Funkcionalna Hrana, Nutraceutici (4. Predavanje)

FUNKCIONALNA HRANA S ANTIOKSIDANSIMA

Faktori okoliša Antioksidansi

Hrana

Glukoza Kontrola potrošnje energije

Sunčevo zračenje

Mikrobi

Popravak i zaštita

Mitohondrij

Energija

Slobodni radikal: 

Svaka molekula koja sadrži jedan ili više nesparenih elektrona

Tipovi slobodnih radikala: 

Reaktivni oksigenovi spojevi (ROS)



Reaktivni nitrogenovi spojevi (RNS) - NO



Reaktivni metaboliti ili intermedijeri – metabolička aktivacija lijekova, otrova, polutanata ...

Reaktivni oksigenovi spojevi (ROS) 

Superoksid (O2.-)

Hidrogen peroksid (H2O2) .  Hidroksil radikal (OH ) – produkt 

Fentonove reakcije katalizirane slobodnim Fe i Cu 

Singlet oksigen (1DgO2) – oksigen u pobuĎenom stanju

Izvori slobodnih radikala 

Mitohondrije: - stvaranje energije - ATP - glukoza, masne kiseline, aminokiseline - O2 2H2O 4e- ROS: O2-. (superoksid) H2O2 (hidrogen peroksid)



Glatki endoplazmatski retikulum (mikrosomi) - detoksikacija (CYP450) - toksini, lijekovi, ksenobiotici - O2 + RH

R-OH + H2O

- ROS: O2-. (superoksid)

metabolička aktivacija - X. (slobodni radikal)



Peroksisomi - sadrže oksidaze za degradaciju različitih supstrata (β-oksidacija masnih kiselina) - glukoza, aminokiseline, ksantin... - zahtijeva O2 - sporedni produkt: H2O2



Citoplazma

-

produkcija nitrogen oksida (NO.) iz arginina

-

funkcioniše kao biološki glasnik

-

u mozgu (neurotransmiter), vaskularnim endotelnim stanicama

(regulacija krvnog pritiska) i makrofagima (citotoksični agens)

. . - NO + O2

. ONOO (peroksinitrit)



Produkcija singlet oksigena – zahtijeva svjetlost, O2, fotosenzibilizatore – fotosenzibilizatori u biološkom sistemu

(bilirubin, riboflavin, retinal, porfirin) – fotodinamička terapija

ANTIOKSIDANSI ENZIMSKI

NE-ENZIMSKI

Primarni enzimi Sekundarni enzimi SOD Katalaza GSH peroksidaza

GSH reduktaza G-6P- dehidrogenaza

Kofaktori

Vitamini

Koenzim Q10

Vitamin A Vitamin C Vitamin E Vitamin K

Minerali Zn, Se

Organosumporni spojevi Flavonoidi Flavonoli

Flavanoli

Antocijanini

Kvercetin Kemferol

Katehin Pelagonidin

Cijanidin Pelargonidin

Izoflavonoidi Flavanoni Genistein

Hesperidin

Flavoni

Alil sulfid Indoli Glutation

Karotenoidi β-karoten Likopen Lutein Zeaksantin

Neproteinski nitrogenovi spojevi

Fenolna kiselina

Mokraćna kis.

Hrizin Hidroksicinamična kiselina Hidroksibenzojeva kiselina Ferulična kiselina Galna kiselina p-kumarinska kiselina Elaginska kiselina

Sistem zaštite od slobodnih radikala SOD opada sa starenjem  Katalaza  GSH Px  “Hvatači” slobodnih radikala  Antioksidansi (hrana, suplementi) 

Antioksidativni enzimi Cistein

GSH peroksidaza

CuZnSOD

O2•¯

H2O2

H2O + O2

Fe2+ Mn SOD

Katalaza

OH•

GSH

Funkcije GSH-ovisnih enzima L-OH H 2O

GSSG GSH Px

L-OOH H 2O 2

NADPH

GSH--Rx

GSH

NADP+

X.

GSH-TR

GSX X-Merkapturna kiselina

“Hvatači” slobodnih radikala 

Stanični proteini koji heliraju prooksidativne minerale (Fe, Cu i dr.)



Transferin – transportni protein za Fe



Feritin – vezujući protein za rezervno Fe



Metalotionein – Zn/Cu/Cd/Hg



Ceruloplazmin – Cu

Antioksidansi Primarni mehanizam djelovanja: doniranje vodika R. + AH → RH + A.

Struktura i antioksidativna aktivnost 1) lako doniranje H bez oštećenja primarne molekule

Struktura i antioksidativna aktivnost 2) dvostruka veza u bočnom lancu

Antioksidans je... 

“svaka supstanca koja, prisutna u niskoj koncentraciji u odnosu na oksidabilni supstrat, značajno odlaže ili zaustavlja oksidaciju tog supstrata” (Halliwell and Gutteridge, 1995)



“svaka supstanca koja odlaže, sprečava ili uklanja oksidativno oštećenje ciljne molekule” (Halliwell, 2007)



“svaka supstanca koja direktno hvata ROS ili indirektno djeluje na povećanje antioksidativne odbrane ili inhibira produkciju ROS” (Khlebnikov i sur., 2007)

Ekvilibrij (AOX=ROS)

Oksidativni stres (ROS u višku)

Oksidativni stres (AOX u deficitu)

Antioksidansi

Oksidansi

OKSIDATIVNI STRES

Oksidativno oštećenje

oštećenje tkiva Lipidi

Proteini Nukleinske kiseline

upala

Oštećenje DNA

Δ signalni put

• ↑ smrti stanica (apoptoza)

• aktivacija faktora transkripcije

• ↓ proliferacije

• ↓ NO signalnog puta→↓angiogeneze • neurotoksičnost

ROS Oksidacija proteina

Lipidna peroksidacija

• ↓ funkcije enzima

• prostanoidi → upala

• inhibicija faktora rasta

• lančane reakcije → formiranje radikala

Degenerativno oštećenje retine Katarakta Oko

Renalni graft Glomerulonefritis

Bubreg

Koža

Žarenje Dermatitis Psorijaza Srce

Ishemija Endotoksini Oštećenje jetre

GIT OKSIDATIVNI STRES

Zglobovi

Krvni sudovi

Vazospazam Ateroskleroza

Pluća

Mnogi organi

Starenje Karcinom Upalna/autoimuna promjena Ishemija Dijabetes

Angioplastične promjene Keshanova bolest (deficit Se)

Mozak

Astma Hiperoksija

Trauma Moždani udar Neurotoksičnost Parkinsonova bolest Alzheimerova bolest

Reumatoidni artritis

Markeri oksidacijskog stresa  Detekcija slobodnih radikala  DPPH; 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidrat (stabilan radikal)

 Detekcija produkata oksidacijskog stresa Markeri lipidne peroksidacije: malondialdehid (MDA), konjugirani dieni, 4-hidroksinonenal (HNE), izoprostani

Markeri oksidativnog oštećenja proteina: proteinski hidroperoksidi, proteinski karbonili

Markeri oksidativnog oštećenja DNA: modificirani nukleozidi

Gu et al. FASEB J. 2005, 20:598; Wu et al J Ag Food Chem. 2004,52:4026-37

Osnovni problemi u evaluaciji antioksidanasa 

Efekat izrazito ovisan o dozi!



UtvrĎivanje stepena apsorpcije antioksidanasa iz hrane



Ekstrapolacija in vitro podataka na uslove

in vivo?

Antioksidansi iz hrane Vitamin E i vitamin C 

Vitamin E – zaštita lipida od oksidacije



Vitamin C – antioksidativna zaštita u tjelesnim tečnostima



Vitamin C – posebno aktivan u zaustavljanju slobodnih radikala iz zraka i cigaretnog dima



Vitamin C može regenerisati oksidirani vitamin E

Cijepanjem daje 2 molekule vitamina A

β-karoten

Vitamin A

• Nisu esencijalni nutrijenti (nemaju RDA) • Karoteni (likopen, β-karoten) i ksantofili (zeaksantin, lutein) • 6-10 mg/dan (u hrani) može smanjiti rizik od karcinoma i CVD (oprez u pušača – kancerogeno djelovanje β-karotena!)

• Termička obrada hrane povećava probavljivost i apsorpciju • Slabiji antioksidansi in vitro (hvatač 1O2) • Potpuno ih uništavaju peroksil radikali • Antioksidativno djelovanje vitamina A: reakcija s peroksil radikalima i sprečavanje peroksidacije lipida.

Minerali Selen • sastavni dio većine antioksidativnih enzima (metaloenzimi, GSH peroksidaza, tioredoksin reduktaza)

• Moguće predoziranje suplementima (osip, GIT tegobe, ciroza jetre)

Cink • inhibitor NADPH oksidaze (katalizira produkciju singlet oksigena, uz NADPH kao donora elektrona)

• Sastavni dio SOD • Inducira sintezu metalotioneina (hvatač hidroksil radikala)

Antioksidansi iz hrane  Vitamini

i minerali skupa smanjuju oštećenja uzrokovana slobodnim radikalima putem: –ograničavanja formiranja slobodnih radikala –uništavanja slobodnih radikala ili njihovih prekursora –stimulacije aktivnosti antioksidativnih enzima –reparacije oksidativnih oštećenja –stimulacije aktivnosti reparativnih enzima

Antioksidansi iz hrane 

Nenutritivni – fitohemikalije (polifenoli) Ostala djelovanja: – anti-estrogeno

– anti-inflamatorno – anti-alergijsko – anti-holesterolemijsko

– anti-hemoragijsko – anti-mutageno – anti-neoplastično

Flavonoidi

Male razlike u strukturi  velike razlike u biološkoj aktivnosti Broj i položaj OH grupa / priroda supstituenta određuje funkciju: antioksidativni, antiinflamatorni, citotoksični ili antimutageni agensi in vitro ili in vivo. 

Antioksidativno / prooksidativno djelovanje  Indukcija / inhibicija enzima  Proliferacija / inhibicija rasta stanica  Lipofilnost / polarnost – pristup stanici

Protektivno djelovanje protiv oksidativnog stresa je ovisno o strukturi 

“Hvatači” ROS Sposobnost doniranja vodika



Helatno vezivanje prelaznih metala – potreban katehol?



“Hvatači” RNS nitriranje ili oksidacija?



Ne-antioksidativni mehanizam - modulacija signalnih puteva, ekspresije gena

Protektivno djelovanje flavonoida in vivo (eksperimentalne životinje) 

Smanjeno nakupljanje produkata oksidacijskih reakcija (lipid peroksida)



Inhibicija porasta koncentracije produkata oksidacije inducirane eksternim stresom (administracijom karcinogena ili hronično inducirane upale)



Veća otpornost ka patološkim promjenama u animalnih modela humanih bolesti vjerovatno uzrokovanih oksidativnim stresom (npr. efekat na broj tumora ili otok kod upale)

Protektivno djelovanje flavonoida in vivo (eksperimentalne životinje) 

Porast koncentracije endogenih antioksidanasa ili prevencija smanjenja njihovog nivoa u eksterno induciranom stresu



Porast antioksidativnog kapaciteta plazme ili seruma odreĎen ex vivo



Redukcija detektabilnih radikala tokom oksidativnog stresa (mali broj studija)



Inhibicija oksidativnim stresom inducirane hemiluminiscencije odreĎene in situ

Rezultati studija u ljudi 

Epidemiološke studije: Inverzna korelacija konzumacije flavonoida i incidence oboljenja za koja se vjeruje da uključuju oksidativni stres



Smanjenje koncentracije produkata oksidacije



Porast koncentracije endogenih antioksidanasa ili spječavanje njihovog smanjenja u oksidativnom stresu



Povećan antioksidativni kapacitet seruma/pazme mjeren

ex vivo 

Inhibicija treningom induciranog oštećenja mišićnog tkiva i upale



Smanjenje stepena oksidacije lipoproteina utvrĎeno ex

vivo

Strukturni preduslov za H-donirajuću antioksidativnu aktivnost: o-dihidroksi supstitucija na B prstenu 2,3-nezasićena veza u C prstenu 4-karbonil grupa HO

OH

OH O

A

B

C

OH OH

O

KVERCETIN

SCREENING FLAVONOIDA NA ANTIOKSIDATIVNU AKTIVNOST: UTICAJ STRUKTURE B PRSTENA Redukcioni potencijal

E7 (V)

Antioksidativna aktivnost

TEAC

KATEHOLI

Kvercetin Epikatehin

0.33 0.57

4.7 2.4

0.75 0.72

1.3 0.9

MONOHIDROKSI B PRSTEN

Kemferol Hesperetin ALKILPEROKSIL RADIKAL VITAMIN C

1.06 0.25

Promjene flavonoida in vivo 

Metabolizam u crijevu



Metabolizam u jetri (O-metilacija, konjugacija sa sulfatom i glukuronidom)



Cijepanje C prstena



Faktori koji utiču na intracelularnu antioksidativnu aktivnost: – Redukcioni potencijal nastalih konjugata – Pristup stanici i podioni koeficijent – Intracelularni/ekstracelularni metabolizam i strukturne promjene

IN VIVO METABOLITI vs. CELULARNI OKSIDATIVNI STRES

Kaspaza-3

acetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilid

Apoptotični stimulus Pro-kaspaza-3

p-nitroaniline 405 nm

0.20

Svi 30mM

 METILIRANI METABOLIT Niži H-donirajući potencijal – modifikacija katehol grupe

0.15 ***

0.10

***

Sličan protektivni efekat

0.05

 GLUKURONID METABOLIT Neznatno niži H-donirajući potencijal EC Gluc

MeEC

EC

H2O2 (50 mM)

0.00 Kontrola

Porast apsorbance (405 nm) u odnosu na kontrolne stanice

0.25

H2O2 (50mM)

Nema protektivnog efekta nedostupnost ili supstitucija A prstena?

Bioraspoloživost i metabolizam flavonoida 

Manja bioraspoloživost u odnosu na askorbinsku kiselinu i tokoferole



Promjenjiva pod uticajem metabolizma pri apsorpciji (u crijevu)



Manja apsorpcija i značajno niža koncentracija u krvotoku (in vivo)

Plazmatski nivo konjugata flavonoida Flavan-3-ol (katehini vina)

100 nM

Procijanidin

4 μM; 0.26 μM; 0.7 μM

(čokolada/kakao)

Flavanon

(grejp/narandža)

< 4 μM

Antocijanin (sok bobičastog voća)

100 nM; 147 nM

Askorbinska kiselina

30-150 μM

METIL + SULFAT +GLUKURONID EPIKATEHIN SULFAT + GLUKURONID NARINGENIN /HESPERETIN GLUKURONID ANTOCIJANIN GLIKOZID

EPIKATEHIN U ZAŠTITI NEURONA OD OKSIDATIVNIM STRESOM INDUCIRANE SMRTI STANICA I

II

III

IV

I Kontrolni neuroni II Neuroni izloženi oksidativnom stresu III Kontolni neuroni tretirani epikatehinom IV Neuroni tretirani epikatehinom prije oksidativnog stresa

FLAVONOIDI - ZAKLJUČAK:

※ Biološka aktivnost flavonoida in vivo ne ovisi o njihovoj aktivnosti kao direktnih “hvatača” ROS ili RNS, već prije o djelovanju njihovih metabolita na moduliranje enzimske aktivnosti / funkcije proteina, intracelularne signalne puteve i aktivnost receptora

Lotito SB, Frei B. Free Radical Biology & Medicine. 41 (2006) 1727–1746

Fardet A, Rock E, Remesy C. Journal of Cereal Science. 48 (2008) 258-276

Hrana ili suplement?

Hrana 

Sve preporuke se odnose na hranu.



Hrana sadrži mnoštvo korisnih sastojaka, uljučujući i antioksidanse.



Studije ne definišu koja tačno komponenta ili koja tačno kombinacija komponenata ima pozitivan efekat na zdravlje.

Studena DEFENSE STUDENA DEFENSE OSNAŽI SE Nizak glikemijski indeks Biljni ekstrakti zelenog čaja, echinaceae i ginsenga Prirodni šećer iz soka jabuke Prirodne arome crvene naranče i guave Antioksidansi zelenog čaja (EGCG) Vitamin C Cink i selen →Niskoenergetsko

negazirano osvježavajuće bezalkoholno piće od biljnih ekstrakata s dodatkom vitamina, minerala i antioksidansa zelenog čaja. →Studena defense se preporuča u sklopu uravnotežene i raznovrsne prehrane kao sastavni dio zdravog načina života →Odobrilo Ministarstvo zdravstva i socijalne skrbi RH Odobrene tvrdnje: →Antioksidansi cink, selen i vitamin C doprinose očuvanju zdravlja. →Hrana s niskim glikemijskim indeksom pomaže pri očuvanju normalne razine šećera u krvi.

Suplement 

Suplementi sadrže izoliranu supstancu (jednu ili nekoliko).



Ne postoje preporuke za konzumiranje ne-nutritivnih antioksidanasa (koji?, koliko?)



Doze (efektivna/sigurna)? U fiziološkim koncentracijama (tipičnim za zdravu prehranu) antioksidativni, ali u farmakološkim dozama (tipičnim za suplemente) mogu djelovati pro-oksidativno (primjer studije suplementacije βkarotenom – povećana incidenca karcinoma pluća u pušača!)



Rezultati studija kontradiktorni – nutrigenomika?