FV Grau Ccaa 19-20 PDF

 

Grau en Ciènci Cièncie es Am Ambi bie enta nt als Pràct Prà ctiq iques ues de F Fis isio iolog logia ia Vege Vegetal tal Alumne________________________________________ Grup _____  

Curs 2.019-2.020

FISIOLOGIA VEGETAL FISIOLOGIA UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA

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ÍNDICE

Determinación del Potencial Hídrico en Vegetales................... ......................................... ............................................ ...................... 1 Estudio de la Reacción de la reacción de Hill en cloroplastos aislados y su inhibición por DCMU .................... ........................................... ............................................. ............................................ ............................................ ............................................ ...................... 5 Medida del potencial osmótico. Método de la plasmólisis incipiente................................... ................................... 9

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DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL HÍDRICO EN VEGETALES   OBJETIVO: Determinar el potencial hídrico () de un tejido vegetal (tubérculo de patata), estableciéndolo gravimétricamente, es decir, mediante las variaciones de peso que experimentan las muestras frente a diferentes potenciales osmóticos externos. FUNDAMENTO:  El término Potencial hídrico  () se utiliza para expresar las relaciones hídricas plantas ySesus componentes determinan de el estado termodinámico del agua contenidadeenlas su interior. distinguen tres componentes , que corresponden a: Potencial de presión (P), Potencial osmótico ()  y potencial matricial (m), siendo el valor del  potencial hídrico la suma de todos t odos ellos (  = P +   + m). En el caso de los vegetales, el valor de  es, generalmente, negativo. El gradiente de potencial en el sistema suelo-planta-atmósfera determina los movimientos de agua en la planta. El agua tenderá a moverse espontáneamente espontáneamente desde zonas de mayor a zzona ona de menor ; por ello, cuando se sumerge una muestra de tejido vegetal en una solución (en nuestro caso será de sacarosa) cuyo  sea más negativo que el de las células que lo constituyen, dicho tejido perderá agua y, por tanto, peso. Por el contrario, si la solución externa presenta un  mayor que el tejido, éste ganará peso. La concentración de sacarosa en la cual la muestra no experimente variación de peso indicará que el tejido se halla en equilibrio con el medio que le rodea ( = 0), en este estado, tejido  = solución, por lo que el  de la solución correspondiente correspondiente suministra el valor de  del tejido. En esta situación, tejido=  de la solución. Sabiendo que el potencial osmótico de una solución () es igual a -, y que  es la  presión osmótica osmótica de la solución, la cual vale  = R·T·Ci, es posible hallar el valor del potencial hídrico del tejido.

MATERIAL:  •  Un tubérculo de patata. •  Portaobjetos. •  Sacabocad Sacabocados os de 1 cm de diámetro. •  Papel milimetrado. •  6 tubos de ensayo de 25 mL.

•  •  •  •  • 

Papel de filtro. Pipetas de 10 mL. Cuchilla o cutter. Balanza. Solución de sacarosa 1M.

MÉTODO:  •  Preparar 6 tubos de e ensayo nsayo de 25 25 mL y rotularlos, rotularlos, seña señalando lando las concentraciones concentraciones de sacarosa sacarosa que se ensayarán. sacarosa 1M, pre preparar parar 20 mL de las siguientes •  Partiendo de una solución de sacarosa concentraciones: 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50 y 0.60 M •  Escoger un tubércu tubérculo lo de ppatata atata y, utilizando un sacaboca sacabocados dos de un diámetro de 1 cm, extraer un cilindro. Disponerlo sobre un portaobjetos. •  Colocar papel milimetrado d debajo ebajo del portaobjetos y ccortar ortar el el cilindro transversalmente para obtener un cilindro de 4 cm de longitud.

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• 

Cortar el cilindro de 4 cm en sec secciones ciones transversales transversales de 2 mm, pesar pesar todas las secciones secciones conjuntamente y sumergirlas en una de las soluciones de sacarosa. Anotar el momento de la inmersión y dejarlas en estas condiciones entre 60 y 90 minutos. •  Repetir la secuenc secuencia ia anterior para ccada ada una de las restantes soluciones de sacarosa, sacarosa, usando usando un cilindro para cada una de ellas. •  Transcurrido el tiemp tiempoo señalado, señalado, y sigu siguiendo iendo eell mismo orden inicial, extraer extraer las muestras de cada solución, lavarlas, secarlas y pesarlas de nuevo. Procurar que el tratamiento de lavado y secado sea similar en todas las l as muestras para evitar errores de pesada.

RESULTADOS:  a)  Rellenar la tabla en la que figuran, por una parte las concentraciones de sacarosa utilizadas y, por otra, los resultados obtenidos con las diferentes muestras y referidos a: 1) Peso inicial (Pi) 2) Peso final (Pf) 3) Diferencia de Pesos (Pf-Pi) 4)Variación porcentual de peso (  

 Pf - Pi Pi

 100 )



 de las soluciones ensayada ensayadas; s;deexpresar lospara resultados en Megapascales Megapascale (MPa).  b) Representar Calcular el gráficamente las variaciones peso (%) cada muestra de tejido srespecto al potencial osmótico de las soluciones correspondientes. c)  Determinar el estado de equilibrio osmótico y, en esta situación, calcular el  del tejido (tejido) y el  de la l a solución correspondiente.  ______________________  ___________ ______________________ ______________________ ______________________ _______________ ____ Notas:

• 

El   y  se expresan mediante unidades de presión. La unidad de presión actualmente adoptada por el Sistema Internacional (S.I.) modificado es el Pascal (Pa), estableciéndose la siguiente relación con otras unidades (atmósferas -atm-), utilizadas anteriormente: 1 atm = 1.01325 x 10 5 Pa  No icha unidad unidad,, el 6 MPaobstante, (1 MPa en =10nuestro  Pa). caso resulta más manejable utilizar un múltiplo de ddicha

• 

Al utilizar la ecuación  = RTCi, hay que considerar que: *Ci es la concentrac concentración ión de soluto ((en en nuestro caso sacarosa) *T = Tª absoluta ambiental (considerar 20 20ººC). *R = Constante de los gases. R = 0.83 x 10-2  MPa L mol-1 ºK -1

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Esquema-resumen Esquema-resu men del protocolo seguido a la práctica.

1)

H2O

Sa c ar o s a

Repetir per cadascuna Repetir de les les c oncentracions de sacarosa

2)

Pesar 

Comenceu a com ptar el temps quan tingueu tingueu el primer tub fet.

Ferr tub p er tub. No Fe No talleu un no u cilin dre fins qu e no estigu i pesat pesat l’anterior.

3) 60-90 ‘

Pesar 

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RESULTADOS a)  CONCENTRACIÓN DE SACAROSA (M L -1)

solución

 

Pi  (mg)

Pf  (mg)

Pf -P -Pi 

P (%)

(MPa)

0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 b)   P (%)

0

 (MPa) 

%P = _______________ ·  + __________ _____________ ___ r = _______________ _______________

c) tejido

=__________________ MPa MPa 

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ESTUDIO ESTUD IO DE LA REACCIÓN D DE E HILL EN CLOROPLASTOS AISLA AISLADOS DOS Y SU INHIBICIÓN POR DCMU OBJETO:  Estudiar la reacción de Hill en una suspensión de cloroplastos (previamente aislados) utilizando DPIP (2,6-diclorofenol indofenol) como aceptor artificial de electrones. Paralelamente, se determinará la inhibición de la fotólisis del agua a nivel de fotosistema II, utilizando para ello el inhibidor sintético DCMU (3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetil urea), empleado en agricultura como herbicida y conocido comercialmente como Diuron®. FUNDAMENTO: Robert Hill observó en 1.937 que al iluminar preparaciones acelulares que contenían cloroplastos en presencia de algún aceptor artificial de electrones (como podía ser el ferricianuro o algún colorante orgánico capaz de aceptar electrones procedentes de la fotólisis del agua), se producía desprendimiento de oxígeno y reducción del aceptor de electrones según la reacción: LUZ 2A + 2H2O --------------> 2AH2 + O2  Ésta es la llamada Reacción de Hill, Hill , donde A=aceptor de electrones. En condiciones condiciones naturales, los principales aceptores na naturales turales de electrones electrones son la ferredoxina y el NADP, pero se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos. Estos aceptores naturales pueden ser sustituidos in vitro por el DPIP, compuesto que en solución y en estado oxidado presenta un intenso color azul, con un máximo de absorbancia a 590 nm, que mengua al ser reducido dicho compuesto. MATERIAL:  20 g de espinacas. Centrífuga y 4 tubos de centrífuga de 50 mL de plástico con tapón,  preenfriados. •  Mortero preenfriado.

Espectrofotómetro. Baño de hielo. Embudo Büchner, dos gasas y Kitasatos preenfriados. •  Papel de aluminio

•  • 

•  •  • 

Reactivos •  DPIP 0.2 mM •  DCMU: 0.5, 1, 2 y 3 µg/mL •  14 tubos de ensayo de 10 mL.

•  • 

Sacarosa 0.5 M fría. Tampón fosfato 0.2 M pH 6.5 frío.

MÉTODO: Realizar los dos apartados siguientes (a y b) en paralelo para que una vez obtenido el extracto  pueda ser depositado depositado en los correspondien correspondientes tes tubos inmediata inmediatamente. mente.

a)

Extra Extracción cción de cloropl cloroplastos: astos: ** Nota Preliminar: Las condiciones de frío bajo las cuales es necesario operar durante el aislamiento de los cloroplastos son necesarias para evitar la pérdida de actividad de los -5-

 

orgánulos. Por lo tanto, se ruega encarecidamente mantenerlos en frío usando los baños de hielo y procurando que las extracciones no alcancen temperatura ambiente hasta el momento de realizar la reacción y posterior lectura colorimétrica. •  Pesar 20 g de hojas de espinaca, desprovistas de los peciolos y nervios principales. •  Lavar con agua destilada y cortar en pequeños trozos. •  • 

Triturar el material en un mortero preenfriado, al cual se añadirán 10 ml de de sacarosa 0.5 M. Mantener las condiciones condiciones de frío con un baño de hielo hielo. . Filtrar el homogeneizad homogeneizadoo en un embudo Büchner bajo vacío a través de dos gasas. Añadir al mortero 40 ml de sacarosa 0.5 M (en volúmenes de 10 ml), hasta conseguir la recuperación total del triturado. Si no se dispone de trompa de vacío, se puede filtrar por gravedad hasta haber añadido toda la sacarosa y realizar el extracto mediante cerrando las gasas en foma de bolsa y estrujándola hasta que todo el líquido haya salido de ella.  

•  •  • 

•  •  • 

Recoger el filtrado en un Kitasatos preenfriado y dispuesto sobre hielo. Distribuir volúmenes iguales del filtrado en dos tubos de centrífuga preenfriados, equilibrándolos posteriormente a ojo. Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 min. para eliminar trozos groseros de tejido, paredes celulares, etc. Tener preparados otros dos tubos de centrífuga para realizar la

siguiente operación con rapidez. Decantar cada sobrenadante, el cual contiene los cloroplastos, en sendos tubos de centrífuga preenfriados, equilibrándolos posteriormente. Centrifugar a 3500 r.p.m. durante 5 min. para sedimentar los cloroplastos. Desechar el sobrenadan sobrenadante. te. Añadir 12 mL de tampón fosfato 0.2 M pH 6.5 bien frío en cada tubo y resuspender, mediante agitación suave el sedimento. Reunir en un solo tubo las suspensiones de cloroplastos, agitar suavemente y,si es necesario, almacenar bajo refrigeración hasta el momento de su utilización.

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b)

Prepa Preparación ración de los tubo tuboss de reacción: • 

Preparar 2 series de 7 tubos de ensayo. Una de las series se cubrirá con papel de aluminio enrollándolo a su alrededor y teniendo preparado un rectángulo de papel de aluminio  para cubrirlos cuando cuando sea ne necesario. cesario.

• 

Rotular cada serie de tubos según la primera columna de la tabla adjunta.

• 

Llenar cadadetubo conyalosse reactivos correspondientes según tabla adjunta.conLas soluciones DCMU hallan preparadas de antemano y selacorresponden la rotulación de los correspondientes tubos. El extracto se corresponde con el producto de las manipulaciones realizadas en el apartado a).

H2 O Destilada (mL) 4

DCMU (mL)

DPIP (mL)

Tampón (mL)

Extracto (mL)

0

0

1

1

SC 0

4

0

1

1

0

3

0

1

1

1

0,5 1 2 3

2 2

1 1

1 1

1 1

1 1

2

1

1

1

1

2

1

1

1

1

Tubo

SA

Tabla: Volumen de reactivo necesarios para cada uno de los tubos de las dos series. Nota: Agitar el tubo conteniendo la suspensión de cloroplastos (extracto obtenido en el apartado a)) previamente a su utilización, a fin de homogeneizar la suspensión.  Tapar la serie de tubos forrados con papel de aluminio y preservar de la luz (en (en el armario •  de la mesa de trabajo). Exponer las dos series restantes a la luz, durante 10 min. Observar

• 

continuamente soluciones que en ocasiones se decoloran muy rápidamente, enla coloración cuyo caso de es las preciso medirpuesto la absorbancia de inmediato. En otras ocasiones se precisa un tiempo superior al señalado para observar la reacción. Medir la absorbancia de cada una de las soluciones ensayadas a 590 nm. Utilizar agua destilada como blanco del espectrofotómetro.

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RESULTADOS: a) Anotar los resultados de absorbancia de los diferentes tratamientos.

 ABSORBA  AB SORBANCIA NCIA SC

SA

0

0,5

1

2

3

CON LUZ SIN LUZ

 b)  Representar en función una misma los resultados obtenidos, los Los valores de absorbancia en de lasgráfica cantidades de inhibidor (DCMU)situando utilizadas. valores correspondientes a los ensayos SC y SA pueden representarse en el gráfico por una línea  paralela al eje de abscisas. Abs 590

[DCMU] (µg/mL)

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MEDIDA MEDID A DEL POTENCIAL OSMÓTICO. OSMÓTICO. MÉTO MÉTODO DO DE LA PLASMÓLISIS INCIPIENTE. OBJETIVO:  Observación del fenómeno de la plasmólisis en células epidérmicas de bulbo de  Allium cepa cepa y cálculo del potencial osmótico de las mismas. FUNDAMENTO:  El movimiento del agua se realiza siempre a favor de potencial hídrico. En una célula vegetal este potencial viene determinado tanto por el potencial osmótico como por el potencial de presión según la expresión (w =  + P). Cuando una célula vegetal se pone en contacto con una solución que contenga un soluto para el cual la membrana celular sea impermeable, aquélla gana o pierde agua en función del gradiente de potencial que se establezca. Cuando la célula pierde agua, el potencial de presión disminuye y, si esta pérdida es suficiente, el citoplasma deja de presionar contra la pared celular, momento en que el  potencial de presión se iguala a cero. En este punto, denominado de plasmólisis incipiente, y determinado prácticamente como aquel valor de potencial osmótico de la solución que provoca la plasmólisis del 50% del las células del tejido, el único componente del potencial hídrico celular es el potencial osmótico. Mediante una observación del comportamiento de las células frente a distintas concentraciones de un soluto no permeable en el medio se puede determinar el potencial osmótico celular.

MATERIAL •  1 bulbo de cebolla. •  6 cubreobjetos cubreobjetos.. •  6 portaobjetos. •  1 gradilla. •  Microscopio.

• 

6 tubos de ensayo de 15 mL. •  Sacarosa 1 M. •  Pipetas (1x10mL, 1x15mL y 1x2mL). •  1 pipeta Pasteur con tetina.

MÉTODO Preparación tubos bos de ensayo y rotularlos de la siguiente forma: •  Preparar 6 tu 0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7 •  • 

•  •  •  • 

Preparar 6 portaobjetos portaobjetos y rotularlos igual qque ue los tubos aanteriores. nteriores. Procurar que que estén estén bien bien limpios y secos. A partir de un unaa solución solución de sacarosa 1M, pre preparar parar 10 mL de las sigu siguientes ientes concentracione concentraciones: s: 0.0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7 0.7 M Agitar bien los tubos hasta que la solución obtenida sea perfectamente homogénea. Depositar en ccada ada portaobjetos una gota de la so solución lución ddee sacarosa sacarosa correspondiente. Tomar un bbulbo ulbo de cebolla, cebolla, pelarlo, y se separar parar uuna na ddee las hojas. Separar uunn fragmento de epidermis de aprox aproximadamente imadamente 1 cm de lado y depositarlo inmediatamente en uno de los portaobjetos. Si queda arrugado se puede alisar con la ayuda de unas pinzas y una aguja enmangada.

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• 

Cubrir la preparación con un cubreobjetos. Tomarlo por los lados y dejarlo dejarlo caer caer suavemente suavemente sobre la preparación a partir de un ángulo de 45º. A medida que va cubriendo la preparación, asegurarse de que no quedan burbujas de aire. •  Una vez cubierta la preparación, retirar los re restos stos de solución que que puedan puedan haber haber quedado quedado fuera de la misma. Tener especial cuidado de que no queden restos sobre el cubreobjetos ni  bajo el portaobjetos. Es muy importante que tanto uno como otro queden bien limpios y secos, pueslasnolentes tan solo dificultarse la visión de la preparación sino que pueden llegar a dañarse del puede objetivo del microscopio. •  Dejarlos en estas condiciones durante 15 minutos.

Observación microscópica Observación microscópi ca  •  Empezando por la solución de máxima concentración de sacarosa (0.7 M): •  Conectar la fuente de iluminación del microscopio •  Bajar cuidadosamente y de forma completa la platina del microscopio. Usar para ello el tornillo macrométrico. •  Bajar el condensador sin forzarlo cuando llegue a su tope. •  Seleccionar el objetivo de meno menorr aumento (se co corresponde rresponde con el menor de ellos) y situarlo en el eje óptico del microscopio. Para ello se gira el revólver de la torreta portaobjetivos hasta que engaste con su tope correspondiente. abriendo riendo préviamente préviamente la pinza de sujeción. sujeción. Una vez situada, •  Poner la solución en la platina, ab cerrar lentamente la pinza hasta que coja firmemente la preparación. Asegurarse de que la  preparación no no ha quedado to torcida. rcida. preparación, aración, utilizando los tornillos correspond correspondientes, ientes, hasta que el fragmento fragmento de •  Mover la prep epidermis quede iluminado por la luz proveniente del condensador. •  Mirando por el ocular y utilizando el tornillo macrométrico, subir lentamente lentamente la platina hasta que comience a enfocarse la preparación. Continuar enfocando con el tornillo micrométrico hasta que quede perfectamente enfocada. •  Situar la z zona ona de interés en el centro del camp campoo de vvisión isión y ccambiar ambiar a un objetivo de mayor mayor aumento. Reajustar el enfoque con el tornillo micrométrico. Si es necesario, reajustar la iluminación. células las has hasta ta que se es esté té completamente completamente seguro seguro de de poder poder identificar las células células •  Observar las célu  plasmolisadas. Para Para ello se comparará comparará la preparación con la figura ins insertada ertada en este guión. •  Cambiar a la preparación de menor conce concentración ntración de sacarosa (0). Para ello, bajar  préviamente la platina, retirar la preparación y repetir los pasos anteriores en el mismo orden. •  Realizar un con contaje taje de las célula célulass plasmo plasmolisadas lisadas y no plasmo plasmolisadas lisadas en en varios campos del microscopio (asegurarse (asegurarse de contar un total de por lo menos 50 células). •  Calcular el porcentaje de células plasmolisadas para cada preparación.

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Resum Re sumen en del protoc olo empeado en la práctica.

2)

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PLASMÓLISIS INCIPIENTE

o plasmolisadas

Plasmolisadas

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RESULTADOS Tabular los valores de porcentaje de células plasmolisadas frente al potencial osmótico de las soluciones de sacarosa. sacarosa. Para calcular este último, remitirse a la práctica de potencial hídrico. [Sacarosa] (M)

0

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

solución 

(MPa) % Células plasmolisadas

% Células  plasmolisadas

 Solución (MPa)

Calcular el potencial osmótico de las células epidérmicas Tener en cuenta únicamente los valores de potencial osmótico de la solución que cumplan (0 % < % plasmólisis < 100%). % Plasmólisis = ___________·  + ____________ ______________ r= _____________ _____________ 50% plasmolisis = ___________ ________________ _____ (MPa).

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