Ghid Practic de Parazitologie

Asociaţia pentru Calitate în Laboratoare (CALILAB)

GHID PRACTIC DE PARAZITOLOGIE MEDICALĂ

Autori Mihăilescu Patricia Elena Popa Constanţa

Copyright 2015 @ CALILAB - București Toate drepturile rezervate

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Cuprins Capitolul 1 Organizarea compartimentului de microbiologie – parazitologie Cerinţe legale de funcţionare a laboratorului de analize medicale Spaţiul şi condiţiile de mediu necesare funcţionării compartimentului de microbiologie parazitologie Dotarea cu echipamente necesare funcţionării compartimentului de microbiologie - parazitologie Lista serviciilor medicale - compartimentul de microbiologie - parazitologie

Capitolul 2 Examenul coproparazitologic şi diagnosticul unor paraziţi cu semnificaţie clinică la om Diagnosticul giardiozei .................................................................16 Diagnosticul toxoplasmozei .........................................................19 Diagnosticul ascaridiozei .............................................................31 Diagnosticul enterobiazei .............................................................33 Diagnosticul stongiloidozei ..........................................................36 Diagnosticul toxocarozei ..............................................................40 Diagnosticul hidatidozei ...............................................................43 Diagnosticul teniazelor .................................................................48 Diagnosticul himenolepidozei ......................................................53 Diagnosticul botriocefalozei .........................................................58 Diagnosticul leishmaniozei ..........................................................66 Diagnosticul malariei ...................................................................66 Artefacte .......................................................................................83

2

Ghid practic de Parazitologie Medicală Capitolul 3

Managementul calităţii Controlul intern de calitate în compartimentul de microbiologie - parazitologie Controlul intern de calitate în compartimentul de microbiologie - parazitologie Bibilografie

3

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Cerinţe legale de funcţionare a laboratorului de analize medicale

Compartimentul de microbiologie face parte din structura funcţională a laboratorului de analize medicale . În cadrul compartimentului de microbiologie funcţionează parazitologia alături de bacteriologie, virusologie şi micologie conform Ordinului nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007, art . 3 . Serviciile compartimentului de microbiologie - parazitologie ca parte a laboratorului de analize medicale constau în: „- examinarea materialelor provenite din corpul uman prin diverse metode şi tehnici cu scopul de a furniza informaţii pentru diagnosticul, tratamentul şi prevenirea bolilor sau pentru evaluarea stării de sănătate a populaţiei; - consultanţă privind interpretarea rezultatelor investigaţiilor efectuate şi ale eventualelor investigaţii ulterioare necesare.”

Spaţiul şi condiţiile de mediu necesare funcţionării compartimentului de parazitologie în cadrul laboratorului de analize medicale

microbiologie -

Conform art. 11, alin. 3), SECŢIUNEA a 6-a, OMS 1301 din 2007 spaţiul şi condiţiile de mediu necesare funcţionării compartimentului de microbiologie - parazitologie în cadrul laboratorului de analize medicale sunt : „încăpere în care pot coexista bacteriologia, virusologia şi parazitologia” ; “pentru laboratoarele de analize medicale cu compartiment de microbiologie, spaţiu destinat sterilizării, care trebuie să conţină minimum o autoclavă. Se recomandă utilizarea a două autoclave situate în încăperi diferite, una destinată sterilizării materialelor infectate şi alta destinată sterilizării produselor şi materialelor curate care urmează a fi utilizate sterile. Când există o singură autoclavă, aceasta se va utiliza în cicluri alternative, fără a se amesteca materialele infectate cu cele destinate a fi utilizate sterile;” Dotarea cu echipamente necesare funcţionării compartimentului de parazitologie

microbiologie -

Dotarea cu echipamente necesare funcţionării compartimentului compartimentului de microbiologie parazitologie este stipulată în art. 12 şi 13 SECŢIUNEA a 6-a, OMS 1301 din 2007 : ”Laboratoarele de analize medicale care au în structură compartimente de bacteriologie, micologie, parazitologie, virusologie, diagnostic molecular trebuie să aibă în dotare, în mod obligatoriu, hotă de siguranţă biologică de clasă corespunzătoare grupului de risc microbiologic din care fac parte microorganismele manipulate, încadrate conform Ghidului naţional de biosiguranţă pentru laboratoare medicale.

4

Ghid practic de Parazitologie Medicală (8) Laboratorul de analize medicale cu compartimente de bacteriologie, micologie, virusologie şi parazitologie trebuie să dispună de instalaţii de alimentare cu gaz.”

SECŢIUNEA a 7-a OMS 1301 din 2007 descrie dotarea laboratorului de analize medicale pe compartimente de activitate; dotarea compartimentului de mecrobiologie – parazitologie este descrisă la anexa 4 lit C. ”(3) Dotarea minimă obligatorie cu echipamente, necesară autorizării de funcţionare a laborator de analize medicale, este prevăzută în anexele nr. 3 şi 4. C. Microbiologie: 1. Hotă de siguranţă biologică 2. Lampă UV 3. Balanţă 4. Termostat (cu temperatură reglabilă) 5. Microscop binocular 6. Lupă de laborator 7. Frigider 8. Congelator (prevăzut cu încuietoare) 9. Baie de apă cu temperatură reglabilă 10. pH-metru sau indicator pH 11. Bec de gaz 12. Etuvă 13. Autoclavă 14. Anse bacteriologice 15. Pipete automate 16. Termometre 17. Instalaţie de apă purificată*) 18. Sistem de etalonare a inoculului pentru antibiogramă.” Lista serviciilor medicale În OMS 1301 din 2007 , secţiunea a 4-a, Servicii medicale efectuate în cadrul laboratorului de analize medicale , art. 7 se precizează că: ”(1) În cadrul laboratorului de analize medicale se pot efectua analize de parazitologie, se poate acorda consultanţă privind interpretarea rezultatelor investigaţiilor efectuate şi ale eventualelor investigaţii ulterioare necesare. (3) Laboratorul de analize medicale întocmeşte, menţine actualizată şi afişează lista serviciilor medicale pe care le efectuează.” Lista serviciilor medicale pe care le efectuează laboratorul de analize medicale în cadrul compartimentului de microbiologie parazitologie constau în:

5

Ghid practic de Parazitologie Medicală -

informaţii pentru diagnosticul şi tratamentul bolilor - identificarea paraziţilor cu semnificaţie clinică la om : Giardia intestinalis, Taenia spp. Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Enterobius vermicularis, Entameoba coli, Entameoba histolytica, Balstocystis hominis, Trichuris trichiura şi alţii; - consultanţă privind interpretarea rezultatelor investigaţiilor efectuate şi ale eventualelor investigaţii ulterioare necesare.”

Capitolul 2 Examenul coproparazitologic Reprezintă examinarea materiilor fecale pentru identificarea diferitelor specii de paraziți: chiști de protozoare, trofoziti, ouă de helminti, larve mobile. Examenul coproparazitologic este recomandat în următoarele situații: - tulburări intestinale : greată, vomă, eructații, lipsa poftei de mâncare, diaree (cu sau fără sânge), constipație, tulburări de tranzit; - iritabilitate, insomnie, cefalee, amețeala, crize convulsive și alergice, prurit în zona anală, nazală; - simptome generale: astenie, stagnare pondero-staturală la copii , subfebrilitate, scădere ponderală uneori marcată la adulți; Intensitatea simptomelor depinde de gradul de infestare și de statusul imunologic al pacienților. La pacienții cu un sistem imunitar competent fiind posibil ca simptomele să lipsească (pacienți asimptomatici). Pentru un diagnostic corect este foarte importantă dubla examinare a probei de materii fecale: macroscopică și microscopică. Examenul macroscopic oferă date despre aspectul, consistența, culoarea bolului fecal precum și a fragmentelor de paraziți sau chiar a indivizilor întregi (Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, proglote de Taenia spp.), date importante în anamneza pacientului. Dupa consistență materiile fecale pot fi: formate , cu mucus și lichide. Examenul microscopic furnizează date despre prezența chiștilor de protozoare, a trofozoiților, a ouălor de helminți , larvelor mobile precum și a helminților. Colorațiile permanente sunt utilizate pentru identificarea chiștilor de protozoare și a trofozoiților.

Materiale necesare:  Coprorecoltoare cu spatulă . Coprorecoltoarele nu trebuie sa conțină mediu de transport (Carry Blair).  Lame de microscop (de preferință cu margine mată) pentru a permite identificarea probei.

6

Ghid practic de Parazitologie Medicală     

Lamele microscop 24/24 mm Soluție de ser fiziologic Soluție Lugol Microscop standard cu obiective de 2,5x, 10x,40x Lupa binoculară cu o magnificație de cel puțin 4x, 8x pentru analizarea elementelor parazitare de dimensiuni mai mari (proglote de Taenia spp, extremități Ascaris, indivizi de Enterobius vermicularis, Ixodes spp.etc)

Recoltarea corectă a probei se face colectând câte un fragment de materii fecale (o spatulă) din trei locuri diferite ale bolului fecal. Proba trebuie transportată la laborator pentru examinare în cel mai scurt timp. În cazul în care acest lucru nu este posibil, proba trebuie stocată la 2-8 grade C. Pregătirea lamei pentru examinare: - Identificarea probei respectiv a lamei pe care va fi pregătit preparatul

-

Pregătirea materialelor necesare în funcție de suspiciune

Efectuarea preparatului: - se pune pe lamă o picătura de ser fiziologic/Lugol. Dacă este suspectată prezența trofozoiților, serul fiziologic trebuie încălzit la 37oC. - proba de materii fecale se omogenizează bine cu o spatulă - Cu spatula se adaugă o cantitate mică de materii fecale în picătura de ser fiziologic/Lugol și se amestecă foarte bine în așa fel încât preparatul să nu conțină fragmente alimentare și să fie de o transparență care să permită citirea scrisului prin el. - Probele prea dense nu permit o examinare corectă, deoarece fragmentele parazitare pot fi estompate de masa de debri-uri nedigerate. - Probele care nu au consistența corespunzătoare iar densitatea paraziților este mică pot duce la un rezultat fals negativ.

7

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Examinarea preparatului: - Se face la microscop (standard) utilizănd obiectivele de 10x, 40x - Citirea lamei se face în pieptene pe orizontală și apoi pe verticală utilizându-se inițial obiectivul de 10x în așa fel încât toată suprafața lamei sa fie examinată. În cazul în care este identificat un element posibil parazitar se comută pe obiectivul de 40x și se reglează și intensitatea luminii pentru a putea fi observate detaliile de structura. Rezultatul: - Rezultatul se comunică sub forma fie POZITIV/NEGATIV fie PREZENT/ABSENT cu mențiuni asupra speciei și a frecvenței elementului parazitar identificat. Metode de concentrare Sunt reacții care sunt utilizate pentru a crește acuratețea diagnosticului parazitar, deoarece utilizând metodele de concentrare sunt puse în evidența cantități mici de elemente parazitare. Pentru diferitele grupe de paraziți intestinali sunt utilizate metode de concentrare variate în funcție de caracteristicile biochimice și ale ciclului biologic ale speciei respective. Metoda flotării în soluție suprasaturată salină (Willis – Hung) Se prepară o soluție suprasaturată de clorura de sodiu. Se introduce soluția în recipiente individuale (cristalizoare) cu diametrul mai mare decât diagonala unei lamele. În aceste recipiente se adaugă o cantitate (1-2g) de materii fecale, se omogenizează. Pe suprafața de lichid se pune o lamela care este lăsată să plutească complet orizontală, timp de 40 de minute. După expirarea timpului cu ajutorul unei pense lamela este transferată (menținându-se poziția orizontală) pe o lamă de microscop și examinată corespunzător (obiectiv de 10x și 40x pentru detalii). Prin aceasta metodă sunt evidențiate ouăle de helminți (Ascaris, Taenia, Trichuris, Diphyllobotrium, etc.) Metoda formol eter Adăugați în 10 ml formol 10% aproximativ 1g de materii fecale și amestecați până obtineți o suspenșie relativ omogenă. Se instalează un filtru pe un tub de centrifugă (de 12 ml) și se filtrează conținutul eprubetei cu suspensia obținută anterior până este atinsă gradația de 7 ml. Indepărtați filtrul și aruncați conținutul lui în containerul de deșeuri cu risc biologic. Adăugati 3 ml de eter sau eter-acetat și amestecați bine timp de un minut. Transferați conținutul într-un tub de centrifugă și centrifugați 1 minut la 3000 r/min. Eprubeta ar trebui să arate ca în figura următoare.

8

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Metoda Baerman Utilizați o cantitate de materii fecale 10-20g de o consistență semi-formată, nu mai vechi de 24 de ore. Introduce-ți o pâlnie tapetată cu hârtie de filtru într-un recipient stabil. Umpleți pâlnia cu apă distilată incălzită la aprox.370C până aproape de limita superioară. Introduceți materiile fecale în două straturi de tifon (10x10 cm). Sigilați preparatul cu două baghete de lemn introduse prin colțurile tifonului și suspendați-l în lichidul din pâlnie susținându-se pe cele două baghete. Lăsați preparatul la 37oC (în incubator) timp de o oră sau peste noapte la temperatura camerei. După expirarea timpului , indepărtati tifonul și scurgeți lichidul obținut păstrând sedimentul. Mențineți recipientul în repaus pentru încă 15 minute. Utilizați o pipeta Pasteur pentru a transfera porțiunea inferioară a sedimentului într-o cutie Petri. Examinați sedimentul utilizând o lupă binoculară. Metoda este folosită pentru identificarea larvelor de Strongyloides stercoralis. Cultura pe agar Ca o alternativă a metodei Baerman în ceea ce privește diagnosticul strongiloidozei este și cultivarea materiilor fecale pe plăci cu agar simplu. Materiile fecale sunt dispersate într-o zonă circulară pe placa de agar (aproximativ 2-3 cm diametrul) și placa este stocată la temperatura camerei ferită de lumina 48 ore. După 48 de ore este examinată pentru a observa prezența sau absența traiectelor sinusoidale efectuate de larvele de Strongyloides stercoralis. Metoda Ritchie Diluați un volum de materii fecale cu 10 volume de reactiv Ritchie (100 ml formol, 9g NaCl, 900 ml AD) . Amestecați și lăsați la sedimentat câteva secunde. Transferați produsul obținut într-un tub de centrifugă și adaugați eterul: 1/3 eter și 2/3 amestec (pregătit anterior).

9

Ghid practic de Parazitologie Medicală Acoperiți și amestecați prin inversare timp de 30 secunde.Centrifugați 2 minute la 1500r/min. Eliminați supernatantul prin răsturnare (mișcarea trebuie să fie rapidă). Examinați sedimentul la microscop. Metoda este utilizată pentru creșterea sensibilității examenului coproparazitologic și este folosită pentru identificarea formelor chistice și a ouălor. Formele vegetative nu pot fi puse în evidență prin această concentrare, iar ouăle de Ascaris sunt distruse prin acest procedeu. Reacția imunoenzimatică (ELISA) Metoda sandwich – suport solid (godeul) tapetat cu antigen specific (antigen coated microplate well) peste care sunt adăugați anticorpii de analizat (specific human antibody) și în ultima etapă anticorpii marcați (POD labelled anti-human antibody).

Conjugatul (anticorpii marcati - POD) este reprezentat de o fracție de imunoglobulină umană de tip IgG conjugată cu peroxidaza. Răspunsul pozitiv este indicat de prezența culorii albastre (data de cromogen), care se transformă în galben la adăugarea soluției de stopare. Intensitatea culorii galbene este masurată la spectrofotometru cu o lungime de undă de 450 nm (sau diferiți în funcție de producător) și este proporțională cu concentrația anticorpilor specifici IgG.

Microplate wells 10

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Schematic o reacție imunoenzimatică se prezintă astfel:

11

Ghid practic de Parazitologie Medicală Reacția imunoenzimatică ELISA este utilizată drept metodă de screening în diagnosticarea unor afecțiuni parazitare ca: amoebiaza (anticorpi de Entamoeba histolytica, antigen de Entamoeba histolytica), giardioza (antigen de Giardia duodenalis), toxocaroza viscerală, echinococoza hidatică/alveolară , trichineloza, cisticercoza, toxoplasmoza, strongiloidoza, leishmanioza. Reacția de confirmare specifică Western Blot Western blot este o metoda de laborator utilizată pentru identificare unor proteine specifice dintr-un amestec de proteine. Acestea sunt separate electroforetic și fixate pe o membrană nitrocelulozică (faza solidă). Faza solidă este reprezentată de membrana de nitroceluloză care conține extracte antigenice separate electroforetic . Poziția proteinelor depinde de greutatea lor moleculară. Dacă proba este pozitivă, anticorpii specifici din serul/LCR/umoarea apoasă a pacientului aderă la antigenul specific de pe membrană.

În a doua etapă (incubare) anticorpii atașați reacționează cu AP-marcati. În a treia etapă conplexele marcate sunt cuplate cu cromogenul (soluția de substrat) astfel generându-se o reacție de culoare. Dacă serul de analizat conține anticorpi specifici atunci apare o linie neagră intens colorată în poziția corespunzătoare antigenului respectiv. Evaluarea tiparelor de benzi pe strip-ul incubat implică diferențierea dintre anticorpii specifici și nespecifici. Numărul și intensitatea benzilor este decisivă pentru stabilirea răspunsului POZITIV/NEGATIV.

12

Ghid practic de Parazitologie Medicală Reprezentarea schematică a reacției western blot:

Metoda western blot este utilizată ca reacție de confirmare pentru următoarele parazitoze: Parazitoza Echinococoza hidatică Echinococoza alveolară Toxocaroza viscerală Toxocaroza oculară Toxocaroza cerebrală Toxoplasmoza ganglionară Toxoplasmoza oculară Toxoplasmoza cerebrală Trichineloza Cisticercoza Leishmanioza Fascioloza

Produsul utilizat ser/LCR ser ser umoare apoasă LCR ser umoare apoasă LCR ser ser/LCR ser ser

13

Ghid practic de Parazitologie Medicală Polymerase Chain Reaction (PCR) Reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare). Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare ADN in vivo, îl reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacţie este o ADN polimerază ADN-dependentă (cu funcţie de replicază).

(1) Denaturare la 94–96 °C. (2) Răcire la ~65 °C (3) Elongare la 72 °C. Linia albastră Reprezintă matrița ADN la care primerii (sagetile roșii) se atașeaza și lanțul se extinde cu ajutorul AND polimerazei (cercurile verde deschis) pentru a produce fragmente scurte de ADN (liniile verzi), care sunt folosite ca matrițe în procesul de PCR. Principalele componente ale reacţiei sunt : ADN matriţă, o ADN polimerază termostabilă, primeri ++ oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfați (dNTP), tamponul de reacţie, ioni de Mg . O reacţie PCR este formată din n cicluri (între 25 şi 40), în fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape principale: denaturarea termică a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN), ataşarea primerilor şi polimerizarea propriu-zisă. La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultată este dublă faţă de matriţă. Mai mult, produsele rezultate într-un ciclu sunt folosite ca matriţă în ciclul urmator, astfel încât 14

Ghid practic de Parazitologie Medicală n

numărul final de copii ADN este de 2 x y, unde y = numărul iniţial de copii, iar n = numărul de cicluri de replicare. Este de subliniat faptul că moleculele acumulate exponenţial reprezintă copii ale matriţei care la capete au incorporaţi primerii. În concluzie, reacţia PCR este o metodă prin care se obţin cantităţi mari dintr-o anumită secvenţă ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fără a fi necesară o prealabilă clonare moleculară a acestora. Reacția PCR este utilizată în diagnosticul următoarelor parazitoze: Parazitoza Produsul utilizat Toxoplasmoză oculară umoare apoasă Toxoplasmoză cerebrală LCR Toxoplasmoză congenitală lichid amniotic Giardioza Materii fecale Amoebiază (Entamoeba histolytica) Materii fecale Malaria sânge

15

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Diagnosticul giardiozei

Clasificare: Protista, Phylum Sarcomastigophora, Clasa Zoomastigophora, Ordinul Diplomonada, Familia Hexamitidae, Genul Giardia, Specia Giardia lamblia Ciclul biologic

Chisturile, forma de rezistență ale parazitului, sunt responsabile cu transmiterea acestuia. În materiile fecale pot fi găsite ambele forme (stadii de diagnostic) . Chisturile sunt rezistente și pot supraviețui în apa rece mai multe luni. Infecția are loc prin ingerarea chisturilor odată cu apa/hrană contaminate sau prin infestare fecal-orală .În intestinul subțire are loc dechistarea și eliberarea trofozoiților (fiecare chist

16

Ghid practic de Parazitologie Medicală produce 2 trofozoiți) .Trofozoiții se multiplică prin diviziune binară longitudinală ramânând în lumenul proximal al intestinului subțire unde se află în stare liberă sau atașați de mucoasă prin discul adeziv (ventuza) ventrală .Închistarea apare în momentul trecerii parazitului în colon. Chistul este stadiul cel mai întâlnit în scaunele nediareice . Contaminarea directă de la om la om este posibilă și foarte probabilă deoarece chisturile sunt infectante în momentul eliminării prin fecale. Stadiul de diagnostic: chistul, mai rar trofozoitul. Perioada de timp de la ingerare până la diagnostic: câteva ore. Diagnostic: 1. Examen corpoparazitologic direct: chisturile de Giardia sunt identificate într-un preparat de materii fecale + ser fiziologic utilizând un microscop cu obiective de 10x, respectiv 40x – pentru detalii. 2. Examenul coproparazitologic cu Lugol : evidențiază mai bine chisturile de Giardia , permițând o identificare mai facilă a acestora, datorită faptului că în prezența Lugolului membrana chistului devine mai refringentă. Dezavantajul acestor două tehnici este ca dacă infestarea este foarte redusă sau chisturile sunt parțial deteriorate, acestea pot fi ratate. De asemenea, știut este faptul, că paraziții se elimină cu intermitență, având perioade negative alternând cu unele pozitive. De aceea un singur rezultat negativ nu prezintă semnificație din punct de vedere diagnostic. Examenul este recomandat să fie repetat (de minimum 3 ori) la intervale de aproximativ 7-10 zile între examinări. 3. Reacția imunocromatografică: prin această metodă este pus în evidență prezența/absența antigenului de Giardia lamblia. Reacția prezintă avantajul că detectează chiar și urmele de antigen de Giardia, iar dacă infestația este redusă, sau chisturile distruse prezența antigenului poate fi detectată. Rezultatul este raportat drept PREZENTE/ABSENTE antigene de Giardia duodenalis.

Coproantigen de Giardia duodenalis-pozitiv 4. Reacția imunoenzimatică: identificarea antigenelor de Giardia lamblia utilizând o metoda imunoenzimatică (ELISA). Reacția are o sensibiltate și specificitate ridicată și are avantaje nete față de examenul direct. Dezavantajele metodei sunt costul probei și procedura de lucru elaborată. Reacția este semicantitativă și cuantifică nivelul de antigen de Giardia existent în materiile fecale.

17

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Chist de Giardia duodenalis

PCR - biologia moleculară oferă poșibilități de identificare extrem de precisă a diferitelor genotipuri identificate pâna în prezent . Giardia duodenalis care infectează pacienții umani s-a dovedit a avea 7 genotipuri (A –G). Dintre genotipurile cele mai frecvent intâlnite în infecțiile umane sunt A și/sau B. Acestea sunt detectate prin PCR din materiile fecale.

18

Ghid practic de Parazitologie Medicală

Diagnosticul toxoplasmozei Clasificare: Phylum Apicomplexa, Clasa Conoidașida, Subclasa Coccidiașina, Ordinul Eucoccidiorida, Familia Sarcocystidae, Subfamilia Toxoplasmatinae, Genul Toxoplasma, Specia Toxoplasma gondii. Ciclul biologic:

Membrii familiei Felidae (pisicile domestice și rudele lor) sunt singurele gazde definitive pentru Toxoplasma gondii. Oochiștii nesporulați sunt eliminați în fecalele pisicii . Oochiștii sunt eliminați în număr mare aproximativ 1-2 săptămâni. Oochiștii au nevoie de 1-5 zile în mediul extern pentru a sporula și a deveni infectanți. Gazdele intermediare în natura (inclusiv pasări și rozătoare) sunt infectate prin prin ingerarea solului, a plantelor sau a apei contaminate cu oochiști .Oochiștii se transformă în tachizoiți imediat dupa ingestie. Acești tachizoiți se localizează în țesutul nervos și în cel muscular transformându-se în chist tisular (bradizoit) Pisicile se infectează prin consumul gazdelor intermediare contaminate cu chisturi tisulare . Pisicile se mai pot infecta și prin ingestia oochiștilor sporulați. Animalele crescute

19

Ghid practic de Parazitologie Medicală pentru consumul uman și cele din sălbaticie pot deveni infectate cu chisturi tisulare după ingerarea oochiștilor sporulați din mediu .Omul se poate infecta prin una din modalitățile următoare:  Consumând carne insuficient preparată termic contaminată cu chisturi tisulare .  Consumând apa sau hrana contaminată cu fecale respectiv cu probe din mediu înconjurător contaminate (sol contaminat cu fecale, sau schimbând nisipul din lădița pisicii) ;  Transfuzii de sânge sau transplant de organe ;  Transplacentar de la mama la făt ; În gazda umană parazitul formează chisturi tisulare, cele mai frecvente în mușchii scheletici, miocard, creier și ochi: aceste chisturi pot persista toată viață gazdei. Diagnosticul se pune în special prin serologie; deși chisturile tisulare pot fi observate și în produsele patologice examinate la biopsie . Diagnosticul toxoplasmozei congenitale se pune prin identificarea ADN-ului de Toxoplasma gondii în lichidul amniotic folosind metode de biologie moleculară (PCR) . Diagnosticul de certitudine al toxoplasmozei este extrem de dificil de realizat mai ales în ceea privește interpretarea lui. Fenomenul este explicat prin prezența unui mare număr de pacienți asimptomatici (persoane sănătoase, dar cu o serologie pozitivă). Infecția dobândită cu Toxoplasma gondii la o persoana imunocompetentă este în general asimptomatică. În orice caz, 10-20% dintre pacienții cu o infecție acută pot dezvolta o limfadenopatie cervicală și/sau simptome similare gripei. Cursul bolii este de obicei benign și autolimitativ. Simptomele dispar, de obicei în decurs de câteva săptămâni până la câteva luni. În situații rare, poate apărea și afectarea oculară soldată chiar cu pierderea vederii. Pacienții imunodeprimați au destul de des afectare cerebrală (la nivelul sistemului nervos central), retinocoroidite, pneumonii sau alte boli de sistem. La pacienții cu SIDA, encefalita toxoplasmică este cauza majoră a leziunilor cerebrale masive, cauzate prin reactivarea infecțiilor cronice. Toxoplasmoza congenitală este derivată dintr-o infecție acută (primară) dobandită de către mamă în decursul sarcinii. Incidența și gravitatea toxoplasmozei congenitale depinde de trimestrul sarcinii în care a avut loc infecția. Durata și momentul începerii tratamentului mamei sunt foarte importante deoarece contribuie la reducerea sechelelor la nou născut. Sunt mulți copii nou născuți care la naștere nu prezintă semne clinice, dar în timp pot dezvolta simptome ale toxoplasmozei congenitale. Toxoplasmoza oculară, este una din cauzele importante ale retinocoroiditelor și poate fi rezultatul unei infecții congenitale sau a unei infecții survenite dupa naștere. În infecțiile congenitale, pacienții sunt asimptomatici până în a II-a sau a III-a decadă a vieții când pot dezvoltă leziunile în ochi. Diagnosticul de laborator implică un diagnostic direct și unul indirect: Diagnosticul direct : -

20

observarea parazitului în probele recoltate (lavaj bronhoalveolar de la pacienții imunodeprimați sau biopsie ganglionară). Izolarea parazitului din sânge sau alte fluide prin inocularea intraperitoneala la șoareci sau culturi celulare. Șoarecii trebuie testați pentru prezenta Toxoplasma gondii în fluidul peritoneal la 6-10 zile postinoculare; dacă nu sunt găsite organismele se testează șoarecele serologic la 4-6 săptămâni post inoculare. Oochiștii sunt eliminati numai în fecalele felidelor domestice și/sau sălbatice.

Ghid practic de Parazitologie Medicală -

Tachizoiții (trofozoiții) au aprox. 4-8µm lungime și 2-3µm lățime, cu capătul anterior turtit și cel posterior turtit (“blunt”) , cu un nucleu mare. Pot fi gasiți în localizări multiple în corpul gazdei. Chistul de Toxoplasma gondii este de aprox 5-50µm diametrul. Este în mod obișnuit sferic în țesutul cerebral și mai elongat în mușchii cardiac și scheletici.

Diagnosticul indirect : -

-

Diagnosticul serologic (metoda uzuală) Detecția anticorpilor de Toxoplasma gondii se face utilizând metodele de screening cum ar fi: MEIA( micro particle enzyme immunoassay technique), ELFA (enzyme-linked fluorescent assay), Chemiluminescence Immunoassay, ELISA (sandwich/double sandwich) pentru determinarea anticorpilor specifici IgA, IgE, IgM și IgG anti-Toxoplasma gondii, reacția de aviditate pentru anticorpii specifici IgG anti-Toxoplasma gondii, ISAGA (immunosorbent agglutination assay), testul Sabin-Feldman (Dye Test), AC/HS (aglutinarea diferentiala), reacția de imunofluorescenta. Identificarea materialului genetic prin PCR, mai ales pentru diagnosticul toxoplasmozei congenitale “in utero”

Una din cele mai utilizate metode de screening este ELISA, fiind disponibile o varietate de kit-uri pentru diagnosticul toxoplasmozei. Procedurile de lucru, condițiile de validare și valorile de referința diferă de la un kit la altul în funcție de producător. În diagnosticul toxoplasmozei este foarte important de stabilit stadiul bolii (acută sau cronică), localizarea (oculară, ganglionară, cerebrală), precum și confirmarea supoziției prin reacțiile de confirmare disponibile (western blot, PCR, biopșie ganglionară, etc). De asemenea este foarte important diagnosticul corect al toxoplasmozei în cazul sarcinii. Prezența sau absența anticorpilor, interpretarea și algoritmul de diagnostic depinzând de vârsta și evolutia sarcinii.

Pentru diagnosticul toxoplasmozei acute este necesară: -

Determinarea anticorpilor specifici de tip IgA, IgE sau IgM aceștia fiind markeri specifici. Un răspuns pozitiv pentru oricare din cele trei tipuri de anticorpi generând o serie de alte reacții: Reacția de aviditate pentru anticorpii IgG anti-Toxoplasma gondii (cazul unei confirmări) pentru a stabili momentul de debut al bolii (max. 20 - min. 4 săptămâni în funcție de producător) Confirmare western blot (IgA, IgM) – penrtru a exclude sau confirma o falsă reactivitate fată de anticorpii specifici IgA/IgM anti Toxoplasma gondii

Anticorpii de faza acută au urmatoarea remanență (aproximativă, depinzând de statusul imunologic al pacientului): -

Anticorpii anti-Toxoplasma gondii de tip IgM – aproximativ 1 an (uneori pot rămâne până la 24 luni postinfecție) Anticorpii anti-Toxoplasma gondii de tip IgA – 6-9 luni de la începutul infecției

21

Ghid practic de Parazitologie Medicală -

Anticorpii anti-Toxoplasma gondii de tip IgE – aproximativ 6 luni de la începutul infecției. Anticorpii specifici IgE sunt un important marker pentru infecția acută întrucât marchează exact debutul acesteia, fiind primii care dispar în decursul evoluției bolii.

Ca metode de confirmare sunt utilizate: -

-

Western blot. Prin aceasta metodă se pun in evidență diferite benzi specifice (cu o anumită greutate moleculară) caracteristice pentru prezența anticorpilor anti-Toxoplasma gondii. Benzile sunt diferite in funcție de producător : 30 kDa, 31 kDa, 33 kDa, 40 kDa, 45 kDa, 150 kDa, 40 kDa sau 20 kDa. Confirmare western blot (IgA, IgM, IgG) – penrtru a exclude sau confirma o falsa reactivitate față de anticorpii specifici IgA/IgM/IgG anti Toxoplasma gondii PCR (clasic sau real time) permite identificarea materialului genetic de Toxoplasma gondii din diferite produse biologice: ser, sânge, LCR, lichid amniotic, umoare apoasă. Reacția poate fi calitativă sau cantitativă.

În cazul suspiciunii de toxoplasmoză aparuta în timpul sarcinii, este extrem de important să se stabilească prezența sau absența anticorpilor de fază acută (IgA, IgE, IgM) precum și momentul de debut al bolii: în decursul primului trimestrul de sarcina înainte sau după acesta. Aceste criterii sunt esențiale pentru un management sigur și corect al sarcinii.

In cazul screening-ului realizat în primul trimestru de sarcină recomandările sunt următoarele: IgA

IgE

IgM

IgG

Interpretare

Poșibile recomandari

Pozitiv

Negativ Negativ Negativ Infecție foarte recentă (6-9 Reacția de aviditate luni) sau falsă reactivitate față pentru IgG anti-T.g. de IgA anti-T.g. (pentru a stabili momentul de debut al infecției)* Reacția de confirmare specifică Western Blot T.g. IgA Retestarea săptămâni

peste

3-4

ADN Toxoplasma gondii

22

Ghid practic de Parazitologie Medicală (ser)

Pozitiv

Pozitiv

Negativ Negativ Infecție foarte recentă (6-9 Reacția de aviditate luni) sau falsa reactivitate față pentru IgG anti-T.g. de IgA/IgE anti-T.g. (pentru a stabili momentul de debut al infecției)* Reacția de confirmare specifică Western Blot T.g. IgA Retestarea săptămâni

peste

3-4

ADN Toxoplasma gondii (ser)

Pozitiv

Pozitiv

Pozitiv

Negativ Infecție foarte recentă (max.12 luni) sau falsa reactivitate față de IgA/IgE/IgM anti-T.g.

Reacția de aviditate pentru IgG anti-T.g. (pentru a stabili momentul de debut al infecției)* Reacția de confirmare specifică Western Blot T.g. IgA /IgM Retestarea săptămâni

peste

3-4

ADN Toxoplasma gondii (ser)

23

Ghid practic de Parazitologie Medicală

IgA

IgE

IgM

IgG

Interpretare

Poșibile recomandari

Pozitiv

Pozitiv

Pozitiv

Pozitiv

Infecție recentă (maxim 12-18 Reacția de aviditate IgG luni) (pentru a stabili momentul de debut al infecției)* Western blot IgA, IgM, IgG pentru excluderea unei false reactivități. ADN Toxoplasma gondii (ser)

Negativ Pozitiv

Pozitiv

Pozitiv

Infecție recentă (până în 6 Reacția de aviditate IgG luni- vezi IgE T.g.) (pentru a stabili momentul de debut al infecției)* Western blot IgM, IgG pentru excluderea unei false reactivități ADN Toxoplasma gondii (ser)

Negativ Negativ Pozitiv

Pozitiv

Infecție recentă (până în 12- Reacția de aviditate IgG 18 luni- vezi IgM T.g.) (pentru a stabili momentul de debut al infecției)* Western blot IgM, IgG pentru excluderea unei false reactivități ADN Toxoplasma gondii (ser)

Negativ Negativ Negativ Pozitiv

Infecție cronică (mai veche de Nu prezintă pericol 18 luni) pentru evoluția sarcinii. Pacienta prezintă imunitate

Negativ Negativ Negativ Negativ Absența infecției

24

Repetă determinările în trimestrul al II-lea și al

Ghid practic de Parazitologie Medicală III-lea de sarcină.

*În cazul unui rezultat: - aviditate scazută: indică probabilitatea infecției într-un interval de max. 4-20 săptămâni (în funcție intervalul stabilit de producator). Dacă momentul de debut al sarcinii a fost stabilit în interiorul acestui interval, medicul va trebui să interpreteze acest rezultat în funcție de contextul clinic al pacientei precum și împreună cu metodele de confirmare existente (western blot, biologie moleculară - PCR). Valoarea scăzută a aviditații nu trebuie interpretată individual. Există paciente care au un titru scăzut al avidității o perioadă de timp chiar mai mare decât cea stabilită de producatorii kit-urilor de diagnostic. - aviditate ridicată: indică probabilitatea infecției într-un interval mai mare de 4-20 săptămâni (în funcție intervalul stabilit de producător). Dacă momentul de debut al sarcinii a fost stabilit în afara acestui interval sarcina trebuie totuși monitorizată foarte atent pentru a putea înregistra o infecție nouă sau eventual reactivarea unei infecții mai vechi.

25

Ghid practic de Parazitologie Medicală

26

Ghid practic de Parazitologie Medicală

27

Ghid practic de Parazitologie Medicală 1*- Dacă gravida prezintă simptome sugestive sau ecografia fetală arată modificări se recomandă repetarea serologiei. 2* - Dacă rezultatele se mențin (anticorpii de fază acută IgA/IgE/IgM au fost fals pozitive) – supravegherea ulterioară a sarcinii Clașificarea pacientelor gravide 1- Gravidă cu infecție cronică(imună): IgG pozitiv și IgA/IgM negativ 2- Gravidă cu poșibilă infecție recentă: IgG și IgA/IgE/IgM pozitive - Aviditate IgG - Interpretarea depinde de vârsta sarcinii la momentul recoltării probelor 3- Gravidă posibil în primul stadiu al infecției: IgG negativ și IgA/IgE/IgM pozitiv - diagnosticul trebuie confirmat și repetat după 15 zile pentru a exclude falsa reactivitate IgA/IgE/IgM. 4- Sarcină supravegheată (nu a fost niciodată infectată): IgG și IgA/IgE/IgM.

28

Ghid practic de Parazitologie Medicală

29

Clasificarea nou născuților: 1. Caz în observație: nou născut cu IgG în scădere și IgA, IgE, IgM negativ la vârsta 30 de zile. 2. Suspiciune: - nou născut cu/fără simptomatologie a cărui mamă a dezvoltat o toxoplasmoză recentă în timpul sarcinii. - nou născut simptome de boală: icter, limfadenopatie, hepatosplenomegalie, micro și hidrocefalie, anemie, spasme, greutate redusă, prematur, corioretinita, calcificari cerebrale, strabism, iridoiclita, anormalități în lichidul cefalorahidian – IgG pozitiv. 3. Caz confirmat: - IgA/IgE/IgM pozitiv la copilul în vârsta de o săptămână; - persistența sau chiar creșterea nivelului IgG; - copil la care Toxoplasma gondii a fost confirmată intrauterin; - copil cu PCR pozitiv identificat în lichidul amniotic în cursul sarcinii. 4. Suspiciune infirmată: IgA/IgE/IgM și IgG negative.

Prezența toxoplasmozei la nivelul sistemului nervos central este foarte greu de diagnosticat. Pentru a diferenția o toxoplasmoză cerebrală de una viscerală este recomandat să se detecteze anticorpii specifici anti-Toxoplasma gondii în lichidul cefalorahidian. Prezența anticorpilor în sângele periferic nu confirmă existența infecției la nivelul sistemului nervos central. Detectarea anticorpilor specifici de T.g. în LCR are o mai mare specificitate, însă numai puține kit-uri comerciale de diagnostic sunt standardizate în detecția anticorpilor în LCR, metoda utilizată -WB. Prezența benzilor specifice (de o anumita greutate moleculară – în funcție de producător ) indică prezența infecției la nivelul SNC. Biologia moleculară (PCR convențional, RT-PCR calitativ/cantitativ) ofera o confirmare a reacțiilor deja existente (ELISA/WB), prezența ADN de Toxoplasma gondii în lichidul cefalorahidian întărind diagnosticul de toxoplasmoză cerebrală. În cazul suspiciunii de toxoplasmoză oculară produsul recomandat pentru analizare este umoarea apoasă. Prezența anticorpilor IgA/IgG în umoarea apoasă este specifică toxoplasmozei oculare. Metodele utilizate sunt western blot/ PCR.

30

Diagnosticul ascaridiozei Clasificare: Phylum Nematoda, Clasa Secernentea, Ordinul Ascaridida, Familia Ascarididae, Genul Ascaris, Specia Ascaris lumbricoides Ciclu biologic:

Viermii adulți trăiesc în lumenul intestinului subțire. O femela poate produce aproximativ 200.000 ouă/zi, ouă care sunt eliminate prin fecale .Ouăle nefecundate ingerate nu sunt infectante. Ouăle fecundate embrionează și devin infectante într-un interval cuprins între 18 zile până la câteva săptămâni , în funcție de condițiile de mediu (optim: sol umed, cald și umbros). După ce sunt înghițite ouăle infectante , larvele eclozează , penetrează mucoasa intestinală, sunt transportate prin circulatia sistemică în plămâni .Larvele își continuă evoluția în plămâni (10 pana la 14 zile), străpung peretele alveolar, urcă în arborele bronșic, faringe și sunt înghițite . În momentul în care ajung în intestinul subțire ating stadiul de adult . Este necesară o perioadă de 2 - 3 luni de la ingerarea ouălor infectante până la ovipoziția femelei adulte. Viermii adulții pot supraviețui 1-2 ani. Stadiul de diagnostic: ouă (fecundate/nefecundate), adulți (masculi si/sau femele). Perioada necesară de la infecție până la diagnostic: aproximativ 2-3 luni. 31

Diagnostic: 1. Examen coproparazitologic direct: astfel pot fi identificate ouăle de Ascaris lumbricoides. 2. Metode de concentrare: Formol-Eter, Kato, Willis Hung 3. Examen macroscopic al materiilor fecale. Identificarea indivizilor adulți de Ascaris lumbricoides in proba adusă spre examinare. 4. Identificarea directă: este solicitată de către pacient în urma eliminării unui individ adult de Ascaris lumbricoides. Pentru o identificare corectă se ține cont de criteriile morfologice: aspect, dimensiune. Individul este examinat cu ajutorul unui stereomicroscop. Este examinată extremitatea anterioară – cefalică - (cu butonul cefalic) și extremitatea posterioară (la femele – dreaptă ascuțită, la masculi – întoarsă având aspectul unui mâner de umbrelă – caracteristic nematodelor).

Ascaris lumbricoides adulți

Ou fecundat

Ou nefecundat

5. Teste serologice: - HLG completă cu numărătorea eozinofilelor. Este foarte importantă deoarece se înregistrează o creștere semnificativă a nivelului eozinofileleor în perioada de migrarea perienterică parazitului. - De asemenea cuantificarea nivelului anticorpilor anti IgE specifici pentru Ascaris lumbricoides, Reprezintă un marker important care ușureaza diagnosticul. Nivelul anticorpilor specifici anti-IgE Ascaris este crescut în perioada de migrare perienterică a parazitului.

32

Diagnosticul enterobiazei Clasificare: Phylum Nemathelmintes, Clasa Secernentea, Subclasa Spiruria, Ord.Oxyurida,Fam. Oxyuridae, genul Enterobius, specia Enterobius vermicularis Ciclul biologic:

Ouăle sunt depuse în pliurile anale . AutoInfecția survine in urma transferării ouălor din zona perinanală la gura cu ajutorul mâinilor murdare .De asemenea contaminarea este posibilă prin transferul ouălelor de la o persoană la alta fie prin contact direct sau prin intermediul lenjeriei contaminate. Enterobiaza poate fi contactată prin intermediul obiectelor contaminate cu ouă de Enterobius. Uneori un număr mic de ouă poate fi inhalat. Acestea vor fi înghițite și vor urma aceeași evoluție ca ouăle ingerate. Ulterior ingerării ouălor, larvele eclozează în intestin și adulții se stabilesc în colon . Intervalul de timp de la ingerare până la depunerea ouălor de către femelele adulte este de aproximativ o lună. Durata de viață a adulților este de aproximativ două luni. Femelele gravide migrează noaptea prin anus și depun ouăle în pliurile anale . Larvele se dezvoltă în interiorul ouălor (ouăle devin infectante) în condiții optime in 4-6 ore. 33

Retroinfecția, sau migrarea larvelor nou eclozate de pe tegumentul anal în rect are loc cu o frecvența aleatorie. Stadiul de diagnostic: ou, adult. Perioada necesara de la infecție până la diagnostic: aproximativ o lună. Diagnosticul enterobiozei se face prin identificarea directă a ouălor și/sau a indivizilor adulți de Enterobius vermicularis prin: 1. Amprenta anală (scotch-test) este metoda de elecție deoarece ouăle sunt stocate în pliurile anale și colectate cu ajutorul scotch-ului. Probabilitatea unui examen pozitiv crește direct proporțional cu gradul infecției. Cu cit nivelul de infestare este mai mare cu atât posibilitatea de identificare a ouălor prin amprenta anală este mai mare. Pentru un examen corect trebuie ținut cont de mai multe aspecte. În primul rând recoltarea trebuie facută dimineața înaintea toaletei locale și/sau a defecării. În momentul recoltării zona perianală trebuie să fie ferită de aplicarea cremelor sau a talcului. Pe dispozitivul de recoltare (bagheta) se fixează o bucată de scotch (suficient de lungă sa poată fi ținută de ambele capete), transparent, cu partea adezivă la exterior. Cu acest dispozitiv se tapetează pliurile anale astfel încât ouăle existente în această regiune să adere la scotch. Ulterior scotch-ul este fixat cu suprafața adezivă pe o lamă de microscop, iar surplusul este înlăturat.

Lama este examinată la microscop cu un obiectiv de min.10x, și 40x pentru examinarea detaliilor. Unii producători de consumabile medicale au creat dispozitive speciale pentru recoltarea oxiurilor.

Paleta are o parte adezivă care se aplică în pliurile anale. Paleta poate fi indepartată de capac și examinată la microscop. Avantajul este că se reduce pericolul contaminării, iar posibilitatea de transport sigur a probei crește. 34

Rezultatul este raportat: PREZENTE/ABSENTE ouă de Enterobius vermicularis în amprenta anală, menționându-se și frecvența (rare, relativ frecvente, frecvente, numeroase). Un prim rezultat negativ nu este definitiv, ținând cont de perioadele negative ale parazitului când acesta nu se elimină. Sunt necesare cel puțin trei examene negative la interval de aproximativ o săptămână unul de celălalt pentru a lua o decizie. De asemenea amprenta anală (scotch test) este obligatoriu să fie recoltată în cabinete de recoltare, de către personal medical calificat. 2. Examen coproparazitologic direct: astfel pot fi identificate ouăle de Enterobius vermicularis numai în cazul unei infestări masive. În mod obișnuit ouăle fiind depuse în pliurile anale nu sunt antrenate cu bolul fecal. Uneori în momentul defecării sunt antrenați indivizi adulți (în special femele cu uterul hipertrofiat plin de ouă), iar în momentul omogenizarii probei aceastea sunt distruse, pot elibera ouă care vor fi identificate în examenul coproparazitologic. 3. Examen macroscopic al materiilor fecale. Identificarea indivizilor adulți de Enterobius vermicularis în proba adusă spre examinare. 4. Identificarea directă: este solicitată de către pacient în urma recoltării de pe lenjeria intimă și/sau de pat, dimineața a adulților de Enterobius vermicularis. Pentru o identificare corectă se ține cont de criteriile morfologice, aspect, dimensiune, precum și de caracteristici etologice (momentul eliminării-nocturn). Individul este pus pe o lamă de microscop, într-o picătura de ser fiziologic și examinat la microscp utilizând obiectiv de maximum 10x (din cauza dimensiunilor mari). Este examinată extremitatea anterioară- cefalică (cu alele laterale), esofagul (rabditoid), corpul (prezența sau absența uterului hipertrofiat) și extremitatea posterioară (la femele – dreapta ascuțită, la masculi – întoarsă, având aspectul unui mâner de umbrelă – caracteristic nematodelor).

a.Extremitatea cefalică

b.Individ femel

35

c. Individ mascul

d. Ouă Enterobius vermicularis (40x)

Diagnosticul stongiloidozei Clasificare: Phylum Nematoda, Clasa Secernentea, Ordinul Rabditida, Familia Strongiloididae, Genul Strongyloides, Specia Strongyloides stercoralis Strongyloides stercoralis este un nematod parazit care produce în organismul uman afecțiunea numită strongiloidoza. Aceasta este provocată de două specii ale genului Strogyloides: stercoralis și fuelleborni (cu o răspândire limitată la câteva regiuni din Africa și Papua Nouă Guineea). Cea mai răspândită dintre cele două este Strongyloides stercoralis, fiind raspândită pe tot globul și cu o importanță clinică majoră (aproximativ 30 milioane de oameni afectați din 70 țări). Ciclul biologic:

36

Ciclul biologic al lui Strongyloides stercoralis este mult mai complex decât al altor nematode deoarece cuprinde o alternanță de generații libere și parazite și posibilitatea de autoinfecție și de multiplicare în corpul gazdei. Generatiile libere: Larvele rabditoide eliminate în materiile fecale (vezi“Generațiile parazite”) pot năpârli de două ori și se pot transforma în larve filariforme infectante (dezvoltare directă) sau pot năpârli de patru ori și să se transforme în adulți liberi (masculi și femele) aceștia se împerechează și produc ouă din care eclozează larvele rabditoide . Ulterior pot evolua în fie: o nouă generatie de adulți liberi (precum la ), fie în larve filariforme infectante . Larvele filariforme penetrează tegumentul gazdei pentru a iniția ciclul parazitar. Generațiile parazite: Larvele filariforme existente în solul contaminat, penetrează tegumentul gazdei ,și sunt transportate către plămâni unde pătrund în spațiile alveolare; sunt conduse apoi prin arborele bronșic către faringe, apoi sunt înghițite și ajung în intestinul subțire . În intestinul subțire larvele năparlesc de două ori și se transformă în femele adulte Femelele adulte se inserează în epiteliul intestinal și produc ouă prin partenogeneză , din care eclozează larve rabditoide. Larvele rabditoide fie sunt eliminate prin materiile fecale (vezi “Generațiile libere”), sau pot cauza autoinfecția .In autoinfecție larvele rabditoide devin larve infectante, filariforme, care fie pot penetra epiteliul intestinal (autoinfecție internă) sau tegumentul din zona perianală 37

(autoinfecție externă); în ambele situații larvele vor urma traseul descris mai sus, fiind transportate succesiv în plămâni, arborele bronșic, faringe și intestinul subțire unde se maturizează ajungând la stadiul de adulți. O altă posibilitate ar fi să disemineze în întregul corp al gazdei. În cazul Strongyloides stercoralis autoinfecția reprezintă o explicație pentru existența infecțiilor persistente mai mulți ani la persoane care nu au fost în zone endemice și hiperinfecțiile la persoanele imunodeprimate. Stadiul de diagnostic: larva rabditoidă. Perioada necesară între infecție și diagnostic: dificil de stabilit. Diagnosticul strongiloidozei este dificil, deoarece din examinarea microscopică directă a materiilor fecale pot fi identificate larvele de Strongyloides numai in aprox. 30% din cazuri. În timp au fost dezvoltate metode de diagnostic imunologic (ELISA) care sunt un mijloc de diagnostic folositor în fazele diseminate, dar care prezintă un dezavantaj și anume reacția încrucișată cu alte nematode (Hookworms, Filaria, Schistosoma). Un alt mijloc de diagnostic este punerea în evidență a anticorpilor de tip IgE total (crescuți în faza de diseminare și cu valori normale sau puțin crescute în faza cronică) sau IgE specifici . Diagnosticul strongiloidozei: 1. Diagnostic de certitudine: examenul microscopic direct ce constă în examinarea directă (cu ser fiziologic) a materiilor fecale. Prin această metoda este posibilă identificarea larvelor de Strongyloides stercoralis (de obicei rabditoide) în aprox.30% din cazuri. Rezultatul este calitativ: PREZENT/ABSENT

Strongyloides stercoralis larva rabditoidă 2. Reacția imunoenzimatica, cu specificitate și sensibilitate scazută. Indică prezența sau absența anticorpilor produși la posibila prezență a larvelor de Strongyloides, Hookworms, Schistosoma. Rezultatul este calitativ (PREZENT/ABSENT), semicantitativ sau cantitativ in funcție de producător. 3. Metode de cultivare a materiilor fecale: a. Cultura pe cărbune – într-un mojar se amestecă aproximativ 100g de cărbune (pentru analize - Merck) cu apa, până se obține o pastă groasă de dimensiunea unei nuci. Aceasta se amestecă cu o cantitate egală de materii fecale. După o omogenizare perfectă se așează produsul (modelându-se o forma conică) în mijlocul unei plăci Petri astfel încât vârful conului să atingă capacul plăcii Petri. Se acoperă placa Petri cu un tifon 38

umed împăturit în mai multe straturi și se depozitează la loc întunecat timp de 48 ore. În acest timp tifonul trebuie menținut în stare umedă, astfel încât pe capacul plăcii Petri să apară picături de condens. Această metodă extrem de eficientă (condiția este ca praful de cărbune utilizat să nu fie tratat cu antibiotice, astfel fiind inhibată creșterea larvelor) se bazează pe tropismele larvelor de Strongyloides stercoralis: higrotropism, geotropism negativ și tigmotropism larvele concentrându-se in picăturile de condens de pe interiorul cutiei Petri. Examinarea se face utilizând un stereomicroscop. Rezultatul este calitativ: PREZENT/ABSENT b. Cultura pe agar- este o metodă alternativă culturii pe cărbune. O cantitate de materii fecale (o ansa) este însămânțată într-o zonă de 2-3 cm de la extremitatea unei plăci cu Nutrient Agar. Placa Petri este pastrată la temperatura camerei, ferită de lumină. După 48 de ore se examinează placa. În cazul unei culturi pozitive se observă urme sinusoidale lăsate de larvele de Strongyloides pe mediul de cultură. În cazul unei culturi negative aceste urme nu sunt prezente. Rezultatul este calitativ: PREZENT/ABSENT 4. Metoda Baerman – utilizați materii fecale, proaspete (nu mai vechi de 24 ore) de o consistență semi-solidă, de dimensiunea unei mingi de tenis. Introduce-ți o pâlnie tapetată cu hirtie de filtru intr-un recipient stabil. Pâlnia este prevăzută cu un furtun de plastic (material care permite sterilizarea pentru o utilizare ulterioară) care prezintă la capatul inferior o clemă metalică care împiedică scurgerea lichidului din palnie. Capătul tubului este introdus într-un pahar Erlenmayer pentru colectarea lichidului din pâlnie. Umpleți pâlnia cu apa distilată incălzită la aprox.370C până aproape de limita superioară. Introduceți materiile fecale în două straturi de tifon (10x10 cm). Sigilați preparatul cu două baghete de lemn introduse prin colțurile tifonului și suspendați-l în lichidul din pâlnie susținându-se pe cele două baghete. Lăsați preparatul la 37oC (în incubator) timp variabil între 1-3 ore sau peste noapte la temperatura camerei. Dupa expirarea timpului , îndepărtați tifonul și scurgeti lichidul obținut. Mențineți recipientul în repaus pentru înca 15 minute. Este bine de știut că diferitele stadii de viață ale Strongyloides stercoralis migrează prin dispozitivul Baerman diferit. Adulții liberi și larvele de stadiul al III lea migrează relativ rapid, și cantități mai mari din aceste stadii pot fi obținute prin colectarea dupa prima oră. Toate stadiile de evoluție pot fi colectate dupa 2 ore. Primul stadiu larvar migrează mai lent și pot necesită și 3 ore de incubație. Utilizați o pipetă Pasteur pentru a transfera porțiunea inferioară a sedimentului într-o cutie Petri. Examinați sedimentul utilizând o lupă binoculară. Rezultatul este calitativ: PREZENT/ABSENT.

39

Diagnosticul toxocarozei Clasificare: Phylum Nematoda, Clasa Secernetea, Ordinul Ascaridida, Familia Toxocaridae, Specia Toxocara canis/cati. Ciclul biologic:

Toxocara canis își completează ciclul biologic în organismul câinelui, omul intrând în ciclul biologic accidental. Ouăle neembrionate sunt eliminate în fecalele gazdei definitive . Ouăle embrionează și devin infectante în mediul exterior . În urma ingerarii de către câine , din ouăle infectante larvele eclozează și penetrează peretele intestinal. În organismul câinilor tineri, larvele migrează în plămâni, arborele bronșic și esofag: paraziții ajung în intestin și depun ouă . La câinii adulți, pot apărea și infecții aparente, dar cel mai comun fenomen este închistarea larvelor în țesuturi. Stadiile închistate se reactivează în organismul femelelor adulte ultima parte a gestației și infectează transplacentar și transmamar puii în al carui intestin subțire se dezvoltă viermi adulți . Puii sunt sursa majoră de contaminare a mediului inconjurator. Toxocara canis poate fi transmisă și prin consumul unei gazde intermediare (mici mamifereiepuri- care consumă hrana infestată cu ouă, iar larvele eclozate în intestinul lor subțire, penetrează peretele intestinal și prin circulație, ajung în diferite țesuturi unde se închistează .Ciclul biologic este complet în momentul în care câinele consumă aceste gazde intermediare , iar larva se transformă în intestinul subțire al câinelui într-un adult ce produce 40

ouă. Oamenii devin gazde în mod accidental infectându-se prin ingerarea ouălor infectante din mediul înconjurător sau de la gazdele intermediare .După ingestie larvele eclozează, penetrează peretele intestinal și sunt transportate cu ajutorul sistemului circulator în multe țesuturi din organism (ficat, inima, plămâni, musculatura, ochi, creier) . Deși în aceste țesuturi larvele nu depăsesc acest stadiu de dezvoltare (impas parazitar), ele pot genera reacții locale. Cele două forme importante ale toxocarozei sunt: Larva Migrans Visceralis și Larva Migrans Ocularis. Diagnosticul este pus de obicei utilizând serologia sau identificarea larvei in biopsia de țesut. Stadiul de diagnostic : prezența larvelor încapsulate în țesturi (ficat, glob ocular, creier, etc). Diagnostic: prin punerea în evidență a anticorpilor specifici anti-Toxocara canis în sângele pacientului prin metode de screening (ELISA) și apoi confirmarea răspunsului pozitiv prin Western Blot în ser, LCR sau umoare apoasă în funcție de suspiciunea respectivă. Diagnostic: în cazul suspiciunii de toxocaroza diagnosticul se pune pe baza testelor specifice. Metoda de screening cea mai utilizată este reacția imunoenzimatica (ELISA). La ora actuală exista multe kit-uri comerciale disponibile. Aceasta metodă pune în evidență în serul pacientului anticorpii specifici anti-Toxocara canis. Reacția este una calitativă sau semicantitativă, sensibilitatea și specificitatea kit-urilor fiind diferite în funcție de producător.Trebuie ținut cont de eventualele reacții incrucișate, iar rezultatele pozitive trebuie confirmate prin reacția specifică western blot Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV Absenti/ Prezenți anticorpi specifici anti-Toxocara canis. În sprijinul diagnosticului de toxocaroză acută vine reacția de aviditate anti-Toxocara canis IgG. Aceasta este o reacție extrem de utilă deoarece permite stabilirea unui interval aproximativ de debut al bolii (diferit în funcție de producător). De asemenea numărătoarea eozinofilelor oferă indicii în privința stadiului de evoluție a parazitului (numărul de eozinofile este crescut în perioada de migrare perienterică a parazitului) Reacția de confirmare, western blot, este o reacție cu o sensibilitate și specificitate superioare reacției ELISA. Permite confirmarea suspiciunilor de toxocaroza prin analizarea probelor atât de ser, LCR cât și de umoare apoasă. Un răspuns pozitiv pentru o probă testată din lichid cefalorahidian indică prezența toxocarozei cerebrale și este un factor de decizie important în ceea ce privește conduita terapeutică viitoare. Suportul este reprezentat de benzile de nitroceluloza impregnate cu antigene parazitare specifice (proteine cu greutati moleculare definite). În contact cu serul/LCR aceste proteine formează complexe antigen-anticorp in pozitii specifice. Rezultatul este raportat NEGATIV/POZITIV in funcție de prezența benzilor specifice în locurile bine stabilite. Greutatea moleculară a benzilor și numărul lor diferă de la un producător la altul.

41

Fig.1

Fig.2 Rezultatul este considerat pozitiv în: SER/LCR/Umoare apoasă – dacă sunt prezente 2 sau mai multe benzi LMW (low molecular weight – benzi specifice Toxocara spp) din intervalul 24-35 kDa. HMW (high molecular weight) sunt benzi care pot aparea și în cazul altor infecții helmintice. 42

Suspiciunile de toxocaroză oculară se recomandă a fi confirmate sau infirmate prin testarea anticorpilor specifici anti-Toxocara canis din umoare apoasă. Greutatea moleculară, dispoziția și numărul benzilor specifice diferă de la un producător la altul (vezi fig.2 – pozitiv în cazul prezenței tuturor celor 3 benzi specifice: 120, 32, 26 kDa) Măsurarea nivelului anticorpilor anti IgE specifici pentru Ascaris, precum și nivelul eozinofilelor sunt markeri importanți în suspiciunile de toxocaroză, nivelul acestor parametri fiind ridicat pe parcursul migrării larvelor în organismul gazdei (forma acută) .

Diagnosticul hidatidozei Clasificare: Phylum Platyhelmintes, Clasa Cestoda, Ordinul Cyclofillidae, Familia Taeniidae, Genul Echinococcus, Specia Echinococcus granulosus Echinococcus granulosus este un helmint din clasa cestodelor. Corpul viermelui este de 3 - 6 cm lungime, alcătuit din scolex cu 4 ventuze, un rostrum cu 36 - 40 cârlige și 3 - 4 proglote, dintre care ultima conține 400 - 800 de ouă. Ciclul biologic:

43

Adultul de Echinococcus granulosus (3 până la 6 mm lungime) trăiește în intestinul subțire al gazdelor definitive (câinii și alte canide). Din proglotele gravide sunt eliberate ouăle care sunt eliminate în materiile fecale. După ingerarea acestora de către gazda intermediară (în condiții naturale: oi, capre, porc, vite, cai, camile) oul eclozează în intestinul subțire și eliberează oncosfera care penetrează peretele intestinal și migrează cu ajutorul sistemului circulator în diferite organe, în special ficat și plămâni. În aceste organe oncosferele se tranformă în chist care crește progresiv, producând protoscolecși și vezicule fiice care umplu interiorul chistului. Gazda definitivă se infectează ingerând organe conținând chisturi sau o gazdă intermediară infectată. După ingestie, protoscolecșii evaginează și se atașează de mucoasa intestinală și se transformă în adulți. în 32 până la 80 de zile. Ciclul biologic este similar și la E.multilocularis (1.2 – 3.7 mm) cu următoarele diferențe: gazdele definitive sunt vulpile, și mai puțin câinii, pisicile, coiotii și lupii; gazdele intermediare sunt rozătoare mici; dezvoltarea larvară (in ficat) rămâne un timp nelimitat în faza proliferativă, rezultând invazia țesuturilor înconjurătoare. Stadiul de diagnostic: chistul cu diferite localizări Perioada necesară de la infecție până la diagnostic: mai mulți ani. Diagnosticul echinococozei hidatice este dificil de realizat. Rareori există indicii specifice care să sugereze infecția parazitară. De aceea este recomandată combinația metodelor imagistice (ecografie, CT,RMN) cu teste de laborator. Aceste investigații aduc informații importante despre aspectul, consistența membranelor, localizarea chistului precum și a gradului de activitate.

Dacă în urma examenului imagistic suspiciunea este menținută se impune continuarea cu teste de laborator. Serologie specifică: detectarea anticorpilor specifici anti-Echinococcus granulosus prin metode de screening (ELISA, IFA, IHA) și de confirmare (Western Blot). 44

Reacția de screening – ELISA, reacția de screening cea mai larg utilizată, detectează nivelul anticorpilor specifici anti-Echinococcus granulosus/Echinococcus multilocularis. Majoritatea testelor comerciale existente detectează numai anticorpii de E.granulosus (sensibilitate și specificitate>95%) dar există și truse standardizate pentru diagnosticul echinococozei alveolare produsă de E.multilocularis (sensibilitate 93%, specificitate 98%). Reacțiile sunt calitative sau semicantitative în funcție de producător. Rezultatele sunt exprimate în indice de pozitivitate (IP) sau COI (indicele de cut off), valorile fiind influențate de numeroși factori printre care o importanță deosebită o prezintă statusul imunologic al pacientului. Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV (Prezenți/Absenți anticorpi specifici de Echinococcus granulosus/multilocularis). Reacția de confirmare –Western Blot, este o reacție calitativă utilizată drept confirmare pentru probele testate în prealabil prin metoda de screening (ELISA). Reacția se poate efectua utilizând ser și/sau LCR și prezintă o sensibiltate și specificitate mare. În funcție de producător, unele kituri permit confirmarea numai a echinococozei chistice, produsă de Echinococcus granulosus, altele ambele afecțiuni echinococoza chistică și alveolară (Echinococcus multilocularis). Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV – prezența/absența pe strip-ul de test a benzilor specifice cu greutatea moleculară de 7 și/sau 26-28 kDa indică prezența anticorpilor specifici IgG de Echinococcus în ser/LCR). Prezența benzilor intermediare, între 7 și 26-28 kDa (17, 1618) permite diferențierea între cele două specii: granulosus și multilocularis. Exemple de reacții pozitive de western blot pentru Echinococcus spp.:

45

1. 2. -

Diagnosticul Genului Echinococcus Prezența sau absența benzilor 7 și/sau 26-28 kDa Diferențierea între cele două specii: Tipar P1 sau P2: Echinococcus granulosus (E.g.) Tipar P3: Echinococcus multilocularis (E.m.) Tipar P4 sau P5: Echinococcus multilocularis sau Echinococcus granulosus

Testul de viabilitate a protoscolecșilor: produsul examinat este reprezentat de un fragment de chist hidatic extras intraoperator (membrană de chist hidatic, vezicule fiice, lichid hidatic). Preparatul este examinat proaspăt (lamă lamelă), produsul fiind preparat astfel: -

46

Se spală membrana cu ser fiziologic și se raclează energic. Din lichidul obținut se prepară două lame : o Una cu: o picătură preparat + o picătură de ser fiziologic o A două: o picătură preparat + o picătură eozină Fluidul hidatic trebuie centrifugat 10 minute la 3000 rot/min, iar din sediment se pregătește un preparat, lamă lamelă.

-

Lamele se examinează la microscop cu obiective de 10x și 40x pentru detalii. Rezultatul se raportează menționându-se prezența sau absența protoscolecșilor și/sau a cârligelor.

Membrană chist hidatic

Protoscolecs invaginat + cârlige (20x)

Protoscolecs evaginat + cârlige (20x)

47

Diagnosticul teniazelor Clasificare: Phylum Plathelmintes, Clasa Cestoda, Ordinul Cyclophillidae, Familia Taeniidae, Genul Taenia , Speciile: Taenia solium, Taenia saginata Ciclul biologic:

Taeniaza este afecțiunea survenită în urma infecției cu adultul speciilor Taenia solium, saginata, asiatica. Oamenii sunt numai gazde definitive pentru speciile menționate anterior. Prin materiile fecale sunt eliminate în mediul extern ouăle sau proglotele gravide ; ouăle pot supraviețui în mediul extern de la câteva zile la luni. Bovinele (T.saginata) și porcinele (T.solium) se infectează ingerând vegetale contaminate cu ouă sau proglote gravide .Oncorsferele eclozează în intestinul animalelor , penetrează peretele intestinal și migrează în musculatura striată, unde se transformă în cisticerci. Un cisticerc poate supraviețui câțiva ani în organismul gazdei. Oamenii se infectează ingerând carne infestată, insuficient preparată termic .În intestinul subțire al omului cisticercul se transformă în adult în aproximativ 2 luni. Adultul poate supraviețui în organismul gazdei umane mai mulți ani. Viermele adult se atașează de pretele intestinal cu ajutorul scolexului restul strobilei fiind suspendată în intestinul subțire .Lungimea viermelui adult este: Taenia saginata - de aproximativ 5m (uneori mai puțin, alteori mai mult - poate atinge chiar și 25m); Taenia solium- 2 până 7 m. Adulții se maturizează produc proglote, care se maturează, devin gravide se detașează de viermele adult și sunt eliminate prin materiile fecale 48

(aproximativ 6/zi). Adultul de Taenia saginata conține în mod obișnuit 1000-2000 de proglote, în timp ce Taenia solium conține o medie de 1000 de proglote. Ouăle conținute în proglotele mature sunt eliberate după ce proglotele sunt eliminate prin scaun. Taenia saginata produce până la 100.000 ouă/proglot în timp ce Taenia solium până la 50.000 ouă/proglot. Stadiul de diagnostic: ou, proglot matur, adult întreg/fragment. Perioada necesară de la infecție până la diagnostic: aproximativ două - trei luni. Diagnostic: 1. Examenul coproparazitologic – pune în evidență existența ouălor și/sau a proglotelor. Ambele specii de Taenia produc ouă identice din punct de vedere morfologic. Dacă sunt identificate ouă în examenul direct/ proba de concentrare NU se poate diferenția specia numai după aspectul oului.

Taenia spp. Ouă 40x 2. Probe de concentrare – metoda Kato, formol-eter, Willis Hung 3. Amprenta anală – în momentul eliminării proglotelor sunt eliberate ouă care pot ramane în pliurile anale, fiind puse în evidența prin tehnica scotch-ului. 4. Identificarea morfologică proglotelor cu ajutorul probei cu tușul de India. Se introduce tuș de India prin orificiul genital al proglotului, care apoi este examinat la microscop/stereomicroscop, pentru a observa ramificațiile uterului.

Taenia saginata Scolex ( 4 ventuze)

Proba cu tus de India

49

Taenia solium Scolex (4 ventuze + coroana de cârlige)

Proba cu tus de India

Identificarea la microscop/stereomicroscop a scolexului. Pentru viitoarea conduită terapeutică este foarte important să de identifice specia de tenie adusă spre examinare. Această identificare se face numai prin identificarea ramificațiilor uterine, utilizând tehnica tușului de India, precum și prin identificarea scolexlui parazitului. În cazul în care fragmentul adus în laborator nu conține scolex, trebuie luată în considerare posibiltatea ca acesta să nu se fi desprins din peretele intestinal, fapt care duce la concluzia că va produce în continuare proglote și în câteva luni (2-3) va reveni la forma matură. În diagnostic trebuie ținut cont și de câteva particularități comportamentale ale celor două specii de Taenia, și anume : - Tania saginata proglotele gravide, mature, se desprind de strobilă și se elimină activ prin orificiul anal între defecații. Au musculatura foarte dezvoltată și sunt foarte active chiar și după ce au fost eliminate. Sunt colectate de pe lenjeria intimă. - Taenia solium proglotele gravide, mature, se desprind de strobilă și se elimină impreună cu materiile fecale în momentul defecării. Cisticercoza

50

Cisticercoza este infecția cu stadiul larvar al cestodului Taenia solium, întâlnită atât la oameni cât și la porcine. Infecția este cauzată de ingestia ouălor eliminate prin materiile fecale de către un purtător uman al adultului de Taenia solium . Porcinele și oamenii devin infectați prin ingerarea proglotelor gravide sau/și a ouălor , . Oamenii se mai pot infecta prin consumul de hrană contaminată cu fecale cu Taenia solium (autoinfecție). În ultimul rând, o persoană infectată cu un adult de Taenia solium poate ingera ouăle produse de propriul parazit, fie prin contaminare fecală fie prin peristaltism invers, acestea ajungând în stomac. Odată ingerate ouăle, oncosferele sunt eliberate în intestin , , penetrează peretele intestinal și migrează către musculatura striată, creier, ficat, și alte țesuturi unde se dezvoltă cistirecii . În cazul localizărilor cerebrale, pot cauza daune majore, generând neurocisticercoza. Când oamenii consumă carne infestată cu cisticerci și insuficient preparată termic, ciclul biologic al parazitului este complet . Chiștii evaginează și se atașează de intestinul subțire prin scolex . Adultul se dezvoltă (până la 2-7 m lungime și produce aproximativ 1000 proglote, fiecare cu 50.000 ouă/proglot) și traiește în intestin mai mulți ani. Diagnostic: în cazul suspiciunii de cisticercoză diagnosticul se pune pe baza testelor specifice. Metoda de screening cea mai utilizată este reacția imunoenzimatică (ELISA). La ora actuală există multe kit-uri comerciale disponibile. Această metodă pune în evidență în serul pacientului anticorpii specifici anti-Taenia solium. Reacția este una calitativă sau semicantitativă, sensibilitatea și specificitatea kit-urilor fiind diferite in funcție de producător.Trebuie ținut cont 51

de eventualele reacții încrucișate, iar rezultatele pozitive trebuie confirmate prin reacția de confirmare specifică western blot. Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIVcu Absenți/ Prezenți anticorpi specifici anti-Taenia solium. Reacția western blot este o reacție cu o sensibilitate și specificitate superioare reacției ELISA. Permite confirmarea suspiciunilor de cisticercoza prin analizarea probelor atât de ser cât și de LCR. Un răspuns pozitiv pentru o probă testată din lichid cefalorahidian indică prezența neurocisticercozei și este un factor de decizie important în ceea ce privește conduita terapeutică viitoare. Suportul este reprezentat de benzile de nitrocelulooza impregnate cu antigene parazitare specifice (proteine cu greutati moleculare definite). În contact cu serul/LCR aceste proteine formează complexe antigen-anticorp în poziții specifice. Rezultatul este raportat NEGATIV/POZITIV în funcție de prezența benzilor specifice în locurile bine stabilite. Greutatea moleculară a benzilor și numărul lor diferă de la un producător la altul.

În exemplul de mai sus rezultatul este considerat pozitiv în: SER – dacă sunt prezente ce puțin două benzi bine definite (din cele 5 benzi specifice descrise: 6-8, 12,23-26, 39, 50-55 kDa) LCR - daca este prezentă ce putin o bandă bine definită (din cele 5 benzi specifice descrise: 6-8, 12,23-26, 39, 50-55 kDa).

52

Diagnosticul himenolepidozei Clasificare: Phylum Plathelmintes, Clasa Cestoda, Ordinul Cyclophillidae, Familia Hymenolepididae, Genul Hymenolepys, Speciile: Hymenolepis nana/diminuta. Ciclul biologic: Hymenolepis nana

Ouăle de Hymenolepis nana sunt infectante imediat ce sunt eliberate cu proba de materii fecale și nu rezistă în mediul exterior mai mult de 10 zile . Când omul ingerează ouăle (cu hrana sau apa contaminate, sau de pe mâinile contaminate cu fecale), oncosferele conținute în ouă sunt eliberate. Oncosferele (larvele hexacante)penetrează vilozitațile intestinale și dezvoltă larva cisticercoidă .Prin ruperea vilozitatilor, larvele cisticercoide revin în lumenul intestinal, și evaginează scolecsul , care se atașează de mucoasa intestinală și se transformă în adulți, de obicei în zona ileonului, producând proglote gravide . Ouăle sunt eliberate prin materiile fecale pe masură ce sunt eliberate din proglote prin porul genital, sau prin dezintegrarea proglotelor în intestinul subțire . O variantă alternativă de Infecție este autoinfecția internă, prin care din ouă sunt eliberați embrionii hexacanti, ce penetrează peretele vilozitaților continuând ciclul parazitar până la eliberarea în mediul extern prin materiile fecale .Durata de viață a unui vierme adult este de 4-6 săptămâni, dar autoinfecția permite ca infestarea să dureze și ani de zile. 53

Când ouăle sunt ingerate de către un artropod, gazda intermediară (diferite specii de gândaci și purici pot servi drept gazda intermediară), ei se dezvoltă în cisticercoizi, care în urma ingerării pot infecta oamenii sau rozatoarele și se transformă in adulți în intestinul subtire. O variantă identică, H.nana var.fraterna, infectează rozatoarele și utilizeaza artropodele ca gazde intermediare. Ciclul biologic: Hymenolepis diminuta

Ouăle de Hymenolepis diminuta sunt eliminate în fecalele gazdelor definitive infectate (rozătoare, oameni) .Ouăle mature sunt ingerate de gazdele intermediare (diferite artropode adulți sau larve) , oncosferele sunt eliberate din ouă și penetrează peretele intestinal al gazdei , și se transformă în larve cisticercoide. Speciile din genul Tribolium sunt gazde intermediare comune pentru specia Hymenolepis diminuta. Larvele cisticercoide persistă în cursul dezvoltării artropodului până la stadiul de adult. Infecția cu H.diminuta la mamifere survine după ingerarea de către mamifer a gazdei intermediare purtătoare a larvei cisticercoide .Oamenii pot fi infectați accidental prin ingerarea insectelor existente în cereale, sau în alte produse alimentare sau direct din mediul inconjurător (fenomenul “pica” întâlnit la copii). Dupa ingerare, țesuturile artropodului infectat sunt digerate eliberând larva cisticercoidă în stomac și în intestinul subțire. Evaginarea scolecsului are loc imediat după ce larva cisticercoidă este eliberată. Parazitul se atașează de mucoasa intestinului subțire utilizând cele 4 ventuze. Maturarea parazitului survine in decurs de 20 de zile , iar adultul poate atinge o lungime medie de aproximativ 30 cm .Ouăle sunt eliberate din proglotele gravide în intestinul subțire , 54

proglote adulte care se desprind din corpul viermelui adult și se dezintegrează. Ouăle sunt eliminate în mediul exterior odată cu materiile fecale ale mamiferului gazdă .

Tribolium castaneum – Gazda intermediara pentru Hymelopepis diminuta

Stadiul de diagnostic: ou, adultul Perioada de timp de la infestare până la diagnostic: 4-6 săptămâni (H.nana); aproximativ 20 zile (H.diminuta). Diagnostic: 1.Examen corpoparazitologic direct: Identificarea oului de Hymenolepis nana/diminuta în proba de materii fecale, utilizându-se ser fiziologic/Lugol. Identificarea se face utilizând un microscop standard, iar pentru examinare obiectivele de 10x ,respectiv 40x (pentru detalii). Hymenolepis nana - la maturitate segmentele mature se dezintegreaza și elibereaza ouăle, care masoară aproximativ 30-47 µm în diametru. Oncosfera este acoperită cu un strat extern subțire, hialin (membrana externă) și o membrană internă, groasă cu două ingroșări polare de unde pornesc filamente circulare (Hymenolepis nana). Hymenolepis nana – ou (40x)

Hymenolepis diminuta – ou (40x)

Hymenolepis diminuta - ouăle sunt mai mari , rotunde sau usor ovale, 70 – 85 µm X 60 -80 µm, cu o membrană externă striată și una internă subțire. Oncosfera are 6 cârlige și NU EXISTĂ filamente polare în spațiul existent între oncosfera și membrana externă.

55

2. Metode de concentrare: - metoda Willis Hung - metoda Ritchie 3. Identificare adultului și/sau a proglotelor în proba de materii fecale: Hymenolepis nana (grecescul “nanos”= pitic) rareori depașește 40 mm lungime și 1 mm lățime. Scolexul poartă un rostru retractabil înarmat cu o coroană formată dintr-un singur rând de cârlige (23-30 la număr). Scolexul mai conține, de asemenea, și 4 ventuze. Gâtul este lung și subțire, iar segmentele sunt mai mult late decât lungi. Strobila începe cu proglote scurte și înguste, urmate de cele mature, adulte.

Hymenolepis nana –adult

Hymenolepis nana – scolex

Hymenolepis nana – proglote mature

Hymenolepis diminuta – adultul măsoară 20 -60 cm lungime, proglotele sunt similare cu cele ale Hymenolepis nana cu diferența că sunt mai mari.

56

Himenolepis diminuta - adult

Hymenolepis diminuta - scolex

Himenolepis diminuta – proglote mature

57

Diagnosticul botriocefalozei Clasificare: Phylum Plathelmintes, Clasa Cestoda, Subclasa Eucestoda, Ordinul Pseudophyllidae, Familia Diphyllobotriidae, Specia Diphyllobotrium latum Ciclul biologic:

Ouăle imature sunt eliminate prin materiile fecale . Ouăle se maturează în condiții corespunzătoare în aproximativ 18-20 zile și dezvoltă oncosferele care se vor transforma în coracidii . După ingerarea de către un anumit crustaceu de apă dulce (copepodul este prima gazda intermediară) coracidia se transformă în larva procercoidă . În continuare copepodul este ingerat de a doua gazdă intermediară Notropis stramineus , pești mici de apă dulce, larvele procercoide sunt eliberate din copepod și migrează în musculatura peștelui unde se transformă în larve plerocercoide (sparganum) . Larvele plerocercoide reprezintă stadiul infectant pentru om. A două gazda intermediară poate fi ingerată de prădători mai mari de exemplu păstrăvi, bibani . În acest caz sparganum poate migra în musculatura prădătorilor mai mari, iar oamenii devin infestați prin consumul acestora din urmaă , carnea fiind crudă sau 58

insuficient preparată termic .După ingerare larvele plerocercoide se transformă în adulți imaturi apoi în tenii adulte în intestinul subțire al gazdei. Adulții de Diphyllobotrium latum se atașeaza de intestinul subțire al gazdei prin intermediul celor două botrii (fante laterale) ale scolexului .Adulții pot atinge peste 10 m lungime, cu mai mult de 3000 proglote. Ouăle imature sunt eliberate din proglote (peste 1000.000 ouă/zi/adult) și sunt eliminate prin fecale . Ouăle apar in fecale la 5-6 săptămâni de la infecție. În afară de oameni multe alte mamifere pot servi drept gazdă definitivă pentru Diphyllobotrium latum.

Stadiul de diagnostic: ouăle, proglotele, adultul. Perioada de timp de la infecție până la diagnostic: 5-6 săptămâni Diagnostic: 1. Examen coproparazitologic direct: identificarea în examenul microscopic a ouălor de Diphyllobotrium latum utilizându-se examinarea între lamă / lamelă cu ser fiziologic și/sau Lugol. Oul de Diphyllobotrium latum este un ou mare având dimensiunea de 40x60 µm, cu un opercul (capac la una din extremități) si cu un buton (“knob”) la extremitatea opusă operculului. 2. Metode de concentrare: -

Metoda Willis Hung

-

Metoda Ritchie

3. Identificarea proglotelor și/sau adultului în materiile fecale:

Diphyllobotrium latum - ou

59

Diphyllobotrium latum – scolex/proglote mature

60

Diagnosticul leishmaniozei Clasificare: Phylum Euglenozoa, Clasa Kinetoplastida, Ordinul Tripanostomatida, Genul Leishmania, Speciile: L.aethiopica, L.chagași, L.donovani, L.infantum, L.major, L.mexicana, L.tropica (și altele). Ciclul biologic:

Leishmanioza este transmisă prin înțepătura unor insecte hematofage aparținând ordinului Diptera, subfamiliei Phlebotominae, genului Phlebotomus și/sau Luzomyia numite“sandflies”. Există aproximativ 93 specii de sandflies dovedite stiintific ca fiind vectori pentru speciile de Leishmania. Insecta injectează prin trompa (proboscis) în timpul prânzului hematofag) saliva conținând stadiul infectant (promastigotele) . Promastigotele care ating locul puncției sunt fagocitate de către macrofage unde se transformă în amastigote și: (a) ramân cantonate în locul inoculării determinând apariția “butonului de orient”;(b) sunt incorporate în macrofage sunt raspândite prin circulația sanguină către alte regiuni ale corpului uman afectând țesuturile mucoase și cartilaginoase (leihmanioza cutanată diseminată/leishmanioza muco-cutanată); (c) Infecția initial cantonată la nivel cutanat, diseminează pe cale circulatorie la nivelul organelor interne: ficat, splină, maduvă ososă hematogenă (leishmanioza viscerală (Kala-Azar), unde se multiplică prin diviziune directă și vor infecta alte celule (inclusiv macrofage) . Insectele (“sandflies”) devin infectate în timpul prânzului hematofag ( , ). În corpul insectei,

61

amastigotele se transformă în promastigote în cavitatea abdominală (proboscis) .

și migrează către trompa

Leishmanioza este o boală cauzată prin transmiterea de către un vector, din genul Phlebotomus și/sau Luzomyia , a agentului cauzator, un protozoar obligat intracelular din genul Leishmania. Infecția umană este cauzată de aproximativ 21-30 specii care afectează și alte mamifere. Acestea includ complexul L.donovani cu 3 specii (L.donovani, L.infantum și L.chagasi), complexul L.mexicana cu 3 specii principale (L.mexicana, L.amazonensis și L.venesuelensis), subgenul Viannia cu 4 specii importante (L.(V.)braziliensis, L.(V.)guyanensis, L.(V.)panamensis și L.(V.)peruviana). Speciile diferite nu pot fi diferențiate morfologic, dar diferența se poate face prin analize izoenzimatice, metode de biologie moleculară și/ sau utilizând anticorpi monoclonali.

62

63

Diagnostic: 1. Metode de screening: Reacția de imunofluorescență indirectă și reacția imunoenzimatică (ELISA). - Reacția de imunofluorescență indirectă (IIFT) prin care se pun în evidență existența anticorpilor anti-Leishmania spp. (cel mai frecvent donovani). Pentru examinarea preparatului este necesar un microscop cu imunofluorescență cu obiective de 20x/40x

Leishmania donovani – Pozitiv (IIFT)40x Testul poate fi realizat calitativ sau cantitativ. Rezltatul este raportat: NEGATIV/POZITIV – Absenți/Prezenți anticorpi specifici anti-Leishmania spp. În cazul testelor cantitative trebuie menționată ultima diluție la care a fost observată reacția (în cazul probelor pozitive), respectiv NEGATIV cu diluția de pornire. -

ELISA pentru determinarea anticorpilor specifici anti-Leishmania spp. Este o reacție mai puțin utilizată din cauza procedurii mai complicate și a costurilor mult mai mari decât în cazul imunofluorescenței. 2. Metode de confirmare : - frotiuri colorate Giemsa: se evidențiază parazitul (formele promastigote) în frotiuri efectuate din materialul recoltat din: amprente, secțiuni de material bioptic din leziunile cutanate, puncții ganglionare, sternale, din creasta iliacă, mai rar din ficat sau splină.

Leishmania donovani – promastigoți (100x)

64

Leishmania spp. – amastigote – Western Blot, este o reacție calitativă utilizată drept confirmare pentru probele testate în prealabil prin metoda de screening (IIFT/ELISA). Reacția se poate efectua utilizând ser și prezintă o sensibiltate și specificitate mare.

Exemplu de reacție pozitivă de western blot pentru Leishmania spp.:

-

În acest caz rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV – prezența/absența pe strip-ul de test a benzilor specifice cu greutatea moleculară de 14 și/sau 16 kDa indică prezența anticorpilor specifici IgG de Leishmania în ser.

65

Diagnosticul malariei Clasificare: Phylum Apicomplexa, Clasa Aconoidașida, Ordinul Haemosporida, Familia Plasmodiidae, Genul Plasmodium, Speciile: malariae, falciparum, ovalae și knowlesii Ciclul biologic:

Ciclul biologic al parazitului Plasmodium implică existența a două gazde. În timpul prânzului hematofag, femela de țânțar din specia Anopheles inoculează în gazda umană sporozoiții de Plasmodium . Sporozoiții infectează celulele hepatice și se transformă în schizonți , care se rup și eliberează merozoiții .(De reținut ca în cazul speciilor de P. vivax și P.ovale poate persista în ficat un stadiu dormant (hipnozoiți) care cauzează recăderi eliberându-se în circulația sanguină timp de săptămâni, sau chiar ani). După această replicare inițială în ficat (schizogonie exo-eritrocitară ), paraziții suferă o multiplicare asexuată în eritrocite (schizogonie eritrocitară ). Merozoiții infectează hematiile . Stadiul de inel se maturizează în schizonții, a căror distrucție duce la eliberarea merozoiților . O parte din paraziți se diferentiază în stadiile sexuate eritrocitare (gametociții) .Stadiile sanguine ale parazitului sunt responsabile pentru manifestările clinice ale bolii. Gametociții masculi (microgametociții) și femeli (macrogametociții) sunt ingerați de către femela de Anopheles în timpul prânzului hematofag . Multiplicarea paraziților în organismul 66

țânțarului este cunoscută drept ciclul sporogonic . În stomacul țânțarului, microgametociții penetrează macrogametociții rezultând zigoții . Zigoții devin alungiți și mobili (ookineți) și penetrează peretele abdominal al țânțarului unde se transformă în oochiști . Oochiștii se dezvoltă, se rup și eliberează sporozoiții , care își continuă drumul către glanda salivară a țânțarului. Inocularea sporozoiților într-o nouă gazdă umană perpetuează ciclul biologic al malariei . Distribuția geografică a speciilor de Plasmodium

Stadiul preeritrocitar (zile) Perioada prepatentă Perioada de incubație (zile)

Speciile Plasmodium vivax

Plasmodium ovale

Plasmodium malariae

Plasmodium falciparum

6-8

9

14-16

5½-7

11 -13 10 – 14 15 -16 9-10 15 (12 – 17) 17 (16 -18) sau 28 (18 -40) sau 12 (9 -14) sau până la 6 mau mult mai mult 67

– 12 luni Ciclul eucariotic 48 (ore) (aproximativ) Parazitemia/µl (mm3) 20.000 Medie

50

72

48

9000

6000

20.000 500.000

Maximă Atacul primar*

20.000 Moderat

Perioada (ore) Recăderi Perioada de recurență** Durata infecției netratate (ani) Distribuție geografică

8 -10

50.000 30.000 Moderat pana Moderat la sever febrilă 8 -12 8 -12

–

++ Variabila

++ Variabila

Foarte lunga

2.000.000 Sever la cei neimunizati 16 -36 sau mai mult Scurta

1½-5

1½-5

3 – 50

1-2

Raspândită în regiunile temperate și subtropicale. Mai rar în zonele tropicale.

În principal în Raspândită în Africa tropicală vestul Africii zona tropicală și și alte țări din (are prevalența subtropicală. zona tropicelor. scăzută). De asemenea poate apărea și în alte regiuni ale Africii sub sahariene. * Severitatea infecției și gradul de parazitemie sunt foarte influențate de răspunsul imun. Chemoprofilaxia poate supresa un atac inițial de la câteva săptămâni până la câteva luni. ** Tiparele infecțiilor și recîderilor variază mult la diferitele tulpini.

Diagnostic: 1. Gold standard-ul pentru diagnosticul malariei îl reprezintă picătura groasa și frotiul din sângele periferic. La o examinare corectă a acestora se pun în evidență elementele parazitare caracteristice fiecărei specii de Plasmodium. Colorațiile folosite sunt: Giemsa și/sau Field A+B.Este o metoda de diagnostic extrem de utilă , dar care necesită condiții speciale pentru prelevarea probei și prelucrarea ei (recoltarea corectă, fixare, colorare și examinare cu ajutorul unui microscop standard cu obiectivul de 100x folosind ulei pentru imersie). Plasmodium falciparum

68

Picătura groasă – colorația Fields (obiectiv 100x)

a.Mai mulți trofozoiți și doi gametociți

b.Pigment cromatinian roșu și citoplasma albastră

Frotiu – Romanowsky (obiectiv100x) Trofozoiți mici, uneori mai mulți în aceeași celulă.Pigment Maurer (Maurer’s dots) Schizont, numai în severe

observat infecțiile

Gametociți pH 6,6 – 6,8

pH 7,0 – 7,2

69

70

Distribuție geografică Recăderi Generalitati

Hematiile gazdă

Trofozoiții

Schizonții

Gametociții

Africa tropicală și in alte zone din regiunea tropicală. Obișnuit se stinge în decursul primului an de la primul atac.  Sunt prezenți numeroși paraziți.  De obicei sunt identificați numai trofozoiții și gametociții  Nu sunt mărite de volum  FĂRĂ granulații Schuffner, dar în celulele ce conțin trofozoiții se observă granulațiile roșii-violet Maurer.  Pot apărea numeroși paraziți  Apar ca inele mici și delicate (pe frotiu) sau mici fragmente citoplasmatice cu granulații de cromatină (picătura groasă)  Pot avea și granulații duble de cromatină  În infecțiile severe, pot fi intâlnite inele mărite.  Foarte rar pot fi observați. Prezența lor pe frotiul sanguin (de obicei însoțiti cu cu multe inele) sunt un indicator al infecției severe care trebuie raportat imediat.  Daca apar, de obicei sunt mici, conținând numai puțini merozoiți și un singur fragment de pigment întunecat la culoare.  În formă de banană cu capetele rotunde și/sau ovale  Pigmenți granulari, în special în jurul nucleului.

71

Plasmodium malariae Picătura groasă- colorația Fields (obiectiv 100x)

a.Trofoziți și schizonți tineri. De obicei se b.Gametocitul (sus) și schizont matur. găsesc numai puțini trofozoiți în infecțiile cu De remarcat dimensiunea mică și același Plasmodium malariae.De observat pigmentul pigment galben brun al parazitului. Frotiu – Romanowsky (obiectiv100x) Trofoizoiți , de obicei puțini și în formă de bandă. Prezent numeros pigment galben brun. Schizonți, integri și la maturitate conțin până la 10 merozoiți pH 6,6 – 6,8

Gametociții sunt mici, de formă rotundă sau ovală pH 7,0 – 7,2

72

73

In zona tropicală și subtropicală. Distribuție geografică Persistă mai mulți ani după atac Recăderi  Generalități  Hematiile gazda

 

Trofozoiții

  

 Schizonții   Gametociții  

74

Rareori sunt mai mult de 1% din hematii sunt infectate De obicei sunt identificați trofozoiții, schizonții și gametociții Nu sunt mărite de volum FARA granulații Schuffner sau Maurer Groși, compacți și dens colorați Sub forma de bandă conținând pigment galben-maroniu (frotiu) “Bird’s eye” – poate fi observat ocazional (un inel citoplasmatic ce înconjoară o granulație centrală de cromatină). Mici și compacți cu merozoiții dispuși ordonați cu un pigment galben-maroniu abundent. Schizonții maturi conțin până la 12 merozoiți și puțină citoplasma. Mici,compacți, rotunzi sau ovali. Este dificil sa îi diferențiezi de trofozoiții maturi. Nucleii dispuși de obicei excentric. Pigment galben-maroniu ușor de observat.

Plasmodium vivax Picătura groasă- colorația Fields (obiectiv 100x)

a. Trofozoiți și schizonți. Trofozit matur (in b Schizont tânar și gametociți centru) înconjurat de granulații James Frotiu – Romanowsky (obiectiv100x) Trofozoiții sunt mari și cu citoplasma fragmentată (impraștiată). Hematiile sunt mărite de volum, cu forma neregulată și conțin granulații Schuffner pH 6,6 – 6,8

Schizonții sunt mari, iar la maturitate conțin pH 7,0 – 7,2 24 sau mai mulți merozoiți. Granulații Schuffner. Gametociții sunt mari și cu forma neregulată Granulații Schuffner.

75

Distribuție geografică Recaderi Generalități

Hematiile gazdă

Trofozoiții

Schizonții

Gametociții

76

În majoritate în regiunile temperate, subtropicale și în zonele tropicale. Obișnuit se stinge in 3 -5 ani de la primul atac.  Rareori sunt mai mult de 2% din celule infectate  De obicei sunt identificați trofozoiții, schizonții și gametociții  Sunt mărite de volum și capătă forme neregulate  Granulațiile Schuffner sunt prezente și pot fi observate înconjurând paraziții (picătura groasă).  Majoritatea sunt mari, neregulați ca formă (amoeboizi). In picătura groasă citoplasma apare fragmentată.  Granule fine de pigment apar în citoplasmă.  Mari, rotunzi sau cu forma neregulată  Schizonții maturi conțin 24 sau mai mulț merozoiți și o cantitate mică de pigment.  Mari, rotunzi sau cu forma neregulată.  Pot fi observate de asemenea granule de pigment impraștiate.

Plasmodium ovale Picătura groasă- colorația Fields (obiectiv 100x)

a.Trofozoiți și schizonți (dreapta sus).Trofozoit b. Schizont tânar și gametociți matur (în centru) înconjurat de pigment James. Frotiu – Romanowsky (obiectiv100x) Trofozoiți tineri și integri. Hematiile conțin pigment James și pot deveni ovale.

pH 6,6 – 6,8

Schizonții sunt mici, iar la maturitate pot conține până la 10 merozoiți. Pigment James și celule pH 7,0 – 7,2 ovale. Gametociții sunt mici. Pigment Schuffner(James.)

77

78

Distribuție geografică

Intâlnită în special în Africa de Vest (are prevalență scazută). Mai poate fi îtâlnită și în alte regiuni ale africii sub-sahariene. Puține

Recăderi  Generalități   Hematiile gazdă   Trofozoiții   Schizonții   Gametociții 

Rareori sunt mai mult de 2% din celule infectate De obicei sunt identificați trofozoiții, schizonții și gametociții Aproximativ 20 – 30% din celulele infectate devin ovale sau de forma neregulată cu prelungiri franjurate. Granulațiile Schuffner (James) sunt prezente și observate ca înconjurând paraziții în picatura groasă. Mici, compacți, similari cu cei de la Plasmodium malariae. Mai puțin pigment ca la Plasmodium malariae. Mici și similari cu cei de la Plasmodium malariae. Schizonții maturi conțin până la 10 merozoiți. Mici și de obicei rotunzi. Sunt dificil de diferențiat de trofozoiții maturi (“late stage trophozoites”) Nucleii de obicei excentrici

79

Plasmodium knowlesii Picătura groasă –Giemsa 100x

a.Infecție severă cu Plasmodium knowlesii b.Trofozoiți și gametocit de Plasmodium evidențiind trofozoiți, gametocit și schizont knowlesii Frotiu – Giemsa 100x

Plasmodium trofozoiți

80

knowlesii Plasmodium knowlesii Plasmodium knowlesii gametociti (gam) și trofozoiți schizonți (sch) și trofozoit. cu aspect de bandă

Distributie geografică Recăderi Generalități

Malaysia, S-E Asiei Puține    

Hematiile gazdă

   

Trofozoiții

 





Schizonții

 

Gametociții

 

Parazit natural mal macacului. Frecvent infecții mixte P.knowlesii cu P.falciparum Infecțiile sun foarte severe, P.knowlesii multiplicându-se asexuat la fiecare 24 de ore cu pusee febrile zilnice. In frotiurile sanguine sunt observați trofozoiții, schizonții și gametociții. Pot fi prezenți numeroși paraziți. Nu sunt mărite de volum Ocazional apar cu captele franjurate Pot contine granulații neregulate caracteristice Când sunt prezente numai stadiile tinere de trofoziți pot fi ușor confundate cu cele de la P.falciparum Într-o singură celulă pot fi întâlniți mai mulți trofozoiți. Granulații simple, duble și uneori chiar triple de cromatină pot fi observate (“early trophozoit”). Citoplasma este compactă și densă, usor amoeboidă, aspect de bandă; pigmentație variabilă (“late trophozoit”) Citoplasma compactă, densă, formă rotundă; pigmentație închisă și aspect de bandă; forma NEAMOEBOIDĂ (“mature trophozoite”) Similari cu cei de la Plasmodium malariae cu aglutinări de pigment închise la culoare (maron închis). Schizonții maturi conțin până la 16 merozoiți Rotunzi cu pigment difuz, similar celui de la P.malariae În mod obișnuit umplu întreaga celulă parazitată

2. Teste rapide de diagnostic – sunt bazate pe tehnici imunocromatografice utilizând ca markeri ai infecției anticorpi monoclonali. Antigenele parazitare ce urmează a fi identificate este de preferat să fie din toate fazele de dezvoltare ale parazitului (sexuate și asexuate) și anume: HRPII (histidine rich protein II) , LDH (lactat dehidrogenaza) și 81

aldolaza. Organizația Mondiala a Sănătății a stabilit ca sensibilitatea testelor rapide trebuie să fie apropiată de 100% la o parazitemie de 100 paraziți/l.

C= banda de control (în cazul absenței ei testul este invalid și trebuie repetat) T1 = indică prezența antigenelor specifice de Plasmodium falciparum T2 = indica prezența antigenelor specifice de Plasmodium vivax+malariae+ovale -

Prezența benzilor poate persista și câteva zile până la săptămâni după instituirea tratamentului. Prezența benzilor nu este indicator de reinfecție. În cazul unui rezultat negativ este necesară repetarea testului in 48 de ore.

Sensibilitatea testelor rapide variază in funcție de producător (aproximativ 81,5%), iar specificitatea de asemenea (aproximativ 81,9%). Procedura de lucru și interpretarea sunt relativ simple (în aproximativ 15 min. testul este finalizat), dar având în vedere sensibilitatea și specificitatea mai reduse este recomandat să nu se utilizeze ca unică metodă de diagnostic. Ideal este sa fie folosite cel puțin ambele metode (testul rapid+frotiu).

82

ARTEFACTE

La examinarea de rutina a unei probe de materii fecale este necsar sa tinem cont de o multitutide de factori: varsta pacientului, dieta acestuia, medicatia utilizata. In continuare vom considera fiecare fctor in parte astfel: Varsta pacientului: este un indiciu important deoarece in functie de aceasta vor fi comunicate sau nu in raportul de analiza anumite elemente intalnite in proba pacientului. De exemplu scaunul unui copil va contine mai multe elemente vegetale nedigerate (amidon, celuloza), acestea ne avand o semnificatie deosebita din punct de vedere clinic, deoarece dieta copiilor este de regula, bogata in fibre, iar tranzitul intestinal al acestora este mai rapid decat al unui adult. Daca aceste elemente (amidon, celuloza nedigerate), apar in scaunul unui adult imunocompetent, in cantitati demne de luat in seama (1-3 elemente/campul microscopic), acestea indica fie tulburari de tranzit – in acest caz fiind asociate cu scaune diareice, chiar apoase, fie cu tulburari ale florei intestinale, uneori fiind insotite si de infectia cu Helicobacter pylori. Dieta pacientului: daca pacientul are o dieta iogata in fibre, scaunul pacientului poate contine elemente carecteristice respectiv – amidon, celuloza, fibre vegetale, digerate si/sau nedigerate. Daca aceste sunt prezente in cantitati mari (1-3 elemente /camp microscopic) este bine sa fie mentionate pentru a orienta medicul clinician in diagnostic. Medicatia: scaunul poate fi modificat de administrarea diferitelor medicamente. Un exemplu este administrarea fierului, care genereaza scaune inchise la culoare (aproape de culoarea negru). In examinarea microscopica a materiilor fecale intervine frecvent confuzia diferitelor stadii parazitare cu alte elemente de origine umana sau vegetala. Examinarea preparatelor microscopice trebuie sa se realizeze cu o deosebita atentie intrucat aceste confuzii sunt foarte frecvente. Pentru acest lucru se utilizeaza un microscop standard cu obiective cuprinse intre 10x si 40x magnificatie. Elementele de origine umana ce pot aparea frecvent in preparatele proaspete sunt: cristalele Charcot-Leyden, celulele epiteliale, polimorfonuclearele, hematiile. 

Cristalele Charcot-Leyden

Cristale Charcot-Leyden 40x Cristalele Charcot-Leyden sunt rezultatul dezintegrarii eosinofilelor si pot aparea in materiile fecale la persoanele care sufera de boli parazirare sau alergice.

83



Celule epiteliale

Celula epiteliala versus trofozoit amoebian 40x Este de remarcat refringenta diferita a celor doua elemente si raportul diferit intre dimensiunea nucleului si masa citoplasmatica



PMN si hematii

PMN si hematii 10x Elementele de origine vegetala ce pot aparea in preparatele proaspete sunt: amidonul, celuloza, fibrele vegetale, polenul.

84



Amidonul

Amidon nedigerat 10x (SF)

Amidonul are un aspect foarte apropiat de oul de Enterobius vermicularis. Pentru un ochi mai putin experimentat confuzia se poate face extrem de usor. Pentru a evita orice suspiciune se realizeaza reactia de diferentiere specifica cu Lugol. Particulele de amidon incorporeaza Iodul din Lugol, in timp ce ouale de Enterobius NU se coloreaza!!

Amidon nedigerat 10x (Lugol)

85

Amidon nedigerat_ou de Enterobius vermicularis 0x



Celuloza

Celuloza nedigerata 10x Aspectul cel mai frecvent intalnit la celulozei este de “batista sifonata”. Prezenta celulozei in scaun, in absenta unui regim bogat vegetarian, indica existenta unor probleme de absobtie si/digestie si pacientul ar trebui indrumat catre serviciul de gastroenterologie.

86



Fibrele vegetale

87

Fibre vegetale cu aspecte diferite 10x

Fibrele vegetale adesea sunt confundate cu larvele nematodelor Strongyloides stercoralis, Necator americanus, Ancylostoma duodenalae. La o examinare atenta, se observa ca fragmentele vegetale nu prezinta structura interna, nu se evidentiaza esofagul rabditoid caracteristic speciilor mentionate mai sus si de cele mai multe ori extremitatile se incheie brusc, fiind rupte. Un alt aspect important este ca fragmentele vegetale sunt inerte, in timp ce larvele nematodelor sunt extrem de active.

88

Fibre vegetale versus larva de Strongyloides stercoralis 10x 

Polenul

Polenul este unul din elementele vegetale cel mai polimorf. Poate avea aspecte si dimensiuni variabile unele dintre ele foarte apropiate cu elementele parazitare. La o examinare mai atenta se observa absenta structurilor interne sau caracteristicilor morfologice specifice parazitului suspectat. Pentru observarea detaliilor este necesara utilizare obiectivului cu magnificatie 40x.

Polen 20x

Polen 20x

Ou de Taenia spp. 20x

89

Polen 40x

Ou de Taenia spp. 40x

Ou de Taenia spp. 40x

Polen 40x

90

Ou de Trichuris trichiura 40x

Polen 40x

Ou de Ascaris lumbricoides 40x

Cele doua imagini de mai sus aparent sunt identice, dar la o examinare atenta se observa ca invelisul extern al granulei de polen prezinta spini, pe cand membrana externa a oului de Ascaris lumbricoides este mamelonata.



Levurile Levurile sunt prezente in materiile fecale in mod obisnuit. Ceea ce este important de luat in seama si de comunicat este densitatea acestora. Prezenta levurilor in cantitati mari in materiile fecale poate indica fie o recoltare si stocare incorecta a probei pana a fost transportata la laborator (scaunul a fost recoltat inainte de 24 de ore si stocat la temperatura camerei), fie administrarea unor medicamente (antibiotice) care pot produce un dezechilibru de flora intestinala si de pH ce poate favoriza inmultirea aberanta a levurilor. Mentionarea acestui amanunt este foarte importanta pentru orientarea clinicianului in diagnostic.

91

Levuri 20x

Levuri 40x

92

Levuri si chisturi de Giardia duodenalis 40x

Prezenta unui mare numar de levuri de tip Candida, in absenta unui de diferentiat cand este vorba in special de diagnosticul giardiozei. Levurile au dimensiuni si aspect apropiat chisturrilor de Giardia intestinalis. Pentru distingerea detaliior de structura se utilizeaza obiectivul de 40x. In cazul levurilor refringenta este alta (mai mica decat in cazul chisturilor de Giardia), se remarca absenta axostilului si a nucleilor.

93

94

Examen coproparazitologic (SF_40x)

95

Examen coproparazitologic (SF_40x)

96

Analiza coproparazitologica este un examen microscopic ce necesita experienta din partea investigatorului pentru a diferentia elementele parazitare de cele non parazitare. Est necesara examinarea in pieptene a lamei de microscop, in asa fel incat toata suprafata preparatului sa fie observata cu mare atentie. In cazul observarii unor elemente cu aspect caracteristic, inainte de a trage o concluzie trebuie efectuate teste de diferentiere si utilizarea obiectivelor cu magnificatie superioara (20x, 40x) pentru a putea diferentia elementele non parazitare de cele parazitare. Utilizarea obiectivelor cu magnificatie superioara permite observarea detaliilor de structura ale elementului observat, diferentele de refringenta intre chisturile unor paraziti si diferite artefacte, precum si diferentele intre dimensiunile elementelor observate. Ca o concluzie, pentru efectuarea unui examen coproparazitologic complex si corect trebuie tinut cont de detaliile clinice ale pacientului (deci o anamneza corecta si furnizarea tuturor detaliior necesare laboratorului), o dotare corespunzatoare (microscop standard cu obiective de 10x,20x,40x), rectivii necesari efectuarii tutror reactiilor de diferentiere (Lugol) si nu in ultimul rand de calificarea si experienta necesara, acesta implicand o cunoastere amanuntita a ciclului biologic, deci si a stadiilor de dezvoltare ale posibililor paraziti din patologie umana precum si sute de preparate observate in antecedente.

97

Managementul calităţii Laboratoarele medicale sunt preocupate de creşterea calităţii rezultatelor analizelor medicale pe care le efectuează pentru pacienţi . Factorii care influenţează calitatea rezultatelor analizelor efectuate de către laboratoarele medicale conform Ordinului nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007 sunt : - demonstrarea competenţei profesionale a personalului care îşi desfăşoară activitatea în laboratorul de analize medicale - competenţă care trebuie evaluată periodic conform art. 6 alin 1); - efectuarea controlului intern al calităţii, analizarea valorilor obţinute la efectuarea controlului intern al calităţii şi evaluarea externă a calităţii - menţionate în SECŢIUNEA a 9-a-Managementul calităţii. Demonstrarea competenţei profesionale a personalului Numărul specialiştilor din laboratoarele medicale în parazitologie medicală ( medici cu specialitatea medicina de laborator, biologi, chimiști, biochimiști, asistenți medicali licenţiaţi ) este restrâns datorită perioadei de formare profesională specifice fiecărei categorii profesionale: -

-

medicii se pregătesc 11 ani pentru a lucra în laboratorul medical (6 ani studii universitare şi 5 ani rezidenţiat în medicina de laborator); biologii, chimiştii şi biochimiştii se pregătesc 4-5 ani prin studii universitare în biologie, chimie şi biochimie, 6 luni de practică şi 4 ani experienţă pentru examenul de specialitate medicală – parazitologie medicală ; asistenţii medicali se pregătesc 3 ani în colegiu sau 4 ani la facultatea de medicină în cazul asistenţilor medicali licenţiaţi. În evidenţa Colegiului Medicilor din România existau în anul 2011 :

-2051 de medici cu specialitatea medicină de laborator , laborator medical sau cu specialitate în diferite compartimente ale laboratorului medical în judeţe iar în Municipiul București 471 medici deci în total, 2522 de medici . În evidenţa Ordinului Biochimiştilor, Biologilor şi Chimiştilor în sistemul sanitar din Romînia ( OBBCSSR) existau în anul 2011 : -

2504 specialişti cu autorizaţie de liberă practică în vederea exercitării profesiei ca biolog, chimist şi biochimist în laboratoarele medicale în judeţe iar în Municipiul Bucureşti 900 deci în total 3404 specialişti. 39 de biologi au specialitatea în parazitologie medicală dintre cei 3404 specialişti biologi, chimişti şi biochimişti din laboratoarele medicale cu drept de autorizaţie de liberă practică în anul 2014:

98

în judeţe – 29 de biologi în judeţele Argeş – 1, Bacău - 1,Bistriţa ăsăud – 1, Botoşani – 2, , braşov- 1, Buzău – 1, Cluj – 5, Constanţa – 1, Hunedoara – 1, Iaşi – 5, Maramureş – 2, Prahova – 2, Olt- 2, Satu Mare- 1, Sibiu- 1, Tulcea – 1, Timiş – 1 iar în Bucureşti .- 10 biologi cu specialitatea în parazitologie medicală.. Controlul intern de calitate în laboratorul de analize medicale SECŢIUNEA a 9-a , art. 23, Ordinului nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale prevede că : ”(1) Organizarea controlului intern al calităţii este responsabilitatea şefului de laborator de analize medicale. Reprezentantul legal al laboratorului de analize medicale are obligaţia de a asigura resursele necesare îndeplinirii acestuia. (2) Controlul intern al calităţii se efectuează zilnic, cel puţin o dată la 8 ore şi ori de câte ori este nevoie. (3) Rezultatele controlului intern obţinute se analizează de către specialistul responsabil de analiza respectivă, care decide acceptarea sau rejectarea rezultatelor obţinute.” Cerinţe legale de efectuare a controlului extern al calităţii pentru laboratoare medicale SECŢIUNEA a 9-a , art. 24 şi 25 , Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale prevede că : art. 24 ”(1) Laboratorul de analize medicale trebuie să participe în mod regulat la programe de evaluare externă a calităţii. (2) Evaluarea externă a calităţii se efectuează la solicitarea şefului de laborator de analize medicale, care se adresează unor instituţii furnizoare de servicii de evaluare externă a calităţii, notificate la Ministerul Sănătăţii Publice pentru acest domeniu de activitate. (3) Periodicitatea participării laboratoarelor de analize medicale la programele de evaluare externă a calităţii se stabileşte prin normele metodologice de aplicare a contractuluicadru privind condiţiile acordării asistenţei medicale în cadrul sistemului de asigurări sociale de sănătate.” art. 25”Rezultatele controlului calităţii şi măsurile luate pentru îmbunătăţire se consemnează şi se analizează după primirea fiecărui raport de evaluare a performanţelor laboratorului de analize medicale, obţinut în urma participării la programele de evaluare externă a calităţii”. Laboratoarele medicale care contractează analize decontate de CNAS din bugetul asigurărilor sociale de sănătate trebuie să efectueze un număr minim de 4 participări anuale la controlul extern al calităţii pentru a primi un punctaj - îndeplinirea criteriilor de calitate din lege Anexa nr. 19, Cap. II, lit. B, pct. 2, Criteriul de calitate, lit. b). – Norme metodologice de aplicarea Contractului – Cadru de acordare a asistenţei medicale în cadrul sistemului de asigurări sociale de sănătate. Laboratoarele medicale care sunt sau doresc să aibă acreditarea de la Organismul Naţional de Acreditare RENAR conform standardului SR EN ISO 15189:2013 Laboratoare medicale Cerinţe pentru calitate şi competenţă trebuie să îndeplinească cerinţa acestui standard de la pct. 5.6.3 Comparaţii interlaboratoare , pct. 5.6.3.1 “Participare NOTA” care precizează că 99

“ Se recomandă ca laboratorul să participe la programe de comparaţie interlaboratoare, care îndeplinesc în mod substanţial cerinţele relevante ale ISO / IEC 17043.” Programele de comparaţie interlaboratoare “care îndeplinesc în mod substanţial cerinţele relevante ale ISO / IEC 17043” sunt furnizate de organizatorii de control extern al calităţii – internaţionali sau naţionali - care au implementat standardul ISO 17043:2010, sunt acreditaţi sau în curs de acreditare de către organismul naţional de acreditare din ţara în care organizatorul controlului extern al calităţii are sediul în conformitate cu standardul SR EN ISO CEI 17043:2010 Evaluarea conformităţii Cerinţe generale pentru încercările de competenţă. CALILAB – controlul extern al calităţii în compartimentul de bacteriologie – parazitologie anul 2014 Asociaţia pentru Calitate în Laboratoare ( CALILAB ) este furnizor de control extern al calităţii notificat de Ministrul Sănătăţii şi recunoscut de RENAR care distribuie scheme de încercări de competenţă inclusiv în parazitologie. SCOPUL controlului external calităţii îl constituie compararea rezultatelor raportate de către laboratoarele medicale participante în urma “examinării materialelor provenite din corpul uman – în cazul examenului parazitologic – materii fecale - prin diverse metode şi tehnici cu scopul de a furniza informaţii pentru diagnosticul, tratamentul şi prevenirea bolilor sau pentru evaluarea stării de sănătate a populaţiei” – OMS 1301- 2007 – faţă de rezultatul aşteptat.. CALILAB distribuie în cadrul schemei de încercări de competenţă – parazitologie ca obiect supus încercării de competenţă -

materii fecale care conţin unul sau după caz, cînd se urmăresc scopuri ştiinţifice , mai mulţi paraziţi cu semnificaţie clinică întâlniţi în mod uzual în analizele de rutină ale pacienţilor efectuate de către laboratoarele medicale din România : Giardia intestinalis, Taenia spp. Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Enterobius vermicularis, Entameoba coli, Entameoba histolytica, Balstocystis hominis, Trichuris trichiura; sau

-

materii fecale care nu conţin elemente parazitare – sunt absente .

Motivaţia alegerii a două niveluri pentru încercarea de competenţă – parazitologie este următoarea :

100

-

nivelul 1 – absente elemente parazitare – corespunde celei mai frecvente situaţii întîlnite la efectuarea analizelor medicale de rutină din materii fecale ale pacienţilor;

-

nivelul 2 - prezente elemente parazitare – cu nominalizarea parazitului sau după caz, paraziţilor identificaţi - corespunde situaţiei în care laboratorul medical trebuie să ofere clinucianului informaţii pentru diagnosticul, tratamentul şi urmărirea eficienţei terapiei medicamentoase în cazul identificării unui parazit.

Participanţii sunt informaţi în instrucţiunea de utilizare a materialului de încercat că proba poate contine şi alte elemente ca de ex. produse alimentare nedigerate (amidon, celuloza, fibre vegetale) fara importanta în patologie şi că: - paraziții condiționat patogeni se raportează numai dacă există minimum 7 elemente parazitare pe câmpul microscopic.;acest număr de elemente parazitare obligatorii de identificat este valabil numai pentru paraziții condiționat patogeni (ex. Entamoeba coli, Blastocystis hominis). -

paraziții cu importanță în patologia umană se raportează indiferent de numărul de elemente parazitare observate pe câmpul microscopic.

Fiecare obiect supus încercării de competenţă - materii fecale de origine umană- conţine ca prezervant Formaldehida 10%.

Anterior prezervării materilalul biologic furnizat de CALILAB este testat pentru a nu exista în obiectul supus încercării de competenţă alte elemente parazitare decât cel sau cele aşteptate ca în exemplul următor conform fisei de însoţire pentru materialul de încercat care conţine oua ale parazitului de Taenia spp: Parametrul testat Antigen duodenalis

Antigen pylori

Metoda

Giardia Microscopie

Producator/Nr.lot/Data expirare Ser (Merck)

Rezultat

fiziologic/Lugol negativ

Imunocromatografie CerTest/G-042/07.2016

negativ

Helicobacter Imunocromatografie CerTest/P-159/09.2016

negativ

Antigen Cryptosporidium parvum

Imunocromatografie CerTest/N-031/12.2014

Antigen Entamoeba ELISA R-biopharm, coproantigene de Germania/14074/09.2015 hystolitica/dispar Entamoeba histolytica/dispar Taenia spp. – oua

Microscopie

negativ

negativ

Ser fiziologic/Kato Miura negativ 101

(Merck) Coloratie Ziehl Colorant Ziehl Neelsen Neelsen modificata Ascaris lumbricoides - Microscopie oua Hemoragii oculte

Ser fiziologic/Kato Miura

Imunocromatografie Innovacon/TFO 602/12.2015

negativ negativ negativ

În anul 2014 CALILAB a distribuit ca obiecte supuse încercării de competenţă materii fecale : -

corespunzătoare celei mai frecvente situaţii - materii fecale care nu conţin elemente parazitare – sunt absente – nivel 1 al materialului de încercat ;

-

corespunzătoare celei de a doua cea mai fracventă situaţie – cei mai întâlniţi paraziţi – materii fecale care au conţinut Giardia intestinalis , Ascaris lumbricoides , Taenia Spp.- nivel 2 al materialului de încercat – cei mai întâlniţi paraziţi cu semnificaţie clinică întâlniţi în materiile fecale umane în analizele de rutină effectuate de către laboratoarele medicale pentru pacienţi distribuite conform tabelului prezentat în continuare.

TABELUL distribuţiei obiectelor supuse încercării de competenţă în anul 2014 RUNDA

RUNDA

RUNDA

RUNDA

RUNDA

RUNDA

RUNDA

din

din

din

din

din

din

din

luna

luna Martie

luna Mai

luna Septembrie

luna Septembrie

luna Octombrie

luna Noiembrie

Evaluare initiala inainte de excludere

Dupa eliminarea rezultatelor de absent din evaluarea statistica

Februarie

Parazit trimis

Numar participan ti 102

Giardia intestinalis

Absente Absente Ascaris elemente elemente lumbricoide parazitare parazitar s e

Ascaris lumbricoides

Absente elemente parazitare

Taenia Spp.

99

339

230

213

488

412

Rezultate “satisfacat oare”

89,90%

83,78%

84,47%

36%

62.61%

46,01%

82,58%

Rezultate “acceptabi le”

7,07%

-

-

-

1,30%

-

8,81%

16,22%

15,53%

46,62% absente

36,09%

53,99%

8,61%

3,03% Rezultate “nesatisfac atoare”

19%-alti paraziti =65,62%

Graficile corespunzătoare evaluării rezultatelor raportate de către participanţi prin echivalenţa răspuns aşteptat versus rezultat raportat de către participanţi sunt prezentate în continuare pentru fiecare rundă a incercării de competenţă.

103

104

Concluzia analizei graficelor radiale care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către participanţi în rundele din lunile februarie, martie şi mai este că numărul răspunsurilor raportate de către participanţi şi evaluate ca “ nesatisfăcătoare” prin metoda echivalenţei rezultatului raportat versus răspuns aşteptat este în limita unui procent rezonabil : Runda din luna februarie 2014 - 3% pentru Giardia Intestinalis Runda din luna martie 2014 - 16,22% pentru absente elemente parazitare

Runda din luna mai 2014 - 15,53% pentru absente elemente parazitare În runda din luna septembrie 2014 materialul de încercat a conţinut parazitul Ascaris Lumbricoides.

.

105

Concluzia analizei graficului radial care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către participanţi în runda din luna septembrie 2014 este că: -

numai 36% dintre participanții la aceasta schema de incercari de competenta au identificat corect parazitul Ascaris lumbricoides prezent in materialul de încercat deşi materialul de încercat a fost omogen după cum relevă testele de omogenitate;

- numărul răspunsurilor “ nesatisfăcătoare” respectiv procentul răspunsurilor nesatisfăcătoare a fost prea mare : -un procent de 46,62 % nu au identificat niciun parazit în materialul de încercat răspunsul fiind “Absente elemente parazitare”, răspuns identic cu rundele din trimestrele I și II ale anului 2014 când materialul de încercat nu a conținut elemente parazitare; -19% dintre participanti au identificat un alt parazit (Giardia și Taenia), deși testele de omogenitate pe care le avem efectuate pentru materialul de încercat relevă faptul indubitabil că cei doi paraziți Giardia și Taenia nu se găsesc în materialul de încercat trimis participanților; Este îngrijorător pentru noi faptul că în această rundă ne-am confruntat cu următoarele situații în raportarea rezultatelor pentru schema de încercări de competență examen coproparazitologic: - același laborator care a raportat trei rezultate, două dintre aceste rezultate sunt raportate corect, adică Ascaris lumbricoides, iar al treilea greșit - Absente elemente parazitare; - laboratoare cu mai multe sedii au raportat rezultatele diferite, în sensul că pentru un sediu al laboratorului a raportat corect rezultatul asteptat Ascaris lumbricoides, iar pentru alt sediu a raportat “Absente elemente parazitare”. Specialiştii CALILAB au declarant runda compromise şi au distribuit participanţilor un alt material de încercat de această data cu “ absente elemente parazitare”. 53,99% dintre rezultatele raportate au fost nesatisfăcătoare , participanţii identificând diferiţi paraziţi . Aceste runde sunt încă studiate de specaliştii CALILAB pentru a identifica cauzele posibile ale numărului foarte mic de laboratoare medicale care au identificat correct parazitul conţinut în materiile fecale trimise ca obiect supus încercării de competenţă.

106

Concluzia analizei graficului radial care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către participanţi în runda din luna noiembrie 2014 este că numărul răspunsurilor raportate de către participanţi şi evaluate ca “ nesatisfăcătoare” prin metoda echivalenţei rezultatului raportat versus răspuns aşteptat este în limita unui procent rezonabil respectiv 8, 61% din rezultatele raportate de către participanţi după examinarea obiectului supus încercării de competenţă. Concluzia analizei graficului radial care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către participanţi în toate rundele anului 2014 este că numărul răspunsurilor raportate de către participanţi şi evaluate ca “ nesatisfăcătoare” prin metoda echivalenţei rezultatului raportat versus răspuns aşteptat este în limita unui procent rezonabil în : Runda din luna februarie 2014 - 3% pentru Giardia Intestinalis Runda din luna martie 2014 - 16,22% pentru absente elemente parazitare Runda din luna mai 2014 - 15,53% pentru absente elemente parazitare

107

Runda din luna noiembrie 2014 – 8,61% pentru Taenia Spp. Rezultatele globale raportate de către participanţi în runda din luna septembrie 2014 sunt încă studiate de specaliştii CALILAB.

Utilitatea controlului extern al calităţii pentru laboratoarele medicale şi autorităţi – Ministerul Sănătăţii, CNAS, RENAR Utilitatea controlului extern al calităţii pentru laboratoarele medicale A. Analiza rapoartelor de evaluare a performanţei de către specialiştii laboratorului medical şi luarea măsurilor care se impun pentru creşterea calităţii rezultatelor analizelor medicale Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007 la art. 24 precizează că : ”Rezultatele controlului calităţii şi măsurile luate pentru îmbunătăţire se consemnează şi se analizează după primirea fiecărui raport de evaluare a performanţelor laboratorului de analize medicale, obţinut în urma participării la programele de evaluare externă a calităţii.” Analiza fiecărui raport de evaluare a performanţelor laboratorului de analize medicale obţinut în urma participării la programele de evaluare externă a calităţii presupune: -

personal competent - instruit şi cu experienţă - atât în domeniile laboratorului medical dar mai ales în domeniul managementului calităţii în laboratoarele medicale;

-

efectuarea controlului intern al calităţii , interpretarea valorilor obţinute la efectuarea lui pe baza regulilor Westgard şi luarea măsurilor care se impun de către specialistul responsabil de analiză;

Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007 la art. 23 precizează că: „(1) Organizarea controlului intern al calităţii este responsabilitatea şefului de laborator de analize medicale. Reprezentantul legal al laboratorului de analize medicale are obligaţia de a asigura resursele necesare îndeplinirii acestuia. (2) Controlul intern al calităţii se efectuează zilnic, cel puţin o dată la 8 ore şi ori de câte ori este nevoie. (3) Rezultatele controlului intern obţinute se analizează de către specialistul responsabil de analiza respectivă, care decide acceptarea sau rejectarea rezultatelor obţinute „. 108

B. Instruirea specialiştilor laboratorului medical pe baza rezultatelor participărilor la controlul extern al calităţii furnizat de un organizator naţional sau internaţional Standardul SR EN ISO CEI 17043:2010 Evaluarea conformităţii Cerinţe generale pentru încercările de competenţă menţionează în „ Introducere” că „ de regulă, scopurile pentru comparările interlaboratoare includ” – lit. f) – „ instruirea laboratoarelor participante pe baza rezultatelor unor astfel de comparări.” Utilitatea controlului extern al calităţii pentru autorităţi – Ministerul Sănătăţii, CNAS, RENAR Datele naţionale referitoare la dotarea cu echipamente a laboratoarelor medicale şi rezultatele globale ale participării la controlul extern al calităţii sunt utile instituţiilor şi autorităţilor statului – Ministerul Sănătăţii, casa Naţională de Asigurări de Sănătate , pentru elaborarea politicilor şi programelor naţionale în domeniul sanitar.

Beneficiile participării laboratoarelor medicale la controlul extern al calităţii

Specialiştii CALILAB au identificat 4 categorii de beneficiari ai controlului extern al calităţii furnizat laboratoarelor medicale: 1.pacientul – utilizatorul serviciilor furnizate de către laboratoarele medicale este primul şi principalul beneficiar al furnizării controlului extern al calităţii; comparările interlaboratoare oferă posibilitatea comparării la nivel global a rezultatelor furnizate de către laboratoarele medicale la controlul extern al calităţii astfel încât un pacient să nu fie declarat sănătos în baza unui buletin de analiză emis de un laborator şi bolnav în baza unui alt buletin de analiză – emis de acelaşi laborator sau un laborator diferit .

2.laboratoarele medicale este cel de al doilea beneficiar al participării laboratoarelor medicale la schemele de încercări de competenţă prin faptul că: - oferă laboratoarelor medicale un mijloc de a evalua corectitudinea rezultatelor furnizate pacienţilor pe buletinul de analiză prin - compararea la nivel global a rezultatelor raportate de către acestea furnizorului de control extern al calităţii după măsurarea obiectului supus încercării de competenţă ţi - evaluarea performanţei laboratorului medical în grupul de comparare comun alcătuit pe baza echipamentelor sau metodelor de măsurare identice sau echivalente tehnic ; 109

indiferent de dotarea cu echipamente, calificarea şi numărul specialiştilor angajaţi, spaţiile laboratoarelor, calibratorii, controalele interne sau metodele de măsurare şi examinare utilizate de laboratoarele medicale astfel încât un pacient să nu fie declarat sănătos în baza unui buletin de analiză emis de un laborator şi bolnav în baza unui alt buletin de analiză – emis de acelaşi laborator sau un laborator diferi; - oferă laboratoarelor medicale un mijloc de a obţine un punctaj de la CNAS tranformat în alocarea de bani din fondul asigurărilor sociale de sănătate pentru minimum 4 participări anuale la controlul extern al calităţii conform - Anexa nr. 19, Cap. II, lit. B, pct. 2, Criteriul de calitate, lit. b). – Norme metodologice de aplicarea Contractului – Cadru de acordare a asistenţei medicale în cadrul sistemului de asigurări sociale de sănătate; 3.Furnizorii de control extern al calităţii este cel de al treilea beneficiar al furnizării controlului extern al calităţii ; conform standardelor , legilor şi altor documente în vigoare aplicabile controlului extern al calităţii organizat de către furnizori pentru laboratoarele medicale, aceştia au obligaţia să: 3.1. furnizeze scheme de încercări de competenţă la nivelul cerut de standardele aplicabile demonstrând că cerinţele au fost implementate – cerinţa standardului de acreditare a laboratoarelor medicale SR EN ISO 15189:2013 , pct. 5.6.3.1. Nota- „- Se recomandă ca laboratorul să participe la programe de comparaţie interlaboratoare, care îndeplinesc în mod substanţial cerinţele relevante ale ISO / IEC 17043.” 3.2 transmită în timp util participanţilor rapoartele de evaluare a performanţei acestora, inclusiv comentarii , recomandări , consultanţă post participare şi instruire în domeniul controlului extern al calităţii prin specialiştii săi care alcătuiesc Grupul ştiinţific al furnizorului de control extern fără de care acesta nu poate funcţiona conform cerinţelor 4.4.1.4 şi 4.4.1.5 ale standardului SR EN ISO CEI 17043:2010 Evaluarea conformităţii Cerinţe generale pentru încercările de competenţă; 3.3. furnizeze - ofere ” Ministerului Sănătăţii Publice, Casei Naţionale de Asigurări de Sănătate şi caselor judeţene de asigurări de sănătate, la cererea acestora, informaţii referitoare la rezultatele evaluărilor statistice globale ale laboratoarelor participante din România” conform Ordinul nr. 2.071 din 16 decembrie 2008 privind aprobarea Procedurii de notificare a schemelor de testare a competenţei pentru laboratoare de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice, art.3., lit. k); 4. Ministerul Sănătăţii, CNAS, RENAR , alte instituţii şi autorităţi ale statului român sunt o categorie care poate fi cel de al patrulea beneficiar al furnizării controlului extern al calităţii datorită faptului care obţin de la organizatorii de control extern al calităţii naţionali sau internaţionali date naţionale referitoare la laboratoarele medicale din România – printre care : dotarea acestora cu echipamente, rezultatele globale ale participării la controlul extern al calităţii, numărul şi calificările personalului angajat – specialiştii acestora , etc date care sunt utile instituţiilor şi autorităţilor statului – Ministerul Sănătăţii, Casa Naţională de Asigurări de Sănătate , altor instituţii şi autorităţi, pentru elaborarea politicilor şi programelor naţionale în domeniul sanitar. 110

Transmiterea cu întârziere a rapoartelor de evaluare a performanţei participanţilor de către unii furnizori de EQA – uneori şi după luni de zile precum şi neanalizarea rapoartelor de evaluare de către specialişti conform OMS 1301:2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale care precizează la art. 25 că “rezultatele controlului calităţii şi măsurile luate pentru îmbunătăţire se consemnează şi se analizează după primirea fiecărui raport de evaluare a performanţelor laboratorului de analize medicale, obţinut în urma participării la programele de evaluare externă a calităţii “ anulează beneficiile participării laboratoarelor medicale la controlul extern al calităţii, respectiv creşterea calităţii serviciului furnizat de către acestea – furnizarea rezultatelor analize medicale .

111

Bibliografie 1. Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology – WHO Geneva 1991. 2. Techniques usuelles de biologie clinique – Manet L., Savel J. – Flammarion MedecinesSciences, 1971 3. Infecții parazitare – Dan Steriu – Editura Ilex, 2003 ISBN 973-7928-22-9 4. Part 1 District Laboratory Practice in Tropical Countries 2nd Edition Update 2009 – Monica Cheesbrough – Cambridge Univerșity Presss 5. Principii și tehnici de analiză imunologică și moleculară utilizate în laboratorul clinic – Lazăr Veronica, Mihăescu Grigore, Chifiriuc Mariana Carmen - Editura Universității din București, 2013 ISBN 978-606-16-0264-3 6. A new laboratorial method for the diagnosis of gastrointestinal parasites in dogs - Rev. Bras. Parasitol. Vet., Jaboticabal, v. 22, n. 1, p. 1-5, jan.-mar. 2013 ISSN 0103-846X (impresso) / ISSN 1984-2961 (eletrônico). 7. Substitution of Malachite Green with Nigrosin - Eosin Yellow Stain in the Kato-Katz method: microscopical appearance of the helminth eggs Emmanuel I.Odongo-Aginya, Narcis Kabatereine, Siefert Ludwig, Henry Wabinga, Alan Fenwick; Antonio Montresor - WHO Vietnam PO Box 52 10000 Hanoi Vietnam. 8. Further observations on the formol-ether concentration technique for faecal parasites - V. H. ALLEN AND D. S. RIDLEY - From the Hospital for Tropical Diseases, St Pancras Way, London jcp.bmj.com on January 6, 2014 - Published by group.bmj.com. 9. Laboratory Diagnosis of Toxoplasma gondii Infection and Toxoplasmosis - Jose G. Montoya Department of Immunology and Infectious Diseases, Research Department of Immunology and Infectious Diseases, Research Institute, Palo Alto Medical Foundation, Palo Alto, and Division of Infectious Diseases and Geographic Medicine, Department of Medicine, Stanford Univerșity School of Medicine, Stanford, California Institute 10. Immunodiagnosis of human cysticercoșis (Taenia solium): A field comparison of an Antibody-Enzyme-Lynked Immunosorbent Assay (ELISA), and an Enzyme-LinkedImmunotransfer-Blot (EITB) assay in Peru – Diaz J.F., Verastegui M., Gilman R.H., Tsang V.C.W., Pilcher J.B., Gallo C., Garcia H.H., Torres P., Montenegro T., Miranda E., and the CWG. – Am.J.Trop.Med.Hyg., 1992, 46-5 610 – 615. 11. Evidence for an increasing presence of Echinococcus multilocularis in foxes in The Netherlands Katsuhisa Takumi , Ankje de Vries, Mei Ling Chu, Jaap Mulder,Peter Teunis , Joke van der Giessen International Journal for Parașitology 38 (2008) 571–578 12. Echinococcosis: a review Pedro Moro, Peter M. Schantz International Journal of Infectious Diseases (2009) 13, 125—133 13. Giardia immunity – an update - Katarina Roxstrom-Lindquist, Daniel Palm, David Reiner, Emma Ringqvist and Staffan G. Svard - TRENDS in Parașitology Vol.22 No.1 January 2006 Diagnoșis of visceral leishmaniașis - Pankaj Srivastava, Anand Dayama, Sanjana Mehrotra, Shyam Sundar - Department of Medicine, Institute of Medical Sciences, Banaras Hindu University, Varanasi, India Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 105 (2011) 1–6. 112

14. The reliability of diagnostic techniques in the diagnoșis and management of malaria in the absence of a gold standard - L B Ochola, P Vounatsou, T Smith, M L H Mabaso, C R J C Newton - Lancet Infect Dis 2006; 6: 582–88 15. Interet dagnostic immunologique par ELISA et EITB pour la conduite diagnostique et therapeutique d’une neurocysticercose – Simac C., Michel Ph., Andriantsimahavandy A., Esterre Ph., Michault A. – 1994, Arch.Inst.Pasteur Madagascar, 61, 21 -27. 16. Neurocysticercosis: updated concepts about an old disease -Hector H Garcia, Oscar H Del Brutto, for The Cysticercosis Working Group in Peru Lancet Neurol 2005; 4: 653–61 17. High Prevalence of Asymptomatic Plasmodium falciparum Infection in Gabonese Adults - Matthias P. Dal-Bianco, Kai B. Köster, Ulrich D. Kombila, Jürgen F. J. Kun, Martin P. Grobusch, Ghyslain Mombo Ngoma, Pierre B. Matșiegui, Christian Supan, Carmen L. Ospina Salazar, Michel A. Missinou, Saadou Issifou, Bertrand Lell, and Peter Kremsner Am. J. Trop. Med. Hyg., 77(5), 2007, pp. 939–942 18. Strongyloidiasis in Transplant Patients - Alison C. Roxby,Geoffrey S. Gottlieb, and Ajit P. Limaye IMMUNOCOMPROMISED HOSTS • CID 2009:49 (1 November) 19. Strongyloides stercoralis: there but not seen - Martin Montesa,b, Charu Sawhneyb,c and Nicolas Barrosa Current Opinion in Infectious Diseases 2010, 23:500–504 20. Use of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Dipstick Assay for Detection of Strongyloides stercoralis Infection in Humans - H. Rogier van Doorn, Rob Koelewijn, Henk Hofwegen, Henk Gilis, Jose C. F. M. Wetsteyn, Pieter J. Wismans, Claudine Sarfati, Tony Vervoort, and Tom van Gool - JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Feb. 2007, Vol. 45, No. 2, p. 438–442 21. La toxocarose, une zoonose helminthique majeure – J.-F. Magnaval, L.T. Glickman, Ph. Dorchies. Revue de Medecine Veterinaire 1994, 145: 611 – 627. 22. A collaborative study on larval secretory excretory antigens of Toxocara canis for the immunodiagnosis of human toxocariasis with ELISA – F.Speiser, B.Gottstein – Acta Tropica, 1984; 41: 361 – 372. 23. The Differential Agglutination Test as a Diagnostic Aid in Cases of Toxoplasmic Lymphadenitis_ Jose G. Montoya, Andrew Berry, Fernando Rosso and Jack S. Remington JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2007, p. 1463–1468 Vol. 45, No. 5 24. Toxoplasma gondii Infection in Pregnancy - Fabiana Maria Ruiz Lopes, Daniela Dib Gonçalves, Regina Mitsuka-Breganó, Roberta Lemos Freire and Italmar Teodorico Navarro - Braz J Infect Dis vol.11 no.5 Salvador Oct. 2007 25. Lymphadenopathy and Malignancy - ANDREW W. BAZEMORE, M.D., and DOUGLAS R. SMUCKER, M.D., M.P.H.Univerșity of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio American Family Phyșician December (1), 2002/volume 66, Number 11. 26. Toxoplasmosis J G Montoya, O Liesenfeld - Lancet 2004; 363: 1965–76 27. Ordinul nr. 2.071 din 16 decembrie 2008 privind aprobarea Procedurii de notificare a schemelor de testare a competenţei pentru laboratoare de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 11 din 7 ianuarie 2009 28. Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007 113

29. Standardul SR EN ISO 15189:2013 Laboratoare medicale Cerinţe pentru calitate şi competenţă 30. Standardul SR EN ISO CEI 17043:2010 Evaluarea conformităţii Cerinţe generale pentru încercările de competenţă 31. Regulament specific de acreditare a furnizorilor de încercări de competenţă conform SR EN ISO CEI 17043 din 24.10.2014 32. Norme metodologice de aplicare a Contractului – Cadru de acordare a asistenţei medicale în cadrul sistemului de asigurări sociale de sănătate 33. ”Rolul resurselor umane în implementarea unui sistem de control al calității în laboratoarele medicale„ Teza de doctorat - autor C. Popa, susţinută public în data de 17.10.2011 la UMF Bucureşti, Facultatea de Medicină şi Farmacie; 34. www.renar.ro.

114

115