Fosfatasa-alcalina1

November 13, 2018 | Author: Daniel Arroyo | Category: Enzyme Kinetics, Enzyme, Phosphate, Catalysis, Enzyme Inhibitor
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fosfatasa alcalina...

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PRACTICA #9

FOSFATASA FOSFATASA ALCALINA ALCALIN A (PARTE (PARTE I)

DAYANA PAOLA PARODY PEREZ DINA LUZ GUEVARA CANOLE KESMY ISABEL LIDUEÑA PEREZ

PRESENTA PRESEN TADO DO A: RAMON LOZADA DEVIA

UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA SINCELEJO-SUCRE 0!MAYO!"0$

OBJETIVOS



Obtener una curva de calibración del para-nitrofenol (PNP). Que representa las variaciones de absorbancia de una solución que contenga esta susutancia a diferentes valores de concentración, esto es absorbancia vs [PNP]

MARCO TEORICO as reacciones qu!"icas en los siste"as biológicos sólo ocurren en presencia de catali#adores, que son prote!nas espec!ficas deno"inadas en#i"as. a presencia de una en#i"a se detecta por las reacciones espec!ficas que catali#a. $oda reacción en#i"%tica puede esque"ati#arse co"o sigue&

 's!, la en#i"a se co"bina con un sustrato () que se transfor"a en un producto (P). l tie"po que tarda una deter"inada cantidad de  en transfor"arse en P es lo que caracteri#a a la en#i"a, * se deno"ina velocidad o actividad en#i"%tica (v) que se define co"o cantidad de sustrato transfor"ado o de producto for"ado en la unidad de tie"po. a cat%lisis en#i"%tica es de gran i"portancia en los seres vivos, pues acelera reacciones qeue en su ausencia tardar!an "uc+o en ocurrir. a "a*or!a de las en#i"as son de origen proteico. as fosfatasas on prote!nas de "e"brana cu*a estructura es la de una glicoprote!na. a parte gluc!dica est% for"ada por cadenas de oligosac%ridos que llevan general"ente en el etre"o "%s aleado de la prote!na %cido si%lico a fosfatasa alcalina es una en#i"a +idrolasa responsable de eli"inar los grupos de fosfato de varios tipos de "olculas co"o nucleótidos, prote!nas * alcaloides. l proceso de eli"inar el grupo se deno"ina desfosforilacion. /o"o sugiere su no"bre, las fosfatasas alcalinas son "%s efectivas en un entorno alcalino.

a fosfatasa alcalina (Ortofosfórico "onoster fosfo+idrolasa, (/ 0.1.0.1) es una en#i"a a"plia"ente distribuida que +idroli#a el enlace ster fosfórico entre un grupo fosfato * un radical org%nico a p2 b%sico (p2 ópti"o entre 3 * 14) liberando fosfato inorg%nico. st% presente en ri5ón, +!gado, intestino * +ueso. p-nitrofenilfosfato ( pNPP ) es un sustrato cro"ognico para la fosfatasa %cida * alcalina en ensa*os espectrofoto"tricos convencionales.

stas en#i"as catali#an la +idrólisis de pNPP a a"arillo para- nitrofenol . ste producto

absorbe

fuerte"ente

a

647

n"

*

se

puede

"edir

con

un

espectrofotó"etro de lu# visible .

sta en#i"a +idroli#a el

 p-nitrofenilfosfato

para for"ar el cro"ógeno a"arillo p-

nitrofenol de acuerdo a la siguiente reacción&

I%&' & reacción en#i"%tica a actividad de una en#i"a se deter"ina conociendo la velocidad de la reacción que catali#a. a velocidad de reacción se define co"o la cantidad de sustrato consu"ido o de producto for"ado por unidad de tie"po. a deter"inación de la actividad de la fosfatasa se reali#a "idiendo la cantidad de p-nitrofenol liberado por acción del en#i"a contenido en las clulas durante un per!odo de tie"po deter"inado. a reacción se detiene a5adiendo carbonato sódico (Na8/O0) que provoca un ca"bio brusco de p2 alcalini#ando el "edio. a actividad de la en#i"a se puede estudiar gracias a que el producto de la reacción (p-nitrofenol) en solución alcalina posee un color a"arillo caracter!stico que posee su "%i"o de absorbancia a 644 n" ("ientras que el sustrato de la reacción, pnitrofenil-fosfato, no absorbe a esta longitud de onda).

PORCEDIMIENTO*

 Tubo

Dilución de

PNP

Na2HP

Bufer

PNP (con Bufer de glicina ) -----1:2 1:4 1:8 1:1!

Blanco 1 2 3 4 

diluid o (ml) ---3 3 3 3 3

O4 (ml)

de Glicina

1 1 1 1 1 1

3 -----------

$abla 1& /antidades necesarias para la preparación de las distintas "uestras

DATOS*

 Tubo

"b#orbancia#

1 2 3 4 

4$28! 3$823 3$%&' 3$43& 1$&'

$abla 8& 'bsorbancias obtenidas con distintas concentraciones de PNP

RESULTADOS

1. /oncentración de PNP para cada tubo& $ubo 1&

$ubo 8&

[ PNP ]

=



5

3∗10  M 

C 1∗V  1 =C  2∗V  2

C 2=

C 1∗V  1 V  2



C 2=



5

3∗10  M ∗3 ml 6 ml



5

1,5∗10  M 

$ubo 0& −

C 2=



=

5

1,5∗10  M ∗3 ml 6 ml

=



5

0,75 ∗10  M 

$ubo 6& −

5

0,75 ∗10  M ∗3 ml 5 C 2=  M  =0,375 ∗10 6 ml −



$ubo 7& −

C 2=

5

0,375 ∗10  M ∗3 ml 5  M  =0,1875 ∗10 6 ml −

8. 'bsorbancia 9s [PNP]

PNP 3*10

"b#orbancia 4$28!

-5

1,5*10

-5

0,75*10

-5

3$823 3$%&'

-

3$43&

0,1875*1

1$&'

0,375*10 5

0

-5

"b#orbancia # PNP 4* +(,)  438%*'%, . 3*'8 /0  '*&

4 3* 3 2*

"b#orbancia*

inear ()

2 1* 1 '* ' '

'

'

'

'

'

'

'

PNP :r%fica 1& /urva est%ndar de la ;osfatasa alcalina.

CUESTIONARIO * +D,./& 1 234/56 4 7/38 1 ,67/38 &4 6&4 3.7 4& 8,&7&,& &4&4/& a fosfatasa alcalina (Ortofosfórico "onoster fosfo+idrolasa, (/ 0.1.0.1) es una en#i"a a"plia"ente distribuida que +idroli#a (0) el enlace ster (1) fosfórico entre un grupo fosfato * un radical org%nico a p2 b%sico (p2

ópti"o entre 3 * 14) liberando fosfato inorg%nico. Por lo tanto es de tipo +idrolasa * de subtipo fosfatasa.

"* +;6< 6/= 6%34 4& N&">PO  4& %?4& @ 4& .&/= a función que cu"ple la Na 82PO6 es que detiene la reacción porque el eceso de p-nitrofenol in+ibe la actividad en#i"%tica pero la presencia del fosfato i"pide esta in+ibición. Otra función que cu"ple es q al "o"ento de interaccionar con las prote!nas estas dis"inu*en la perdida de agua.

L8, 8,&78, , %34& 8%8 [email protected]/7/8, &4/%7&./8, * +;6< ,/'//[email protected] 7/ 4 56 4& .&/= , 44 & &8 8 6 6.  3>0* Porque a este p2 la fosfatasa +idroli#a el enlace ester fosf%tico entre el grupo fosfato * un radical org%nico * libera fosfato inorg%nico

* +P8. 56< 4& &,8.&/& %2/%& @4 PNP , %/@ & 0 % a absorbancia se "ide a 614 n" porque a velocidad de incre"ento de absorbancia debido a la producción de p-nitrofenol (pNP) es directa"ente proporcional a la actividad de fosfatasa alcalina en la "uestra.

$* E234/56 +38. 56< 4 /8 Z" &7& 8%8 6 &7/[email protected] @ 4& 8,&7&,& &4&4/&
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