sembradas sobre la mesa de trabajo para que se desarrollen sin dificultad Los microorganismos que requieran para su desarrollo una temperatura más elevadas o más bajas que la ambiental, deben ser colocados en una incubadora provista de temperatura regulable o con condiciones especiales como las incubadoras de CO2 y las anaeróbicas. (Ver Capitulo 7)

MANIFESTACIONES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO En medios de cultivo líquidos En general el crecimiento se manifiesta por turbidez, la cual podrá opacar todo el cultivo o darle un aspecto granuloso o nebuloso. En medios de cultivos sólidos Como la bacteria se encuentra impedida de desplazarse por la solidez del medio, al multiplicarse en un punto especifico, sus descendiente que alcanzan magnitudes millonarias en menos de 24 horas, ocasionan agregados bacterianos, que dan lugar a estructura visibles de diferente formas, aspecto y colores, denominados colonias bacteriana , cuyos caracteres serán típicos para cada genero o especies.

Cultivo puro El cultivo es puro cuando en el se desarrolla una sola especie.

Cultivo mixto Cuando dos o más especies se desarrollan simultáneamente en el medio de cultivo.

Resiembra Cuando en el cultivo mixto, nos interesa estudiar un solo tipo de colonia, se procede a extraer una pequeña porción con un asa de platino estéril procediendo a sembrarla en un medio de cultivo idóneo, para de esta manera obtener un cultivo puro. Esta acción se denomina resiembra. 233

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

¿Qué usted entiende por siembra microbiológica? ¿Describa los diferentes instrumentos de siembra? ¿Describa el método de siembra por estrías? ¿Cómo se realiza la siembra por punción? ¿Cómo se denomina el método de siembra que se realiza con pipetas? ¿Con que objetivo se utiliza la espátula de Dyigalski? ¿Describa como se realiza la siembra con asa de platino o hisopo en el slam de los medios sólidos en tubos.? 8. ¿Cómo se realiza la siembra cuando se utiliza el mismo hisopo con que se toma la muestra? 9. ¿Cuales son los aspectos a tener en cuenta para incubar los cultivos.? 10. ¿Como se manifiesta el crecimiento bacteriano en los medios líquidos y sólidos.? 11. ¿Cuál es la diferencia entre un cultivo puro y uno mixto? 12. ¿Qué usted entiende por resiembra?

234

CAPÍTULO 18

PRODUCTOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO INTRODUCCIÓN Además de los nutrientes básicos y específicos, que le son proporcionados a las especies de interés, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel de laboratorio, en la fórmula de algunos medios de cultivo empleados al efecto, se incluyen determinados compuestos con el objetivo de favorecer su desarrollo en detrimento de otras especies contaminantes o no, o para distinguir y diferenciar las colonias producidas. Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se emplean indistintamente productos químicos, principalmente carbohidratos, para conocer su capacidad metabólica frente a esos sustratos o se enfrentan a otros tipos de compuestos para determinar su resistencia, así como a diversos productos biológicos para evidenciar sus reacciones.

HIDRATOS DE CARBONO Los carbohidratos comúnmente empleados son diversos. Los más utilizados son los monosacáridos como: glucosa, manosa, galactosa y fructuosas, entre otros y los disacáridos como: lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. También algunos trisacáridos, entre los que se encuentra la rafinosa y polisacáridos como la celulosa y el almidón. Uno o varios de estos carbohidratos suelen formar parte, como fuente de carbono, de la composición de diversos medios, para el cultivo primario o las resiembras, así como, de los medios bioquímicos destinados para el diagnóstico de las especies. El objetivo de su empleo, es determinar, si el microorganismo en estudio, fermenta "in vitro" el carbohidrato con formación de sustancias ácidas, como por ejemplo: el ácido láctico, lo cual será detectado por la acción del indicador presente en el medio de cultivo al variar el pH. 235

INDICADORES Los indicadores son compuestos químicos elaborados con ácidos o bases débiles, que se caracterizan por dar lugar al cambio de color de la disolución o sustancia donde se encuentran al variar el pH, debido a su capacidad de ionización mediante la cual, a determinado nivel de la escala de pH, transforman los iónes o moléculas y viceversa. Los indicadores son de dos colores oudiendo ser uno de ellos incoloro. Cuando el indicador está cambiado de color, la mitad se encuentra en estado iónico y la otra mitad en estado molecular, por lo que el color en esta fase no será definido, sino más bien un color intermedio entre ambos. Los indicadores que forman parte de la fórmula del medio de cultivo, deben estar en concentraciones muy bajas, para que la determinación del ph se deba exclusivamente a los cambios que tiene lugar en la solución. Ejemplos de indicadores Cuadro 12. Colores a los que dan lugar los indicadores en su rango de pH

I N D I CAD O R

COLOR ACIDO

BASE

RANGO DE ph

ROJO FENOL

Amarillo

Rojo

6.4 - 8.2

AZUL BROMOTIMOL

Amarillo

Azul

6.0 - 8.0

ROJO DE METILO

Rojo

Amarillo

4.0 - 6.0

ROJO NEUTRO

Rojo

Amarillo

7.0 -

FENOLFTALEINA

Incoloro

Rojo

ROJO CRESOL

Amarillo

Rojo púrpura

PÚRPURA DE BROMOCRE.

Amarillo

Rojo

8.0

8.0 - 10.0 7.2 -

5.2 -

8.3

6.8

Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color del medio o de las colonias, en correspondencia con las variaciones del pH. 236

SANGRE Y HEMODERIVADOS La sangre se emplea en la elaboración de algunos medios de cultivo, no teniendo como única finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desarrollo de determinadas especies, sino además, el permitir evidenciar y diferenciar la actividad hemolítica de algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollan en el medio "Agar sangre", colonias correspondientes a especies productoras de hemolisinas, éstas actúan sobre la sangre que se encuentra en sus inmediaciones, hemolisando a los hematíes total o parcialmente. Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciará por la formación de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis total se clasifica como "betha". En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hematíes, pero actúa sobre la hemoglobina que porta, reduciéndola a biliverdina, el efecto se evidenciará por la presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis se clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre humana, como los obtenidos de diversas especies de animales, como por ejemplo: carneros, conejos, cabras, etc., son utilizadas en diferentes pruebas de hemaglutinación o para detectar diversas reacciones hemolíticas. El suero sanguíneo se emplea comúnmente para serodiagnósticos y el plasma (sin preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capacidad enzimática de especies productoras de coagulosa, una enzima que utiliza como sustrato el plasma sanguíneo, provocando la formación de coágulos.

Colorantes La edición de determinados colorantes a la fórmula del medio de cultivo, tiene como objetivo, inhibir el desarrollo de las especies más sensibles, que interfieren el estudio, favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras más resistentes de interés en la investigación, como por ejemplo: el "Verde brillante" que forma parte de la composición del medio de cultivo del mismo nombre, utilizado para aislar algunas especies del género Salmonella, al interferir total o parcialmente el desarrollo de otras especies presentes en la muestra. Las colonias de Salmonella se observan además en este medio con un color, rosado o casi blancas, dependiendo de la condiciones de cultivo y el tiempo de incubación. Otro ejemplo lo constituye la siembra en el medio "Eosina-Azul de Metileno Agar". Estos colorantes inhiben el desarrollo de los gérmenes gramnegativos y al mismo tiempo permiten diferenciar a las especies de enterobacterias fermentadoras de lactosa, la sacarosa o ambos azúcares, de los que no las fermentan. Por ejemplo, las colonias de E. coli, Citrobacter y P. vulgaris, adquieren un color azul oscuro, con aspecto metálico (que se evidencia con luz 237

indirecta), en tanto que las Salmonellas y las Shigellas se mantienen incoloras o ligeramente teñidas, mientras que las del resto de los coliformes se tiñen con un tono parduzco.

Productos químicos Teniendo en cuenta, la información genética de que dispone cada especie bacteriana, que la capacita para actuar metabólicamente sobre determinados sustratos, es parcial o totalmente diferente entre sí, se emplean para su diagnóstico diversos sustratos, la mayoría de naturaleza química, cuyas reacciones específicas, nos aportan información acerca de su identidad. Entre los productos químicos, empleados con mayor frecuencia se encuentran los siguientes: Urea, citrato, malonato, nitrato, KCN, así como diversos tipos de aminoácidos, entre otros. El producto químico que se vaya a emplear, formará parte de la fórmula de un medio de cultivo, que contiene además los nutrientes necesarios para el desarrollo de la especie en estudio. Al actuar la bacteria sobre el producto químico en cuestión, generalmente lo degradan por acción enzimática a productos más simples, caracterizados por tener un ph diferente al del producto reaccionante, lo cual se pondrá en evidencia por la acción del indicador que forma parte del medio de cultivo, que proporcionará el cambio de color del medio, haciendo factible la lectura de esa prueba.

Aminoácidos Los aminoácidos: lisina, ornitina y arginina son utilizados corrientemente en el laboratorio, como parte de las pruebas que se realizan a una cepa en estudio, para determinar la identidad de la especie. De manera similar a la empleada con los productos químicos para igual propósito, cada uno de estos aminoácidos es adicionado por separado, en una proporción del 1 % a un caldo base que contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo del germen y un indicador. El principio de estas pruebas radica en la capacidad de algunos microorganismos para decarboxilar uno o varios de estos aminoácidos formando una amina con la consiguiente alcalinidad, lo que será puesto de manifiesto por la acción del indicador, al producirse el cambio de ph.

Antibióticos Para medir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en estudio a los antibióticos, se realiza una técnica denominada antibiograma con el 238

empleo de discos de papel de filtro estériles de unos 5 ó 6 mm de diámetro, impregnados por separado con una carga en g o unidades de un antibiótico determinado, equivalente a la concentración sérica media, obtenida en el pico de una terapéutica a dosis habituales. Estos discos (desecados) se colocan con todas las precauciones de asepsia sobre la superficie del cultivo, tan pronto se realiza la siembra, siendo incubada de inmediato. Transcurrida 24 horas, un halo de inhibición alrededor de cada disco, en dependencia del tamaño del diámetro, será indicativo de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en estudio a cada uno de los antibióticos empleados.

Fig. 126: Discos de papel de filtros para antibiogramas

Basado en el mismo principio y por un procedimiento similar, se realizan pruebas específicas con el empleo de un solo disco, impregnado en este caso con bacitracina u optoquina. La bacitracina inhibe el crecimiento de más del 95 % de los Estreptococos del grupo A, en tanto que la optoquina inhibe el desarrollo del S. pneumoniae (Neumococos), por lo que, la lectura de estas pruebas aportaran un importante dato para sus respectivos diagnósticos. Otras pruebas de resistencia, se realizan con el empleo de productos químicos como: el cianuro de potasio o el desoxicolato de sodio, así como mediante la exposición del microorganismo a sustancias de secreción orgánica como la bilis. La interpretación de los resultados se sustentará en el hecho de que los microorganismos sean o no capaces de desarrollarse en presencia de estos compuestos. 239

Fig. 127: Sueros empleados para serodiagnósticos.

Sueros Los sueros empleados en las técnicas de serodiagnóstico, se obtienen a partir de animales sensibilizados, que han sido expuestos de manera controlada a determinadas sustancias antigénicas con el objetivo de que induzca la formación y el incremento de diferentes tipos de inmunoglobulinas, con las cuales, el sistema inmunológico del animal producirá los anticuerpos específicos, que al interactuar con el antígeno en cuestión, darán lugar a reacciones de aglutinación, precipitación o de hemólisis, las que serán perceptibles "in vitro" si este suero es confrontado con un antígeno similar, por procedimientos de laboratorio. Los sueros obtenidos, mediante sangría de animales sensibilizados son procesados industrialmente, purificados y preservados, siendo envasados en frascos cuentagotas para su comercialización, debiendo ser almacenados de 2-80c hasta su caducidad.

Antígenos Los antígenos comerciales empleados para serodiagnóstico, pueden ser elaborados con cepas certificadas de microorganismos portadores del antígeno de interés que reaccione específicamente con los anticuerpos inducidos por él, o ser preparados artificialmente con diversos compuestos, cuya composición química sea similar a la de los antígenos de la célula microbiana, teniendo la propiedad de reaccionar con los anticuerpos presentes en el suero problema de forma similar que cuando se confrontan con antígenos reales. Un ejemplo de antígeno elaborado con cepas, lo constituye, el antígeno troponémico empleado para el serodiagnóstico de la sífilis, que se elabora con una cepa de Treponema pallidum (cepa Nichols) cultivad "in vivo" en testículos de conejo, la cual se liofiliza para su comercialización. Los anticuerpos presentes en el suero de un paciente con sífilis al ser confrontados con este antígeno, interactuará con él, evidenciándose por microscopía las reacciones resultantes de aglutinación o inmovilización del Treponema. 240

Un ejemplo de antígeno no treponémico, lo constituye el denominado antígeno de cardiolipina para pruebas de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), el cual no está elaborado con cepas de Treponemas, sino por un compuesto formado por: cardiolipina, lecitina y colesterol. Este compuesto tiene una configuración química, aunque no igual, a la del antígeno real, que hace que la reagina (anticuerpo) presente en el suero problema interactúe con este "antígeno", dando lugar a reacciones de aglutinación "in vitro". Esta prueba es inespecífica, ya que por tratarse de un antígeno artificial, los anticuerpos inducidos por algunos agentes infecciosos, reaccionan con él de forma similar para dar lugar a reacciones positivas aparentes. Este antígeno se expende en ámpulas selladas de 5 mL.

Látex El látex es una resina de aspecto lechoso, con textura viscosa y elástica, que se extrae mediante incisiones (cortes) de determinados vegetales, entre los que se encuentran diversas especies pertenecientes a la familia Euforbiáceas, oriundas de Brasil (de donde se extrae el caucho) y la Gutapercha, endémica de Sumatra, así como del opio, una adormidera verde, natural de Asia, que se utiliza esencialmente como narcótico. Esta sustancia tratada con sulfuro de carbono, da lugar a la producción de un material muy resistente que se emplea en la fabricación de neumáticos, envoltura de cables, impermeables, etc. Investigaciones posteriores demostraron que el látex era muy inerte. Esta propiedad unida al ínfimo tamaño de su partícula de 0,81 de diámetro, fue utilizada por los laboratorios biomédicos para recubrir las globulinas específicas, con lo cual se favorece la observación de la aglutinación pasiva. Desde hace varias décadas, diversas empresas farmacéuticas, dedicadas a la fabricación de reactivos comercializan diferentes tipos de látex sensibilizados para el serodiagnóstico de diferentes tipos de microorganismos.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué datos aportan los carbohidratos utilizados para el diagnóstico de laboratorio? 2. ¿Qué son los indicadores? 3. Nombre los indicadores que Ud. conozca que sean empleados con frecuencia en los laboratorios de microbiología. 241

4. ¿Qué información aporta la sangre y el plasma en el diagnóstico de laboratorio? 5. ¿Para qué se utilizan determinados colorantes en la composición de los medios de cultivo? 6. Nombre los productos químicos que son empleados en la composición de medios de cultivo destinados al diagnóstico microbiológico. 7. ¿Qué le sucede a los cultivos que contienen ciertos aminoácidos como la lisina, ornitina y arginina, cuando son atacados por determinadas especies bacterianas, cuya reacciones aportan información acerca de su identidad. 8. ¿ De qué manera se emplean algunos antibióticos para identificar especies bacterianas en estudio? 9. ¿Cómo se obtienen los sueros empleados en los sero diagnósticos? 10. ¿Cómo son elaborados los diferentes tipos de antígenos utilizados para el diagnóstico de las diferentes especies. 11. ¿Qué es el látex? 12. ¿Cuál es la propiedad que tiene el látex que lo hace muy eficaz en las pruebas microbiológicas? 13. ¿Cómo se utiliza el látex?

242

CAPÍTULO 19 GARANTÍA DE LA CALIDAD INTRODUCCIÓN Con independencia de las buenas condiciones técnicas que tenga un laboratorio de microbiología y de la adecuada competencia del personal que en él laboran, los resultados de las investigaciones realizadas pueden estar permeadas de imprecisiones, debidas generalmente a deficiencias técnicas o errores humanos, originados por impericia, negligencia o mal trabajo. La falta de cuidado, el incumplimiento de las normas técnicas establecidas, así como la mala calidad de los materiales empleados o el deficiente funcionamiento de los equipos o instrumentos contribuyen entre otras causas afectar la calidad de los resultados. Debe tenerse presente que cada uno de los pasos o etapas del proceso investigativo es susceptible de afectar la calidad del resultado final. Por ejemplo: la toma de muestras sin la calidad requerida, así como su deficiente conservación y transporte. El mal montaje de las preparaciones en láminas, el empleo de colorantes vencidos o deteriorados, deficiente microscopía, incubación incorrecta, así como la errónea interpretación de las pruebas, son algunos de los factores que inciden en la calidad de los resultados. A los efectos de evitar o al menos reducir al mínimo estas insuficiencias y asegurar la buena calidad de los diagnósticos de laboratorio , se establecen un conjunto de medidas encaminadas a controlar mediante fiscalizaciones regulares todos los factores que inciden en el proceso investigativo, desde la toma de la muestra hasta el informe final, centrando la atención en los ejecutores, en cada etapa del ciclo.

OBJETIVOS Los objetivos del control para la garantía de la calidad son los siguientes: 1. 2. 3.

Mejorar la fiabilidad de los resultados y con ello optimizar el servicio. Validar la calidad de las pruebas empleadas sobre la base de su factibilidad, bajo costo y eficiencia. Emplear racionalmente las pruebas de elevado costo. 243

DIFERENTES TIPOS DE CONTROL - Interno (Denominado también control de calidad) - Externo Control interno El control interno es planificado, organizado, ejecutado y controlado por la dirección del laboratorio a través de las siguientes actividades: a) La fiscalización sistemática "in situ". b) La aplicación de controles de precisión. c) El empleo de pruebas estadísticas. La fiscalización sistemática "in situ" Consiste en supervisar la labor que realiza el personal de laboratorio en cada sección de trabajo con la finalidad de detectar errores groseros que puedan incidir en la calidad de los resultados. Esta fiscalización consiste esencialmente en la revisión de: 1. 2. 3. 4.

La limpieza, desinfección y esterilización del material de vidrio. El uso de reactivos y medios de cultivo con la calidad requerida. La correcta aplicación de los procederes establecidos para la toma de muestras. La habilidad y destreza en la realización de las técnicas de acuerdo con las normas.

Control de precisión Se denomina precisión a la propiedad que tiene un determinado método de dar resultados lo más iguales posibles cuando se realizan varias determinaciones sobre una misma prueba. Para determinar la precisión se emplean dos variantes: la reproductibilidad, que es la precisión de muestras idénticas cuando se procesan en días diferentes y la repetibilidad, que es la precisión de muestras idénticas cuando se procesan en serie en el mismo día. En el servicio de microbiología, el control mediante la reproductibilidad, puede verse afectado por la falta de homogenicidad al estar presente en una misma muestra más de una especie, así como la falta de estabilidad del microorganismo presente en la muestra debido la multiplicación o incremento de las muertes al no procesarse oportunamente. Para la realización de las pruebas de 244

reproductibilidad o repetibilidad se emplean muestras "a ciegas", cuyas características son conocidas por el jefe del laboratorio y que el técnico no puede diferenciar del resto de las muestras, procesándola como una muestra más. El informe final de ese resultado se compara con los datos conocidos que sirven de control y cuando se detectan resultados incorrectos se toman las medidas de adiestramiento necesarias. Las muestras empleadas para controlar precisión, pueden ser reales o artificiales. Las reales se estudian previamente y se determinan sus características pudiendo añadírsele diferentes sustancias o elementos. Por su parte las artificiales son muestras simuladas elaboradas con diferentes solventes, por ejemplo: agua destilada con ácido pícrico para simular una muestra de orina o solución salina fisiológica a la que se le añade una o dos gotas de suero sanguíneo y glucosa, para simular un líquido cefalorraquídeo. Las muestras artificiales más que un elemento de control de la calidad, constituye una forma de controlar la seriedad y responsabilidad del técnico.

Pruebas estadísticas Existen diversas pruebas estadísticas utilizadas en los estudios de precisión y por lo tanto muy ligadas al control de la calidad. Entre las más usuales se encuentran la prueba estadística "F" y la prueba estadística "T". La aplicación de estas pruebas es muy familiar para los estadísticos, pero no para el personal técnico de microbiología, que debe recurrir a personas experimentadas en el manejo de estas pruebas cuando resulte necesario. Prueba Estadística "F" Esta prueba es utilizada para comparar la precisión de dos métodos, el trabajo realizado por dos técnicos, etc. Prueba Estadística "T" Esta prueba es utilizada para comprobar si los resultados que se obtienen con un método son cuantitativamente superiores o inferiores en relación con otro o si un grupo de datos de una serie es mayor que los de otra.

PRINCIPALES FUENTES DE ERRORES Como ya se explicó, la génesis de los malos resultados de las investigaciones de laboratorio, tienen sus principales causas en los errores originados por deficiencias técnicas o humanas, debido al mal desempeño del personal de laboratorio. 245

1. Errores técnicos a) Deficientes condiciones constructivas o estructurales del laboratorio. b) Insuficiente disponibilidad de recursos materiales. c) Mal estado de los reactivos, medios de cultivo, colorantes y otros medios para el diagnóstico. d) Empleo de equipos e instrumentos obsoletos o con funcionamiento deficitario. 2. Errores humanos a) Deficiente capacitación en su formación. b) Poca experiencia técnico-laboral en la sección de trabajo donde se desempeña. c) Falta de habilidad para realizar con destreza y precisión los procederes de laboratorio. d) Violación arbitraria de las normas técnicas. e) Falta de concentración o premuras indebidas durante la realización de: exámenes microscópicos, la selección de colonias para las resiembras, la lectura de las pruebas diagnósticas, etc. f) Inadecuada selección de los medios y métodos empleados. g) Informar de manera incorrecta o incompleta los resultados en la orden de análisis.

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS Todos los laboratorios de microbiología deben disponer de un manual de normas y procedimientos donde se describan las secuencias y regulaciones establecidas para la realización de las diferentes investigaciones, tales como: los requisitos para la recolección y toma de las diferentes muestras, así como su conservación y transporte, la marcha analítica para su procedimiento, donde se especifica todo lo concerniente al examen microscópico, la selección de los medios de cultivo, las particularidades para la incubación de los cultivos, así como la notificación de los resultados. El manual establece además, las indicaciones esenciales para el buen funcionamiento del laboratorio, relacionadas con: a) b) c) d)

La limpieza y/o desinfección del lugar de trabajo. Las normas de higiene personal. Las áreas designadas para comer o fumar. Las medidas de seguridad para cada sección de trabajo. 246

e) La manipulación y eliminación de materiales infecciosos. f) El cumplimiento del esquema de inmunización acorde con la actividad que se realiza. g) El control y cuidado de los equipos e instrumentos.

REGULACIONES DEL CONTROL DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA Control de equipos e instrumentos Todos los equipos e instrumentos que sean asignados al laboratorio deben estar registrados en una carpeta de medios básicos, donde se especifique la marca, modelo, número de serie y la fecha de su adquisición. A cada equipo se le abrirá una tarjeta, donde se refleje los datos ya referidos y las fechas en que se les da mantenimiento, se dictamina su rotura o se repara. a) Equipos térmicos A todos los equipos termorregulados, como: incubadoras, baño de María y refrigeradores se le comprobará su buen funcionamiento diariamente, antes de comenzar su utilización, anotando los resultados en el registro, habilitado al efecto. En el caso del horno, el control se efectuará cada vez que el equipo se vaya a utilizar y en cuanto al autoclave, simultáneamente con la temperatura, se comprobará la presión a través de los manómetros y se colocarán junto con el material a esterilizar, cintas indicadoras o bioindicadores que cambian de color cuando la esterilización no ha resultado óptima. b) Balanzas analíticas y técnicas. Las balanzas se deben mantener limpias para que la suciedad no interfiera en la pesada, debiendo comprobar su exactitud con pesas certificadas. c) Potenciómetros (pHmetros) Antes de su utilización se debe ajustar con soluciones estándar de pH 4 o 7 de acuerdo a la utilización que se les vaya a dar.

Nota: En todos los casos se debe tener en cuenta la condición de apto para el uso de los equipos emitida por metrología.

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Control de medios de cultivo Tanto los medios deshidratados, como los ingredientes para su preparación o los medios que se adquieran ya listos para su uso, deben ser almacenados tan pronto se reciban en el laboratorio, para lo cual se anotará en la etiqueta la fecha de recepción, siendo colocados seguidamente en un lugar ventilado y protegido de la luz solar. Al extraer los frascos que serán utilizados, se tendrá en cuenta la fecha de vencimiento y el número de lote para ir utilizando los más viejos. Al realizar la apertura del frasco se anotará la fecha. Durante el tiempo que dure el almacenamiento, los frascos deben ser revisados periódicamente, procediendo a desechar los que se hallan ennegrecidos o hidratados. Cuando el almacenamiento se prolongue, es recomendable voltear los frascos y colocarlos con la tapa hacia abajo para aminorar los efectos de la hidratación. Para comprobar su funcionamiento se utilizará un 3 % del total de medios preparados en los que se sembrarán cepas controles certificadas salvajes, aisladas y debidamente identificadas en el laboratorio. Las cepas empleadas se suspenden hasta alcanzar una turbidez de 0,5 % de la escala de McFarland y se siembran pequeños inóculos calibrados en el medio, procediendo a su incubación de acuerdo a las cepas empleadas. Las cepas controles regularmente empleadas son de cocos grampositivos, Enterobacterias, haemophillus, Neisserias, Pseudomonas, Vibrios, Clostridium y Candidas albicans. Al concluir el período de incubación si se comprueba que el medio preparado permite el desarrollo óptimo de las diferentes cepas controles se considerará con buenas condiciones para su empleo.

Control de colorantes y reactivos Al igual que los medios de cultivo, en la etiqueta de los frascos de colorantes y reactivos se anota la fecha en que se reciben en el laboratorio y se utilizan atendiendo al número del lote y la fecha de vencimiento, debiendo almacenarse igualmente en lugares frescos y protegidos de la luz. Durante su almacenamiento se observan periódicamente y se procede a la eliminación de aquellos que esten precipitados. El control de los reactivos y los colorantes se debe realizar frecuentemente en dependencia de su estabilidad. Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno empleado en la prueba de catalada, el plasma congelado para la prueba de coagulasa, el tertrametil-parafenil endiamina al 1%, empleado para la prueba de oxidasa, el reactivo de Kovac empleado en la prueba de indol, etc, se enfrentan con cepas stock de características conocidas, cada día que se vayan a utilizar estas pruebas. Los colorantes de uso frecuente como los empleados para las coloraciones de Gram y Ziehl Neelsen, se prueban con cepas stock cuando se 248

preparan y posteriormente una vez por semana. Los colorantes de uso menos frecuente como los empleados para la coloración de cápsulas, esporas, etc, se prueban por igual método cada día que vayan a ser utilizados.

Control de discos para antibiograma Los discos para antibiograma, así como otros discos que se utilizan para la realización de diferentes pruebas diagnósticas como: optoquina, bacitracina,etc, se deben conservar en refrigeración (congelación) en los recipientes de fábrica provistos de material desecante. Su eficacia se debe comprobar con cepas controles conocidos con respecto a su sensibilidad o resistencia a los diferentes antibióticos. El control se realizará cuando se empiece a utilizar un nuevo lote de medios de cultivo. Con posteridad a estas comprobaciones el control se realizará una vez por semana, conjuntamente con los antibiogramas que se realicen ese día.

Control de antígenos y antisueros Para su conservación algunos antígenos y antisueros se almacenan en refrigeración de 2 a 8ºC, mientras que otros requieren congelación. En relación con estos últimos se recomienda dividir el suero en alicuotas para evitar repetidas congelaciones y descongelaciones que pueden afectar el resultado de las pruebas, no debiendo utilizarse después de la fecha de vencimiento. Para comprobar su efectividad se utilizarán cultivos puros recientemente obtenidos, de reactividad conocida. En cada prueba que se vaya a realizar se empleará en paralelo un suero testigo de reactividad conocida. Recomendándose además el empleo de sueros dobles. Cada lote que vaya a empezar a utilizarse debe comprobarse con sueros negativos y positivos.

Conservación de cepas para el control biológico Como se ha explicado, para la comprobación de la eficiencia de los medios de cultivo y colorantes, así como para el control del funcionamiento de los antígenos y los antisueros empleados en el laboratorio se requiere del empleo de cepas microbianas debidamente identificadas o certificadas que hayan sido conservadas sin sufrir ningún cambio genético o fisiológico. Para ello, los laboratorios deben disponer de una colección acorde con las investigaciones que realiza. 249

Métodos de conservación de cepas Cualquier método que se vaya a emplear debe propiciar microbiostasis, mediante la cual el agente microbiano se mantiene vivo sin crecer ni reproducirse, debido al enlentecimiento de su actividad metabólica. Los diferentes métodos empleados pueden proporcionar una conservación a corto o a largo plazo. Conservación a corto plazo Este método se sustenta en el empleo de medios de cultivo con bajo potencial nutricional y la conservación de los cultivos en refrigeración, con lo cual se logra mantener la cepa durante varios meses. 1. 2.

3.

La mayoría de los microorganismos aerobios se pueden conservar en cultivos sobre agar inclinado, conservado en refrigeración. Para la conservación de algunos microorganismos anaerobios se emplea la siembra por punción con aguja en medio agarinizado, en tubos de ensayo, pudiendo añadirse después de la siembra una capa de aceite mineral con lo cual se excluye al oxígeno al mismo tiempo que evita la desecación del medio, debiendo guardarse en refrigeración. Las especies anaerobias extrictas deben ser sembradas en medio de tioglicolato en tubos de ensayo o caldo con carne picada, conservándose igualmente en refrigeración.

Conservación a largo plazo Para conservar las cepas durante varios años, se emplea la liofilización, que consiste en un método de deshidratación con vacío a muestras congeladas. Procedimiento 1.

2. 3. 4.

Suspender el cultivo en suero inactivado o leche estéril, distribuyendo algunas en ámpulas de vidrio, procediendo de inmediato a su congelación. Los cultivos congelados en ámpulas son colocados en una liofilizadora para efectuar su desecación. Concluida la deshidratación, las ámpulas se sellan al vacío con la llama del mechero que forma parte de este equipo. Etiquetear el ámpula con el nombre de la especie. 250

El material queda dentro del ámpula en forma de una tableta pudiendo en este estado de desecación conservarse durante varios años. Cuando se requiera utilizar la cepa, se rompe asépticamente el ámpula depositando la cepa liofilizada en un medio líquido adecuado, procediendo a su incubación de 24 a 48 horas. Control externo Estará a cargo de un laboratorio de referencia de nivel municipal, provincial o nacional. Este control puede producirse en dos direcciones:

Del laboratorio de referencia al laboratorio que será evaluado Para realizar el control con esta variante, el laboratorio de referencia enviará muestras cifradas, cuyos resultados no son conocidos por el jefe del laboratorio que será evaluado, siendo introducidas "a ciegas" en la forma y explicada, y procesadas como si se trataran de muestras ordinarias. Los resultados obtenidos serán informados en encuestas que acompañan a las muestras que serán remitidas al laboratorio de referencia para su revisión, notificándose al laboratorio evaluado los resultados. Además de muestras pueden enviarse cultivos para determinar la sensibilidad o resistencia de la cepa a los diferentes antibióticos, o sueros para determinaciones serológicas de diferentes tipos.

Del laboratorio de la unidad al laboratorio de referencia Se remitirá al laboratorio de referencia un porciento establecido de: frotis coloreados y muestras, para estudio por examen directo, examen concentrado y serológico, así como de cepas que serán sometidas a estudios de comprobación del diagnóstico emitido por la unidad. Los frotis, muestras y cepas predeterminadas para este control son los siguientes: Frotis coloreados a- Frotis de esputo coloreado por el método de Ziehl Neelsen para investigar la presencia de BAAR. - Envío en menos de 72 horas de todas las láminas con diagnóstico negativo para evaluación de la extensión y la coloración 251

Frotis de exudados uretales y endocervicales para investigar la presencia de diplococos arriñonados (intra y extracelulares) - Enviar el 100% de los frotis con diagnóstico positivo. - Enviar un 5% de los frotis con diagnóstico negativo. Muestras - Heces fecales Enviar: El 5 % de las muestras donde se hayan identificado especies de protozoarios. - El 10 % de las muestras donde he hayan identificado huevos o larvas de helmintos. - El 25 % de las muestras con diagnóstico negativo. -

Suero o L.C.R. Enviar el 100 % de las muestras reactivas y débil reactiva empleadas para la prueba de VDRL. Enviar el 2 % de las muestras no reactivas. Cepas Envío del 100% de las cepas recuperadas en los casos de Síndrome Neurológico Infeccioso y de Infecciones Diarreicas Agudas.

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CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

¿Cuáles son las principales causas de la falta de calidad en los diagnósticos de laboratorio? ¿Cuáles son los objetivos del control para la garantí de la calidad? Enumere los indicadores del control interno. ¿Cómo se controla la precisión de los resultados? ¿Cuáles son las principales fuentes de error? ¿Cuáles son los principales aspectos en cada una de las fuentes de errores? ¿Qué aspectos se describen en el manual de normas y procedimientos? ¿Cómo se controlan los equipos e instrumentos? ¿Qué aspectos han de tenerse en cuenta para el control de los medios de cultivo? Explique cómo se controla el estado de los colorantes y los reactivos. ¿Cómo se deben conservar los discos impregnados en antibióticos? Refiérase a la manera de controlar los antígenos y los antisueros. ¿De cuantas maneras diferentes se puede efectuar el control externo? ¿Cuáles son las muestras que deben remitirse al laboratorio de referencia para su control y con qué periodicidad?

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

13. 14. 15.

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