fosfatasa_acida

Estudio Cinético de la Fosfatasa Ácida Giselle Jiménez 173405 - Ray Marcel Marín 173407 Fecha de realización de la práctica: Febrero 27 del 2003 Objetivos Obtener el extracto crudo a partir de una muestra de germen de trigo. Determinar las condiciones de pH, tiempo, temperatura, concentración de la enzima y concentración del sustrato, óptimas para que la velocidad de reacción catalizada por la enzima sea máxima. Calcular el valor dela constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima de reacción. Analizar el efecto que tiene en la velocidad de reacción la presencia de un inhibidor. Fundamento teórico y reacciones (1, 2) Fosfatasa Ácida Como ya es sabido, al igual que el químico en el laboratorio, la naturaleza también dispone de catalizadores para aumentar la velocidad de las reacciones que suceden en los organismos vivos. Dichos catalizadores reciben el nombre de enzimas y como es costumbre en la historia de la química, primero se descubrieron sus capacidades catalíticas y después su forma y estructura, lo cual sigue siendo hoy motivo de investigación. Al igual que todos los catalizadores, la función de las enzimas es disminuir la energía de activación de la reacción (sin afectar el cambio neto de energía entre reactivos y productos) mediante interacciones entre el sustrato y el sitio activo de la enzima, las cuales suelen basarse en la distorsión y debilitamiento de unos enlaces para formar otros.

E ES

S E+P Coordenada de Reacción

Las enzimas son macromoléculas orgánicas o biopolímeros cuya estructura y forma tridimensional son los directos responsables de su actividad biológica. Las enzimas, por estar constituidas de una o varias proteínas, poseen como mínimo una estructura terciaria, sin embargo en la mayoría de los casos poseen también una estructura cuaternaria. A diferencia de la estructura secundaria que depende de la secuencia de aminoácidos genéticamente determinada (estructura primaria), las estructuras terciarias y cuaternarias dependen mayormente de las condiciones del medio en que se encuentra la enzima. Esto quiere decir que dependiendo del pH los residuos de aminoácidos y por lo tanto la enzima tendrán una carga diferente, lo cual se traduce en interacciones coulómbicas intramoleculares diferentes y por lo tanto una estructura más globular o más alargada. Las enzimas deben mantenerse a un pH en el que mantengan la forma globular ya que es esta la configuración que permite una alta selectividad del sustrato y un óptimo funcionamiento del sitio activo. Es más, sin forma globular posiblemente no exista ningún sitio activo. En la estructura cuaternaria también influyen las condiciones del medio pues esta se debe a interacciones no covalentes intercatenarias e intracatenarias las cuales se pueden ver afectadas por el pH en el caso de los aminoácidos ácidos o básicos, por la polaridad del solvente en el caso de las interacciones hidrofóbicas, por la presencia de agentes oxidantes o reductores en el caso de la formación de puentes disulfuro entre cisteínas, y por la temperatura ya que esta cambia la energía cinética de las moléculas que puede romper desde la delicada estructura cuaternaria hasta la fuerte estructura primaria. En cuanto a la cinética de las reacciones catalizadas por enzimas, tendremos en cuenta el modelo desarrollado por Michaelis-Menten el cual se basa en el siguiente razonamiento:

E+ S

k1

k3

ES

k2

E+ P

En primer lugar se da un proceso reversible que consiste en que el sustrato logra ubicarse en el sitio activo de la enzima en donde ésta facilitará la reacción. Allí se ha formado el complejo enzima-sustrato que avanzará (en una reacción comúnmente irreversible o cuyo equilibrio está muy desplazado hacia los productos en el comienzo de la reacción) hacia los productos, siendo esta etapa la más lenta y por lo tanto la que determine la velocidad de la reacción. Teniendo en cuenta esto se puede plantear:

[ E ][ S ] [ ES ] v = k 3 [ ES ]

KS =

[1] [2]

Donde KS es la constante de disociación de del complejo ES. A su vez también se puede expresar la concentración de enzima libre como:

[ E ] = [ E 0 ] −[ ES ] donde [E0] es la concentración inicial de enzima y Reemplazando [3] en [1] y despejando [ES] se obtiene:

[ ES ] =

[3]

[E] es la concentración de enzima libre.

[ E 0 ][ S ] K S + [S ]

[4]

y reemplazando [4] en [2] se obtiene la ecuación de Michaelis-Menten:

v=

[ E 0 ][ S ]k 3 K M + [S ]

[5]

en donde KS se hace igual a KM cuando k2 >> k3 es decir cuando la reacción catalizada es mucho más lenta que la reacción de disociación del complejo ES o también llamado complejo de Michaelis. Aunque existe una manera mas larga y elaborada de llegar a la ecuación de Michaelis-Menten y diferentes modelos de la misma según sea la naturaleza de la reacción, de aquí se puede partir para hacer el estudio cinético de la fosfatasa ácida. En una última modificación, y teniendo en cuenta que:

Vmax = k 3 [ ES ] max = k 3 [ E 0 ]

[6]

se puede plantear la ecuación de Michaelis-Menten de la siguiente manera:

v=

Vmax [ S ] K M + [S ]

[7]

Aunque es posible conocer el valor de la velocidad máxima y de la constante de Michaelis en una gráfica de v vs. [S], existen otros modelos que nos permiten obtener los valores de una manara más exacta. Utilizando la ecuación [7] se puede calcular la velocidad máxima proyectando una recta asintótica con respecto al punto mas alto de la gráfica y se puede conocer en valor de KM interpolando en el eje x el valor correspondiente a la mitad de Vmax, pues:

v=

Vmax V [S ] = max 2 K M + [S ]

K M + [ S ] = 2[ S ] K M = 2[ S ] − [ S ] = [ S ] Haciendo un primer rearreglo de la ecuación [7] se puede obtener también:

K 1 1 1 = M + v Vmax [ S ] Vmax

[8]

v +Vmax [S ]

[9]

y haciendo otro rearreglo a [7]:

v = −K M

Michaelis-Menten v

Lineweaver-Burk 1/v

Eadie-Hofstee v

Vmax

b=Vmax

m=KM/Vmax

Vmax /2

m=-KM

b=1/Vmax KM

[S]

-1/KM

Vmax / KM 1/[S]

v/[S]

Dentro del campo de la cinética de las reacciones catalizadas por enzimas, se puede afirmar que la actividad de la enzima es máxima siempre y cuando esta se encuentre en las condiciones del medio óptimas. Sin embargo es posible influenciar la velocidad de las reacciones tanto en forma negativa como en forma positiva. En el primer caso estamos hablando de los inhibidores los cuales pueden actuar de diferentes maneras. En la inhibición competitiva, tanto el sustrato (sustancia a transformarse en el proceso catalítico) como el inhibidor pueden unirse a la enzima de manera reversible, lo cual implica que la probabilidad de que el sustrato forme el complejo enzima-sustrato disminuye a medida que la cantidad de inhibidor se hace mayor y viceversa. En este caso no se ve afectada la velocidad máxima ya que esta depende de k3 pero si se ve afectada KM ya que se forma menos cantidad de complejo ES o desde otro punto de vista se aumenta la disociación de ES. Un segundo tipo de inhibición es la no competitiva en la que el inhibidor se une al complejo ES para formar un complejo terciario ESI inactivo que también se puede disociar además de unirse a E únicamente. En este caso se ve afectada Vmax pero no KM. Un tercer tipo de inhibición es la acompetitiva en la que el inhibidor solo se une al complejo ES pero no e la enzima sola. En este caso se afecta tanto Vmax como KM. Un cuarto tipo de inhibición es la irreversible en la cual el inhibidor se une irreversiblemente a la enzima o al complejo ES. Este es el caso de metales pesados como el Hg2+ y el Pb2+. Otro factor que puede jugar en contra de la velocidad de reacción es el tiempo, ya que con es transcurso de la reacción se va formando mas producto el cual puede inhibir la reacción o simplemente desplazar el equilibrio hacia los reactivos. En cuanto a la influencia positiva, estamos hablando de sustancias que son indispensables para el funcionamiento de la enzima, de tal manera que su ausencia disminuye la actividad de la misma. Estas sustancias reciben el nombre de cofactores los cuales pueden ser iones metálicos como Zn 2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+, K+ y Na+. En el caso en que se trata de cofactores orgánicos se les llama coenzimas que en la mayoría de los casos son vitaminas. Así, cuando la enzima esta en presencia del cofactor o la coenzima se dice que está como haloenzima pero si esta está sola se le llama apoenzima.

Nuestro estudio consiste entonces en ver como todos estos factores (pH, temperatura, [S], [E], tiempo, inhibidor) afectan la velocidad de la reacción catalizada por la fosfatasa ácida y concluir cuales son las condiciones óptimas para que la enzima tenga su mayor actividad. La función de la fosfatasa ácida es la de hidrolizar los enlaces tipo monoester del ácido fosfórico, y en nuestro caso el sustrato a hidrolizar es el β -glicerofosfato de sodio: OH OH -

+

O Na O

P

-

O -

+

O Na

+

H2O

+

Fosfatasa

OH

ácida

+

P

HO

O Na

O -

O Na+

OH

OH

Determinación de Fósforo Para poder medir la velocidad de la reacción es necesario que conozcamos la cantidad de reactivo que desaparece en un intervalo de tiempo o la formación de producto en el mismo. En este caso emplearemos la detección del producto mediante el método de Fiske-Subbarow. Este método consiste en adicionar ácido molíbdico a la solución para que reaccione con el fosfato y forme ácido fosfomolíbdico. Posteriormente se adiciona ácido ascórbico para formar los óxidos de molibdeno de color azul: Fosfato + Ácido Molibdico  Ácido fosfomolíbdico Ácido fosfomolíbdico + Ácido ascórbico  óxidos de Molibdeno (azul) Tablas de datos y resultados Curva de calibración Concentración del patrón: 0.04mg/ml

Masa molar: P = 30.9

Tabla 1. Valores de concentración de patrón de fósforo y absorbancia obtenidos para la construcción de la curva de calibración. Tubo

B

1

2

3

4

5

Volumen de Patrón (mL)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Abs 660nm

0

0.119

0.231

0.372

0.567

[P] (mM)

0

Muestra de cálculos:

2.6E-08 5.2E-08 7.8E-08 1.0E-07

Αbs 660 nm = −log T660 nm

[ P] =

Vp a tr ó n⋅ 0.0 4mm gL 3 0 9 0 0 ⋅ 5 .0 m L m gP m ol

1.09 1.3E-07

[10]

[11]

donde Vpatrón corresponde al volumen de solución patrón de concentración 0.04mg/mL adicionado a cada muestra, 30900 a la masa molar del fósforo y 5.0 al volumen total de la muestra. Para el dato del tubo 1:

[ P] 1 =

0 .1 m ⋅ L0.0 4mm gL

= 2.6 ⋅ 1 0− 8 m M 3 0 9 0 0 ⋅ 5 .0 m L m gP m ol

Gráfica 1. Curva de Calibración de fósforo. 1.200

1.000 A = 5.3E+06[P] 2 R = 0.9819

Abs 660nm

0.800

0.600

0.400

0.200

0.000 0.00E+00

2.00E-08

4.00E-08

6.00E-08

8.00E-08

1.00E-07

1.20E-07

Concentración de fósforo (mM)

Determinación del tiempo óptimo de incubación Tabla 2. Valores de absorbancia obtenidos para la muestra a diferentes tiempos de incubación y concentraciones de fósforo obtenidas a partir de la curva de calibración. Tiempo (min)

5

17

20

30

40

Abs660nm corregida

-0.148

0.050

-0.042

0.021

0.074

-2.80E-08

9.41E-09

-7.90E-09

3.95E-09

1.40E-08

[P] (mM)

Velocidad inicial (pendiente en el origen): 1.2x10-9 mM/min Tiempo óptimo de reacción: 40 min Muestra de cálculos: El valor de Abs660nm fue calculado empleando la ecuación [10]. La concentración de fósforo fue calculada según la ecuación obtenida por regresión en la gráfica 1:

A = 5.3 ×10 6 [P ]

[12]

Para un tiempo de incubación de 5 minutos:

[ P] = 5.3 ×10

6

− 0.148

= -2.80 ×10 -8 mM

[13]

Gráfica 2a. Determinación del tiempo óptimo de incubación (todos los datos). 1.00E-07 8.00E-08

[P] (mM)

6.00E-08 4.00E-08 2.00E-08 0.00E+00 0

5

10

15

20

25

-2.00E-08

30

35

40

sin corregir Abs corrigiendo Abs

-4.00E-08 Tiempo (min)

45

Gráfica 2b. Determinación del tiempo óptimo de incubación (sin el dato de 17 minutos). 1.00E-07 sin corregir Abs

[P] = 1.2E-09t + 3.3E-08 2 R = 0.997

corrigiendo Abs

8.00E-08 6.00E-08

[P] (mM)

4.00E-08 [P] = 1.2E-09t - 3.3E-08 2 R = 0.9959

2.00E-08 0.00E+00 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

-2.00E-08 -4.00E-08 Tiempo (min)

Efecto del pH Tiempo de reacción: 10 min Tabla 3. Valores de absorbancia, concentración de fosfato y velocidad de reacción obtenidos para muestras a diferentes pH. Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

6

PH

5.3

5.3

5.3

3.0

4.0

5.0

5.3

5.6

6.2

0.000

0.022

0.284

Abs660nm corregida

0.003

0.061

0.042

0.029

0.144

-0.034

[P] (mM)

5.53E-10

1.15E-08

7.91E-09

5.56E-09

2.72E-08

-6.51E-09

V (mM P/min)

5.53E-11

1.15E-09

7.91E-10

5.56E-10

2.72E-09

-6.51E-10

pH óptimo: 5.6 Muestra de cálculos: El cálculo de la concentración de fósforo se realizó utilizando la ecuación [13], para el tubo 1:

[ P] = 5.3 ×10

6

0.003

= 5.53 ×10 -10 mM

la velocidad de la reacción se calculó como:

v0 = Para el dato del tubo 1:

[ P] 10 min

[14]

v0 =

5.53 ×10 −10 mM = 5.53 ×10 −11 10 min

mM min

Gráfica 3. Efecto del pH en la velocidad de reacción.

2.80E-09 2.30E-09

v 0 (mM P/min)

1.80E-09 1.30E-09 8.00E-10 3.00E-10 -2.00E-10 2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

-7.00E-10 pH

Efecto de la temperatura Tiempo de reacción: 10min Tabla 4. Valores de absorbancia, concentración de fosfato y velocidad de reacción obtenidos para muestras a diferentes temperaturas. Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

T °C

18

18

18

0

18

37

60

92

0.000

0.008

0.187

Abs660nm corregida

0.123

0.107

0.107

0.249

0.038

[P] (mM)

2.33E-08

2.03E-08

2.03E-08

4.71E-08

7.17E-09

V (mM P/min)

2.33E-09

2.03E-09

2.03E-09

4.71E-09

7.17E-10

Temperatura óptima: 60°C Muestra de cálculos: La concentración de fosfato y la velocidad de reacción fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14]. Por ejemplo para el dato correspondiente a una temperatura de 0°C:

[ P] = 5.3 ×10 0.123

v0 =

6

= 2.33 ×10 -8 mM

2.33 ×10 −8 mM = 2.33 ×10 −9 10 min

mM min

Gráfica 4. Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción. 5.00E-09 4.50E-09

v 0 (mM P/min)

4.00E-09 3.50E-09 3.00E-09 2.50E-09 2.00E-09 1.50E-09 1.00E-09 5.00E-10 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Temperatura (°C)

Efecto de la concentración de la enzima Tiempo de reacción: 10 min Tabla 5. Valores de absorbancia, concentración de fosfato y velocidad de reacción obtenidos para muestras con diferente concentración de la enzima. Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

V de enzima (mL)

0.0

0.0

0.1

0.1

0.1

0.2

0.3

0.4

0.000

0.000

0.137

Abs660nm corregida

0.018

0.116

0.173

0.018

0.240

[P] (mM)

3.39E-09

2.20E-08

3.27E-08

3.39E-09

4.54E-08

V(mM P/min)

3.39E-10

2.20E-09

3.27E-09

3.39E-10

4.54E-09

Actividad del extracto enzimático: 2.1x10-8 mM P/min mLextracto Muestra de cálculos: La concentración del fosfato y la velocidad de reacción fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14], respectivamente. Para el tubo 1:

[ P] = 5.3 ×10 0.018

v0 =

6

= 3.39 ×10 -9 mM

3.39 ×10 −9 mM = 3.39 ×10 −10 10 min

mM min

Gráfica 5a. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de reacción (todos ls datos). 5.00E-09 4.50E-09 4.00E-09

v 0 (mM P/min)

3.50E-09 3.00E-09 2.50E-09 2.00E-09 1.50E-09 1.00E-09 5.00E-10 0.00E+00 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

Volumen de extracto enzimático (mL)

Gráfica 5b. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de reacción (sin el dato de 0.300mL de extracto enzimático). 5.00E-09 4.50E-09 4.00E-09

v 0 (mM P/min)

3.50E-09 3.00E-09 v 0 = 2.1E-08Vextracto

2.50E-09

2

R = 0.9267

2.00E-09 1.50E-09 1.00E-09 5.00E-10 0.00E+00 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Volumen de extracto enzimático (mL)

Efecto de la concentración del sustrato

0.35

0.4

0.45

Tiempo de reacción: 10 min Tabla 6. Valores de absorbancia, concentración de fosfato y velocidad de reacción obtenidos para muestras con diferente concentración del sustrato. Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

6

7

8

0

40

0

1

2

4

8

12

16

20

40

[S] (mM) Abs660nm corregida

0.097

0.136

0.010

0.038

0.150

0.061

0.069

0.123

[P] (mM)

0.000 0.000 0.187

1.84E-08

2.58E-08

1.94E-09

7.29E-09

2.85E-08

1.15E-08

1.30E-08

2.33E-08

V(mM P/min)

1.84E-09

2.58E-09

1.94E-10

7.29E-10

2.85E-09

1.15E-09

1.30E-09

2.33E-09

1

0.50

0.25

0.13

0.083

0.063

0.05

1/[S] 1/V

0.025

5.44E+08 3.87E+08 5.16E+09 1.37E+09 3.51E+08 8.66E+08 7.68E+08

4.30E+08

Muestra de cálculos: La concentración del fosfato y la velocidad de reacción fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14], respectivamente. Para el tubo 1:

[ P] = 5.3 ×10 0.097

v0 =

6

= 1.84 ×10 -8 mM

1.84 ×10 −8 mM =1.84 ×10 −9 10 min

mM min

Gráfica 6a. Efecto de la concentración de sustrato y presencia de inhibidor en la velocidad de reacción (todos los datos). 4.00E-09 3.00E-09 2.00E-09

v 0 (mM P/min)

1.00E-09 0.00E+00 0

5

10

15

20

25

30

35

40

-1.00E-09 -2.00E-09 -3.00E-09 Sin inhibidor

-4.00E-09

Con inhibidor -5.00E-09 [S] (mM)

45

Gráfica 6b. Efecto de la concentración de sustrato y presencia de inhibidor en la velocidad de reacción (sin los datos de 1, 2 y 12mM de sustrato en ausencia de inhibidor). 3.00E-09 2.00E-09

v 0 (mM P/min)

1.00E-09 0.00E+00 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

-1.00E-09 -2.00E-09 -3.00E-09 -4.00E-09 -5.00E-09 [S] (mM)

Gráfica 7a. Gráfica de Lineweaver-Burk (con todos los datos de la gráfica 6b). 6.00E+09 5.00E+09

1/v 0 (min/mM P)

4.00E+09 1/v 0 = 2.1E+10(1/[S]) - 4.3E+08

3.00E+09

2

R = 0.9392 2.00E+09 1.00E+09 0.00E+00 -1E-08 0.05 -1.00E+09

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

-2.00E+09 -3.00E+09 1/[S] (1/mM)

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

Gráfica 7b. Gráfica de Lineweaver-Burk (sin el dato de 4mM de sustrato).

1.40E+09 1.26E+09 1.12E+09 1/v 0 (min/mM P)

9.80E+08 8.40E+08 1/v 0 = 9.1E+09(1/[S]) + 2.6E+08

7.00E+08

2

R = 0.982

5.60E+08 4.20E+08 2.80E+08 1.40E+08 0.00E+00 -0.02 0

-0.04

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

1/[S] (1/mM)

Gráfica 8. Gráfica de Eadie-Hofstee para evaluar el efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción. 1.20E-10

v 0 (mM P/min)

1.00E-10 8.00E-11 6.00E-11 v 0 = -0.0182(v 0 /[S]) + 1E-10

4.00E-11

2

R = 0.7537 2.00E-11 0.00E+00 0.00E+00

5.00E-10

1.00E-09

1.50E-09

v 0/[S] (1/min)

Según la gráfica 7b se obtienen los siguientes valores para KM y Vmax:

2.00E-09

2.50E-09

Vm ax =

1 1 = = 3.8 × 10− 9 mmMin 8 m in b 2.6 × 10 mM

(

)(

)

K M = m Vm a x= 9.1× 1 09 m mMmM i n 3.8 × 1 0− 9 mm Min = 3 5m M A partir de la gráfica 8 se obtiene:

Vm a x = 1× 1 0− 1 0 mm Min K M = 0.0182 mM Efecto de la presencia de un inhibidor Inhibidor: HgCl2 Concentración del inhibidor: 0.5mg/mL Tiempo de reacción: 10min Tabla 7. Valores de absorbancia, concentración de fosfato y velocidad de reacción obtenidos para muestras con diferente concentración del sustrato en presencia de inhibidor. Tubo

BB

[S] (mM)

0

BS

BE

40

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1

2

4

8

12

16

20

40

-0.041

-0.201

-0.030

-0.015

-0.030

-0.186

-0.044

-0.065

[P] (mM)

-7.75E-09

-3.82E-08

-5.71E-09

-2.92E-09

-5.71E-09

-3.53E-08

-8.41E-09 -1.23E-08

V(mM P/min)

-7.75E-10

-3.82E-09

-5.71E-10

-2.92E-10

-5.71E-10

-3.53E-09

-8.41E-10 -1.23E-09

1

0.5

0.25

0.13

0.083

0.063

-1.29E+09

-2.62E+08

-1.75E+09

-3.42E+09

-1.75E+09

-2.83E+08

Abs660nm corregida

0.000

0.000 0.252

1/[S] 1/V

0.050

0.025

-1.19E+09 -8.13E+08

Muestra de cálculos: La concentración del fosfato y la velocidad de reacción fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14], respectivamente. Para el tubo 1:

[ P] = 5.3 ×10

6

− 0.041

v0 =

= −7.75 ×10 -9 mM

− 7.75 ×10 −9 mM = −7.75 ×10 −10 10 min

mM min

Respuesta al cuestionario ¿Mediante qué código se identifica la fosfatasa ácida y que indica cada número? El código EC que identifica a la fosfatas ácida es EC.3.1.3.2 en donde los números de izquierda a derecha indican lo siguiente: •

3  Indica que la enzima corresponde al grupo de la hidrolasas (al que siempre le corresponde el número 3).

• • •

1  Indica que la enzima lleva a cabo la hidrólisis sobre un enlace tipo ester. 3  Indica que la hidrólisis se lleva a cabo en esteres de monofosfato. 2  Este es el número que le corresponde a la fosfatasa ácida.

¿Cómo podría purificar la fosfatasa ácida del germen de trigo? La fosfatasa se extrae con agua mediante varios lavados (4), durante un tiempo de 30 minutos cada uno, para posterior centrifugación. Se puede adicionar una cierta cantidad de Mn 2+ en solución el cual va actuar como cofactor de la enzima y permitirá que actividad de la misma sea alta durante todo el proceso, lo cual cobra importancia a la hora de hacer la reacción y medir la cantidad de fosfato liberado por el método de Fiske – Subbarow. Nuevamente la mezcla es centrifugada. Con el sobrenadante se hace una primera precipitación por fuerza iónica adicionando una solución de sulfato de amonio al 37% y al sobrenadante se le hace una segunda precipitación adicionando una solución de sulfato de amonio al 57%. Luego de esto la solución se calienta a 60°C por 2 minutos y luego se enfría a 8°C y se centrífuga. Al sobrenadante se le hace un tratamiento con bentonita y de nuevo se centrifuga. De nuevo se hace una precipitación adicionando una solución de sulfato de amonio al 47%, centrifugando a adicionando al sobrenadante una solución de sulfato de amonio al 61%. Se centrifuga y se conserva el sobrenadante. A éste se le adiciona solución de sulfato de amonio saturada, EDTA 0.2M y metanol, se centrífuga y el sobrenadante se somete a una diálisis durante 11 horas con EDTA 0.01M. Finalmente se realiza una cromatografía de intercambio iónico con una columna de DEAE-celulosa y se seca por liofilización. ¿Cómo se define la unidad de actividad? Esta es una de las medidas que se emplean para ver la efectividad o eficiencia de la enzima en las condiciones de trabajo. La unidad de actividad se define como la cantidad de sustrato transformado (en mg) por minuto (mg/min). ¿En condiciones se logra la mejor extracción de la fosfatasa ácida de la levadura? Hay que tener en cuenta tres pautas para lograr una extracción exitosa de la fosfatasa ácida de la levadura. En primer lugar se necesita hacer un lisado con agitación, pero este no es eficiente si el pH no es alcalino. Esto se logra con la adición de bicarbonato de sodio que mantiene el pH cerca de 8. A pesar de esto se reporta que la adición de tolueno mejora notablemente la extracción. Esto es, por cada 4 libras de levadura se adicionan 1000mL de agua, 350mL de tolueno y 130g de bicarbonato de sodio y se deja agitando durante 4 horas en un baño a 37°C. ¿Para la fosfatasa ácida de la levadura en qué condiciones se logra la máxima estabilidad en soluciones de etanol? La máxima estabilidad se logra en presencia de Mg2+, a temperaturas de 0°C o menores y a valores de pH entre 7 - 8.5. ¿Cuál es la constante de sedimentación de la enzima de la levadura purificada? La constante de sedimentación de la enzima es 1.4 Svedberg. ¿Cuáles son las características de estabilidad térmica de la fosfatasa ácida de la levadura y las características de inactivación por agitación? La enzima presenta diferente estabilidad a una temperatura relativamente alta (50°C), dependiendo del pH al que se encuentre y como es obvio de la presencia o ausencia de cofactor que en este caso es el Mg 2+. En ausencia de magnesio presenta su máxima actividad o estabilidad en un pH cercano a 8.0 y en presencia del metal a un pH entre 8.0 y 8.5. Sin embargo el aumento en la actividad de la enzima al adicionar el magnesio, no es el mismo a lo largo de toda la escala de pH. Al avaluar la disminución de la actividad en función del tiempo de calentamiento a 50°C, se observo que excepto para los valores de pH mencionados, en los demás casos siempre se ve un descenso rápido de la actividad en los primeros 30 minutos y después se va estabilizando el valor de la actividad remanente. También se observó que luego de mantener la enzima durante 15 minutos en calentamiento y enfriar a 20°C se recupera entre el 20 - 30% de la actividad enzimática inicial, pero la sustancia no es estable y tiende a descomponerse. La enzima también fue desnaturalizada por agitación y se observó un comportamiento similar al anterior al analizar la actividad de la enzima en función del tiempo de agitación. Empieza con una fuerte disminución pero luego disminuye con menor rapidez En este caso también se ve como la adición de

magnesio contrarresta el efecto desnaturalizante y más aún cuando esta a una temperatura de 0°C. También se observo que en la medida en que haya más proteína la inactivación por agitación será menor. Discusión de Resultados y Conclusiones La curva de calibración con el patrón de fosfato resultó bastante lineal dentro del rango de bajo error permitido por la curva de Crawford del error relativo, la cual establece que los valores de absorbancia deben encontrarse entre 0.2 y 1 para tener bajo margen de error. En nuestro caso solo tres valores se salen de este rango: el blanco (lo cual es obvio), el primer punto después del blanco y el último punto. Sin embargo el primer punto después del blanco se ve bastante colineal, pues está muy cerca de 0.2. El último punto si tiene un valor de absorbancia de más de 1 lo cual se ve reflejado en la gráfica 1. Por esta razón fue el único valor que no se tuvo en cuenta para hacer la regresión lineal. En la optimización del tiempo se presentaron dos errores de tipo experimental. El primero tiene que ver con el segundo punto de la gráfica 2. En este caso el blanco de la enzima presentó un valor de 0 absorbancia, por lo que a la hora de corregir la absorbancia de la mezcla de reacción, esta resulta más alta y se sale de la tendencia lineal. Por esta razón este valor fue eliminado. El segundo error es que los blancos quedaron más concentrados de lo que debería ser, logrando en varios casos presentar una absorbancia (total de los blancos) mayor que la de la mezcla de reacción, dando como resultado absorbancias negativas y por lo tanto concentraciones de fósforo negativas. Estos errores solo son atribuibles a fallas en la consecución del experimento, que a nuestro modo de ver están muy ligadas con los siguientes aspectos: Los tubos en que se realizan las medidas no son del mismo diámetro ni de la misma calidad, lo cual va a hacer que en todos los casos la cantidad de luz dispersada, reflejada, y absorbida sea diferente. Es por esto que en colorimetría se recomienda trabajar siempre con la misma celda y ubicarla siempre de la misma manera en el instrumento. El material utilizado para hacer las medidas de volumen, si bien ha sido diseñado para mediar esas cantidades, no son lo más preciso que se puede encontrar en un laboratorio, además de que su uso consecutivo (cerca de 500 pipeteadas en toda la práctica) no permite mayor reproducibilidad en las medidas. Sin embargo, teniendo en cuenta que no se está trabajando en las condiciones más cómodas y que siempre está el factor tiempo presionando, los resultados no deben presentar tanta discrepancia con lo esperado, por lo tanto, tanto estos, como otros errores experimentales que se mencionaran más adelante, están relacionados también con el desempeño de nosotros. Luego de hacer estas aclacaraciones y volviendo al tema de la optimización del tiempo, se ve como se guarda una relación directamente proporcional entre la cantidad de fosfato producido y el tiempo de reacción, lo cual no indica que en todos los casos la velocidad de reacción inicial es la misma. También se puede decir que la velocidad total de reacción durante el tiempo evaluado es siempre la misma, pues no se observa un cambio en la pendiente. Esto nos indica que la enzima no ha llegado a saturarse de producto y que la reacción inversa o la inhibición por parte de éste no ha tomado partido aún y por lo tanto el tiempo óptimo de reacción es 40min o talvez más (seguramente más). Sin embargo, en la literatura (3) se reporta un tiempo óptimo de 20minutos En las medidas de optimización del pH, aunque se llega a un valor acorde con el reportado en la literatura (3) que es 5.8, no se observa el mismo comportamiento en lo referente al cambio de la velocidad con respecto al pH, pues es de esperarse que se obtenga una curva continua en la que se aumente la velocidad hasta lograr un máximo y posteriormente descienda. En nuestro caso se ve una gráfica truncada que no obedece a otra cosa que al error experimental del que se habló anteriormente. Sin embargo, como ya se mencionó, el resultado del experimento (pH óptimo de 5.6) está muy cerca que en el reportado en la literatura. En el estudio de la temperatura óptima, si se obtuvo un resultado muy diferente al reportado en la literatura, pues allí se reporta como temperatura óptima 37°C (3) y nuestros resultados dicen que la temperatura óptima es 60°C, lo cual no puede ser, pues a 50°C se desnaturaliza la fosfatasa ácida de la levadura (4). Paradójicamente, aparece también que la velocidad de la reacción es mayor a 0°C que a 18 y 37°C. La única explicación para ese comportamiento, aparte del error experimental, es que debido a la

alta temperatura, el sustrato se haya hidrolizado sin la intervención de la enzima. Esta hipótesis, sin embargo, pierde toda validez al comparar con el bajísimo valor de velocidad que se obtuvo para una temperatura mayor (92°C). En cuanto al estudio de la cantidad de enzima, se ve un comportamiento similar al esperado, aunque con ciertos puntos alejados de la curva. Sin embargo se pudo obtener un valor para la actividad del extracto enzimático que no es comparable con el de la literatura ya que aquí se tiene unidad de actividad por mL de extracto y no por mg de proteína como está definida la actividad específica. Tampoco es posible hacer la conversión ya que no se conoce la concentración de la enzima. En la gráfica 5b se observa como la velocidad de la reacción empieza a estabilizarse a partir de una cierta cantidad de enzima. Esto se debe seguramente a que se ha agotado el sustrato y se obtiene la misma cantidad de fosfato así la cantidad de enzima sea mayor. Este resultado es coherente con la gráfica 2b pues de allí se dedujo que la cantidad de sustrato no se lograba hidrolizar totalmente en el tiempo de 40 minutos, cuando la concentración de enzima utilizada (0.2mL de extracto) aparece dentro la parte lineal de la gráfica 5b. En cuanto a la determinación de KM y Vmax, se puede comentar lo siguiente: El conjunto original de datos no permite obtener gráficas similares a las que se plantearon en el marco teórico del informe, tanto en presencia como en ausencia de inhibidor. Si se eliminan tres puntos de la gráfica correspondiente al experimento sin inhibidor (gráfica 6a), se obtiene una gráfica muy parecida a la que predice la ecuación de Michaelis-Menten (gráfica 6b), sin embargo al trazar la gráfica de Lineweaver-Burk con la ecuación [8] (gráfica 7a) se obtiene un valor de Vmax negativo y una KM negativa. Eliminando un cuarto dato, se logra ajustar la recta (gráfica 7b) de tal manera que se obtienen valores positivos de KM y Vmax. Al comparar con la literatura (3) resulta desproporcionado hacer una comparación de los valores de KM, pues mientras que allí se reporta un valor de 0.27mM, nosotros obtuvimos un valor de 35mM, por este método. Utilizando el método de EadieHofstee, (gráfica 8) se obtiene un valor mucho menor: 0.0182mM. Sin embargo, según se recomienda en la literatura (2), resulta más confiable la gráfica de Eadie-Hofstee ya que en esta se tienden a distribuir mas homogéneamente los datos a lo largo de la gráfica. A pesar de estas aclaraciones, no se puede dar fe de ninguno de estos valores ya que fueron obtenidos a partir de gráficas “incompletas”, pues sería mucho más certero un valor obtenido con todos los datos experimentales. De igual manera, se puede decir que la confiabilidad del valor de velocidad máxima no es mucha basados en los mismo argumentos. Estos valores tan alejados nos indican, en el primer caso, que la formación del complejo enzima sustrato no está muy favorecida, lo cual es coherente con el tiempo óptimo de reacción hallado, que es el doble del que reporta la literatura, es decir que la enzima no tiene una muy buena actividad. El valor de 0.0182 para KM no es coherente con estos resultados (a pesar de lo anteriormente explicado), pues significa que la formación del complejo enzima sustrato esta muy favorecida y por lo tanto la reacción se debería completar mucho mas rápido. En cuanto al comportamiento de la enzima en presencia de inhibidor, se ve, ignorando las fluctuaciones del error experimental, como la velocidad se disminuye notablemente al mismo valor en todos los casos. Aquí también se obtienen concentraciones negativas debido a que el blanco absorbió más que todas las muestras. Aquí lo que se concluye es que no se da ningún tipo de inhibición reversible, sino que se da un proceso de inhibición irreversible como se esperaba debido a que se trata de mercurio. Por esta razón no se obtiene un comportamiento que esté de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten, ya que no hay la formación de complejos enzima sustrato que progresen hacia los productos, y por lo tanto no se puede determinar ni KM ni Vmax (2). Tabla Resumen de Resultados Tiempo óptimo pH óptimo T° óptima Actividad del extracto

Resultado 40min 5.6 60°C 2.1x10-5µ M/min*mL

Literatura 20min3 5.83 37°C3 3000µ mol/mg

KM Vmax Tipo de inhibición

35mM (Burk); 0.0182mM (Eadie) 3.8x10-9mM/min (Burk); 1x10-10mM/min (Eadie) irreversible

0.27mM3

3

irreversible1

Bibliografía 1. 2. 3. 4.

Bohinski R. C. Bioquímica, 5°Ed, Pearsons Education, 1991, pp 173-195 Fersht A. Estructura y Mecanismo de los Enzimas, Ed Reverté, 1980, pp 85-96 Joyce B.K. Grisolia S. Purification and Properties of a nonspecific acid phosphatase from wheat germ, The journal of Biological Chemistry 235: 2278-2281, 1960 Tsuboi K.K., Wierner G., Hudson P.B. Acid phosphatase. VII: Yeast phosphomonoestearase: isolation procedure and stability characteristics. The Journal of Biological Chemistry 224: 621635 1957.