glucogeno PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 15

PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 15 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO OBJETIVO Determinar y cuantificar los niveles de glucógeno hepático de los pollos durante los estados de ayuno y con dieta balanceada (normal). MARCO TEORICO

El glucógeno es la forma principal de almacenaje de carbohidratos en los animales, se encuentra en proporción mayor en el hígado (hasta 6%) y en el músculo, donde rara vez excede de 1%. Sin embargo, debido a su masa mayor, el músculo almacena tres a cuatro veces la cantidad de glucógeno que tiene el hígado como reserva. Al igual que el almidón, es un polímero ramificado de alfaglucosa . el glucógeno es un polisacárido de la D-glucosa con enlaces alfa 1-4, sin embargo, está más ramificado, y su molécula es más reducida que la amilopectina; las ramificaciones aparecen cada 8 a 12 residuos de glucosa. El glucógeno puede aislarse de los tejidos animales digiriéndolos con disoluciones calientes de KOH en las que los enlaces no reductores alfa 1-4 y alfa 1-6 son estables. (5) El peso molecular del glucógeno varia ampliamente según el grado de ramificación, y el tamaño global. En promedio se encuentra entre 2 y 5 millones. FUNDAMENTO El tejido hepático en presencia de una hidrólisis alcalina destruye a las proteínas y el glucógeno queda intacto. El glucógeno es precipitado por su baja solubilidad con el alcohol, luego se resuspende el glucógeno y se cuantifica expresado en mg de glucosa por gramo de tejido hepático (previa hidrólisis ácida con ácido sulfúrico). El Ácido Sulfúrico del reactivo Antrona hidroliza al glucógeno en unidades de glucosa, la cual es convertida en hidroximetil furfural por el mismo ácido y reacciona con antrona para dar un compuesto coloreado.

Reactivo de antrona en acido sulfúrico

MATERIALES  Tubos de ensayo, pipetas, centrifuga, fotocolorímetro Hígado de dos pollos(uno de pollo con alimentación normal y otro sometido a ayuno durante 24 horas) Solución de hidróxido de Potasio (KOH) 30% Alcohol Etílico (CH3CH2 OH) 95 % Estandar de Glucosa 5 mg /100mL Reactivo Antrona 0.2% en Ácido Sulfúrico (H2SO4 ) concentrado

PROCEDIMIENTO Se toman dos pollos, uno en ayunas y otro en estado normal de alimentación. Se les sacrifica, y se le extrae el hígado rápidamente y se coloca en baño de hielo. Separar y pesar 0.5 a 1.0 g de cada hígado picar finamente, trasvasar a un homogenizador con 4 mL de solución de hidróxido de potasio al 30%, y llevar a Baño de agua hirviente hasta hidrólisis de los tejidos durante 30 minutos Enfriar a chorro de agua fría y agregar 7 mL de etanol absoluto refrigerado para precipitar Centrifugar a 3,000 r.p.m. por 10 minutos Decantar el sobrenadante y disolver el residuo (glucógeno) con 100 ml de agua destilada

Un pollo en ayunas y un pollo comido

   Disponer 6 tubos de ensayo y proceder de acuerdo al siguiente cuadro 1 blanco 2 ayunas 3 alimenta 4 estándar Glucógeno ais (ml) 0.50 0.50 Patrón de glucosa (ml) 0.50 Agua destilada (ml) 2.00 1.50 1.50 1.50 Rect, antrona (ml) 4.00 4.00 4.00 4.00

5 estándar

6 estándar

1.00 1.50 4.00

1.50 1.50 4.00

El reactivo de antrona debe añadirse rápidamente, de tal manera que el chorro caiga en el centro del tubo. Mezclar rápidamente, colocar los tubos en baño de agua hirviendo durante 10 minutos, enfriar y Leer la absorbancia a 620 nm en el fotocolorímetro. Realizar los cálculos correspondientes.

Calculos. Determínanos las concentraciones de glucosa en los tubos estándar Sabemos que un decilitro es 1dl= 100ml

5mg existen →100ml Entonces

X →0.5ml

X=0.025mg de glucosa el estándar 4 5mg existen →100ml Entonces

X →1.0ml

X=0.050mg de glucosa el estándar 5 5mg existen →100ml Entonces

X →1.5ml

X=0.075mg de glucosa el estándar 6 Leer la absorbancia a 620 nm en el fotocolorímetro

Tubos de muestra

absorvancias

Pollo en ayunas

0.2514

Pollo que comió

0.2696

Estándar 4

0.3630

Estándar 5

0.3740

Estándar 6

0.3999

Sabemos que se usara el estándar 4 porque contiene la misma concentración que el tubo de los pollos en estudio Glucosa mg/dl = Abs. Desconocido * 5mg/dl Abs. Estándar

g = P*F seria

=0.4485*5.0mg/dl = 0.4440

:101mg/dl

contraciones absorbancia 0,03462 0,2514 0,03713 0,2696 0,025 0,363 0,05 0,374 0,075 0,3999

Absorbancias Vs concentraciones de glucosa mg/ml 0.405 0.4 0.395 0.39 0.385 Series1

0.38

Linear (Series1)

0.375 0.37 0.365

y = 0.738x + 0.3421

0.36 0.355 0

0.02

0.04

0.06

0.08

CUESTIONARIO 1. Calcule de la concentración de glucógeno en cada uno de las experiencias (hígado del pollo con alimentación normal y en ayunas) y expréselos en mg de glucosa / g de tejido hepático.

2. Compárelos los valores obtenidos con los valores normales que indica en la referencia (Indique: el título, autor, edición, capítulo y página). 3. Mediante que reacción química se puede diferenciar el almidón de glucógeno. Escriba las estructuras química del almidón y del glucógeno. 4. Que función cumple el glucógeno en el organismo 5. KOH 30% en la experiencia.