Fundamentos de La Microscopia

Fundamentos de la microscopia Cuando se acerca un observador a un objeto, crece el ángulo visual y ese objeto parece ser mayor. Sin embargo, por debajo de una determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto, éste no se ve con claridad. Este límite se debe a la capacidad máxima de deformación del cristalino. Si se sitúa entre le ojo y el objeto un sistema óptico capaz de aumentar el ángulo visual, se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad. Ese sistema óptico es el MICROSCOPIO. Produce una imagen aumentada de un objeto no visible de forma que sea perceptible por el ojo humano. Se consigue mediante el uso de lentes u otros sistemas. Esta ampliación de la imagen se puede conseguir de dos formas: ondas luminosas: m. Óptico haz de electrones (é): m. Electrónico Términos que describen las características ópticas del microscopio AUMENTO: relación entre el tamaño a simple vista y el tamaño observado con el microscopio (es el número de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real). En el microscopio compuesto se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Se expresa mediante un número seguido del signo “por” (x). CONTRASTE: diferencia en la absorción de luz entre el objeto estudiado y el medio que lo rodea. Puede aumentarse mediante procedimientos de tinción. PODER DE RESOLUCIÓN: capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Determina la máxima amplificación útil del microscopio. Depende de la longitud de onda (L) y de la apertura numérica (AN): cuanto menor es L y/o mayor la AN, mayor es la resolución. La resolución máxima de un microscopio óptico es de 200 nm. APERTURA NUMÉRICA: capacidad de la lente para juntar los rayos de luz proyectados hacia ella. Determina la eficacia del condensador y del objetivo. La AN depende del índice de refracción del medio que hay entre la muestra y la lente (IR), y del seno de la mitad del ángulo del cono de luz que penetra en la lente (sen α). Si se rellena el espacio existente entre la muestra y el objetivo no con aire, sino con una sustancia de mayor IR (p.e. aceite), se consigue que la mayor parte de los rayos perdidos por los fenómenos ópticos ocasionados en el condensador y en el portaobjetos, se refracten y penetren en el objetivo, con lo que se incrementa la resolución del microscopio. PROFUNDIDAD DE CAMPO: espesor de la preparación enfocada en cualquier momento. Será mayor cuanto menor sea el aumento. ÁREA DEL CAMPO: es el diámetro de la parte de la preparación que se está viendo. Será mayor cuando menor sea el aumento.

Funcionamiento del microscopio Los microscopios tienen tres sistemas que facilitan su funcionamiento, que son: Sistema mecánico * SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. * PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. * CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, etc * REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. * TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque. Es la estructura que sostiene las demás partes del microscopio y le permite moverse. Está formado por el tubo, la platina y el pie. El tubo contiene en su extremo superior el ocular, y a través de él la luz llega hasta el lente objetivo; La platina es donde se coloca la muestra que se va a observar; y el pie es la estructura sobre la que se apoya el microscopio. En el mecánico se incluyen dos tornillos que facilitan el enfoque del objeto observado: el tornillo macrométrico (permite el enfoque global de la muestra) y el tornillo micrométrico (enfoca detalladamente y con precisión cada una de sus partes). Por tanto este sistema de soporte y mecánico del microscopio está compuesto por: tubo del ocular, revólver, platina, pinzas, brazo, base, tornillos macrométrico y micrométrico.

Conjuntamente se encargan de amplificar la imagen de las estructuras y organismos. El ocular y los objetivos están marcados con unos números que indican el aumento de cada lente. Si multiplicamos estos números, se conoce el aumento total con el cual estamos observando. Sistema de iluminación Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos: * Fuente de iluminación: se trata generalmente de una lámpara incandescente de tungsteno sobrevoltada. Por delante de ella se sitúa un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el diámetro de la parte de la preparación que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observación produciendo luces parásitas. * El espejo: necesario si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema óptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para iluminación natural (luz solar). Los modelos más modernos no poseen espejos sino una lámpara que cumple la misma función que el espejo. * Condensador: está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación); existen condensadores de inmersión, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajándose para su uso con objetivos de poca potencia. * Diafragma: el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico. Sistema óptico El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego amplía. * El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado. * Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión. * Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. * El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior. A. B. C. D. E. F.

OCULARES (A) REVOLVER (B) OBJETIVOS (C) (los aumentos en el ext.) PLATINA (D) Tornillos para desplazar la preparación sobre la platina en sentido longitudinal y transversal (E) CONDENSADOR (F)

G. Tornillo MACROMÉTRICO (G) H. Tornillo MICROMÉTRICO (H) I. DIAFRAGMA IRIS (I) J. Tornillo para regular la altura del condensador (J) K. INTERRUPTOR (K) L. Regulador de la Intensidad de Luz (L) M. PINZAS para ajustar la preparación sobre la platina (M) N. PIE O SOPORTE (N)

Microscopio óptico Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como microscopio de luz, microscopio fotónico (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos. Partes del microscopio óptico y sus funciones Las partes esenciales que componen un microscopio óptico son: Parte mecánica Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en él se encuentra la fuente de iluminación. Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el portaobjetos con la preparación, y unas escalas que ayudan a conocer qué parte de la muestra se está observando. La platina presenta 2 tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la misma, que permiten desplazar la preparación sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal respectivamente. Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y objetivos. Es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Revólver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos. Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomat el microscopio para trasladarlo de lugar. Tornillo macrométrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer enfoque de la muestra al utilizrse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible. Tornillo micrométrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez que se ha realizado el enfoque con el macrométrico. También desplaza verticalmente la platina, pero de forma prácticamente imperceptible. Es el único tornillo de enfoque que se utiliza, una vez realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor aumento. Parte óptica Oculares: son los sistemas de lentes más cercanos al ojo del observador, situados en la parte superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se reseña en la parte superior de los mismos (normalmente 10X en los microscopios que se utilizarán en esta práctica). Dependiendo de que exista uno o dos oculares, los microscopios pueden se mono o binoculares. Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior del tubo, mediante el revólver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma creciente según sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado es distintivo de los aumentos de cada objetivo, que también van reseñados en el lateral del mismo. Algunos objetivos no enfocan bien la preparación al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersión (normalmente van marcados con un anillo rojo). Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra sobre la preparación, de manera que proporciona mayor o menos contraste. Se regula en altura mediante un tornillo Fuente de iluminación: en los microscopios a utilizar, el aparato de iluminación está constituido por una lámpara halógena de bajo voltaje (12V) situada en el pie del microscopio. La luz procedente de la bombilla pasa por un reflector que envía los rayos luminosos hacia la platina. Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminación. Abriéndolo o cerrándolo permite graduar la intensidad de la luz. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

Transformador: ya que el voltaje de la bombilla es menor que el de la red, es necesario para enchufar el microscopio. Algunos modelos ya lo llevan incorporado en el pie del microscopio. Además, el transformador dispone de un potenciómetro para regular la intensidad de la luz. 1) Microscopio Optico Simple: Este es el más común, y popularmente se lo conoce como lupa, este esta formado por un lente convergente y es él más sencillo de los instrumentos ópticos. Este microscopio tiene una capacidad de ampliacion de unas 10 veces aproximadamente. 2) Microscopio Optico Compuesto: Este se halla comprendido por tres sistemas  Sistema Mecánico: Sirve de soporte a las piezas donde se instalan los lentes, y posee mecanismos de movimiento controlado; Aquí se encuentra el pie o base que da la estabilidad, la columna que sostiene las diversas partes, la platina que se usa para colocar el objeto a observar, el carro que va sobre la platina y permite desplazar la preparacion, el brazo en el que se encuentran los tornillos macrometicos y micrometicos, el tubo va unido al brazo y en su parte superior se coloca el ocular y en su parte inferior se coloca el revolver de objetos; el revolver es donde van enfocados los objetivos.  Sistema Óptico: Esta formado por: * El ocular: Se encuentra en la parte superior del tubo y recibe ese nombre porque se encuentra cerca del ojo del observador, y cumple la función de aumentar la imagen formada por la lente del objetivo. * Los Objetivos: Son una serie de lentes montados sobre cilindros de distintos tamaños que se enroscan al revolver, y por estar próximos a la preparación que se observa producen el aumento de la misma. Estos lentes se clasifican en menor, mediano, y mayor aumento, y son considerados como objetivos secos, puesto que no necesitan ningún liquido en su estructura para su desempeño.  Sistema de Iluminación: Comprende de: * El condensador: Es un conjunto de lentes situado debajo de la platina, que permite concentrar la luz sobre el objeto a observar. * El espejo: Nos permite dirigir la luz, ya sea artificial o natural al campo de observación del microscopio, tiene una cara plana para observar la luz natural y otra cóncava para la luz artificial. Pero hoy ya no se fabrican estos, porque los microscopios traen una lamparilla incorporada. * El iris: Esta debajo del diafragma y es el que regula el paso de la luz hacia el condensador y por consiguiente la platina. Algunos microscopios copticos compuestos pueden aumentar un objetos por sobre las 2.00 veces. Aplicaciones del microscopio óptico Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en donde la estructura y la organización microscópica es importante, incorporándose con éxito a investigaciones dentro del área de la química (en el estudio de cristales), la física (en la investigación de las propiedades físicas de los materiales), la geología (en el análisis de la composición mineralógica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de la biología (en el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de la ciencia. Hasta ahora se da uso en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la microscopía permite determinadas aplicaciones diagnósticas, entre ellas el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, depósitos de amiloide, etcétera. El microscopio óptico tiene muchas aplicaciones, siendo las principales: Se realizan estudios de: Hematología: Fórmula roja, blanca y rutina, plaquetas, tiempo de protombina, glucosa urea, creatinina, general de orina, bilirrubina: Directa e indirecta. TGO, TGP, acido úrico, factor Reumatoide, proteína C reactiva, reacciones febriles, bacteriología, exudado uretral, faringeo, vaginal y de heridas varias. Microscopio de fluorescencia Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayos luminosos. Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados

debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. Fluorescencia El fenómeno de la fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital. Aprovechando este fenómeno, se han creado los fluorocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitación que seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo. Los más comunes son el DAPI que tiñe el núcleo de las células y el GFP. Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). Problema: La utilización de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia. Fluorescencia: A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado. CONSTITUCION FUNDAMENTAL: Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta. Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos: *El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. *El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. *Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia. Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa. FUNDAMENTO FISICO La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación. Ejemplo: 1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) 2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo . 3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos: *El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo que el largo de onda de la luz excitadora

*Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz. Por lo tanto la energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida. *La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de la luz de excitación *La fluorescencia se desvanece. *Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico. APLICACIONES 1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la muestra misma. 2.Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante métodos de tinción. Ej:substancias específicas como organelos celulares, proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc. 3. Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un virus. MICROSCOPIO INVERTIDO Como su nombre lo dice un microscopio invertido está al revés comparado con un microscopio convencional. La fuente de luz y el condensador están sobre la plataforma apuntando hacia abajo. Los objetivos y la torrecilla están debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Las únicas cosas que están en disposición corriente son el tubo binocular o trinocular, así mismo la muestra es colocada sobre la plataforma o platina mecánica. Aunque un microscopio electrónico tiene gran significado en la magnificación y resolución de la muestra, éste requiere que el especímen sea completamente preparado, conduciendo a que cualquier tipo de vida en la muestra no sobreviva. Por otra parte, el microscopio de luz concede una observación temporal de muestras vivas, sin embargo, éstas requieren una hidratación constante que las somete a estres permanente, imposibilitando de tal manera su supervivencia. A diferencia de estos microscopios, el microscopio invertido permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa, favoreciendo el monitoreo del estado de crecimiento, comportamiento y demás parámetros involucrados en el desarrollo del cultivo. Con un microscopio invertido se pueden observar cultivos enteros o grandes muestras bajo estados más naturales y con disminuidas condiciones de estres. La observación se realiza a través de las bases de diferentes recipientes con espesores y características ópticas variables, tales como placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux, cajas de Petri plásticas y de vidrio. El material plástico es ópticamente superior que el de vidrio debido que son más delgados y uniformes. Una desventaja del microscopio invertido es su limitada magnificación, debido a que los objetivos más potentes son de 40X y de 60X, aunque éste último eventualmente se encuentra en el mercado y es de muy alto costo. Si embargo estos objetivos tienen la ventaja de sobrepasar el límite del grosor del recipiente y observar la imagen con fineza. Componentes. En el microscopio invertido se identifican los siguientes componentes: -Portalámpara: Es un casquillo dentro del cual se encuentra la lámpara que es la fuente de luz halógena. -Soporte de filtros: Es un contenedor dentro del cual se insertan filtros específicos para el tipo de iluminación requerida en la observación. El filtro de cobalto es de color azul, pasa la luz de amarillo a blanco, viéndose la imagen en campo claro (es un tipo de iluminación que permite observar la muestra oscura contra un fondo claro). El filtro verde es indispensable para el contraste de fases (es un tipo de iluminación que diferencia la imagen en grado de tono, brillo o color, observándose las células traslúcidas) y eventualmente puede emplearse para contraste en relieve o de interferencia (que produce alto contraste, imágenes tridimensionales y reales de objetos transparentes, a diferencia del contraste de fases suple una claridad definida, imagen detallada de células gruesas o células con amplios índices de refracción). -Portanillos de luz: Es una corredera de anillos, que se maneja de acuerdo con el tipo de iluminación requerida (contraste de fases o contraste en relieve). No se emplean anillos para campo claro. -Apertura del diafragma: Es un dispositivo con el cual se gradúa el nivel de luz emitido por la lámpara. Puede ser mantenido bajo para enfocar fácilmente sobre muestras no coloreadas o abierto para contraste de fases. -Condensador: Es un sistema de lentes que recoge los rayos de luz y los converge dentro de un foco. Está localizado directamente por encima de la plataforma del microscopio y está acoplado con la apertura del diafragma para controlar el incremento de la resolución, realzar el contraste, reducir el resplandor y garantizar óptimos resultados con todas las combinaciones ocular–objetivos.

-Soporte: Es el que sostiene el condensador y la lámpara manteniendo la estabilidad del microscopio. - Plataforma mecánica: Platina metálica donde se colocan las muestras a observar, presenta un orificio central que comunica la luz proveniente del condensador con los objetivos. -Carro mecánico: Soporte hueco en el cual se acopla el recipiente del cultivo, posee una regleta que permite el movimiento del carro sobre la plataforma mecánica, de derecha a izquierda o de arriba hacia abajo. De acuerdo con el tipo de recipiente se emplea un soporte específico. En el caso de los frascos no se emplea este soporte. Sin embargo éste es un accesorio que puede ser reemplazado, colocando cualquier recipiente directamente sobre la plataforma mecánica y haciendo el monitoreo del cultivo manualmente, con movimientos diagonales o en zig zag. -Objetivos: Es un sistema de lentes complejos localizados debajo de la plataforma mecánica. Los objetivos corrientes de alto poder, tienen muy corta distancia de trabajo y por lo tanto deben acercarse a la muestra para su enfoque, en el microscopio invertido los objetivos son adaptados para trabajar a largas distancias debido a que el grosor de los recipientes impide el contacto estrecho entre el objetivo y la muestra. Además los objetivos son corregidos para enfocar muestras sobre diferentes bases. El aumento de los lentes se identifica con un código de colores; 4X - rojo, 10X – amarillo, 20X – verde, 32 o 40X – azul. El objetivo de 100X no es disponible para este microscopio. Comercialmente los microscopios invertidos tienen dos presentaciones de objetivos; la primera con aumentos de 4X, 10X, 20X y 32X y la segunda con aumentos de 4X, 10X, 20X y 40X. -Revolver de portaobjetivos: Es un dispositivo donde se ensamblan los objetivos. -Otras piezas: Son los botones micro y macrométrico, tubo binocular o trinocular (en caso de poseer un fototubo para adaptar cámara fotográfica), oculares, anillo de ajuste de dioptrías (para la corrección de la diferencia de dioptrías entre ambos ojos), botón para ajustar el bulbo de voltaje (regula la entrada de voltaje al microscopio prolongando su tiempo de duración), receptáculo para el cable de conexión comunicado con el fusible del microscopio. Algunas ventajas y desventajas del microscopio invertido. Una gran ventaja del microscopio de luz sobre el microscopio electrónico es la habilidad para observar organismos vivos y tejidos. Varios tipos de microscopios electrónicos requieren que el espécimen altamente preparado (lo cual incluye recubrimientos con oro) y vacío para la observación. En los microscopios de luz se pueden observar temporalmente organismos vivos, lo cual permite determinar algunas funciones vitales, sin embargo las muestras se preparan con soluciones de alcohol o formaldehido, componentes que denaturan las proteínas y los ácidos nucleicos. Mientras un microscopio electrónico tiene una alta magnificación y resolución que un microscopio de luz (algunos producen espectaculares imágenes tridimensionales), sólo produce imágenes de muestras muertas. A diferencia de estos microscopios, en el invertido los cultivos o muestras se pueden colocar en diferentes recipientes con espesores y características ópticas variables, se utilizan entonces, placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux, cajas de Petri plásticas y de vidrio, lo cual permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa, se pueden además observar grandes cultivos o muestras bajo estados muy naturales, lo cual permite disminuir las condiciones de estrés. La primer desventaja es el costo. Los microscopios invertidos no están en cualquier lugar, como si lo está un microscopio con una configuración estándar por eso es poco competitivo para los fabricantes . Otra desventaja es su limitada magnificación, pues el objetivo más potente es de 60X, siendo poco frecuente en el mercado y de muy alto costo. Actualmente se están comenzando a fabricar objetivos de 100X que se utilizan en aceite de inmersión, sin embargo son bastante costosos y escasos. Microscopio de campo oscuro Utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal. Fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados. Permite ver : - Partículas dispersas en un medio homogéneo. - La observación del movimiento Browniano de las partículas. - Se puede utilizar para la observación de preparaciones vivas, sin colorear. - Visualiza los bordes destacados de las muestras. - Y microorganismos con diámetros superior a 0.2 um. Consta de un condensador especial que debe estar muy cercano a la preparación y que lanza sobre la muestra un cono hueco de luz. Con esto se logra que, solamente los rayos que chocan con las estructuras sometidas a estudio y son reflejados hacia arriba, puedan ser visualizados a través del objetivo.

Cómo funciona el microscopio de campo oscuro Debido al ángulo de incidencia del haz luminoso sobre el espécimen que se va a observar, permite que el fondo sea oscuro y los bordes de las células sanguíneas aparezcan brillantes. Esto es posible gracias al tipo de condensador que lleva este tipo de microscopio. La luz se dispersa al chocar contra la célula o espécimen que se va a observar. Es como si en una habitación oscura entra un pequeño haz de luz por una rendija de una ventana y en el fondo oscuro de la habitación se iluminan las partículas de polvo que flotan en el aire. Lo que en un principio era invisible se vuelve visible. Para comprender como funciona la microscopía en campo oscuro hemos puesto un video que nos hace visualizar este tipo de técnica. Microscopio Electrónico Es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 2 aumentos comparados con los de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles". Se utiliza para conocer el tamaño, estructura y morfología de los seres vivos. El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska, Max Knoll y Jhener entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. Limitaciones del microscopio electrónico El limitado diámetro de la apertura no permite que la información detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolución. * El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al constraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes gruesos. * El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes finos. * Existen también distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmática, esférica y cromática * El problema de la función de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas. El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vacío y la transferencia de energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra: * Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas: 1. La fijación química o la criofijación 2. La inclusión en resinas (criosustitución) 3. La réplica metálica * Para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas: 1. La tinción negativa: los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactúan mínimamente con la muestra y son estables en la interacción con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusión, tienen un tamaño de grano pequeño. 2. La réplica metálica: para construir la réplica metálica se evapora el metal (estaño), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vacío, se disuelve. 3. La criomicroscopía Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. Un microscopio electrónico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o

provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más. Este tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. Se han desarrollado otros tipos de microscopios electrónicos. Un microscopio electrónico de barrido y transmisión (Scanning Trasnmission Electron Microscope, STEM) combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los átomos individuales de un objeto. El microanalizador de sonda de electrones, un microscopio electrónico que cuenta con un analizador de espectro de rayos X, puede analizar los rayos X de alta energía que produce el objeto al ser bombardeado con electrones. Dado que la identidad de los diferentes átomos y moléculas de un material se puede conocer utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de electrones no sólo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un microscopio electrónico, sino que suministra también información sobre la composición química del material. Para estudiar la estructura intema de los procariotas es esencial el uso del microscopio electrónico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, la resolución obtenìda con el microscopio electrónico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio optico. Mientras que con el microscopio optico ordinario o el de contraste de fases las estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0,001 µm. Con el microscopio electrónico es posible ver mucbas sustancias incluso de tamaño molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados: si se está interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto último transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la deshidratación, la muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por elIo, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor. Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrónico es la tinción negativa. Se aplica el mismo principio que en la tinción negativa del microscopio óptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas más comúnmente utilizadas en la microscopia electrónica se realiza con ácido fosfovolfrámico (fosfotúngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrónico. Otra técnica de la microscopía electrónica recientemente desarrollada es la de criocorrosión que evita la formación de artefactos al eliminar la fijación química y la inclusión. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento químico, y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las células. Se hacen y se examinan entonces réplicas en carbono de esas superficies, pudiéndose observar estructuras superficiales o internas de las células. La mayoría de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas químicamente se ven también en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos. | Mantenimiento del microscopio

* El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo. Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa plástica o campana de vidrio. * Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste se puede humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Que hayan caído sobre las citadas partes. * La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe emplearse papel "limpiante" que expiden las casas distribuidoras de material de laboratorio. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas. Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel "limpiante" con éter y luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. El aceite de cedro que queda sobre la lente frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de finalizada la observación. Para ello se puede pasar el papel "limpialentes" impregnado con una gota de xilol. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formación de hongos. Ciertos ácidos y otras sustancias químicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio. Manejo y colocación del microscopio. Si es posible, el microscopio debe dejarse permanentemente montado en el banco o mesa, cubierto con una tapa contra el polvo, cuando no se utiliza. Generalmente, la mayor parte de los desperfectos que sufre un microscopio son producidos por los continuos golpes que recibe al ser introducido y extraído de su estuche. Si no pudiera dejarse fijo, se procederá siempre a su movimiento con sumo cuidado, procurando cogerlo por el brazo o soporte rígido del mismo, a fin de evitar desajustes. La mesa para el microscopio debería ser lo más sólida posible. Cualquier vibración impide una microscopía de precisión a altos aumentos. 1. Traslado. Se toma con la mano derecha el brazo del microscopio y con la mano izquierda la base. 2. El cordón se deberá enrollar sobre si mismo , no alrededor del cuerpo del microscopio. 3. El microscopio se encenderá hasta que comience la observación. 4. Ya encendido, no se apagará constantemente, sino hasta finalizar la observación de todas las muestras que se indiquen en la práctica, mientras no se observe, se disminuirá la intensidad luminosa. 5. Mientras permanezca encendido se evitará realizar cualquier movimiento brusco. 6. Se evitará manejarlo con las manos húmedas o mojadas. 7. Cuando no se esté observando, deberá eliminarse la lente ocular con el objeto de menor aumento. 8. El sistema óptico y de iluminación nunca deberá ser tocado con los dedos. 9. No se deberán colocar los portaobjetos mojados sobre la platina. 10. Después de usar el lente de inmersión se deberá limpiar con un paño suave o con un papel higiénico. 11. En las preparaciones en fresco siempre deberá cubrirse con cubreobjetos. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: 1. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. 2. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 1. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de

percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 2. Empleo del objetivo de inmersión: 1. Bajar totalmente la platina. 2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. 3. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. 4. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. 5. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. 6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 7. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 8. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. 9. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. 10. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. Colocación de las preparaciones Para un manejo correcto del microscopio conviene seguir los siguientes pasos: 1.-Preparaciones Los objetos que se pueden observar al microscopio han de ser transparentes para que la luz pueda atravesarlos. En muchas ocasiones se tiñen para poder observarlos mejor. Los objetos han de ser muy delgados para poder enfocarlos correctamente. 2.-Colocación de la preparación - El objeto a observar se pone sobre una lámina de vidrio llamada portaobjetos. - Generalmente se cubre con un vidrio más delgado llamado cubreobjetos - La preparación se coloca sobre la platina, bien centrada y se fija con las pinzas. 3.- Enfoque: se deben seguir los siguientes pasos Se pone el objetivo de menor aumento (es el de tamaño más pequeño) Mirando por fuera se sube la platina con el tornillo macrométrico hasta que el objetivo se halla a 1 cm del objeto Mirando por el ocular bajar la platina lentamente hasta ver la imagen Finalmente se afina el enfoque con el tornillo micrométrico. 4- Iluminación Se realiza con el espejo o iluminador. Se corrige la cantidad de luz con el diafragma y lentes 5-Observación a mayor aumento Sin desenfocar se da la vuelta al revolver hasta colocar en posición el objetivo mediano Mirando por el ocular se enfoca nuevamente. Se regula la iluminación si fuera necesario 6-Cálculo de los aumentos Para calcular los aumentos con que se está observando una preparación basta con multiplicar los aumentos del ocular por los aumentos del objetivo. Enfoque seco debil, fuerte y de inmersión Objetivos.- Son las lentes situadas cerca de la preparación. Amplían la imagen de ésta última. Existen tres tipos de objetivos con un diferente aumento cada uno: Seco Débil (10x) Es el objetivo de menor aumento y se utiliza para hacer enfoques simples. Seco Fuerte (40x) Este objetivo es utilizado para ver preparaciones en fresco, como son la orina, la sangre, un exudado, etc... Inmersión (100x) El objetivo de mayor aumento, se utiliza para observar preparaciones fijas, debido a que es necesario para su enfoque, agregar unas gotas de aceite. Para enfocar en Seco Débil: 1. Conectar 2. Colocar el objetivo de menor aumento 3. Localizar fuente de iluminación

4. Encender en 3 o 4 5. Bajar el condensador completamente 6. Abrir la palanca del diafragma hasta que pase la mayor cantidad de luz 7. Colocar la preparación ensamblando el portaobjetos con las pinzas de la platina 8. Hacer coincidir la preparación con el orificio de la platina utilizando los tornillos para carro de la platina 9. Observando lateralmente subir la platina con el tornillo macrométrico 10. Observar a través del ocular sujetando los anillos y ajustar la platina, primero con el tornillo macrométrico y al observar una imagen, darle nitidez utilizando el tornillo micrométrico. 11. Tomar los tornillos de carro de la platina e ir observando la imagen Seco Fuerte 12. Cambiar al objetivo de 40x y dar mayor nitidez a la imagen utilizando el tornillo micrométrico 13. Elevar el condensador para obtener suficiente iluminación Inmersión 14. Cambiar a objetivo 100x 15. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el prtaobjetos 16. Elevar el condensador lo más posible sin forzarlo 17. Abrir completamente el diafragma 18. Descender el objetivo 19. Dar nitidez. ¿Comó debe ser la iluminación? Sistema de iluminación La iluminación del microscopio puede ser exterior pero, actualmente lo más común es que la iluminación se consiga mediante lámparas halógenas incorporadas al propio microscopio. Esta luz debe recogerse y enfocarse en el objeto colocado sobre la platina. La iluminación de la muestra que se observa al microscopio se realiza mediante un cono de luz concentrado por la acción de una lente condensadora situada directamente debajo de la platina. Ajuste de iluminación (Iluminación Köehler) La iluminación koehler tiene como fin realizar una observación más correcta de un espécimen del microscopio, ésta técnica ayuda a lograr una iluminación detallada del espécimen en el microscopio; con esta técnica se puede observar con los objetivos de 10X, 40X y con el de 100X de inmersión, sin tener que enfocar otra vez. Para poder lograr la iluminación koehler se requiere de un microscopio con tres diafragmas de iluminación. Bibliografia -http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html -http://www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm -http://www.xuletas.es/ficha/microscopia/ -http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/minvertido.htm -www.uam.es/.../Guiones/Practica3.htm -http://www.mailxmail.com/curso-microscopio/mantenimiento-precauciones -http://www.cnb.csic.es/~fotonica/Diferencias.htm -httphttp://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_iluminacion.htm -http://www.monografias.com/trabajos/microscopio/microscopio.shtml -http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto -http://danival.org/notasmicro/microscopio/microscop_20_microscop.html