Foodquality Histamine Enzymatic PDF

 

 

INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE HISTAMINA EN PRODUCTOS DE LA PESCA MEDIANTE KIT ENZIMÁTICO DESARROLLADO POR BioSystems S.A.

ENERO 2017

 

 

INTRODUCCIÓN La validación de un método de ensayo consiste en un estudio sistemático que permite conocer si las características técnicas del mismo cumplen las especificaciones relativas al uso previsto. La validación de un método será poco exhaustiva, limitándola a la comprobación del cumplimiento de las características especificadas en aquellos métodos que se consideran de referencia, y mucho más completa y exhaustiva en las nuevas metodologías analíticas, en cuyo caso, si es posible la validación debe basarse en normas reconocidas. Existen algunas normas ISO para la validación de métodos microbiológicos, como es el caso de la ISO 16140:2003 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo de validación de métodos alternativos”, sin embargo no hay normas disponibles para la validación de ensayos físico-químicos alternativos, aunque sí guías ampliamente reconocidas con protocolos para la validación de métodos de ensayo, y que sirven de referencia a las entidades que acreditan el cumplimiento cumplimiento de la UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 como son por ejemplo la guía guía Eurachem (“The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics”), o el documento del CODEX “ Guidelines on Establishing methods criteria for the identification of relevant analytical methods”.  Además, la DECISIÓN DE LA COMISIÓN 2002/657 de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados, establece normas relativas a los métodos analíticos de muestras oficiales, y fija criterios comunes de interpretación de los resultados analíticos por parte de los laboratorios oficiales de control. Concretamen Concretamente, te, en su artículo 3, especifica que llos os Estados miembros garantizarán que los métodos analíticos hayan sido validados de acuerdo con los procedimientos que se especifican en dicha Decisión. ANFACO-CECOPESCA ha recopilado estas y otras referencias bibliográficas en el Procedimiento PG/0/06 para la validación de métodos de ensayo, ensayo , integrado en el sistema de calidad según la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005, 17025:2005, y que tiene por objeto definir la operativa establecida por ANFACO-CECOPESCA para la validación de métodos o procedimientos de ensayo y la definición de los formatos aplicables, en base a los siguientes documentos:   AOAC International (1998). (1998). AOAC Peer-verified methods progra program. m. Manual on policies



and procedures. Maryland. USA.

 

 

  DECISIÓN DE LA COMISIÓN (2002/657/CE) de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica



la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados.   DIRECTIVA 98/53/CE, de la Comisión, de 16 de julio de 1998, por la que se fijan métodos



de toma de muestras y de análisis para el control oficial del contenido máximo de algunos contaminantes en los productos p roductos alimenticios.   Ellison, S L R, Rosslein, M and Williams A. (2000). Quantifying Uncertainty in Anaytical



Measurement. 2ª edición. EURACHEM/CITAC Guide.   EURACHEM-GUIDE (1998). The fitness for purpose of analytical methods: A laboratory



guide to method validation and related topics. LGC, Teddington.   Horwitz, W. (1998). A simple Method for Evaluating Data from an Interlaboratory Study.



Journal of AOAC International Vol. 81, No. 6.   Hotwitz, W. (2003). Validation: An invisible component of Measurament. AOAC



International.   Huber, L. (1998). Validation of Analytical Methods: Review and Strategy. LC-GC



International,pp. 96-105.   J.C. Miller, J.N. Miller. (1993). Estadística para química analítica Addison-Wesley



Iberoamericana. 2ª edición.   Statistical Subcommittee of the AMC. (2004). The amazing Horwitz function. Technical



Brief No.17 July. Royal Society of Chemistry.   Thompson, M. (2000). Recent tre trends nds in inter-laboratory precision precision at ppb and sub-ppb



concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, 125 385-386.   Thompson, M, Ellison, S. S. L.R. and Wood, R R.. (2002). Harmonized guideli guidelines nes for single-



laboratory validation of methods of analysis. IUPAC Technical report. Pure Appl. Chem., vol 74, Nº 5, pp. 835.855.

 

 

IDENTIFICACIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO Nombre completo del método: Procedimiento para la determinación de histamina mediante la utilización de un kit enzimático y posterior medida en un analizador automático.  automático.  Tipo de método: Cuantitativo Analito: Histamina  Unidades: mg/kg Matriz: atún crudo, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite, semiconserva de anchoa Rango:: de 10 a 200 mg/kg Rango

Método de referencia utilizado: Analito, rango y unidades: Histamina, rango de 10 a 500 mg/kg. Acreditación: PEE/1/119, acreditado por ENAC según UNE-EN ISO/IEC 17025 (Anexo Técnico nº 96/LE230) Matriz: Productos de la pesca, de la acuicultura y sus derivados Método:: HPLC- detector UV Método

 

 

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN PRUEBAS REALIZADAS Selectividad y Especificid Especificidad ad Linealidad Exactitud Precisión Robustez Límites de detección y de cuantificación

           

SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDA ESPECIFICIDAD D Definición: La selectividad y especificidad es la capacidad de un método de distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias. Descripción: Se realizó la prueba de selectividad a partir de extractos de las matrices de estudio adicionados con 1000 mg/kg de posibles interferentes. En este caso se realizó con agua, tiramina, putrescina y agmatina. Para ello se prepararon extractos sin histamina y extractos con 25 mg/kg de histamina con los distintos interferentes de estudio. Se midieron las concentraciones obtenidas en el equipo. Los resultados obtenidos han sido los siguientes: ATUN CRUDO HISTAMINA (mg/kg)

0

25

COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm)

ATÚN AL NATURAL RESULTADOS (mg/kg)

AGUA Tyramine Putrescine Agmatine AGUA

3,4 3,4 5,2 65,8 28,2

Tyramine

26,7

Putrescine Agmatine

28,7 90,2

HISTAMINA (mg/kg)

0

25

ATÚN EN ACEITE HISTAMINA (mg/kg)

0

25

COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm)

COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm)

RESULTADOS (mg/kg)

AGUA Tyramine Putrescine Agmatine AGUA

1,6 1,8 3,3 60,2 25,6

Tyramine

25,2

Putrescine Agmatine

29,4 84,7

SARDINA FRESCA RESULTADOS (mg/kg)

AGUA Tyramine Putrescine Agmatine AGUA

4,2 4,2 5,8 52,7 28,9

Tyramine

28,2

Putrescine Agmatine

29,8 77,1

HISTAMINA (mg/kg)

0

25

COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm)

RESULTADOS (mg/kg)

AGUA Tyramine Putrescine

5,1 4,8 4,9

A AgGm UaAtine Tyramine Putrescine Agmatine

5268,,23 29,7 29,0 79,6

 

 

SARDINA EN ACEITE HISTAMINA (mg/kg)

0

25

SEMICONSERVA ANCHOA

COMPUESTOS REACCIÓN (1000 CRUZADA ppm)

AGUA Tyra mine Putrescine Agmatine AGUA Tyra mine Putrescine Agmatine

RESULTADOS (mg/kg)

HISTAMINA (mg/kg)

4,8 4,2 4,3 61,2 30,1 30,5 30,8 85,9

0

25

COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm)

AGUA Tyramine Putrescine Agmatine AGUA Tyramine Putrescine Agmatine

RESULTADOS (mg/kg)

3,6 4,0 4,8 51,6 28,5 29,2 30,7 75,1

Los resultados obtenidos muestran que la agmatina causa interferencias con el kit y por tanto debe indicarse en las instrucciones del mismo que si las muestras contienen agmatina las medidas proporcionadas por el mismo no son adecuadas.

LINEALIDAD Definición: Relación que existe entre la concentración de un determinado analito y la respuesta proporcionada por el método. método.   Descripción: Se evalúa la linealidad en el rango de 10 a 200 mg/kg, comprobando el coeficiente de regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración:

 

 

 

Valor obtenido

Se calcula el coeficiente de regresión lineal (r2) y el factor respuesta/concentración en cada nivel de concentración entre 10 y 200 mg/kg.

Concentración patrón de histamina

10

50

100

150

200

Respuesta

10,03 10,03 9,86 9,80 50,89 50,61 50,67 50,67 99,50 99,15 99,50 99,55 150,85 150,33 150,33 150,91 199,16 198,30 199,62 198,59

Criterio de aceptabilidad

r2 ≥ 0,99 

2

r : 0,9999 Factor Respuesta / Concentración: Ver siguiente tabla

Factor Respuesta / Concentración: 90- 110 % (Sólo un punto podrá desviarse de este criterio, y tendrá que cumplir el intervalo máximo de 80-115 %)

Respuesta media

FR

% FR

9,93

0,99

99

50,71

1,01

101

99,42

0,99

99

150,61

1,00

100

198,92

0,99

99

Conclusión: Se observó que la recta es lineal en el intervalo de 10 a 200 mg/kg presentando un r 2 de 0,9999 y que cumple los criterios factor respuesta/concentración establecidos. 

 

 

EXACTITUD

Definición: La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Descripción: Se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 10 hasta 200 mg/kg, de modo que en cada nivel de concentración se analizaron las matrices de estudio. Se considera el método exacto si la recuperación media en todos los niveles de concentración cumple los criterios establecidos por la AOAC. RESULTADOS

EXACTITUD RECUPERACIÓN

VALOR DE REFERENCIA (mg/kg)

MATRIZ

Nº Réplicas

% REC. MEDIO

CRITERIO

¿se acepta?

10

ATÚN FRESCO

5

100

80-110

SI

50

ATÚN FRESCO

5

103

80-110

SI

100

5

101

90-107

SI

150

ATÚN FRESCO ATÚN FRESCO

5

100

90-107

SI

200

ATÚN FRESCO

5

100

90-107

SI

10 50

ATÚN AL NATURAL ATÚN AL NATURAL

5 5

108 105

80-110 80-110

SI SI

100

ATÚN AL NATURAL

5

100

90-107

SI

150

ATÚN AL NATURAL

5

99

90-107

SI

200

ATÚN AL NATURAL

5

101

90-107

SI

10

ATÚN EN ACEITE

5

100

80-110

SI

50

ATÚN EN ACEITE

5

103

80-110

SI

100

ATÚN EN ACEITE

5

101

90-107

SI

150

ATÚN EN ACEITE

5

100

90-107

SI

200

ATÚN EN ACEITE

5

100

90-107

SI

 

 

VALOR DE REFERENCIA

MATRIZ

Nº Réplicas  Réplicas 

% REC. MEDIO

CRITERIO   CRITERIO

¿se acepta?  acepta? 

10

SARDINA FRESCA

5

100

80-110

SI

50

SARDINA FRESCA

5

103

80-110

SI

100

SARDINA FRESCA

5

101

90-107

SI

150

SARDINA FRESCA

5

100

90-107

SI

200

SARDINA FRESCA

5

100

90-107

SI

10

SARDINA EN ACEITE

5

98

80-110

SI

50

SARDINA EN ACEITE

5

98

80-110

SI

100

SARDINA EN ACEITE

5

94

90-107

SI

150

SARDINA EN ACEITE

5

94

90-107

SI

200

SARDINA EN ACEITE

5

98

90-107

SI

10

SEMICONSERVA DE ANCHOA

5

98

80-110

SI

50

SEMICONSERVA DE ANCHOA

5

103

80-110

SI

100

SEMICONSERVA DE ANCHOA

5

98

90-107

SI

150

SEMICONSERVA DE ANCHOA

5

96

90-107

SI

200

SEMICONSERVA DE ANCHOA

5

97

90-107

SI

(mg/kg) 

MATERIALES DE REFERENCIA ORGANIZADOR

MATRIZ

REFERENCIA

FAPAS   FAPAS

CANNED FISH  FISH 

TET040RM   TET040RM

FAPAS   FAPAS

CANNED FISH  FISH 

27176   27176

ORGANIZADOR

MATRIZ

FAPAS   FAPAS

CANNED FISH  FISH 

VALOR ASIGNADO (mg/kg) 16.6 ± 0.9  0.9  216 (186-247)   (186-247)

INTERLABORATORIO REFERENCIA FOOD CHEMISTRY PROFICIENCY TEST 27189  27189 

RESULTADO BIOSYSTEMS (mg/kg) 16.4   16.4 204   204

¿se acepta? SI SI   SI SI  

Z SCORE

¿se acepta?

0.6 0.6  

SI SI  

Conclusiones: Conclusiones: El método se considera exacto en el rango de trabajo desde 10 a 200 mg/kg, en todas las matrices objeto de ensayo (atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite y semiconserva de anchoa), de acuerdo a los intervalos de recuperación aceptables establecidos por la AOAC. Asimismo, la participación en ejercicios intercomparativos y la medición de materiales de referencia arrojan resultados satisfactorios.

 

 

PRECISIÓN

Definición: Grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en condiciones predetermin predeterminadas. adas. Descripción: La precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones estándar relativas calculadas y las desviaciones relativas estándar de Horwitz.

PRECISIÓN RDS

PLANIFICACIÓN Y RESULTADOS VALOR DE REFERENCIA (mg/kg) 10

MATRIZ

Nº Réplicas

RSDCALCULADA  RSDHorwitz 

CRITERIO

¿se acepta?

5

7.81

11.31

RSDCALC≤RSDHOR 

50

ATÚN FRESCO ATÚN FRESCO

5

3.16

RSDCALC≤RSDHOR 

100 150

ATÚN FRESCO ATÚN FRESCO

5 5

3.96 2.83

8.88 8.00 7.53

SI SI

RSDCALC≤RSDHOR  RSDCALC≤RSDHOR 

SI SI

200

ATÚN FRESCO

5

5.04

7.21

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

10

ATÚN AL NATURAL

5

4.78

11.31

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

50 100

ATÚN AL NATURAL ATÚN AL NATURAL

5 5

3.00 2.04

8.88 8.00

RSDCALC≤RSDHOR  RSDCALC≤RSDHOR 

SI SI

150

ATÚN AL NATURAL

5

0.97

7.53

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

200

ATÚN AL NATURAL

5

1.22

7.21

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

10

5

0.90

11.31

RSDCALC≤RSDHOR 

50

ATÚN EN ACEITE ATÚN EN ACEITE

5

1.26

8.88

RSDCALC≤RSDHOR 

SI SI

100

ATÚN EN ACEITE

5

1.46

8.00

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

150

ATÚN EN ACEITE

5

1.07

7.53

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

200

ATÚN EN ACEITE

5

0.90

7.21

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

10

5

4.95

11.31

RSDCALC≤RSDHOR 

50

SARDINA FRESCA SARDINA FRESCA

5

1.76

8.88

RSDCALC≤RSDHOR 

SI SI

100

SARDINA FRESCA

5

2.59

8.00

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

150

SARDINA FRESCA

5

1.78

7.53

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

200

SARDINA FRESCA

5

0.91

7.21

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

 

 

VALOR DE

¿se

Nº Réplicas  RSDCALCULADA  RSDHorwitz  CRITERIO 

acepta? 

REFERENCIA (mg/kg) 

MATRIZ

10

5

3.83

11.31

RSDCALC≤RSDHOR 

50

SARDINA EN ACEITE SARDINA EN ACEITE

5

1.89

8.88

RSDCALC≤RSDHOR 

SI SI

100

SARDINA EN ACEITE

5

1.00

8.00

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

150

SARDINA EN ACEITE

5

1.39

7.53

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

200

SARDINA EN ACEITE

5

1.36

7.21

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

5

4.26

11.31

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

5

3.44

8.88

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

5

1.46

8.00

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

5

4.02

7.53

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

5

3.37

7.21

RSDCALC≤RSDHOR 

SI

10 50 100 150 200

SEMICONSERVA DE ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA DE SEMICONSERVA ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA

Conclusiones: Conclusiones: El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 10 a 200 mg/kg en todas las matrices evaluadas: atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite y semiconserva de anchoa.

 

 

ROBUSTEZ Definición:  Susceptibilidad de un método analítico a los cambios de las condiciones Definición:  experimentales, como puede ser el tipo de matriz que se analice y que pueden expresarse en forma de lista de los materiales de la muestra, los analitos, las condiciones de almacenamiento o las condiciones ambientales o de preparación de la muestra en las que puede aplicarse el método tal cual o con determinadas modificaciones menores. Descripción:  La idea fundamental para la prueba de la robustez es introducir Descripción:  deliberadamente pequeñas variaciones en el método y observar los efectos. Si los resultados se alteran, los usuarios deben ser advertidos de no desviarse de las condiciones especificadas en el manual de instrucciones. Para esta determinación se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluación de la robustez de un método químico analítico. Para ello a una muestra de conserva de atún al natural adicionada con 50 mg/kg de histamina se le varió el volumen de extracción (20, 25 y 30 ml), el tiempo de medida tras la extracción (10, 20 y 30 minutos) así como el tiempo de almacenamiento de la muestra antes del análisis a temperatura ambiental ambiental (30 minutos, 1 hora y 2 horas).

CONSERVA DE ATÚN AL NATURAL CON 50 PPM D DEE HISTAMINA PARÁMETROS DE LA ROBUSTEZ

Valor del factor F A: 20 ml a: 30 ml a´: 25 ml B: 10 min b: 20 min b´: 30 min C: 30 minutos c: 1 hora c´: 2 horas (mg/kg)

VALOR 1

VALOR 2

VALOR 3

A. VOLUMEN DE EXTRACCIÓN B. TIEMPO DE EXTRACCIÓN

20 ml 10 min

25 ml 20 min

30 ml 30 min

C. TIEMPO ALMACENAMIENTO ANTES DEL ANÁLISIS A TEMPERATURA MUESTRA AMBIENTAL

30 min

1 hora

2 horas

Combinación de las determinaciones 4 5 6

1

2

3

7

8

9

A

A

A

A

a

a

a

a

a´

B

B

b´

b´

B

B

b´

b´

b

C

c´

C

c´

C

c´

C

c´

c

47,5

46,6

47,2

48,8

50,3

51,5

47,8

48,2

48

 

 

Comparación de Variables (X-x) Δ A, a Δ A, a´ Δ a, a´ Δ B, b Δ b,b´ Δ C, c Δ B, b´ Δ C, c´ Δ c, c´

Diferencias promedio (Di)

SD de las diferencias (SDi)

2,1 0,9 1,6 1,9 0,5 0,9 2,0 1,8 1,5

1,1 0,5 0,8 1,0 0,3 0,5 1,0 1,0 0,8

SD del método en 50 mg/kg para

Criterio Criteri o de

atún al natural

aceptación

1,6

SDi  ≤ SD50

Cumplimiento SI SI SI SI SI SI SI SI SI

Conclusión: El método se considera robusto, pues la desviación estándar de las diferencias es, en todas las combinaciones, menor que la desviación estándar del método a ese nivel de concentración en la matriz de atún al natural evaluada.

 

 

LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Definición: Límite de detección: concentración más baja de analito que se puede detectar en la muestra pero no necesariamente cuantificar con las condiciones experimentalmente establecidas. Límite de cuantificación: menor concentración del analito que puede determinarse con precisión y exactitud aceptables en una muestra, bajo las condiciones del método utilizado (verificado experimenta experimentalmente). lmente). Descripción: Límite de detección:  detección: Para el cálculo de LOD se aplica la siguiente fórmula:

LOD = Donde:  X 0 es el valor medio analítico de la matriz sin adicionar y  sb es la interjección interjección de la recta; y m es la pendiente de la recta. Límite de cuantificación:  cuantificación:  se estima mediante la fórmula 3xLOD. Se verifica posteriormente el límite de cuantificación realizando 10 réplicas en cada matriz. Los resultados obtenidos han sido los siguientes:

LOD = LOD = LOQ  =  = 3 x LOD

SARDINA ACEITE 5,77

SEMICONSERVA ANCHOA 2,85

ATUN NATURAL 4,28

ATUN ACEITE 4,58

ATUN CRUDO 0,29

SARDINA FRESCA 7,01

17

8,5

13

14

0,9

21

Se verificaron los límites de cuantificación en todos los casos a 10 mg/kg obteniéndose los siguientes resultados:

 

 

VALOR DE REFERENCIA (mg/Kg)

RESULTADO  (mg/kg)

ATÚN FR ESCO

10

8,97 8,85 9,61 8,97 9,35 9,35 9,10 9,86 8,85 9,10

MATRIZ

VALOR DE REFERENCIA (mg/Kg)

RESULTADO  (mg/kg)

AT ÚN AL N AT URAL

10

11,08 11,00 10,97 11,03 11,30 10,78 10,94 11,19 10,82 10,89

MATRIZ

VALOR DE REFERENCIA

RESULTADO

MATRIZ

(mg/Kg)

 (mg/kg) 12,39 13,12 12,88 12,89 12,71 13,14 12,64 11,91 12,64 12,28

ATÚ N E N AC EI TE

10

MATRIZ

VALOR DE REFERENCIA (mg/Kg)

RESULTADO  (mg/kg)

SAR DIN A FRESC A

10

17,34 17,82 16,37 15,41 15,89 15,41 15,65 16,62 16,13 15,65

MATRIZ

VALOR DE REFERENCIA (mg/Kg)

RESULTADO  (mg/kg)

SAR DIN A EN AC EI TE

10

14,63 14,82 14,79 14,73 14,53 14,79 14,59 14,29 14,63 14,22

MATRIZ

VALOR DE REFERENCIA (mg/Kg)

RESULTADO  (mg/kg)

10

12,82 12,10 11,77 12,52 11,92 12,22 12,62 12,54 11,92 12,31

SEMICONSERVA DE   ANCHOA

MUESTRA SIN RESULTADO ADICIÓN FINAL (mg/Kg)

0,50

8,47 8,35 9,11 8,47 8,85 8,85 8,60 9,36 8,35 8,60

MUESTRA SIN RESULTADO ADICIÓN FINAL (mg/Kg) 9,87 9,79 9,76 9,82 10,09 1,21 9,57 9,73 9,98 9,61 9,68 MUESTRA SIN RESULTADO ADICIÓN (mg/Kg)

3,03

FINAL 9,36 10,09 9,85 9,86 9,68 10,11 9,61 8,88 9,61 9,25

MUESTRA SIN RESULTADO ADICIÓN FINAL (mg/Kg) 11,40 11,88 10,43 9,47 9,95 5,94 9,47 9,71 10,68 10,19 9,71 MUESTRA SIN ADICIÓN RESULTADO FINAL (mg/Kg) 9,78 9,97 9,94 9,88 9,68 4,85 9,94 9,74 9,44 9,78 9,37 MUESTRA SIN RESULTADO ADICIÓN FINAL (mg/Kg) 9,82 8,10 8,77 9,52 8,92 3,00 8,22 9,62 9,54 8,92 9,31

M EDIA

% RECU PERAC IÓN

BIAS

Sr

RS D

8,7

87

-1

0,34

3,86

AV ERAGE

% RECU PERAC IÓN

BIAS

Sr

RS D

9,8

98

0

0,16

1,65

AV ERAGE

% RECU PERAC IÓN

BIAS

Sr

RS D

9,6

87

0

0,38

3,97

AV ERAGE

% RECU PERAC IÓN

BIAS

Sr

RS D

10,3

103

0

0,82

7,97

AV ERAGE

% RECU PERAC IÓN

BIAS

Sr

RS D

9,8

98

0

0,21

2,11

AV ERAGE

% RECU PERAC IÓN

BIAS

Sr

RS D

9,1

91

-1

0,59

6,51

 

 

Conclusión: Los límites de detección obtenidos han sido los siguientes: Atún crudo: 0,29 mg/kg Atún al natural: 4,28 mg/kg Atún en aceite: 4,58 mg/kg Sardina fresca: 7,01 mg/kg Sardina en aceite: 5,77 mg/kg Semiconserva de anchoa: 2,85 mg/kg Se verificó que los límites de cuantificación obtenidos en todas las matrices de estudio han sido de 10 mg/kg y se observó que en todos los casos las RSD son menores del 10 %.

EVALUACIÓN VALIDACIÓN: RESUMEN

Parámetro Rango validado Exactitud Precisión Selectividad / Especificidad Robustez Linealidad Límite de cuantificación

Validado por:

Fecha: 25/01/17 Características del método 10-200 mg/kg Aceptable en todo el rango RSDCALC≤ RSDHOR  Confirmación de la selectividad y especificidad con la experiencia (interferencia (interferencia con agmatina) Método robusto Método lineal 10 mg/kg

Validación

Nombre: Vanesa Losada Iglesias Aceptada Cargo: Técnico especialista área de Asistencia Técnica Rechazada

Firma y Fecha    

25/01/2017

 

 

ANEXO I CRITERIOS DE ACEPTACIÓN (EXACTITUD Y PRECISIÓN)

 

 

CRITERIOS DE EXACTITUD: Tabla de intervalos de recuperación aceptables Intervalos de recuperaciones (%) (AOAC Peer Verified Methods)  Analito (%)

 Analito ratio

Unidades

Media recomendada (%)

100

1

100%

98-102

≥10 

10-

10%

98-102

≥1 

10-  

1%

97-103

≥0.1 

10-3 

0.1%

95-105

0.01

10-4 

100 ppm

90-107

0.001

10-  

10 ppm

80-110

0.0001

10-  

1 ppm

80-110

0.00001

10-  

100 ppb

80-110

0.000001

10-8 

10 ppb

70-110

0.0000001

10-  

1 ppb

70-110

 

 

CRITERIOS DE PRECISIÓN: La precisión de un método se evalúa comparando el valor obtenido de RSD con el valor de referencia (RSD de Horwitz) que dependerá del nivel de concentración y se calcula según las ecuaciones descritas a continuación:  

 RSD  RS D Horwi tz 

  



Horwitz 

c

* 100

; para el cálculo de la

  

Horwitz

 

Para concentraciones 13.8%;

Horwitz   

  

  

 Horwitz 

  

 Horwitz 





0,02c

0,22c   mr 0, 8495

 

mr 

0,01c

0, 5

mr 

 

 

 

ANEXO II CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE

 

 

INCERTIDUMBRE

Determinación de histamina

INCERTIDUMBRE COMBINADA Y EXPANDIDA CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE TOTAL Fuentes de incertidumbre

Incertidumbre estándar (U)

U (P)

0,026

U (R)

0,068

CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE Contribución global

U  U  R 2



U(P)2

I   U  K

 

(Factor de cobertura K=2)

INCERTIDUMBRE COMBINADA (Contribución global) U

INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Contribución global) I

INCERTIDUMBRE DEL VALOR INCERTIDUMBRE OBTENIDO I

0 ,0 7 3

0 ,1 4 6

0,146 X C

Siendo C el valor de la concentración obtenido en el ensayo

EJEMPLOS DE APLICACIÓN CONCENTRACIÓN (g/100 g)

INCERTIDUMBRE (contribución global)

INCERTIDUMBRE EXPANDIDA

10 50 100 150

0, 146 0, 146 0, 146 0, 146

1 ,5 7 ,3 14, 6 21, 8

INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (%) 15 15 15 15

200

0, 146

29, 1

15

Contribuciones a la incertidumbre

0,1 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Precisión Exactitud