Fonnegra 2015 - Introducción A La Palinología Teoría y Práctica

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES INSTITUTO DE BIOLOGÍA

INTRODUCCIÓN A LA PALINOLOGÍA TEORÍA Y PRÁCTICA MATERIAL EN PRUEBA AÚN SIN REVISIÓN

CONCEPTOS TEÓRICOS BÁSICOS Y MÉTODOS DE ESTUDIOS PALINOLÓGICOS

Ramiro Fonnegra G.

Medellín – Colombia 2015 1

PRIMERA PARTE: CONCEPTOS TEÓRICOS BÁSICOS

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TABLA DE CONTENIDO PRIMERA PARTE - CONCEPTOS BÁSICOS TEMA

PÁGINA

Introducción Microsporogénesis en angiospermas Composición química del polen Palinología: Breve historia del desarrollo de la palinología Alcances de la palinología Morfología del grano de polen Dimorfismo polínico Importancia de la morfología polínica Caracterización polínica Palinotaxonomía Morfología de las esporas de los hongos Morfología de las esporas de las algas Morfología de las esporas de los líquenes Morfología de las esporas de los briofitos Morfología de las esporas de los pteridofitos Morfología de los biolitos Morfología de los fitolitos Breve historia de la fitolitología Alcances de la fitolitología Morfología de los granos de almidón Palinología aplicada Paleopalinología Alcances de la paleopalinología Sedimentación polínica 3

Análisis palinológico de sedimentos Preparación de polen fósil Diagrama polínico Paleomicología Aerobiología y aeropalinología Importancia alergológica de los granos de polen Alergia Calendario polínico Utilidad clínica de los calendarios polínicos Importancia de los estudios sobre aeropalinología Calidad biológica del aire Análisis palinológico de la miel de abejas Importancia de los estudios melisopalinológicos Análisis palinológico de materias fecales Análisis palinológico en asuntos judiciales Polinización: dispersión de los granos de polen Formación y desarrollo del tubo polínico Viabilidad de los granos de polen Métodos para el estudio de viabilidad Importancia de los estudios sobre viabilidad de los Granos de polen Glosário Seguna parte-métodos de estudios palinológicos

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INTRODUCCIÓN La grandeza de la naturaleza está mejor demostrada en sus estructuras más pequeñas Linnaeus

POLEN El término polen (lat. Pollen, -inis y Pollis, -inis: polvo muy fino, la flor de la harina), fue usado por Linneo y se introdujo al castellano por Cavanilles con la traducción de: polvillo fecundante. La palabra polen significa “harina fina” e indica la sustancia. Por esto en español no se debería usar el plural polenes. Los plurales correctos son: polen, granos de polen, tipos polínicos. Como la mayoría de los palinólogos son profesionales no biólogos, el plural polenes, se está imponiendo en casi todos los trabajos científicos y publicaciones en español.

El polen es el elemento microscópico reproductivo masculino que mantiene, de una generación a otra, la continuidad genética en los espermatofitos (gimnospermas y angiospermas). El origen del grano de polen es homólogo al de las microsporas de los pteridófitos heterósporos. Sin embargo, esporas y granos de polen son diferentes en función:

El polen aloja al gametofito masculino en la generación haploide de los espermatofitos y lo protege en su transporte hasta el estigma en las angiospermas o hasta la abertura micropilar en las gimnospermas, y así puede ocurrir la fecundación. Tanto los granos de polen como las esporas requieren dispersión en el espacio, pero el polen sólo puede realizar su función sí llega al estigma de una planta de la misma especie, mientras que las esporas solamente requieren caer en un sitio húmedo donde puedan germinar y establecerse el gametofito resultante. 5

La espora es una fase de reposo y dispersión del gametofito de la generación haploide (gametofítica) de las criptógamas. Una función secundaria es la protección del contenido de la espora durante la dispersión y antes de la germinación.

El

desarrollo

de

paredes

gruesas

en

algunas

esporas

probablemente sea una adaptación de protección en sequías excesivas.

El polen se forma en los sacos polínicos (microsporangios masculinos) de las anteras y completa su ciclo de desarrollo cuando llega hasta el estigma en angiospermas o hasta el primordio seminal en las gimnospermas. Su origen tiene lugar en las células madres del polen por reducción meiótica, obteniéndose, cuatro microsporas a partir de una célula madre, las cuales, una vez hayan madurado, darán lugar a cuatro granos de polen, que posteriormente sufren una mitosis constituyendo la fase inicial del gametofito masculino.

En el estado vivo, el polen y las esporas están formados por dos componentes: una parte viviente interna llamada protoplasma y una parte externa, inerte, que corresponde a la pared y recibe el nombre de esporodermis. En algunos taxones los granos de polen presentan en el protoplasma una célula vegetativa y una célula generativa. Este tipo de polen se denomina bicelular o binucleado y en él cuando ocurre la polinización y formación del tubo polínico, la célula generativa se divide mitóticamente dando origen a dos gametos masculinos, llamados anterozoides, uno de los cuales fecundará al huevo o gameto femenino que se encuentra dentro del óvulo (Figura 1.1). En otros grupos vegetales al polen se le denomina tricelular o trinucleado, porque antes de ocurrir la polinización, se da la división de la célula generativa y por consiguiente desde la antera, el polen maduro ya contiene tres células: una vegetativa y dos generativas.

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Figura 1.1. A: Diagrama de un polen. B: Polen binucleado de Lilium sp. C: Polen en germinación detallando el tubo polínico (A y C: Fuller et al. 1974; B: Raven et al. 1991).

El polen es tridimensional, generalmente tiene forma elipsoide, frecuentemente de elipse de rotación. La línea imaginaria que pasa por el centro del grano y atraviesa el centro del polo proximal y el centro del distal, se denomina eje polar (P, Figuras 1.7.b y 1.7.c) o eje de rotación de la elipse. La línea imaginaria perpendicular al eje polar y que atraviesa el grano por su parte media, recibe el nombre de diámetro ecuatorial (E, Figuras 1.7.b y 1.7.c).

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Figura 1.7. a: Diagrama de una tétrada. b: Polen heteropolar. c: Polen isopolar. A—B = diámetro ecuatorial. C—D = eje polar. C = polo distal; D = polo proximal. Existen dos posibles posiciones de observación de los granos de polen: 1.

Vista ecuatorial o posición lateral. Cuando el polen se observa con el eje polar en ángulo recto al observador y

2.

Vista polar o posición frontal. Si el grano se ve con el eje polar, o sea con uno de los polos, hacia el observador (Figuras 1.8. A y B).

En varias especies vegetales el polen, dependiendo de su forma y eje de rotación, solo se observa en una posición ya sea en vista ecuatorial o en vista polar. Tanto las esporas como los granos de polen, están dotados de una doble pared o esporodermis muy resistente a la pérdida de agua, que evita la desecación durante el transporte aéreo y protege al grano de las condiciones adversas. En las criptógamas, como por ejemplo pteridófitos y briófitos, la pared de la espora tiene la función de proteger el futuro gametofito hasta un hábitat húmedo apropiado donde pueda desarrollarse y crecer. En los espermatofitos, la esporodermis protege al gametofito masculino en su paso desde la antera hasta el estigma (polinización).

En las angiospermas la esporodermis de los granos de polen vivos está compuesta de dos capas: la más interna es denominada intina y la más externa recibe el nombre de exina, que a su vez, se divide en otras dos capas llamadas nexina la más interna y sexina la más externa (Figura 1.2). La función de la exina es triple: 1) protege al protoplasma de la desecación excesiva y de daños mecánicos, 2) permite la salida del tubo polínico durante el mecanismo de polinización y fecundación, y 3) por acomodación del tamaño, permite que los granos de polen pierdan o absorban humedad.

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Figura 1.2. Diagrama de los detalles de la esporodermis (Soejarto y Fonnegra, 1972). Sobre la esporodermis generalmente se encuentran aberturas de germinación y la exina frecuentemente se encuentra ornamentada con protuberancias (salientes), aristas ramificadas y anastomosadas reticularmente, mediante las cuales pueden ser identificadas las plantas principalmente hasta familia o género; algunas pocas veces hasta especie y esporádicamente hasta taxones infraespecíficos. El significado adaptativo de estos tipos de escultura aún no es muy claro, aunque se han lanzado muchas hipótesis basadas en estudios ultraestructurales del polen. Algunas gimnospermas presentan granos de polen con sacos o vesículas aeríferas que facilitan la dispersión por el viento (Figura 1.3).

Después de la dehiscencia de la antera, sí el polen no alcanza su destino, sólo permanece vivo por pocos días y en ciertos casos, sólo por unas horas, y tanto el protoplasma

como

la

intina, son

fácilmente

destruidos por acción

de

microorganismos (bacterias y hongos) y desaparecen. La intina también puede ser destruida con temperaturas altas y con sustancias corrosivas. La exina permanece intacta en caso de muerte del polen y es muy resistente a las altas temperaturas (250 a 300ºC) y a las sustancias corrosivas, tales como ácido sulfúrico, ácido acético glacial y anhídrido acético, entre otras. Por esto, la estructura de la exina no se altera por muerte del protoplasma aunque haya ocurrido millones de años atrás. Esta es la base de los estudios palinológicos. Pero la exina es menos resistente a los agentes oxidantes como el ácido crómico 9

y es degradada por oxidantes fuertes, siendo afectada por dos bases: hidróxido de potasio fundido (KOH) y 2-aminoetanol.

PALINOLOGÍA Es una rama de la botánica dedicada al estudio del polen, esporas y palinomorfos recientes o pasadas. El término palynology (inglés) lo establecieron Hyde & Williams en 1945, para designar el estudio morfológico de las esporas y granos de polen actuales, subfósiles o fósiles, como también su dispersión y aplicaciones. En la actualidad el estudio de las esporas y granos de polen recibe el nombre de palinología (del griego Palyneim: dispersar, esparcir) porque los granos de polen frecuentemente son dispersados por el viento, agua, animales (principalmente insectos) y otros agentes polinizadores.

Erdtman (1952) define el término palinología como ciencia que estudia las paredes de esporas y granos de polen sin tener en cuenta su interior vivo. Este concepto es universalmente aceptado. La palinología se basa principalmente en los caracteres morfológicos de las paredes de esporas y granos de polen. Los principales parámetros son: unidad polínica; tipo, número y posición de las aberturas; estructura y ornamentación de la exina, polaridad, simetría, forma y tamaño del grano. Todos estos son caracteres regulados genéticamente, aunque la forma y el tamaño pueden variar según el método de preparación utilizado para su estudio (Erdtman 1969).

En sentido amplio la palinología, también incluye el estudio de microorganismos o partes de microorganismos, tanto de la época reciente, como de otras eras geológicas (microfósiles), denominados palinomorfos, por ejemplo: biolitos, almidones, quistes o estructuras quistiformes de algas o de origen desconocido, flagelados, foraminíferos, radiolarios, acritargos, estructuras y organismos fúngicos, animales o protista, entre muchos otros, que se encuentran dentro del rango del tamaño del grano de polen y esporas. 10

Figura 1.3. A – C: Grano maduro de polen de Pinus sp. (Wilson & Loomis 1968).

BREVE HISTORIA DEL DESAROLLO DE LA PALINOLOGÍA MUNDIAL El polen fue conocido por el hombre desde la antigüedad, algunas veces utilizado como alimento. Pero según Wodehouse (1935), las observaciones de los granos de polen se iniciaron en el siglo XVII cuando comenzó el desarrollo de la microscopía de luz, gracias a la cual se fueron acumulando datos que hicieron posible las primeras generalizaciones y variaciones morfológicas.

El polen fue estudiado por primera vez e independientemente por el italiano Marcello Malpighi (1670) y por el inglés Nehemiah Grew (1628-1712), ambos reconocidos como fundadores de la anatomía microscópica, y quienes notaron la variedad polínica en cuanto a forma y color.

Posteriormente varios investigadores observaron variaciones en otros caracteres, tales como tipo de escultura, número de aberturas y simetría, entre otras. El inglés Francis Bauer (1758-1840) presentó los primeros dibujos de polen de 181 plantas. Jan Evangelista Purkinje (1787-1869), anatomista checo, estudió el tejido de los sacos polínicos y la estructura del polen. Afirmó que la forma, sulcos, poros, entre otros, eran resultado del desarrollo de los granos de polen en contacto de unos con otros dentro del saco polínico.

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En el siglo XIX predominaba la idea de que el polen era un órgano formado de varias células, frecuentemente con glándulas secretoras, que no son otra cosa más que las salientes encontradas en muchos granos. El conocimiento de la morfología polínica se incrementó con el uso de sustancias químicas en las técnicas de preparación.

Fritzsche (1837, en Wodehouse 1935) afirmó que el polen era una sola célula con inclusiones de almidón, aceites y otras sustancias y que estaba recubierto por una doble pared: la interna constituida de celulosa y que la externa era resistente a los ácidos y la digestión gástrica, además, que sobre esta pared se localizaban los caracteres morfológicos que permitían distinguir los diferentes tipos polínicos. Estableció los términos intina y exina para denominar las paredes interna y externa respectivamente e introdujo la técnica de observar con mayor claridad la exina

y

la

intina

destruyendo

el

contenido

protoplasmático

utilizando

principalmente ácido sulfúrico.

A finales siglo XIX, el estudio morfológico del polen, había alcanzado un gran desarrollo, sobre todo con Fischer quien describió 2.200 tipos diferentes de granos de polen con base en la exina y lugares de salida del tubo polínico.

A comienzos del siglo XX, el polen era usado sólo como un caracter auxiliar de la taxonomía de algunos grupos vegetales. Por esta época el estudio del polen recibió un gran impulso motivado no sólo por su ya conocido valor en la taxonomía vegetal, sino también por el descubrimiento de que podría causar alergias y por el desarrollo del análisis de sedimentos y su aplicación en paleontología, arqueología y prospección de petróleo, lo cual incentivó su conocimiento y el desarrollo de mejores métodos de estudio.

En 1819 el inglés Bostock describió los síntomas del catarro denominándolo Catarrhus aestivus, también llamado “fiebre de heno”, enfermedad estacional cuya aparición coincide con la floración de los cereales y praderas. Más tarde 12

Blackley confirmó que este catarro tenía una causa alérgica relacionada con el polen. A comienzos del siglo XX Anderson estudió los fenómenos anafilácticos de la fiebre de heno y poco después Dunbar comprobó que la “fiebre del heno” era debida a la aspiración del polen por las vías respiratorias. Así surgió la aeropalinología como la parte de la palinología que estudia el contenido esporopolínico del aire. Esta rama de la palinología tiene grandes aplicaciones en medicina debido a los mecanismos alérgicos que desencadenan los granos de polen y esporas en las personas sensibles. Son muchos los investigadores que han surgido en este campo, entre los cuales merecen ser citados: Durham, Charpin, Surinyach, Nilsson, Cour, Benninghoff, entre otros.

A finales del siglo XIX la identificación de los granos de polen presentes en las turberas y sedimentos del suelo, comenzó a utilizarse en los estudios geológicos. Langerhein (1901) y Webber (1918) hicieron los primeros trabajos sobre identificación de polen contenido en turbera y realizaron cálculos porcentuales sobre análisis palinológico de esas turberas.

El sueco Lennart von Post (1884-1951), considerado como el fundador del análisis moderno del polen, en 1916 presentó en una reunión de geólogos en Oslo, los primeros análisis cuantitativos del polen fósil encontrado en las turberas del sur de Suecia, los tipos polínicos los expresó en porcentajes. En este trabajo mostró que era posible reconstruir la flora y el clima de una región mediante el estudio de muestras tomadas en diferentes profundidades de varios tipos de sedimentos (método estratigráfico) y tratadas químicamente para destruir residuos diferentes al polen y hacer micropreparados que permitan la identificación y conteo de los granos de polen encontrados en la capa de suelo en estudio.

Basado en los criterios de von Post, Erdtman desarrolló una metodología de análisis palinológico de los sedimentos. Esta metodología fue rápidamente adoptada en todo el mundo, principalmente para estudios cronológicos sobre vegetación y clima del cuaternario. 13

La variación en forma, tamaño y tipos de abertura de los granos de polen y esporas y la conservación de estos caracteres morfológicos dentro de un taxón determinado, convirtieron a la palinología en una fuerte evidencia para delimitar grupos taxonómicos. Entre los investigadores que han contribuido en este campo, además de los ya citados, se encuentran: Ferguson, Praglowski, Skvarla, Van Campo y otros.

En cuanto al estudio de la esporogénesis y formación de la esporodermis sobresalen: Heslop-Harrison, Risueño y Roland.

El rápido desarrollo de la palinología ha traído como consecuencia una proliferación de terminología descriptiva utilizada por los diferentes investigadores, lo cual ha creado una gran confusión. Muchos palinólogos han intentado unificar criterios y terminología para precisar o unificar las diferentes definiciones. Entre estos palinólogos podemos destacar a: Erdtman, Faegri & Iversen, Kremp, Praglowski, Punt, Straka, y Wodehouse.

Algunos tratados sobre palinología merecen ser citados, debido a la importancia que tuvieron al recopilar los conocimientos palinológicos y principalmente al divulgar los métodos de preparación y sus aplicaciones influyendo en el progreso de estos estudios:

En 1935, el norteamericano Wodehouse publicó Pollen grains, donde realiza una cuidadosa revisión histórica de los estudios de polen, estudió las familias de plantas anemófilas más importante para el reconocimiento del polen suspendido en la atmósfera. Aunque estudia el polen desde el punto de vista de su aplicación en la medicina, se hace asequible a todos los interesados gracias a la forma de descripciones, ilustraciones y presentación.

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En 1943 se publicó el primer libro de Erdtman: An introduction to pollen analysis, con énfasis en la morfología polínica y divulgación de su técnica de preparación de los granos de polen por acetilación de la exina (acetólisis de Erdtman).

En 1950 los noruegos Faegri & Iversen, publicaron Textbook of modern pollen analysis, donde estudian el polen desde el punto de vista de análisis de sedimentos. En este libro hacen una descripción detallada sobre historia, técnicas y aplicaciones del análisis palinológico de turberas y sedimentos.

En 1952 Erdtman publicó Pollen morphology and plant taxonomy en el cual caracteriza y describe el polen de todas las familias de angiospermas descritas hasta esa época. La constancia en las descripciones, el uso de terminología bien definida, la abundante ilustración y la bibliografía citada, hacen este libro fundamental para el estudio palinológico. Aunque las informaciones no abarcan la flora mundial, si dan un panorama general sobre distribución de los tipos polínicos en las angiospermas.

Erdtman, desde 1921 a 1971 trabajó en su laboratorio de Estocolmo sobre morfología polínica y aspectos de la palinología. Publicó numerosos artículos y libros sobre descripciones polínicas de especies, metodologías y técnicas de estudio, terminología y estableció el sistema de clasificación de los granos de polen y esporas con base en las aberturas, conocido como sistema NPC (número, posición y carácter o forma de las aberturas).

BREVE HISTORIA DEL DESAROLLO DE LA PALINOLOGÍA EN COLOMBIA En los años 1950, Thomas Van der Hammen inicia en Colombia las investigaciones palinológicas, las cuales tenían énfasis en estudios de polen fósil, enfocados al estudio del Cuaternario. A partir de esta época son muchos los trabajos de Van der Hammen que sirven de base para los estudios palinológicos en Colombia. En 1956 Van der Hammen, publica el trabajo Nomenclatura Palinológica Sistemática, con el cual en el país ocurre un auge de investigadores y 15

publicaciones de trabajos científicos sobre Paleopalinología. Con Van der Hammen y sus colaboradores, entre los cuales sobresalen Enrique Gonzales, Nuria Sole de Porta, C. García de Mutis y T., A. Wymstra entre otros, surge la escuela de palinólogos colombianos que impulsaron su estudio en el país.

En 1968 J.H. Gerneraad, C.A. Hopping y J. Muller, publican el trabajo Palynology of Tertiary sediments from Tropical áreas, que trata sobre zonificación estratigráfica basada en Palinomorfos. Este trabajo sirvió de base para investigaciones posteriores donde se usan palinomorfos diferentes al grano de polen fósil para estudios estratigráficos. Por ejemplo: Petters y Sarmiento (1956), utilizan los foraminíferos fósiles para el estudio del Cenozoico de Colombia. Bolli 1957, basado en biozonas de planctónicos de Trinidad, sentó las bases para una serie de investigaciones realizadas para el Norte de Colombia. Rincón et al. (2007), proponen un esquema bioestratigráfico con zonas de foraminíferos planctónicos para el Norte de sur América. Gustavo Sarmiento (1992, 1994 y 2000), inició los trabajos sobre el uso de dinoflagelados.

En 1977, 1980, 1981, 1989, Hernando Dueñas publicó varios trabajos sobre los sedimentos Terciarios del Norte de Colombia (Oligoceno, Mioceno). En 1992 con los estudios palinológicos sobre la Formación Guaduas inicia una serie de publicaciones sobre el Cretáceo de la Cordillera Oriental. En 2000 publica Los Dinoflagelados. Un aspecto olvidado de la biodiversidad en Colombia. Estos trabajos son pioneros en el uso estratigráfico de los dinoflagelados en Colombia.

ALCANCES DE LA PALINOLOGÍA En sus inicios la palinología fue considerada como auxiliar de la geología, pero poco a poco se ha desarrollado como una ciencia con identidad propia. Gracias a la gran variedad de formas, tipo de aberturas y riqueza de caracteres estructurales y esculturales de la exina de las esporas y la de los granos de polen, la palinología es una ciencia que presenta muchas relaciones con otras disciplinas 16

científicas a las cuales puede auxiliar, o recibir ayuda de ellas. Son cada vez más numerosos los investigadores (biólogos, farmacéutas, químicos, geólogos, médicos, climatólogos, arqueólogos, agrónomos, entre otros) interesados en estudios palinológicos, ya que, además de su significado en taxonomía, filogenia y evolución de las plantas, el estudio de la morfología polínica es esencial para el reconocimiento e identificación de las esporas y granos de polen que se encuentran en una gran variedad de medios: suelo, aire, agua, sedimentos, miel de abejas y en muchas otras partes del ambiente (Figura 1.4).

La palinología es una ciencia básica y aplicada. La básica ha realizado importantes contribuciones a la taxonomía vegetal, morfología vegetal, citología, genética,

ecología,

arqueología,

paleobotánica,

paleoclimatología,

y

a

paleoecología entre otras ciencias. En la rama de las ciencias aplicadas, ha hecho contribuciones, entre otras ramas del saber humano, a certificación de la calidad de mieles, medicina (polen alergénico), farmacología, agricultura (mejorar cosechas e investigaciones agronómicas). Es de alta aplicación en geología, estratigrafía y prospección de petróleo y carbón mineral, ya que permite efectuar correlaciones regionales.

El rápido desarrollo de la palinología ha mostrado su aplicación en muchas áreas del saber humano, lo que ha llevado a subdividirla en varias ramas entre las cuales podemos citar: 1. Actuopalinología 2. Palinotaxonomía 3. Paleopalinología y Geopalinología 4. Arqueopalinología 5. Aeropalinología 6. Melitopalinología 7. Copropalinología 8. Criminopalinología o Palinología forense 9. Farmacopalinología 17

Figura 1.4. Algunas aplicaciones importantes de la palinología (Kapp 1969).

Actuopalinología. Estudio morfológico de los granos de polen de las plantas actuales. Es base de los estudios en las diferentes ramas de la palinología.

Palinotaxonomía. Estudio de la taxonomía vegetal con base en la morfología polínica. En los taxones actuales, las semejanzas y diferencias del polen, constituyen una metodología básica para diversas familias de plantas, como también para determinar líneas de evolución y filogenia. Sin embargo, los taxónomos raramente se preocupan por tener en cuenta los granos de polen al hacer revisiones de grupos vegetales y cuando lo hacen, son descripciones superficiales.

Paleopalinología y Geopalinología. Estas dos ramas del saber humano estudian lo relativo al polen fósil, su origen y dispersión, aspectos importantes para la reconstrucción del clima y de la vegetación en un ambiente determinado, a través 18

del tiempo. Es de gran interés para la ciencia conocer e interpretar, a partir de los registros bioestratigráficos, los cambios de la vegetación que han ocurrido en una región a través del tiempo. Muchos de los eventos climáticos, geológicos o antrópicos ocurridos en una región, se manifiestan intrínsicamente en variaciones biológicas; el apogeo, disminución o extinción de una especie o grupo de organismos, puede ser un marcador de algún evento, el cual se trata de reconstruir a partir del contenido y distribución de los fósiles hallados en los estratos de los sedimentos estudiados.

El estudio de las esporas y granos de polen fósiles y subfósiles y otros palinomorfos fósiles o subfósiles hallados en un sedimento o fracción estratigráfica, son un grupo importante entre los restos fósiles, utilizados en muchos trabajos de reconstrucción paleoambiental a escala mundial. Entre los microfósiles existe un gran número de taxones diferentes, por ejemplo polen de gimnospermas

y

angiospermas,

esporas

de

helechos

y

hongos

y

microorganismos acuáticos y terrestres. Los datos de la paleopalinología son de gran valor en la interpretación de problemas relacionados con estratigrafía, paleoecología, arqueología. El análisis palinológico de sedimentos, demuestra variaciones florales a través del tiempo, entre las cuales se encuentran las alteraciones climáticas. Por ejemplo Van der Hammen (1961) mediante el análisis palinológico de sedimentos y datación radiométrica con C14, demostró que hubo períodos de glaciaciones e interglaciaciones en los Andes colombianos, períodos que corresponden cronológicamente a los de otras partes del mundo, especialmente de Europa. Entre las más sobresalientes aplicaciones del análisis de polen fósil, está la interpretación de la flora en el pasado y como pueden ser usados estos datos en la interpretación de la evolución del ambiente contemporáneo, además tiene gran aplicación práctica en la prospección de petróleo y carbón mineral.

Estudios

palinológicos

en

sitios

arqueológicos,

han

tenido

interesantes

aplicaciones para explicar el contexto biológico de ciertos artefactos, establecer 19

correlaciones entre culturas humanas y determinar modificaciones causadas por el hombre en la vegetación y el paisaje.

Arqueopalinología. Un objetivo fundamental de la investigación arqueológica es reconstruir y explicar lo más exacto posible los mecanismos y direcciones seguidas por los cambios culturales ocurridos desde la prehistoria. Para cumplir esta tarea el arqueólogo debe mirar más allá de la recuperación e identificación de los elementos culturales (lítica, cerámica, entre otros). El arqueólogo tiene la disponibilidad de expresar con mayor grado de confianza muchos aspectos de las culturas del pasado, a través del análisis cuidadoso de otras posibles fuentes de información como restos de vegetales o de animales, micromorfología de suelos, química edáfica y palinología, entre otras evidencias.

Aunque en un principio la palinología era utilizada principalmente por geólogos y biólogos, en la actualidad es muy importante en los estudios arqueológicos. Estudios

palinológicos

en

sitios

arqueológicos,

han

tenido

interesantes

aplicaciones para explicar el contexto biológico de ciertos artefactos, establecer correlaciones entre culturas humanas, permite reconstruir el ambiente natural en el cual se desarrollaron las antiguas culturas a lo largo del tiempo y permite determinar modificaciones causadas por el hombre en la vegetación y el paisaje. Por ejemplo, en la Cueva des Pas, en Menorca, utilizada como necrópolis colectiva al final de la Edad del Bronce, el polen existente en los sedimentos extraídos del interior y exterior de los sudarios (ajuares o mortajas) y en la piel de las momias, evidenció el uso de plantas en los ritos mortuorios. Aeropalinología. Estudia el contenido esporopolínico del aire y su relación con la sedimentación polínica. Lleva a obtener datos muy útiles para la Iatropalinología o sea el estudio del polen como causante de alergias o Polinosis, la cual va desde rinitis hasta casos muy serios de asma.

Melisopalinología o Melitopalinología. Estudios de los granos de polen contenidos en la miel de abejas o propóleo y su relación con la apicultura en 20

general. También trata de los granos de polen comercial. El reconocimiento de las plantas mediante el polen encontrado en muestras de miel de abejas, permite detectar adulteraciones de este alimento y abre perspectivas útiles al progreso del estudio de la biología de las abejas. En el caso de mieles tóxicas, permite identificar las plantas venenosas que fueron visitadas por las abejas.

Copropalinología. Estudio del polen contenido en heces humanas y animales. El contenido estomacal y los excrementos de animales herbívoros y del hombre, pueden presentar un número considerable de granos de polen, cuya identificación determina la dieta del organismo en cuestión, ya que el polen pasa por el tracto digestivo sin sufrir alteraciones de la exina. La copropalinología se realiza con fines etnobotánicos, estudios de dispersión vegetal y detección de plantas venenosas para el hombre y animales.

Criminopalinología o Palinología forense. Del inglés Forensic palynology, es el estudio de granos de polen y esporas en relación a intereses jurídicos. Ya que la abundancia de polen en el ambiente es un carácter reconocible y persistente, lo cual deriva en su utilidad para la ciencia forense. El suelo, las hojas, la basura y el polvo contienen granos de polen que pueden dar indicios del tipo de habitat o área geográfica de la cual se origina una muestra; por eso cuando se impregnan en los zapatos, uñas o ropa de una persona, pueden proporcionar suficiente polen para análisis y reconstrucción de movimientos o permanencia reciente en un región dada.

Farmacopalinología. Uso de granos de polen y esporas como medicamentos.

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MORFOLOGÍA POLÍNICA La naturaleza es una inagotable creadora de formas Gunnar Erdtman

La morfología de las esporas y granos de polen es determinada por dos tipos de factores: factores emfíticos, que son factores hereditarios o genéticos y por los llamados factores haptotípicos que son debidos al contacto con las células vecinas durante su desarrollo esporogénico. Las características morfológicas de los granos de polen también pueden variar por factores citológicos y por modificaciones en el número de cromosomas.

Las esporas y granos de polen presentan variabilidad en cuanto a unidad polínica; número, posición y tipo de aberturas, estructura y escultura de la pared, polaridad, simetría, contorno, forma y tamaño del grano. Todos estos son caracteres regulados genéticamente, aunque la forma y el tamaño, pueden variar según el método de preparación seguido para su estudio (Erdtman, 1969). Por lo tanto, la forma y el tamaño relativamente tienen valor secundario para la caracterización del polen.

Los principales caracteres de valor taxonómico e importancia para la identificación de los granos de polen son:

1.

Unidad polínica

2.

Aberturas:

número,

posición

y

carácter

(forma)

de

las

aberturas

(Clasificación NPC) 3.

Estructura (estratificación) y ornamentación (escultura) de la esporodermis

Existen otros caracteres de e importancia taxonómica secundaria para la identificación de los granos de polen: 24

1.

Polaridad

2.

Simetría

3.

Forma

4.

Tamaño

5.

Índice de Área Polar

Por la diversidad y por su constancia morfológica dentro del taxón, los granos de polen representan una excelente evidencia que puede ser utilizada en sistemática o para definir líneas o procedencias de los diversos grupos taxonómicos. Debido a esta gran variabilidad y al rápido desarrollo de la palinología, ha surgido una proliferación de términos usados para describir la morfología de las esporas y granos de polen. Gracias al alcance de trabajos publicados, entre los que se resalta el elaborado por Punt et al. (2007), se ha logrado brindar cierta estabilidad a la terminología palinológica, la que en un tiempo no muy lejano resultaba complicada, poco definida y sujeta a confusiones. De tal forma que actualmente existe mayor consistencia en la caracterización y abordaje de la temática palinológica en el ámbito mundial.

UNIDAD POLÍNICA: POLEN SIMPLE Y POLEN COMPUESTO Los granos de polen simples son denominados mónadas y son aquellos granos que cuando maduros no permanecen unidos, o sea que en estado adulto son solitarios (Figuras 1.5. A y 1.6. D-H, J-L). Este tipo de grano ocurre en la mayoría de plantas actuales.

Los granos de polen compuestos son aquellos que en estado adulto permanecen unidos formando grupos de diferente número de elementos y posición dentro del grupo (Figuras 1.5. B-1.5.H y 1.6. A-1.6.C):

Díadas. Cuando permanecen unidos en pares, por ejemplo en Scheuchzeria palustris. 25

Tétradas. Si permanecen formando grupos de cuatro granos organizados con alguna configuración geométrica, según la cual reciben diferentes nombres: •

Tétrada lineal. Con elementos organizados en línea continua, por ejemplo en alguna especies de Typha.

•

Tétrada tetrahedral. Si presenta uno de los granos situado en el centro sobre los otros tres, por ejemplo en Ericaceae, Droseraceae.

•

Tétrada tetragonal. Es una tétrada cuadrangular con los cuatro elementos en el mismo plano, por ejemplo en algunos taxones de Annonaceae o en Typha latifolia.

•

Tétrada romboidal. Las cuatro unidades forman una figura romboidal, por ejemplo en Meconopsis. Las tétradas tetrahedral y tetragonal son los tipos más comunes de tétradas.

•

Seudotétrada. Es una tétrada parecida a mónada, sin paredes divisorias entre los cuatro componentes y sólo uno de los núcleos se desarrolla normalmente, se presenta en la familia Cyperaceae.

Óctadas. Compuesta de ocho elementos por ejemplo en algunas Mimosaceae.

Políadas. Con más de ocho elementos más o menos firmemente unidos, por ejemplo en Calliandra.

Másulas. Agrupaciones de muchos granos de polen cuyo número es difícil de averiguar.

Polinia. Es una masa de granos de polen de toda la teca, en este caso se denomina aparato polínico a toda la unidad funcional formada por un corpúsculo con dos brazos unidos más la polinia, por ejemplo en Asclepiadaceae, Orchidaceae.

26

La mayoría de las especies de angiospermas presentan granos de polen simples, pero se citan 43 familias de dicotiledóneas y 12 de monocotiledóneas, en las cuales algunas o todas las especies de la familia, presentan granos compuestos (Walker & Doyle 1975). Para estos dos autores, las tétradas representan un carácter avanzado sobre los granos aislados o mónadas. La políada es considerada más avanzada que la tétrada, y a partir de estas se pueden originar tétradas y mónadas. Las másulas y polinias, representan las unidades polínicas más avanzadas y en las familias donde ocurren, Orchidaceae y Asclepiadaceae respectivamente, las formas más primitivas tienen tétradas o políadas.

Figura 1.5. Tipos de granos de polen según la unidad polínica en general.

27

Figura 1.6. Tipos de granos de polen según la unidad polínica. A y B: Vistas frontales de dos tipos de políadas de Inga spp. C: Vista frontal de una políada de Calliandra sp. D-H: Diferentes tipos de mónadas en D: Fraxinus sp., E: Dactylis sp., F: Fuchsia sp., G: Ambrosia sp., H: Malvaviscus sp. I: Pseudotétrada en Cyperus sp. J-L: Diferentes tipos de mónadas en J: Eleocharis sp., K: Amarillidaceae, L: Ribes sp.

28

POLARIDAD A partir de una célula madre del polen, después de la meiosis, se forma la tétrada o conjunto de cuatro microsporas haploides, que permanecen unidas hasta la maduración. Al llegar al estado maduro generalmente, las cuatro microesporas, se separan. En algunos grupos estas microesporas permanecen unidas en díadas, tétradas, políadas, entre otros. Cuando los granos están todavía unidos en tétrada, se llama polo proximal de cada grano, al área que está más cerca del centro de la tétrada (lado interno) y al área más alejada (lado externo), se le denomina polo distal (Figuras 1.7. a-1.7.c). El mismo criterio se aplica a díadas, políadas, entre otros Una vez separada la tétrada, es casi imposible determinar la orientación de los polos del grano.

Según la polaridad un polen puede ser:

Apolar. Cuando después de separado de la tétrada, no presenta polaridad definida. Isopolar. Cuyos polos proximal y distal son iguales. Heteropolar. Cuando los dos polos son diferentes, ya sea en forma, ornamentación o sistema apertural, por ejemplo un polo con una abertura y el otro no. Subisopolar. Intermedio entre iso- y heteropolar; presenta un plano ecuatorial más o menos curvo.

29

Figura 1.7. a: Diagrama de una tétrada. b: Polen heteropolar. c: Polen isopolar. A—B = diámetro ecuatorial. C—D = eje polar. C = polo distal; D = polo proximal. SIMETRÍA Un polen simétrico es aquel que tiene al menos un plano de simetría en caso contrario se le llama asimétrico. El polen isopolar puede ser de simetría radial cuando presenta un plano horizontal y dos o más planos verticales de simetría (Figura 1.9. A y B), si sólo presenta un plano de simetría es isopolar bilateral (Figura 1.9. C y D). Los granos de polen radialmente simétricos tienen forma elipsoide de rotación y el eje polar es el eje de rotación.

Figura 1.8. Posición de observación de un polen tricolporado. A: Vista ecuatorial. B: Vista polar.

30

Figura 1.9. A y B: Polen radiosimétrico isopolar. A: Vista ecuatorial. B: Vista polar. C y D: Polen bilateral isopolar. C: Vista ecuatorial. D: Vista polar. ABERTURAS Las aberturas son áreas de la exina especialmente delimitadas, delgadas o sin pared e independientes del patrón de la exina. En estas áreas la sexina desaparece o se hace muy delgada y la nexina se convierte en la capa principal. La intina que se encuentra debajo de las aberturas generalmente es más gruesa que la encontrada en otra parte del grano. En los granos de polen vivos las aberturas no están abiertas sino que están cubiertas por una delgada capa de material de la exina.

A las aberturas también se les llama también áreas de germinación, porque generalmente a través de ellas pasa el contenido celular durante la germinación de le espora o del polen (formación del gametofito

y tubo polínico

respectivamente). Como el tubo polínico emerge solamente por una abertura y generalmente existen varias aberturas, -por ejemplo en Malvaceae existen más de 50 aberturas por grano-, se piensa que tienen alguna otra función. Así en una misma espora o polen coexisten una abertura germinal, que es el punto de salida del gametofito de la espora o del tubo polínico del polen y otras aberturas que son harmomégatas o pseudoaberturas, que favorecen la acomodación del polen a los cambios de volumen producidos por humedad ambiental, controlando los movimientos de agua hacia adentro y hacia afuera del polen. La deshidratación hace que la intina envuelva la abertura y sus márgenes se juntan, esto reduce el área a través de la cual se pierde agua. La imbibición de agua causa un 31

rompimiento de la margen y la membrana que la recubre es estirada, así se incrementa el área a través de la cual el agua puede entrar.

La región gruesa de la intina, debajo de las aberturas, es un depósito de proteínas que se considera tiene función de reconocimiento en la reacción polen-estigma, así las aberturas también serían puntos de salida de estas proteínas.

En términos generales, las aberturas pueden ser ectoaberturas si son de la exina y endoaberturas las de la nexina. También se denomina mesoabertura a la parte media de una abertura compuesta situada entre la ecto y la endoabertura por ejemplo en Polygonum aviculare o en el Género Sonchus (Asteraceae). Los granos de polen y las esporas pueden ser: Inaperturados si no presentan aberturas o Aperturados cuando las presentan.

Sistema NPC para la clasificación de las aberturas: Número, Posición y Carácter (Forma) de las aberturas Para la identificación de una espora o de un polen reciente o fósil, después de definida la unidad polínica, el siguiente carácter a observar debe ser el tipo de aberturas. La clasificación de las aberturas se hace con base en el sistema NPC, establecido por Erdtman (1969) según:

1.

el número (N: lat. numerus),

2.

posición (P: lat. positio)

3.

y el carácter o forma (C: lat. character).

Según el número (N) de aberturas. Las esporas y los granos de polen pueden ser Divididos en siete grupos: N1-N7, caracterizados por una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis aberturas y son llamados mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, hexa o poliaperturados respectivamente (Figura 1.10 y 1.11). El número de aberturas característico de una especie puede variar: por ejemplo una especie 32

con granos de polen triaperturados, algunas veces puede presentar granos de polen con cuatro, cinco o seis aberturas.

Según la posición (P) de las aberturas. Las esporas y los granos de polen pueden ser (Figura 1.10 y 1.11):

1.

Cataaperturados. Con una abertura proximal.

2.

Anacataaperturados. Con una abertura distal y una proximal.

3.

Anaaperturados. Con una abertura distal.

4.

Zonoaperturados. Con aberturas localizadas en la región ecuatorial o subecuatorial o en dos o más zonas paralelas al ecuador.

5.

Pantoaperturados o periaperturados: generalmente son granos esféricos, con aberturas más o menos uniformemente distribuidas por toda la superficie del grano.

Según el carácter o forma (C). Las aberturas pueden ser (Figuras 1.10. y 1.11): 1.

Leptoma. Área delgada en el polo distal que se presume, funciona como abertura. Es un término sustituto para el vocablo cappula, hoy en desuso y propuesto por Erdtman (1957), para definir el adelgazamiento de la esporodermis en la cara distal del cuerpo (corpus) de los granos de polen bisacados.

2.

Sulco. Ectoabertura latitudinalmente elongada situada en los polos distal o proximal de un polen. Es una abertura característica de granos de polen de gimnospermas, angiospermas primitivas y algunas monocotiledóneas. Básicamente un sulco tiene la misma forma de un colpo, pero difiere por la orientación: los sulcos son esencialmente aberturas latitudinales, mientras que los colpos son aberturas longitudinales. Los sulcos pueden ser: Distales (anasulcados). Proximales (catasulcados). Zonosulcados. Extendidos rectamente alrededor del grano. 33

Súlculos. Cuando estas aberturas latitudinales no se encuentran ubicadas exactamente en un polo. Tricotomosulcados. Son granos con aberturas ramificadas en las cuales las ramas son dos veces más largas que anchas, por ejemplo Elaeis guineensis (Arecaceae). 3.

Colpo. Abertura elongada, en forma de bote, dos o más veces más larga que ancha. Con base o extremos agudos, redondeados u otra forma geométrica. Constrictos (adelgazados) o no en la zona ecuatorial. Algunos autores restringen el término a una abertura esencialmente meridional, contrastando esto con los sulcos distales y proximales, por lo que es necesario precisar el significado indicándole un prefijo adecuado. Por ejemplo: ectocolpo, endocolpo, sincolpado. Este tipo de abertura se encuentra

en

muchas familias de

angiospermas; por ejemplo

en

Asclepiadaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Caesalpiniaceae, Cactaceae, Caprifoliaceae, Convolvulaceae, Crassulaceae, Geraniaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Plumbaginaceae, Polygalaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae. 4.

Poro. Término aplicado en palinología a una abertura más o menos esférica, circular, elíptica o ligeramente alargada con extremos redondeados, con una relación largo/ancho menor que 2. (Figura 1.10 y 1.11). El poro es considerado como un carácter más avanzado que el colpo. Se encuentra en muchas

familias

como:

Campanulaceae,

Fumariaceae,

Malvaceae,

Poaceae, Tiliaceae. 5.

Úlcera (ulco). Es una abertura redondeada situada en las caras distal o proximal de un polen (anaulcerado o cataulcerado respectivamente), su forma es la misma que la de un poro. La diferencia de ambas aberturas la da la orientación, pues las úlceras sólo están presentes en los polos, mientras los poros se nombran cuando aparecen en el ecuador (zonoporados o estefanoporados) o cuando son de distribución global (granos de polen periporados o pantoporados). Existe el término úlculo para las úlceras que 34

no están situadas exactamente en el polo como es el caso de algunas gramíneas (Poaceae). 6.

Abertura en espiral. Especie de colpo que rodea todo el grano.

Aberturas compuestas. Algunos taxones presentan aberturas compuestas llamadas: 1.

Cólporo. Cuando está formado de un colpo (ectoabertura) y una o más endoaberturas, en este caso el colpo actúa como abertura harmomégata y la endoabertura actúa como lugar de salida del tubo polínico o abertura germinal. Como en Apiaceae, Apocynaceae, Araliaceae, Asteraceae, Ericaceae, Fabaceae, Fagaceae, Gentianaceae, Oleaceae, Primulaceae, Verbenaceae.

2.

Póroro. Es una abertura compuesta de un poro (ectoabertura) y una endoabertura (Figura 1.11).

3.

Porocolpados. Algunos granos de polen presentan poros y colpos unidos en la zona ecuatoria.

En las aberturas compuestas, la endoabertura recibía el nombre de os (lat. Os: boca, plural Ora: bocas), pero hoy en día este término está en desuso.

En las aberturas compuestas cuando la endoabertura es más o menos redondeada, recibe el nombre de endoabertura circular. Si es alargada lateralmente se le llama endoabertura lalongada. Si lo es en forma longitudinal endoabertura lolongada. Cuando hay presencia de dos endoaberturas se utilizan los términos diploporado o diorado.

Según el tipo de abertura los granos de polen se denominan: sulcados, tricotomocolpados,

colpados,

colporados,

porados,

pororados,

ulcerados,

leptomados, entre otros.

35

Aberturas bordeadas. Son aquellas en las cuales la exina muestra, alrededor de la abertura, una estructura ligeramente diferenciada como un borde, ya sea en ornamentación o en espesor. El borde puede ser tanto de la sexina como de la nexina. El borde grueso o delgado de la sexina alrededor del ectoporo se le llama anillo (annulus) y si bordea un colpo o sulco se denomina margen. En la descripción de esporas fósiles se acostumbra utilizar el término labro para caracterizar el borde que presentan algunas en sus cicatrices. El engrosamiento de la nexina alrededor de una endoabertura o debajo del borde de una ectoabertura se le llama costa o costilla (costae). En algunos granos las dos capas de la exina se separan cerca de las aberturas (generalmente poros) formando una cámara denominada vestíbulo que separa la abertura del resto del grano.

En algunos granos coloporados en la endoabertura la sexina se separa de la nexina y se eleva en forma de áspide y la nexina se engruesa formando la costa alrededor de la endoabertura. Algunas veces sobre la parte central de la abertura se encuentra un área de sexina tan gruesa como la del resto del grano a manera de tapa y recibe el nombre de opérculo (Figura 1.13).

36

Figura 1.10. Diagrama donde se muestra el Sistema NPC para clasificación de las aberturas (Erdtman 1969): N = número, P = posición, C = carácter o forma. ATREME (No, sin aberturas), NOMOTREME (con aberturas regulares. El número varía de N1 a N6, más de 6: N7), ANOMOTREME (con aberturas irregulares, N8). La posición de las aberturas se desconoce en P0. En P1 hay una abertura simple proximal. En P2 hay dos aberturas una proximal y una distal. En P3 hay una abertura distal. En P4 las aberturas están localizadas en una zona. En P5 las aberturas están localizadas en dos o más zonas y en P6 están esparcidas por toda la superficie del polen.

37

Figura 1.11. Clasificación de tipos polínicos con base en el número y posición de las aberturas. Se indican ejemplos en las vistas ecuatorial y polar. Las líneas punteadas indican un plano focal diferente. Los espacios vacíos indican la falta de ejemplos (Moore & Webb 1978).

38

El carácter o forma de las aberturas da las bases para la clasificación mostrada en las figuras 1.12 y 1.13.

Figura 1.12. Clasificación de los tipos polínicos con base en el número, posición y carácter (forma) de las aberturas. (Tschudy 1969).

39

Figura 1.13. Clasificación de tipos polínicos con base en el número, posición y carácter (forma) de las aberturas. A: Vista ecuatorial de un grano de polen colpado. B, C y D: Vistas polares de granos de polen tricolporados. E: Vista polar de un grano de polen tricolpado. F-M: Vistas frontales y laterales de algunos de tipos de aberturas.

40

Figura 1.14. Aberturas bordeadas. A y B: Anillo. C: Endoanillo. D: Atrio. E: Vestíbulo. F: Opérculo. Aberturas especiales. Existen algunos tipos especiales de aberturas entre las cuales se encuentran: 1.

Fenestradas. Es un tipo de abertura tricolporada, con los colpos enmascarados por un raro patrón de sexina, que muestra grandes lagunas aparentes, separadas por bordes altos, por ejemplo en la familia Asteraceae, subfamilia Liguliflorae, género Taraxacum.

2.

Aberturas en espiral. Son aberturas como colpos que rodean todo el grano (Figura 1.15).

A

B

Figura 1.15. Aberturas especiales. A: Grano de polen fenestrado. B: Grano de polen con aberturas en espiral.

41

En un polen las áreas que no están ocupadas por aberturas reciben diferentes nombres dependiendo de si están adyacentes a un poro o a un colpo (Figura 1.16): 1.

Mesocolpio (o mesocolpo). Es el área delimitada por dos colpos.

2.

Mesoporio (o mesoporo). Es el área delimitada por dos poros.

Sí los granos de polen son zonoaperturados, cada polo presenta una un área sin abertura denominada apocolpio (o apocolpo) y apoporio (o apoporo), según que las aberturas sean colpos o poros respectivamente (Figura 1.17).

Figura 1.16. Vistas ecuatorial y polar mostrando como pueden verse las aberturas y las áreas libres de aberturas en los granos de polen. Un polen n-aperturado con aberturas no anastomosadas, tiene n-mesocolpos o nmesoporos que son las áreas delimitadas por dos aberturas adyacentes y por las líneas perpendiculares, imaginarias, que unen los ápices de los colpos o las tangentes paralelas comunes a dos poros.

El apocolpio es un área en los polos delimitada por las líneas imaginarias que unen los ápices de dos colpos o cólporos en granos zonoaperturados, o sea, es una superficie sin aberturas que se encuentra en cada polo.

42

Existen algunos tipos especiales de granos de polen según el carácter de las aberturas en vista polar. Entre estos se encuentran (Figura 1.17):

1. 2.

Sincolpados. Con colpos o cólporos muy largos (longicolpados) que se unen en los polos sin dejar área polar libre o sea carecen de apocolpio. Parasincolpado. Es un caso de grano sincolpado en el cual los colpos o cólporos, son bifurcados y sus ramificaciones se encuentran en la región polar dejando intacto el apocolpio (área libre de aberturas. Figura 1.17).

Figura 1.17. A: Polen sincolpado. B: Polen parasincolpado.

La importancia taxonómica y filogenética de las aberturas, es el hecho de que no están localizadas al azar en la superficie del grano, sino que presentan un lugar definido con relación a los polos y al ecuador. Se considera que la evolución de las aberturas en los granos de polen fue uno de los mayores avances en las plantas con semilla. Las esporas de las pteridófitos no poseen aberturas, sino áreas análogas de menor resistencia, en el polo proximal, llamadas cicatrices de tétradas y pueden ser monoletes y triletes. La primera abertura verdadera se desarrolla en el polo distal del polen de gimnospermas y era semejante a una hendidura. En el polen de algunas gimnospermas fósiles se encuentran dos aberturas, una en el polo proximal y otra en el distal. Existen gimnospermas con granos de polen inaperturados o solamente con una hendidura o poro. Las monocotiledóneas frecuentemente presentan granos de polen inaperturados o con una hendidura o poro, pero la estructura de la exina las distingue de las gimnospermas; por ejemplo las familias Amaryllidaceae, Arecaceae y Liliaceae (monocotiledóneas) y las familias Magnoliaceae, Myristicaceae y Piperaceae

43

(entre otras dicotiledóneas consideradas como primitivas) presentan granos de polen anasulcados que al parecer, según Walker (1974b), fueron el origen de:

1.

Las tétradas anatremas, como las que se encuentran en Ericaceae, Juncaceae, Typhaceae y Winteraceae (dicotiledóneas) y en Orchidaceae (monocotiledóneas). De las tétradas se derivaron las politétradas, como las de Mimosaceae.

2.

El polen tricotomosulcado, como el encontrado en el género Piper (Piperaceae), sin cicatriz gruesa, lo cual lo diferencia de las esporas triletes de los pteridófitos.

3.

Los granos anaporados y operculados

de

Poaceae

(Gramineae-

monocotiledóneas-). A través del grano inaperturado – encontrado en Cupressaceae, Salicaceae y Cyperaceae entre otras - posiblemente se llegó al:

1.

Pantoporado (forado) como el encontrado en Amaranthaceae, Buxaceae, Caryophyllaceae,

Chenopodiaceae,

Juglandaceae,

Malvaceae,

Plantaginaceae, y Zygophyllaceae, entre otras. 2.

Pantocolpado similar al de Polygonaceae.

3.

Zonoaperturado, también a través del inaperturado, posiblemente se llegó hasta el polen zonoaperturado, que es el más frecuente en las dicotiledóneas evolucionadas, ya sea di, tri, pentaporado como, por ejemplo, en Betulaceae, Campanulaceae y Tiliaceae; di, tri, penta – colpado, -colporado; estefanocolpado, estefanoporado o fenestrado como puede ocurrir en Apiaceae (Umbelliferae), Apocynaceae, Asteraceae (Compositae), Fabaceae (Labiatae),

Boraginaceae,

Brassicaceae

(Leguminosae-Papilionoideae), Oleaceae,

Primulaceae,

(Cruciferae),

Ericaceae,

Fagaceae,

Lamiaceae

Rosaceae,

Salicaceae,

Scrophulariaceae. 44

En las angiospermas una única abertura surcada localizada en el polo distal, se considera como un carácter primitivo. Se cree que los granos de polen inaperturados son el origen o intermedio en la evolución hacia los granos de polen colpados o porados, que son los más frecuentes en las angiospermas, que a su vez son el grupo vegetal más evolucionado. En la mayoría de las dicotiledóneas los granos de polen son triaperturados. En algunas familias de angiospermas que normalmente presentan granos de polen zono o pantoaperturados, se encuentran algunos géneros inaperturados por ejemplo en el género Populus (Salicaceae) o en las familias Aceraceae y Cyperaceae, entre otras.

ESTRUCTURA O ESTRATIFICACIÓN DE LA ESPORODERMIS Una vez que las esporas y granos de polen se han separado en clases según las aberturas (sistema NPC), las clases pueden ser divididas con base en la estratificación y escultura de la exina. En microscopía de luz, el estudio de la esporodermis requiere ser realizado con objetivo de inmersión.

Examen en corte óptico. Se entiende por corte óptico meridional aquel en el cual la estratificación de la exina es nítidamente visible cuando el grano es observado en vista ecuatorial. Corte óptico ecuatorial es aquel en el cual la estratificación de la exina es nítidamente visible cuando el grano se observa en vista polar (Figura 1.18).

Figura 1.18. A: Corte óptico meridional. B: Corte óptico ecuatorial. 45

En corte óptico se observa que la esporodermis está constituida por dos capas: la más interna es llamada intina y la más externa recibe el nombre de exina, la cual está dividida en dos subcapas: la más interna es nexina y la más externa la sexina. Esta última puede presentar o no, tectum y diferentes tipos de escultura (ornamentación). La intina (Figura 1.19 A y B) se encuentra siempre presente alrededor de la parte viviente del polen, es delgada, de espesor generalmente homogéneo. Está en contacto directo con la membrana celular, químicamente está compuesta principalmente de celulosa, aunque también se encuentran sustancias pécticas, calosa, enzimas y proteínas. Se destruye con facilidad y desaparece completamente en los procesos de fosilización y acetólisis. Muy pocas especies de plantas actuales producen granos de polen únicamente con intina. Por ejemplo Zostera marina y Naias flexilis, son plantas acuáticas marinas sin exina, únicamente con intina.

Figura 1.19. Estratificación de la esporodermis observada bajo microscopio electrónico. A: de transmisión (MET).

46

Figura 1.19. B: de barrido o rastreo (MEB o MER). a: Espinas del téctum. b: Báculas de la sexina. c: Nexina. d: Intina y parte del citoplasma.

La exina (Figura 1.19 A y B) se encuentra alrededor de la intina, es la pared más resistente de la esporodermis, químicamente está formada por uno de los materiales

más

resistentes

conocidos

en

el

mundo

orgánico,

llamado

esporopolenina que se cree es un bipolímero de carotenos y ésteres de carotenos, pero su composición exacta permanece aún desconocida. También contiene proteínas, compuestos aromáticos y polisacáridos embebidos en la esporopolenina, la cual prácticamente es inerte y resiste la mayoría de los tratamientos químicos y enzimáticos de degradación y despolimerización tales como la acetólisis o el ácido fluorhídrico en medio acuoso.

La terminología aplicada a las subdivisiones de la exina es algunas veces confusa (Tabla 1 y Figura 1.20):

Erdtman (1952), diferenció morfológicamente las dos subcapas de la exina llamándolas sexina a la capa externa (S, de Sculptured exine) y dividió esta capa en endosexina y ectosexina. A la capa más interna de la exina la denominó nexina (N de Non Sculptured exine) por ser lisa y homogénea y la dividió en endonexina y ectonexina. En granos de polen acetolisados la nexina presenta un color castaño oscuro, casi negro, más fuerte que el color de la la sexina 47

(amarillento). En muchas especies, la parte superior de la nexina de estos granos acetolisados, presenta un color similar a la sexina, tiñe de rojo con fuchsina alcohólica y recibe el nombre de nexina-1. La nexina-2 es una capa más interna que la nexina-1, de la cual se diferencia porque la nexina-2 no tiene la misma estructura fina de la nexina-1.

Faegri & Iversen (1950) denominaron las dos capas de la exina como endexina a la más interna y ectexina a la más externa, diferenciándolas químicamente ya que la endexina tiñe debilmente con fuchsina B, mientras que la ectexina toma un color rojo oscuro. La ectexina incluye la sexina y una parte de la nexina llamada capa basal o base (foot layer), que sería la nexina-1, en tanto que la endexina, sería la nexina-2.

En estudios de ultraestructura se han encontrado diferencias en la deposición de la esporoplenina en ambas capas: la endexina tiene una apariencia laminar, mientras que la ectexina es granular-amorfa.

La ectexina de algunos granos de polen es soluble en 2-aminoetanol caliente y algunas de sus sustancias relacionadas, mientras que la endexina no es afectada.

Como se puede observar, aunque las parejas de términos sexina-ectexina y nexina-endexina, se usan frecuentemente como sinónimos, en realidad no lo son y muchos autores prefieren usar la terminología de Fægri únicamente cuando observan granos de polen teñidos y la terminología de Erdtman cuando se observa el polen sin tinción o al microscopio electrónico de barrido o al microscopio de luz. La tinción y diferencias de solubilidad, indican que la esporopolenina de esas dos capas parece ser químicamente diferente.

48

Tabla 1. Comparación de algunos términos propuestos para denominar las capas de la pared del polen.

Figura 1.20. Comparación de los términos propuestos para indicar las capas de la pared del polen, según la terminología de Erdtman (izquierda) y la de Faegri & Iversen (derecha). La sexina frecuentemente presenta dos estratos: tectum e infratectum, este último formado por báculos o columelas. La base o capa basal (foot layer) corresponde a la ectexina (Figura 1.21 y 1.22).

49

Figura 1.21. Estratificación de la esporodermis. E: Exina. E1: Exina1. E2: Exina2. S: Sexina. T: Téctum. B: Báculas. N: nexina. N1: Nexina-1 (también llamada capa basal o base – foot layer). N2: Nexina2. I: Intina. Tr: Trifina. Supr.: Supratectal. pr.: Protuberancia (saliente). intr.: Detalle intratectal. infra.: Detalle infratectal. pe1.: Borde superior de una perforación tectal. pe2: Borde inferior de la misma. El tectum también llamado tegilo, es el estrato más externo. Si el polen presenta tectum se le denomina tectado y si carece de él recibe el nombre de intectado o atectado. Puede presentar un tectum parcial y se le llama semitectado. El tectum también puede ser continuo (eutectado) o interrumpido. Presentar minúsculas perforaciones menores de 1 μm de diámetro: tectum perforado, si no las presenta se le llama tectum imperforado. Si presenta perforaciones de un diámetro mayor a 1 μm, se le denomina tectum foveolado o escrobiculado. Si las perforaciones son hendiduras más largas que anchas, el tectum se llama fosulado.

Figura 1.22. Estructura de la esporodermis. A: Estratificación de la pared. B: Polen intectado. C: Polen semitectado. D: Polen tectado perforado. E: Polen tectado imperforado. 50

Filogenéticamente parece ser que el polen más antiguo es el tectado imperforado, seguido del tectado perforado, después el semitectado y el más evolucionado sería el intectado (Walker, 1974a).

ORNAMENTACIÓN O ESCULTURA DE LA ESPORODERMIS Sobre la sexina, generalmente sobre el tectum, puede haber o no, una serie de elementos esculturales o relieves que constituyen la ornamentación o escultura de las esporas y granos de polen. Los elementos esculturales son variados, pero permanecen constantes en la misma especie y son un carácter usado para diferenciar tipos polínicos y de esporas.

Según la escultura del polen, este puede ser (Figura 1.23-1.26): 1.

Psilado o liso. Cuando no presenta elementos esculturales.

2.

Baculado. Con báculo, elemento escultural no puntiagudo, más alto que ancho, en forma de bastón, base no constricta. Los báculos pueden estar sobre el tectum y son denominados báculos supratectales.

3.

Clavado. Con clava, elemento escultural no puntiagudo, mas alto que ancho, en forma de mazo, o sea con la parte superior más ancho que la base, la cual es constricta.

4.

Equinado. Con espinas, elemento escultural puntiagudo, más alto que ancho, longitud mayor de 3 μm. Cuando la espina no sobrepasa los 3 μm de longitud, recibe el nombre de espinula (polen equinulado).

5.

Escabrido o escabrado. Cuando presenta proyecciones menores de 1 μm, en forma de diminutas escamas.

6.

Estriado. Con líneas o estrías laterales más o menos paralelas.

7.

Gemado. Con gemas, elementos esculturales no puntiagudos, cortos o globulosos, cuya anchura es igual o mayor que la altura y son de base constricta.

51

8.

Granuloso. Con granos que son elementos esculturales isodiamétricos no puntiagudos.

9.

Pilado. Con pilos, elementos esculturales no puntiagudos, con cabeza dilatada en forma de clavo, más altos que anchos.

10.

Reticulado. Con mallas o retículos más o menos salientes. Los retículos están formados de muro que son salientes perpendiculares al grano y lumen espacio entre los muros de un retículo. El lumen puede ser liso o presentar algún tipo de ornamentación: pilos, granos, entre otros A su vez el retículo puede ser positivo (hacia fuera) o negativo (hacia adentro). Los granos de polen reticulados también pueden ser: homobrocados si tienen lumen más o menos igual en toda la superficie del grano, heterobrocado si el lumen varía en tamaño, microrreticulados cuando el lumen es menor a 1 μm.

11.

Rugulado. Con salientes laterales irregulares, dos veces más largas que anchas.

12.

Verrucoso (Verrugoso). Con verrugas, elemento escultural no puntiagudo, de ancho igual o mayor que la altura, base no constricta.

Los granos de polen reticulados, los estriados y los rugulados son semitectados. El tipo de polen psilado es considerado como un carácter primitivo (walker, 1974a), aunque la propia escultura puede ser un carácter reversible, que debe ser interpretado en términos de correlaciones individuales observadas dentro de un determinado taxón.

Figura 1.23. Ornamentación del polen. A: Espínula. B: Espina. C: Báculo. D: Verruga. E: Gema. F: Pilo. G: Clava. H: Gránulo. 52

Figura 1.24. Ornamentación del polen. A: Per-ornamentados. B: Supraornamentados. a: Psilado. b: Escabrado. c: Verrucado. d: Gemado. e: Clavado. f: Baculado. g: Equinado.

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Figura 1.25. Diferentes tipos de ornamentación del polen en vista superficial, corte óptico y análisis L–O. En L–O, las áreas en blanco (luz) corresponden a las salientes, y las áreas oscuras (oscuridad) corresponden al fondo u ollos.

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Figura 1.26 (continuación). Diferentes tipos de ornamentación del polen en vista superficial, corte óptico y análisis L–O. En L–O, las áreas en blanco (luz) corresponden a las salientes, y las áreas oscuras (oscuridad) corresponden al fondo u ollos.

55

Varias familias de angiospermas presentan granos de polen que reciben nombres especiales según su ornamentación (Figura 1.27) por ejemplo: 1.

Cavado. Presenta la sexina separada de la nexina formando una cavidad.

2.

Lofado. En la superficie externa presenta aristas o crestas anastomosadas o libres formando lagunas entre las aristas. Dependiendo de la presencia o no de espinas sobre las crestas puede además denominarse equinolofado o psilolofado respectivamente.

3.

Fenestrado. Es un tipo de polen lofado, intectado o semitectado, reticulado, con muros muy altos y grandes lagunas o ventanas dispuestas simétricamente.

4.

Ondulotectado o cerebroide. Es un polen con tectum ondulado.

5.

Insulado. Con pequeños islotes.

6.

Clipeado. Con un escudo de exina, junto o separado de acuedo al estado de hidratación.

Figura 1.27. Ornamentación de la esporodermis. A y B: Polen cavado (c: Cavidades, m: Margen). C: Polen lofado. D y E: Polen fenestrado, característico de algunas especies de Asteraceae (Compositae). F: Polen ondulotectado, característico de Ulmus minor L. G: Polen insulado. 56

También pueden existir granos de polen con ornamentación de dos tipos, por ejemplo: Escabrado-verrugoso, encontrado en especies del género Quercus. Algunas veces resulta muy difícil formar clases con base en la estructura del tectum, toda vez que un tectum puede tener perforaciones en una determinada forma o tamaño. Sí las perforaciones son grandes, es difícil determinar si es un grano tectado-perforado con perforaciones grandes o si es un semitectadoreticulado con lúmenes pequeños. Sí el lumen es igual o más ancho que el muro, el grano se describe como reticulado y si el muro es más ancho que el lumen, se describe como tetado-perforado. Cuando la exina no es lisa, muchos autores miden las mallas o salientes de la superficie, pero estos patrones generalmente son irregulares dificultando las mediciones. Para tener una idea del tamaño de las mallas, rugosidades y pequeñas cavidades de la exina, se utiliza el método de límites de visibilidad de estos relieves al microscopio con objetivos de 10X, 20X, 40X e inmersión, con un ocular fijo.

El infratectum o intersticio se encuentra entre nexina y tectum, está compuesto de pequeñas barras radiales que reciben el nombre de columelas, si sostienen alguna estructura como un tectum, una placa o una saliente, y se denominan báculos, cuando son cilíndricos y no sostienen cosa alguna. Los báculos generalmente tienen forma de bastoncillos con una cabeza, estas cabezas se unen entre sí para formar el téctum. Muchos autores no hacen diferencia entre báculos y columelas y utilizan estos dos términos como sinónimos cuando pertenecen al infratectum. Actualmente se trata de diferenciar ambas estructuras de la siguiente manera: El báculo es siempre un elemento libre de la escultura, mientras la columela hace parte de la estructura. El infratectum también puede ser alveolar, granular o sin estructura definida.

57

Los granos de polen de las gimnospermas parecen tener una pared con estratificación similar a la de las angiospermas con dos capas también llamadas sexina y nexina (Figura 1.28).

A

B

C Figura 1.28. A: Grano de pole maduro de Pinus sp. (Wilson y Loomis 1968). B y C: Indican las dimensiones que pueden ser útiles: a—a: longitud total. b—b: Altura del cuerpo. c—c: Ancho del cuerpo. d—d: Longitud del cuerpo. e—e: Altura de los sacos. f—f: Ancho del saco (Kapp 1969). Análisis LO-OL. En corte óptico no siempre es posible observar la estructura y escultura de la exina y se requiere de un cuidadoso enfoque a través de la escultura y patrones presentados en una superficie dada. Para el examen de superficie se pueden usar las diferencias de índice de refracción en los estratos de la exina, ya que la luz del microscopio óptico al atravesar la exina se refracta diferentemente según la capa que esté atravesando, así al enfocar en un determinado nivel la superficie presenta “islas” de un color, rodeadas de “canales” de otro color. 58

Dos tipos de observaciones deben ser realizadas: examen en corte óptico meridional y ecuatorial y examen de superficie. Con este método, denominado por Erdtman análisis luz y oscuridad (análisis LO y OL, LO: lat. lux: luz y obscuritas: oscuridad) se detectan las más tenues salientes y entrantes de la pared y es indispensable el uso de objetivo de inmersión. Se trata de observar en la pared de la espora o del polen, en bajo aumento, una zona plana o ligeramente curva, por ejemplo: un apocolpio o la parte central de un mesocolpio. Sí los granos están en un medio de índice de refracción más bajo que el de ellos, por ejemplo: agua, aire, silicona, gelatina glicerinada, bálsamo del Canadá, entre otros, pasando a alto aumento y alejando el objetivo de modo que la pared no esté lejos del foco, se vuelve a bajar lentamente hasta que los primeros detalles (por ejemplo: salientes supratectales), aparezcan como “islas claras” (L), bien enfocadas y definidas, y en el plano inferior del foco aparezcan canales oscuros (O, oscuridad).

En un patrón LO: al observar la superficie del grano en foco alto, las salientes son vistas como “islas” claras, brillantes (luz, L) sobre un fondo oscuro (Figura 1.29). Cuando descendemos lentamente la focalización, la figura se invierte y las “islas” se vuelven oscuras (oscuridad, O) sobre un fondo claro (luz, L), este es el patrón OL. Sí la capa contiene salientes, estas son detectadas por el cambio de las islas de L para O, o sea patrón LO. Si presenta cavidades o perforaciones estrechas dirigidas verticalmente, el efecto se invierte: primero oscuras y luego claras, es el llamado patrón OL. Cuando los granos de polen están en un medio de refracción más alto que el de ellos, el patrón también se invierte. Con este tipo de análisis podemos verificar si la superficie es enteramente lisa o si presenta un estrato externo liso, sostenido por una serie de columnas internas.

El uso de microscopio de contraste de fases puede mostrar la estructura de la exina más claramente. Las diferencias en el índice de refracción son convertidas en diferencias en la intensidad lumínica. Así, la mayor diferencia en el índice de 59

refracción que hay en una estructura sólida y su medio circundante, está en la estructura sólida que aparece oscura. Los elementos esculturales muy pequeños, tales como espínulas, estrías, perforaciones, entre otros, pueden ser visibles en contraste de fase y no lo serían sin este recurso.

Figura 1.29. Tipos de escultura observados en diferentes planos de enfoque. El plano de enfoque está indicado por la línea discontinua sobre la sección de la exina. Enfocando hacia abajo a través de la exina, se produce difracción de la imagen la cual varía según la posición del plano focal. La estructura de la exina puede ser dilucidada con esta secuencia de imágenes (Moore & Webb 1978). FORMA El polen de las angiospermas raramente es amorfo (sin forma definida), por ejemplo en angiospermas marinas como Zostera. La inmensa mayoría de veces es fixiforme (con forma definida).

La forma de las esporas y granos de polen puede ser útil para su identificación. Sin embargo, no se debe dar mucho énfasis a este carácter, especialmente cuando son formas relacionadas, por ejemplo: subprolato, prolato, perprolato, ya que puede variar considerablemente dentro de un tipo y aun dentro de una especie. La forma también puede variar según el método de obtención, preparación e inclusión de la muestra para su estudio.

60

En granos de polen peroblatos, el diámetro ecuatorial, es dos veces la longitud del eje polar. En los granos de polen perprolatos, es menos que la mitad del eje polar. Entre estos dos extremos, existe un rango de formas de los granos de polen para las cuales Erdtman (1952) propuso una clasificación cuando el polen se observa en vista ecuatorial, haciendo la relación entre eje polar y diámetro ecuatorial (índice P/E, Tabla 2, Figura 1.30 y 1.31). Esta clasificación es aceptada mundialmente y es exclusivamente para granos de polen acetolisados.

Tabla 2. Forma polínica según índice de relación P/E (Erdtman, 1952).

La clasificación propuesta por Erdtman (1952) presenta el defecto de tener intervalos de clase abiertos. Estos intervalos se pueden cerrar, arbitrariamente, con el fin de facilitar su uso y evitar ambigüedades así (Salgado-Labouriau, 1973), sin embargo es una propuesta no seguida frecuentemente: 1.

Peroblato. P/E menor de 0,50

2.

Oblato. P/E igual o mayor de 0,50 y menor de 0,75

3.

Suboblato. P/E igual o mayor de 0,75 y menor de 0,88

4.

Oblato-esferoidal. P/E igual o mayor de 0,88 y menor de 1,00

5.

Esferoidal. P/E igual a 1,00

6.

Prolato-esferoidal. P/E igual o mayor de 1,00 y menor de 1,14 61

7.

Subprolato. P/E igual o mayor de 1,14 y menor de 1,33

8.

Prolato. P/E mayor de 1,33 y menor de 2,00

9.

Perprolato. P/E mayor de 200

Existen algunas formas no relacionadas con el índice P/E, ya que son geométricas o parecidas a algún objeto. Por ejemplo: rectangular, romboidal, reniforme, forma de manzana o pera (Figura 1.31).

Figura 1.30. Morfología polínica, formas básicas. A: Diagrama de un polen en vista ecuatorial indicando el eje polar (P) y el diámetro ecuatorial (E). B: Polen en vista polar, indicando el triángulo polar o apocolpio (t). C: Polen oblato. D: Polen esferoidal. E: Polen prolato.

Figura 1.31. Morfología polínica, formas básicas y sus derivadas. A: Oblato. B: Peroblato. C: Suboblato. D: Oblato-esferoidal. E: Esferoidal. F: Prolato-esferoidal. G: Prolato. H: Subprolato. I: Perprolato. J a L: Formas no determinadas por la relación P/E. J: Romboidal. K: Rectangular. L: Forma de manzana. 62

Los granos de polen y esporas son estructuras tridimensionales, hecho que a menudo dificulta su observación usando el microscopio de luz, donde sólo un plano esta en foco por vez y por esto, las formas referidas en las tablas 2 y 3, representan granos observados en vista ecuatorial ideal (elipse de rotación). Cuando el polen es observado en vista polar, no siempre su perímetro máximo, denominado ámbito (Amb.), es circular como deberían ser en una elipse de rotación. Debido a lo cual muchos granos de polen que tienen la misma forma en vista ecuatorial, no son de igual forma en vista polar. Por esto, la forma exacta del polen debe ser considerada tanto en vista ecuatorial como en vista polar. El ámbito de los granos de polen recibe el nombre según la forma geométrica que presentan (Tabla 3, Figura 1.32).

Tabla 3. Contorno del polen en vista polar (ámbito) y en vista Ecuatorial.

63

Figura 1.32. Contorno de los granos de polen en vista polar (ámbito) y en vista ecuatorial. Según la posición de las aberturas en vista polar, los granos de polen reciben los nombres de: 1.

Angulaperturados. Si tienen las aberturas localizadas en los vértices.

2.

Planaperturados. Si las presentan en los lados. 64

3. 4.

Sinaperturados. Cuando las aberturas están en los lados del polen de sección cóncava. Fosaperturados. Con aberturas en concavidades que dejan entre sí los lados del ámbito convexo.

TAMAÑO El tamaño del polen generalmente permanece constante dentro de la misma especie, pero puede ser afectado por el método de preparación, llegando a ser un carácter inestable. Es heterogéneo en los híbridos y está relacionado con el número de cromosomas. Las especies poliploides presentan granos de polen de mayor tamaño que las especies diploides.

En angiospermas el tamaño del polen varía desde 2 um en Myosotis (Boraginaceae) a más de 300 μm en Cymbopetalum (Annonaceae). Se han citado 12 familias con granos de polen de tamaño igual o superior a 200 μm: Annonaceae,

Convolvulaceae,

Marantaceae,

Musaceae,

Cucurbitaceae,

Nyctaginaceae,

Dipsacaceae,

Onagraceae,

Malvaceae,

Polemoniaceae,

Xyridaceae y Zingiberaceae. En angiospermas marinas, por ejemplo Zostera (Zosteraceae) y Cymodocea (Cymodoceaceae), se encuentran granos de polen de 2 mm de tamaño. La mayoría de las angiospermas presentan granos de polen que varían entre 25 y 50 μm de eje polar. Las esporas de algunas pteridófitos presentan granos de casi 1,5 mm. Las esporas fósiles de Triletes giganteus miden de 6 a 7 mm de longitud.

El tamaño del polen está definido por la media aritmética de la longitud del eje polar y por la del diámetro ecuatorial tomadas en corte óptico meridional sin incluir proyecciones de la pared (espinas, verrugas, entre otros) que sobrepasan los 0,5 μm de longitud (Figuras 1.7 y 1.8). El diámetro ecuatorial en vista polar también se toma en corte óptico meridional. Cuando el polen es 3-aperturado o con un número impar de aberturas, el diámetro ecuatorial en vista polar está dado por la línea imaginaria que une un mesocolpo o un mesoporo con la parte media de una de las aberturas. En los granos de polen 4-aperturados o con número par de 65

aberturas, el diámetro ecuatorial en vista polar está dado por la línea imaginaria que une la parte media de una de las aberturas con la de la abertura opuesta. Según el tamaño el tipo polínico se define por la media aritmética de la longitud del eje polar, con base en intervalos determinados arbitrariamente por Erdtman (1952, Tabla 4).

Tabla 4. Tipos polínicos según la longitud del eje polar (Erdtman, 1952). RANGO DE VARIACIÓN (μm)

TIPO POLÍNICO

< 10

Muy pequeño

10 – 25

Pequeño

25 – 50

Mediano

50 – 100

Grande

100 – 200

Muy grande

> 200

Gigante

La clasificación propuesta por Erdtman (1952) presenta el defecto de tener intervalos de clase abiertos. Por lo cual esos intervalos se pueden cerrar, arbitrariamente, con el fin de facilitar su uso y así evitar ambigüedades (SalgadoLabouriau, 1973), sin embargo esta propuesta no es aceptada frecuentemente: 1.

Pequeño. Por debajo de 25 µm

2.

Mediano. Igual a 25 um y por debajo de 50 µm

3.

Grande. Igual a 50 um y por debajo de 100 µm

4.

Muy grande. Entre 100 y 200 µm

Índice de área polar. Otro factor importante en la caracterización del polen en vista polar, es el Índice de Área Polar (I.A.P.), que indica la relación entre la distancia de dos aberturas adyacentes (Lado de Apocolpio o Apoporio, LA) y el diámetro ecuatorial en vista polar (DEP). Iversen & Troels-Smith y Fægri & Iversen (1966), definen los tipos de área polar como se indica en la Tabla 5: 66

Tabla 5. Tipos de área polar según relación LA/DEP RANGO I.A.P. (μm)

TIPO DE ÁREA POLAR

ABERTURA

0

Ausente

Unida en los polos

< 0,25

Pequeña

Muy larga

0,25 – 0,50

Mediana

Larga

0,50 – 0,75

Grande

Corta

> 0,75

Muy grande

Muy corta

TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DEL TAMAÑO El objetivo del tratamiento estadístico es determinar el efecto de la influencia de unos factores sobre otros o una relación más o menos precisa entre los mismos, con miras a eliminar o minimizar los factores de error en la observación. Uno de los métodos utilizados para estudiar las diferencias palinológicas entre las especies de un género o de las poblaciones de una misma especie, es comparar las dimensiones del eje polar (P) y el diámetro ecuatorial (E) de los granos de polen y esporas. Las medidas de los parámetros utilizados para el estudio morfológico de los granos de polen, se analizan estadísticamente dando el rango de variación (R), la media aritmética (x¯), el desvío típico (estándar o patrón) de la media (S sx¯), el desvío típico de la muestra (s) y el coeficiente de variación (V). Además, para comprobar el significado de las diferencias de algunas medidas, se calculan los límites o intervalo de confianza (LC) usando el test de Student o prueba de significancia (t) a 95% para separar las medias, el cual se calcula según la fórmula:

LC = x ± Sx (tn-1), donde: x = media aritmética sx = desvío típico de la media n = número de mediciones

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tn-1 = “t” de Student, para n-1 grados de libertad a 95% (2,06 para 25 mediciones).

Estos cálculos se encuentran en programas estadísticos para computador. Los resultados referentes a los tratamientos estadísticos se representan en tablas, organizados de mayor a menor o viceversa, con miras a obtener una comparación cuantitativa de una misma dimensión en las diferentes especies estudiadas.

Para las medidas de los demás caracteres, como el lado de apocolpo (LA), longitud y grosor de las aberturas y grosor de las capa de la exina, se calcula la media aritmética (x¯) con base en 10 medidas. Lo mismo se hace con las mediciones de los diámetros de los granos de polen de especímenes de comparación.

DIMORFISMO POLÍNICO Existen especies vegetales cuyos granos de polen son más o menos iguales en forma y tamaño y reciben el nombre de granos de polen monomórficos, aunque en tamaño presenten rango de variación propio de la especie. En otras especies, los granos de polen, son diferentes en tamaño y algunas veces en forma y son denominados granos de polen di-,tri-, o polimórficos y esta variación es regulada genéticamente. La variación polínica de una especie puede estar relacionada con hibridación, heterostilía, entre otras causas.

Con el fin de analizar la eventual presencia de variación polínica en tamaño de los granos de polen de un mismo individuo de algunas especies, se miden el eje polar y el diámetro ecuatorial en vistas ecuatorial y polar en 50 granos tomados al azar, para calcular las relaciones P/E de estos granos y la posible variación del diámetro ecuatorial en vista polar. La muestra se realiza en preparaciones de cada antera de una única flor con la intención de verificar si la variación polínica está presente en todas las anteras. 68

IMPORTANCIA DE LA MORFOLOGÍA POLÍNICA La importancia taxonómica y evolutiva de la morfología polínica, puede ser analizada a nivel de especie, género, familia o taxones superiores. En muchos casos el tipo de polen de un taxón es característico y constante y el taxón es denominado estenopalinológico, por ejemplo: en la mayoría de los géneros de Cyperaceae,

Poaceae

y

otras

monocotiledóneas.

Amaranthaceae,

Chenopodiaceae, Lamiaceae, Myrtaceae y otras dicotiledóneas. En otros grupos, los tipos de polen varían considerablemente en aberturas, escultura y estructura de la exina, tamaño o forma y el taxón es llamado euripalinológico, por ejemplo: en la mayoría de los géneros de Amaryllidaceae, Araceae, Orchidaceae, Arecaceae y otras monocotiledóneas. Acanthaceae, Asteraceae, Bignoniaceae, Caesalpiniaceae, Clusiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Loganiaceae, Mimosaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sterculiaceae y otras dicotiledóneas, entre otros Los grupos euripalinológicos son los más frecuentes y en estos casos el polen es de mucha importancia para los taxónomos y sistematas.

CARACTERIZACIÓN POLÍNICA La caracterización morfológica de los granos de polen y esporas se da en forma de descripciones, la mayoría de las veces acompañadas de ilustraciones tales como palinogramas o fotomicrografías. Para la terminología se aconseja la propuesta por Punt et al. (2007).

Descripción. No existe una norma sobre descripción polínica. Una de las aplicaciones de la palinología, es usarla como evidencia en taxonomía vegetal, por lo cual para la descripción de granos de polen y de esporas se debería utilizar el sistema de descripción con base en el carácter y el estado del carácter, usado para fitografía.

Adoptando esta metodología se podría iniciar con los caracteres generales seguidos de aquellos con valor taxonómico. Aunque no es obligatorio, el carácter 69

se resalta mediante letra cursiva (itálica), MAYÚSCULA, negrilla (negrita) o subrrayado. Después de la descripción, cada carácter se separa del otro con punto seguido (.), los estados del carácter son separados por coma (,) y sus variaciones por punto y coma (;). Por ejemplo si se utiliza negrilla: Unidad polínica: mónada, diáda, tétrada, políada, polinia, másula, etc. Tamaño: pequeño, mediano, grande, gigante; dar las medidas en vista ecuatorial y polar indicando en primer lugar las dimensiones del eje polar (P) y luego las del diámetro ecuatorial (E) separándolas por el signo de multiplicación (×); finalmente se presentan las dimensiones del diámetro ecuatorial en vista polar (DEP). En las dimensiones se indica el rango iniciando con el menor valor entre paréntesis ( ), luego la media aritmética ( ) ± los limites de confianza, finalizando con el mayor valor entre paréntesis. Polaridad (apolar, isopolar, heteropolar); Forma (definida por la relación P/E); ámbito. Área polar (ausente, pequeña, media, grande, I.A.P.). Aberturas (con o sin margen, número, posición y carácter – NPC; si hay variación referente al número de aberturas, las de menor y las de mayor frecuencia se citan entre paréntesis en orden ascendente y la media en el centro separada de las dos por un guión); colpos (constrictos o no en la región ecuatorial, largos, cortos, dimensiones, anchos, estrechos; ápice redondo, agudo, obtuso); endoabertura (localización, forma, tipo de extremidades, dimensiones). Exina: definición de su escultura y estratificación, análisis de visibilidad, dimensiones de la exina total, de la nexina, de la sexina, del tectum, del infratectum; relación del grosor de la sexina respecto del grosor de la nexina (tan gruesa, casi dos veces más gruesa, dos veces más gruesa, casi tres veces más gruesa, entre otros); división o no de la nexina, en nexina-1 y nexina-2.

Las dimensiones (medidas) de los caracteres pueden ser presentadas aparte, por ejemplo en tablas organizadas de mayor a menor o viceversa, según el interés del investigador.

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Después de la descripción polínica de especies se indica el material estudiado: localidad de recolección, colector, número, fecha de recolección y sigla del herbario donde está depositado el ejemplar. Así:

Material estudiado:

Nombre científico. PAÍS. Departamento:

Municipio,

localidad exacta, m.s.n.m., día, mes, año (sin abreviar ninguna de las tres fechas). Colector número de colección. (Acrónimo del herbario donde está depositado el ejemplar); todos los ejemplares estudiados se citan separados con punto y coma (;); si son del mismo departamento, pero de diferente localidad (se escribe todo desde Municipio). Si cambia el país se escribe todo, después de un punto seguido (.).

Ejemplo de descripción polínica de familia Familia Myrsinaceae. R. Br. Unidad polínica: mónada. Tamaño: pequeño a mediano: 12,5 – 34,7 × 8,9 – 27,5 μm en vista ecuatorial; 11,9 – 28,5 μm de diámetro ecuatorial en vista polar. Polaridad: isopolar. Forma: varía de oblato-esferoidal a prolato; ámbito subtriangular a triangular, cuadrangular o circular lobado, pocas veces sincolporado. Área polar: pequeña (I.A.P.= 0,25). Aberturas: 3-zonoaperturado; 3-(4-2)-colporado, 4-(5-3)-colpado, colpos constrictos en la región ecuatorial; endoabertura lalongada a lolongada, situada en el centro del colpo; margen alrededor de las aberturas. Exina: reticulada en Ardisia, Ctenardisia y Stylogyne, psilada en Conomorpha y Weigeltia, rugosa en Cybianthus y Myrsine; sexina aproximadamente dos veces más gruesa que la nexina; dificilmente se diferencia la nexina-1 de la nexina-2; sexina tectada o semitectada.

Ejemplo de descripción polínica de género Género Stylogyne A. DC.

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Unidad polínica: mónada. Forma: varía de oblato-esferoidal a prolato; ámbito subtriangular. Área polar varía de pequeña (I.A.P= 0,22) a mediana (I.A.P= 0,26– 0,39). Aberturas: tricolporado; endoabertura lolongada, localizada en el centro del colpo; margen alrededor de las aberturas. Exina: reticulada con pilos aislados en el interior del lumen de los retículos; semitectada, con báculos infratectales distribuidos en una sola fila (infratectum simplibaculado).

Ejemplo de descripción polínica de especie Ctenardisia speciosa Ducke

Unidad polínica: mónada. Tamaño: polen pequeño (20,3) 23 ± 0,4 (26,4) m de eje polar × (18,6) 20,9 ± 0,3 (24,7) m de diámetro ecuatorial en vista ecuatorial y (18,6) 21,4 ± 0,4 (25) m de diámetro ecuatorial en vista polar. Forma: prolatoesferoidal (P/E = 1,1); ámb subcircular. Área polar mediana (I.A.P.= 0,27); lado de apocolpía: 5,7 m. Aberturas: 3-zonocolporado, raramente 2-zonocolporado; colpos constrictos en la región ecuatorial; 18,1 m de longitud; 3,4 um de ancho y 0,9 um de margen; endoabertura lalongada, localizada en el centro del ectocolpo, ancha y redondeada en los extremos; 3,7 μm × 6,2 μm de ancho y margen ca. 1 μm de grosor. Exina: reticulada, heterobrocada, retículos nítidos con 250 aumentos; exina total ca. 3,6 m; nexina 1,8 μm; sexina 2 μm; tectum 0,6 μm de grosor; sexina semitectada; nexina dividida en nexina-1 y nexina-2.

Material estudiado: Ctenardisia speciosa Ducke. BRASIL. PARA: Lago Salgado, Río Trombetas, mata da terra firme a leste, lugares úmidos, A. DUCKE sin número, 7-II-1927 (RB 2524, HOLOTIPO).

Palinogramas. Un Palinograma es una representación visual del polen o de esporas, en la cual se indican los principales caracteres: polaridad, tamaño, forma, aberturas, ornamentación y estratificación de la esporodermis (Figuras 1.33 y 1.34). En general, los palinogramas son dibujos esquemáticos de los caracteres del polen. Los dibujos se hacen con la ayuda de una cámara clara 72

(cámara lúcida) o sobre fotografías, siguiendo determinadas normas para poder ser comparables (Erdtman 1971). Un Palinograma también puede ser hecho con base en fotografías de los granos de polen en sus diferentes observaciones. Un palinograma de un taxón determinado consta de:

1.

Representaciones esquemáticas del polen en vistas ecuatorial y polar, en bajo aumento, para dar una idea global de la forma, contorno y aberturas. En vista ecuatorial, el polen se representa con el eje polar vertical, el polo proximal en la parte inferior y una abertura central en primer plano (Figura 1.33. A y B). En vista polar se representa con una abertura hacia abajo (Figura 1.33 C y E–G).

2.

Un diagrama del polen en vista polar, en aumento alto, mostrando la ornamentación de la superficie de la pared y una sección resaltando su estratificación y escultura en corte óptico. La sexina se representa como una capa punteada y la nexina llena (Figura 1.33. C).

3.

Cuando sea posible, se representa el análisis LO – OL, en recuadros sucesivos para definir el tipo de escultura de la pared del polen. Primero se representa el enfoque alto entrando a continuación en la textura de la pared (Figura 1.33.D).

El tamaño se indica por escalas, determinadas con una Placa milimetrada. La escala de la placa es proyectada y trazada con la ayuda de una cámara lúcida (cámara de dibujo), usándose los mismos aumentos utilizados para hacer los diagramas.

Fotomicrografías. Las fotomicrografías pueden ser complementarias o sustituir completamente a los palinogramas. Se deben tomar resaltando los detalles de las aberturas, ornamentación y estratificación de la pared del polen. Las posiciones en vistas ecuatorial y polar, deben ser similares a las indicadas en los palinogramas. El tamaño se representa por escalas dibujadas por proyección o 73

por fotomicrografías de la escala micrométrica con los mismos aumentos utilizados en la fotografía y ampliación de la foto del polen.

CLAVES DE IDENTIFICACIÓN Al igual que en las claves de otras evidencias taxonómicas, con base en los caracteres morfológicos del polen o de las esporas, tales como aberturas, estratificación y escultura de la pared, forma en vistas ecuatorial y polar, tamaño, etc., se pueden elaborar claves de identificación de taxones con base en la morfología polínica Las claves pueden ser paralelas o dentadas. Se construyen claves con dos alternativas contrastantes que conduzcan a la identificación de los granos de polen de un determinado taxón. Ejemplo:

Clave dentada para identificación palinológica de algunos géneros de Myrsinaceae: 1a. Granos de polen 3-(4-2)-colporados …………………………………………… 2 2a. Exina reticulada ……………………………………………………………. 3 3a. Báculas presentes en el interior del lúmen …………………….. Stylogyne 3b. Báculas ausentes en el interior del lúmen ………...……………………. 4 4a. Exina menor de 3 um de espesor, muros visibles con 500 a 800x de

aumento

……………………………………..…………….

Ardisia 4b. Exina mayor de 3 um de espesor, muros visibles con 250x de aumento ………………………………………..……….. Ctenardisia 2b. Exina psilada a granulosa-rugosa…………………………………………. 5 5a. Granos de polen con exina psilada, báculas infratectales tenuamente visibles con 2.500x de aumento …………………………………… Conomorpha Weigeltia 74

5b. Granos de polen con exina granulosa-rugsa, báculas infratectales nítidas con 2.500x de aumento …………………………………… Cybianthus 1b. Granos de polen 4-(5-3)-colpados o colporoidados ………………… Myrsine

Clave paralela para identificación palinológica de algunos géneros de Myrsinaceae: 1a. Granos de polen 3-(4-2)-colporados …………………………………………… 2 1b. Granos de polen 4-(5-3)-colpadoso o colporoidados ………………..……… Myrsine 2a. Exina reticulada ……………………………………..……………………….…. 3 2b. Exina psilada a granulosa –rugosa …………………..…………………………. 5 3a. Báculas presentes en el interior del lúmen ………….………………… Stylogyne 3b. Báculas ausentes en el interior del lúmen ……………...……………………….. 4 4a. Exina menor de 3 um de espesor, muros visibles con 500 a 800x de aumento ………………………………………………………………. Ardisia 4b. Exina mayor de 3 um de espesor, muros visibles con 250x de aumento ……………………..…………………………………….. Ctenardisia 5a. Granos de polen con exina psilada, báculas infratectales tenuamente visibles

con

2.500x

de

aumento…………………………

Conomorpha,

Weigeltia 5b. Granos de polen con exina granulosa-rugsa, báculas infratectales nítidas con 2.500x de aumento ……………………………………………… Cybianthus

75

Figura 1.33. Palinograma del género Ardisia Swartz. A y B: Cortes ópticos en vista ecuatorial. A: Polen prolato-esferoidal, resaltando la endoabertura (ós) lalongada y de extremidades redondeadas. B: Polen prolato, resaltando la endoabertura lalongada y de extremidades agudas. C: Polen en vista polar mostrando detalles de la escultura y del corte óptico de la exina. D: análisis LOOL en la región polar del grano. E - G: Granos de polen en vista polar. E: 3colporado. F: 4-colporado. G: 3-sincolporado. (Fonnegra, 1985).

76

Figura 1.34. Palinogramas de diferentes tipos polínicos. A a F: Vista ecuatorial de granos triaperturados. G a L: Vista polar de granos triaperturados. M a R: Vista polar de granos tetraaperturados. S: Tétrada tetrahedral. T: Vista distalipolar de un grano monosulcado. U: Vista ecuatorial en posición longitudinal de un grano monosulcado. V: Vista proximalipolar de una espora monolete. X: Vista ecuatorial en posición longitudinal de una espora monolete. Y: Vista proximal y polar de una espora trilete (Erdtman 1971).

77

PALINOTAXONOMÍA La diversidad de los caracteres morfológicos del polen y de las esporas, el mantenimiento de estos caracteres morfológicos dentro del mismo taxón y la facilidad de preparación del material polinífero para su estudio, hacen de la palinología una excelente evidencia taxonómica que debería ser más utilizada por taxónomos y sistematas, ya que en los taxones actuales, las diferencias y semejanzas del polen constituyen una metodología básica para diversos grupos, como también para determinar líneas de evolución y filogenia. Además son grandes contribuyentes de la botánica sistemática, sobre todo en casos en que para situar la planta en un taxón definitivo, fallan los caracteres más manifiestos de

los

órganos

tales

como

número,

morfología,

función,

importancia,

correlaciones y diferencias de estos. La importancia de la morfología del polen en la sistemática vegetal ha sido indicada por numerosos investigadores, entre los cuales se encuentran principalmente: Lindley J. (1830-1840), Fritzsche C.J. (1832, pg. 48), Mohl H. (1835), Fischer H. (1890), Selling O.H. (1946-1947), Cranwell L.M. (1952) y Erdtman G. (1952, 1957). Los datos palinólogos son de gran utilidad en todos los grupos taxonómicos, aún con el sólo uso del microscopio de luz, principalmente en las categorías de familia y género, ya que estos dos taxones presentan en su mayoría, semejanzas y diferencias en la estructura y forma del polen. Frecuentemente el género es el taxón básico de aplicación de la palinología. La mayoría de las veces no se encuentran diferencias significativas a nivel infragenérico, no obstante, se pueden encontrar caracteres diferentes aún en rangos infraespecíficos. Por otra parte, debe tenerse presente que a nivel de especie se mantiene constante el tipo polínico y sólo varía en función del ploidismo.

Al igual que la biología molecular, el número cromosómico o cualquier carácter morfológico, el polen no es la solución de un problema taxonómico, pero si puede contribuir con datos de importancia cuando otras evidencias dejan dudas.

78

Delimitación palinológica de taxones de categorías superiores. Las esporas de hongos, las de los briófitos y las de los pteridófitos presentan una abertura proximal (catatrema) trilete o monolete, que aparentemente falta en Equisetales y en muchas briofitas.

Las subclases Pinidae y Taxidae (gimnospermas) y Lilidae (monocotiledóneas) presentan granos de polen con una abertura distal (anatrema) que puede ser un sulco (o sea el doble de larga que ancha) o ulcerada (a sea el doble de ancha que larga). En Pinaceae y en Abietaceae (excepto en Larix) existen granos de polen bisacados, esto es, con dos sacos aéreos situados a ambos lados del polen, que se consideran adaptaciones para la dispersión anemófila. Los sacos aéreos o de flotación se forman por la separación de la ectexina y la endexina, lo cual determina que la zona distal del grano emerge entre los sacos laterales. En Cupressaceae no existen granos de polen bisacados.

Las aberturas proximales raramente se encuentran en los granos de polen de angiospermas. Por ejemplo en Annonaceae existe un área delgada parecida a un leptoma proximal o anasulcado, pero no se ha comprobado si funciona como una abertura; este tipo de abertura también se encuentra en monocotiledóneas como Amaryllidaceae, Arecaceae (Palmae) y Liliaceae entre otras y en algunas dicotiledóneas primitivas por ejemplo en Magnoliaceae y Myristicaceae. En varios géneros de Mimosaceae los granos de polen se encuentran en políadas con uno o varios poros proximales. Los granos de polen con más de una abertura se encuentran solamente en angiospermas. Sin embargo en la mayoría de las monocotiledóneas los granos de polen tienen una sola abertura distal.

Algunas familias vegetales son homogéneas naturales y por lo tanto fáciles de delimitar. Pero la mayoría son heterogéneas y algunas veces es necesario dividirlas en subgrupos. Para evitar excesivas divisiones, se designan como familias de posición sistemática desconocida. Es aquí cuando es aplicable la 79

morfología polínica para indicar los grupos inciertos y que deberían ser separados o agrupados.

Por ejemplo el género suramericano Abolboda puede ser retirado de Xyridaceae y puesto en una familia propia – Abolbodaceae - ya que sus granos de polen presentan morfología totalmente opuesta a los de Xyridaceae. En Abolboda el polen es esférico, inaperturado, exina delgada, equinada y en Xyridaceae el polen no es esférico, posee pequeñas aberturas, la exina es gruesa y sin espinas (Erdtman 1969).

Delimitación palinológica de taxones de categorías inferiores. La morfología polínica es de gran ayuda para la clasificación de género, indica relaciones entre géneros cercanos, posicionamiento de grupos de afinidad incierta, o sugerir reagrupamientos, separaciones o confirmar otras líneas de evidencias. Por ejemplo con base en el polen y el número de cromosomas, el género Polygonum fue dividido en siete géneros: Koenigia, Persicaria, Polygonum, Pleuropteropyrum, Bistorta, Tiniaria y Fagopyrum (Erdtman 1969).

Puede ser un poco complicada la determinación de especies con base en el polen, porque a nivel de este taxón los granos de polen presentan variaciones morfológicas casi inapreciables. Dicha variación obviamente tiene un origen citológico. Sin embargo, analizando el polen de varias especies de Hibiscus (Malvaceae, Figura 1.35), aunque son muy similares, presentan diferencias en cuanto al tipo y tamaño de las espinas y en la ornamentación superficial. Por ejemplo en Hibiscus rosa-sinensis el polen presenta espinas agudas que salen de una base. En Hibiscus schizopetalus, las espinas son romas (sin punta aguda, Figura 1.35 A) y en Hibiscus sabdariffa las espinas son de punta aguda (Figura 1.35 B). Shaheen N. et al. (2009) Estudiaron, usando microscopía óptica de luz y microscopía electrónica de barrido (SEM),

la morfología del polen y el grado de

variabilidad en 14 especies agrupadas en los géneros Abutilon Mill. y el género Hibiscus L. Concluyeron que ambos géneros son muy diferentes en cuanto a la 80

morfología de grano de polen. Prácticamente no hay similitud entre los granos de polen del tipo Abutilon y el tipo Hibiscus. La morfología y tamaño del polen también varía entre las diferentes especies de los dos géneros.

A

B

Figura 1.35. Varias especies de Hibiscus (Malvaceae). A: Hibiscus schizopetalus (Dyer) Hook.f. B: Hibiscus sabdariffa L. En organismos híbridos el polen se vuelve heterogéneo o polimorfo, aun dentro de una misma antera. Muchas veces se degenera y toma formas bizarras o anormales (Figura 1.35).

Figura 1.36. Granos de polen en híbridos.

Delimitacion

palinológica

de

la

filogenia.

Con

base

en

estudios

paleopalinológicos, la morfología del polen puede ser usada para determinar si un grupo es más primitivo o más avanzado que otro. Por ejemplo a las esporas de briofitas y a las de algunas pteridófitos, que tienen una sola abertura proximal, se 81

les considera más primitivas que a los granos de polen que generalmente presentan más de una abertura. Las esporas con aberturas triletes (trifurcadas) son más primitivas que las esporas con aberturas simples, ya que estas últimas no se han encontrado en estratos más antiguos que el Devónico.

Los granos de polen inaperturados son considerados más primitivos que los aperturados, que son característicos de la mayoría de los grupos de las angiospermas. Los granos de polen con aberturas proximales son las más primitivos entre los aperturados, seguidos de los con aberturas ecuatoriales y los con aberturas esparcidas por toda la superficie del grano, considerados como los más avanzados.

La evolución en la estructura y ornamentación de la esporodermis está relacionada con adaptaciones para la polinización. Las plantas con polinización anemófila generalmente presentan granos de polen psilados, secos y pequeños. Las plantas con polinización entomófila presentan granos de polen con exina ornamentada.

Referente al tectum, Walker (1974) con base en estudios polínicos del complejo Ranales, determinó que la secuencia evolutiva podría ser: polen tectado imperforado - polen tectado perforado – polen semitectado – polen intectado.

En cuanto al tamaño parece ser que el tipo más primitivo es el polen muy pequeño a pequeño (hasta 25 um). BIBLIOGRAFÍA MORFOLOGÍA Aguilar S. C. I. 1995. Contribução à palinotaxonomia de Burseraceae. Tese para obtenção do Título de Doutor em Ciências. São Paulo, Universidade de São Paulo, Instituto de Biociências. 176 pp. 82

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87

MORFOLOGÍA DE LAS ESPORAS

Las esporas son las células de propagación de los organismos agrupados en el Reino Monera: bacterias, cianobacterias y algas unicelulares; de los organismos denominados Protistas; de los hongos (Reino Fungi) y de los organismos actualmente conocidos como plantas criptógamas o inferiores: Briófitos (hepáticas,

antocerotes

y

musgos)

y

Pteridófitos

(helechos

y

grupos

relacionados). En los hongos las esporas pueden ser pluricelulares y en las criptógamas son unicelulares. En las plantas inferiores se originan en el esporofito y, como el polen, presentan diversidad en forma, tamaño, estructura y ornamentación de la pared y demás caracteres morfológicos.

LAS ESPORAS DE LOS HONGOS Ramiro Fonnegra Gómez Melissa Palacio Pulgarín Andrea Carolina Henao Sepúlveda

El Reino FUNGI, reino de los hongos, comprende un grupo de organismos muy diversos en cuanto a morfología, fisiología, ciclos vitales y distribución ecológica. Históricamente los hongos han sido incluidos dentro de la botánica, pero los estudios contemporáneos, indican que los miembros del Reino Fungi están más relacionados con los animales que con las plantas. Al parecer los hongos no tienen ninguna relación evolutiva con los vegetales, como se creyó por mucho tiempo, antes del desarrollo de los análisis moleculares de ADN, ARN y su aplicación en la dilucidación de la filogenia (Blackwell M. & Spatafora J.W. 2015). Sin embargo los hongos comparten características comunes a plantas y a animales. Como las plantas tienen pared celular (pero no de celulosa sino de quitina), poseen vacuolas, absorben nutrientes del sustrato y son inmóviles (en el 88

sentido estricto de la palabra). Se asemejan a los animales porque no realizan fotosíntesis, son heterótrofos y poseen quitina. En la forma de nutrición se diferencian de los animales, ya que estos últimos requieren ingerir los nutrientes, mientras que los hongos los absorben del sustrato. No obstante, los estudios filogenéticos indican que los hongos forman parte de un reino separado del de los animales y de las plantas.

Los

hongos

y

las

bacterias

heterótrofas,

desempeñan

la

función

de

descomponedores. Se calcula que existen 5 toneladas de hongos y bacterias por hectárea en los primeros 20 centímetros de la capa superficial del suelo fértil. Los hongos están dispersos en una amplia variedad de habitats, se les encuentra en agua dulce, agua salada, suelo, hojarasca, organismos vivos, organismos en descomposición, excrementos, entre otros. Se desarrollan prácticamente en todos los medios ya sean naturales o artificiales: alimentos hechos por los humanos, cartones, ceras, combustibles, cueros, lentes de instrumentos ópticos, películas fotográficas, pinturas, plásticos, ropas, vidrio, etcétera. Algunos grupos de hongos pueden crecer a temperaturas de – 6 ºC y otros a más de 50 ºC. Según Blackwell M. & Spatafora J.W. (2015), Hawksworth (1951) calcula que en el mundo pueden existir cerca de 1,500.000 (un millón quinientas mil) especies de hongos, pero también reporta que según datos de Kirk et al. (2001), para el año 2001 únicamente existían descripciones para 64.657 especies de hongos, o sea que no se había llegado a la descripción de las 65.000 especies. En su gran mayoría los hongos son muy pequeños, formados de una célula uninucleada, por ejemplo en las levaduras, o estar formados por varias células alargadas bi o multinucleadas. Los hongos pluricelulares tienen crecimiento filamentoso o alargado, ya que las células se unen en cadena formando filamentos que se conocen con el nombre de hifas. La hifa es la unidad estructural básica de la mayoría de los hongos. Al conjunto de hifas se le denomina micelio, que es el cuerpo vegetativo del hongo. Las hifas algunas veces forman rizoides que fijan al hongo al sustrato. 89

La reproducción de los hongos puede ser sexual o asexual. La reproducción sexual es la más común y se realiza mediante esporas, con caracteres sexuales diferenciados, aunque morfológicamente iguales. En ambientes óptimos para su desarrollo, el micelio da origen a los cuerpos fructíferos, llamados carpóforos o esporocarpos. En los cuerpos fructíferos se originan las esporas. En los Basidiomycetes, los esporocarpos reciben el nombre de basidiocarpos y ascocarpos en los Ascomycetes.

Las estructuras reproductivas de los hongos están separadas de las hifas por septos completos y reciben el nombre de gametangios si directamente producen gametos, o de esporangios (como en los zigomicetes), o células condiógenas (por ejemplo en ascomicetes y basidiomicetes) si producen esporas asexuadas. Los gametos son de igual tamaño por lo cual reciben el nombre de isógamos.

Muchos hongos producen algún tipo de esporas que en su gran mayoría son dispersadas por el viento. Algunas esporas son muy pequeñas (5 µm de diámetro, muy pocas son de menor diámetro), pueden permanecer en el aire durante largos períodos de tiempo y de esta forma son transportadas por el viento a largas distancias y grandes alturas. Otras esporas son dispersadas adheridas al cuerpo de insectos, aves y prácticamente todo tipo de animales. Estos diferentes mecanismos de dispersión hacen que los hongos tengan una distribución tan amplia. Los hongos presentan una alta diversidad en las esporas, las cuales varían en forma, tamaño, ornamentación y colores, entre otros caracteres.

Con los trabajos realizados hasta el presente en esporas de hongos, es muy difícil establecer sus líneas evolutivas, relaciones filogenéticas o caracterizaciones de grupos, por lo cual se necesita hacer muchísimos estudios interdisciplinarios para intentar aclarar su problemática taxonómica y sistemática. Sin embargo las esporas de algunos grupos presentan una morfología más o menos característica.

90

En el reino Fungi se reconocen cuatro filos (phylla): Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota (Blackwell M. & Spatafora J.W., 2015), caracterizados porque en su ciclo vital presentan una fase sexual llamada teleomorfo y una fase asexual denominada anamorfo. La mayoría de los hongos de Ascomycota y Basidiomycota tienen estructuras reproductivas macroscópicas, observables a simple vista y reciben el nombre de macromicetes. Ascomycota y Basidiomycota son los filos más grandes del reino y juntos comprenden más de 95% de todos los taxones conocidos como hongos (Blackwell M. & Spatafora J.W., 2015). Algunos autores reconocen un quinto phyllum: Deuteromycota, no aceptado por otros autores, porque solo se les conoce la fase asexual.

PHYLLUM CHYTRIDIOMYCOTA (QUITRIDIOMICETES) Los hongos que pertenecen a este filo se caracterizan por la presencia de un flagelo. Son hongos saprofitos o parásitos, acuáticos o terrestres, muy pocos crecen en aguas saladas, viven en materia orgánica en descomposición, algunos crecen en el tracto digestivo de animales herbívoros, donde descomponen material vegetal consumido por estos animales. Son hongos muy primitivos. La pared celular está formada de quitina y Betaglucanos. Son unicelulares, algunas veces presentan micelio rudimentario, con hifas no septadas. En la reproducción sexual se fusionan dos esporas o gametos móviles llamados zoosporas, o por la fusión de una zoospora con una espora sin movimiento denominada oospora.

PHYLLUM ZYGOMYCOTA (ZIGOMICETES)

Los zigomicetes son hongos definidos por la presencia de zoosporas, conocidas como zygosporas, y la ausencia de un flagelo. Generalmente viven en el suelo sobre materia en descomposición, otros son parásitos de organismos vegetales o animales, raramente causan enfermedades graves al hombre o a sus animales domésticos. Un ejemplo muy conocido es Rhizopus stolonifer (moho negro del pan) que forma masas algodonosas sobre los alimentos viejos y húmedos ricos en carbohidratos y sobre frutos y legumbres almacenados. Se calcula que este taxón comprende más de 1.000 especies (Blackwell M. & Spatafora J.W., 2015).

91

Los zigomicetes son hongos filamentosos, con hifas no septadas, multinucleadas (pluricelulares), llamadas hifas coenocíticas (cenocíticas). El conjunto de hifas forman el micelio. Las hifas que están dentro del sustrato, forman hifas arqueadas denominadas estolones, en las cuales se desarrollan los rizoides, que tienen las funciones de fijar el hongo al sustrato y la absorción de nutrientes. Por encima de los rizoides se originan los esporangióforos, que son los portadores de los esporangios llamados zigosporangios, los cuales se forman en sus extremos después de la fusión de dos gametangios multinucleados. El zigosporangio da origen a los gametos (núcleos haploides), estos se fusionan y originan núcleos diploides llamados zigotos. En la reproducción sexual, dos hifas compatibles se unen y dan origen a una espora inmóvil, de pared muy gruesa y ornamentada, llamada zigospora (Figura 1.37).

Figura 1.37. Reproducción sexual en el moho del pan Rhizopus stolonifer. A: Zigospora madura. B: Germinación de la zigospora (Wilson & Loomis 1968). Existe un Clado denominado Glomeromycota (Blackwell M. & Spatafora J.W., 2015) que comprende los hongos con hábito micorriza-arbuscular, asociados aproximadamente con el 80% de las especies de plantas del mundo. Este grupo de hongos tiene esporas de gran tamaño (por ejemplo la especie Gigaspora albida tiene esporas de 370 μm de diámetro). El clado Glomeromycota es generalmente situado dentro del phyllum Zygomycota, aunque para algunos autores representa un quinto phyllum. 92

PHYLLUM ASCOMYCOTA (ASCOMICETES) Es el phyllum más grande del reino Fungi con aproximadamente 32.000 especies. Algunas de esas especies tienen gran impacto sobre los humanos como: alimento, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae (una levadura); en medicina, por ejemplo Penicillium chrysogenum, fuente de la penicilina; otros que causan enfermedades por ejemplo, Pneumocystis jiroveci, un agente de la neumonía el género Neurospora, moho asalmonado del pan y muchos grupos patógenos de vegetales o descomponedores de artículos fabricados, alimentos y otros organismos (Blackwell M. & Spatafora J.W., 2015). Los ascomicetes son hongos filamentosos cuando se están desarrollando (excepto las levaduras que son unicelulares). Presentan hifas septadas, o sea divididas por paredes transversales perforadas. El micelio puede presentar hifas uninucleadas o plurinucleadas.

La reproducción asexual se realiza por esporas llamadas conidios, palabra griega que significa “polvo muy fino”. Los conidios se forman en los extremos de los conidióforos. La reproducción sexual ocurre mediante la formación de estructuras complejas, semejantes a bolsas de diferentes formas, denominadas ascas o ascocarpos (Figura 1.38). Muchos grupos tienen ascocarpos macroscópicos. La superficie en la cual se desarrollan las ascas, corresponde a la superficie fértil llamada himenóforo. El ascocarpo presenta mucha diversidad morfológica, por ejemplo cuando tiene forma de disco, copa o cojín y el himenóforo está expuesto, se denomina apotecio. En el interior de las ascas se originan las ascosporas haploides. La ascospora (gr. askós, saco, asco + sporá, espora), es la espora sexual haploide de los ascomicetes. Se forma en el interior de un asca, usualmente como resultado de meiosis, en número de ocho o múltiplo de ocho.

93

Figura 1.38. A: Ascocarpo de Erysiphe aggregata mostrando ascas y ascosporas en su interior. B: Detalle bajo microscopio electrónico de transmisión de ascas de Ascodesmis nigricans con ascosporas en maduración. C y D: Detalle de ascas con ascosporas (Raven 1991). PHYLLUM BASIDIOMYCOTA (BASIDIOMICETES) Es el segundo filum más grande del reino Fungi, con aproximadamente 23.000 especies (Blackwell M. & Spatafora J.W., 2015). Comprende la mayoría de los hongos macroscópicos conocidos popularmente con el nombre de “hongos”, por ejemplo los champiñones, las setas venenosas, falos hediondos, las royas, carbones, entre muchos otros. El micelio está formado por hifas binucleadas, septadas. Los basidiomicetos forman basidios que son unas estructuras microscópicas en forma de clavas, en cuya superficies exterior se originana las basidiosporas (Figura 1.39 y 1.40). La basidiospora (gr. basídion, dim. de básis, base + spora, espora), es la espora sexual típica de los basidiomicetes, formada en la parte externa de un basidio, en número de 1, 2 o 4. Las basidiosporas son haploides y se forman individual y acrógenamente sobre los esterigmas de los basidios, como resultado de la cariogamia y la meiosis. Al germinar producen micelio primario, el cual forma los micelios secundario y terciario, y de este último se originan los cuerpos fructíferos productores de basidios, generalmente en grupos de cuatro. Las basidiosporas son el principal medio de reproducción.

94

Figura 1.39. Partes de una basidiospora. A. Basidio. B. Esterigma. C. Apículo o apéndice hilar. D. Base o extremo proximal. E. Poro apical o germinativo. F. Ápice distal o extremo distal. Largent et al. (1977).

Figura 1.40. Esporas con poro germinativo y con apícula o apéndice hilar (http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20las%20preparaciones.html). La pared celular de las esporas de los basidiomicetes está formada por las siguientes capas o tegumentos de afuera hacia adentro: ectosporio, perisporio, exosporio, episporio y endosporio (Figura 1.41 E y 1.42). La membrana citoplasmática generalmente está ausente. Esta estratificación es muy difícil de observar en la mayoría de los hongos. El ectosporio se desintegra en las esporas maduras e inmediatamente el exosporio cambia bruscamente en su estructura, se quiebra y forma una ornamentación típica para cada especie: rugosa, verrucosa, equinada, sulcada, etcétera, o combinaciones de las anteriores ornamentaciones. 95

Figura 1.41. A a C: Formación y liberación de las basidiosporas. D: Diagrama del extremo de un basidio con basidiosporas verrucosas, cada una sobre su respectivo esterigma (Raven 1991). E: Estructura de la pared de la espora de un homobasidiomiceto (Saenz 1978).

Figura 1.42. Estructura de la esporodermis de una basidiospora. A. Estructura de la esporodermis de la espora. B. Detalle de la estructura de la esporodermis de una espora de Astraeus hygrometricus. Abreviaciones: Ec. Ectosporio. p. Perisporio. Ex. Exosporio. Ep. Episporio. En. Endosporio. m. Membrana citplasmática. Et. Esclerosporio transparente. Eo. Esclerosporio opaco (Saenz 1978). Las basidiosporas en el orden polyporales son consideradas un carácter importante para su clasificación taxonómica. La forma de las esporas varía desde esporas

cilíndricas

simples,

alantoides,

lunadas

elipsoides,

globosas

a

subglobosas. La mayoría de las basidiosporas en los polyporales son lisas y de paredes delgadas, pero en algunos géneros existen esporas con ornamentaciones como espinas, estrías o verrugas pequeñas (Ryvarden & Gilbertson, 1993). Por 96

ejemplo en el género Ganoderma (Karst), las esporas tienen doble pared, la pared interna es ornamentada y engrosada con unos pilares que separan el endosporio y la pared externa la cual es más delgada y generalmente hialina. Basidioporas elipsoides con un ápice truncado y un poro germinal apical. Generalmente de 7 a 20 µm de longitud (Ryvarden, 1998). Por ejemplo en la especie Ganoderma lucidum (W. Curt.:Fr) Kart., las esporas se caracterizan por: Tamaño: 9 – 13 µm de longitud × 6 – 9 µm de diámetro en la parte más ancha. Forma: esporas elipsoides, con un ápice truncado. Ornamentación: esporas de doble pared, con un endosporio ornamentado con pilares que separan las paredes, de color amarillo-dorado, el exosporio es más delgado y hialino. Esporas sin reacción en reactivo de Melzer. Material estudiado: Ganoderma lucidum (W. Curt.:Fr) Kart. COLOMBIA, Cesar, Valledupar, Ecoparque Los Besotes, Bosque Seco Tropical (Bs-T), 4 de julio de 2012. Melissa Palacio, MP # 54.

Fotomicrografía de esporas Ganoderma lucidum (MP #54) En el género Humphreya (Steyaert), se presentan esporas grandes que van desde 10 a 35 µm de longitud, con ápices truncados, ornamentadas con una retícula en forma de crestas, y el exosporio es hialino y delgado (Ryvarden, 1998). Por ejemplo en la especie Humphreya coffeatum (Berk.) Stey, las esporas se caracterizan por: Tamaño: 10 – 12 µm de longitud × 6 – 8 µm de diámetro en la parte más ancha. Forma: esporas con ápice truncado y elipsoides. Ornamentación: Basidiosporas de doble pared, truncadas, pared externa muy delgada y hialina, pared interna con pilares de hasta 1 µm de longitud formando 97

una ornamentación a manera de crestas. Esporas sin reacción en reactivo de Melzer. Material estudiado: Humphreya coffeatum (Berk.) Stey. COLOMBIA, Cesar, Valledupar, Ecoparque Los Besotes, Bosque Seco Tropical (Bs-T), 4 de julio de 2012. Melissa Palacio, MP #60.

Fotomicrografía de de Humphreya coffeatum El género Phellinus (Quél), presenta basidiosporas globosas a cilíndricas, lisas, hialinas a café oscuro, con pared delgada a engrosada, dextrinoides a no dextrinoides en reactivo de Melzer (Ryvarden, 1998). Por ejemplo en la especie Phellinus sp1., las esporas se caracterizan por: Tamaño: 4 µm de longitud × 3 – 4 µm de diámetro. Forma: cilíndricas, de pared delgada, presenta una vacuola refractiva de gran tamaño, ocupando un gran porcentaje de la espora. Ornamentación: aparentemente esporas lisas, de pared simple, de color amarillonaranja. Esporas sin reacción en reactivo de Melzer.

Fotomicrografía Phellinus sp1

de

Material estudiado: Phellinus sp. COLOMBIA, Cesar, Valledupar, Ecoparque Los Besotes, Bosque Seco Tropical (BsT), 6 de julio de 2012. Melissa Palacio, MP # 72. 98

En la especie Phellinus sp2., las esporas se caracterizan por: Tamaño: 5 – 6 µm de longitud × 3 – 4 µm de diámetro. Forma: cilíndrica. Ornamentación: esporas de pared simple y lisa, hialinas. Esporas sin reacción en reactivo de Melzer. Material estudiado: Phellinus sp. COLOMBIA, Cesar, Valledupar, Ecoparque Los Besotes, Bosque Seco Tropical (Bs-T), 20 de marzo de 2012. Melissa Palacio. MP # 29.

Fotomicrografías de Phellinus sp2

MORFOLOGÍA GENERAL DE LAS ESPORAS DE HONGOS Los caracteres microscópicos de las esporas son muy importantes para la identificación taxonómica de los hongos. En 1821, Elias Fries, al igual que muchos investigadores anteriores, enfatizó sobre la importancia del color de las esporas. Generalmente la forma de las esporas de los hongos es más o menos globosa o esférica, pero las esporas presentan una amplia diversidad en forma, simetría, ornamentación y tamaño. Pueden ser elípticas, esféricas, globosas, ovales hasta alargadas (cilíndricas, filiformes, vermiformes), con ramificaciones, estrelladas, helicoidales, poligonales, romboidales entre muchas otras formas.

La pared

puede ser lisa, o tener ornamentación rugosa, verrucosa, equinada (con espinas), reticulada, con surcos o con crestas, gránulos, perforaciones, entre otros tipos de ornamentación, cualquier tipo de esporas puede tener apéndices de diferentes formas y estructuras. El tamaño de las esporas de los hongos generalmente varía entre 5 y 12 µm de diámetro; en ascomicetes puede llegar a medir hasta 20 µm de 99

diámetro y en otros grupos el diámetro puede ser inferior a 5 µm. Gigaspora albida presenta esporas de 370 μm de diámetro.

Debido a esta gran variabilidad y al rápido desarrollo de los estudios microscópicos sobre las esporas de hongos, ha surgido una proliferación de términos usados para describir la morfología de las esporas sin que exista consenso entre los diferentes investigadores. Para la descripción morfológica de los granos de polen y esporas de pteridofitas, gracias al alcance de trabajos publicados, entre los que se resalta el elaborado por Punt & otros (2007), se ha logrado brindar cierta estabilidad a la terminología palinológica, la que en un tiempo no muy lejano resultaba complicada, poco definida y sujeta a confusiones. De tal forma que actualmente existe mayor consistencia en la caracterización y abordaje de la temática palinológica en el ámbito mundial, por lo cual en este capítulo se presenta una adaptación de la terminología usada para la caracterización de los granos de polen y esporas, para ser usada para la descripción morfológica de las esporas de los hongos.

En la morfología de las esporas de los hongos se deben tener en cuenta los siguientes caracteres: 1.

Color de la esporada

2.

Reacciones químicas

3.

Simetría

4.

Ornamentación

5.

Forma

6.

Tamaño de las esporas

7.

Otros caracteres morfológicos

COLOR DE LA ESPORADA La esporada es la masa de esporas obtenida a partir de la deposición de las esporas desde el himenio en un papel blanco (Figura 1.43). Se requiere que el 100

hongo esté fresco. Permite determinar los taxones a nivel de familia y en algunos casos género o especie.

A

B

Figura 1.43. Color de la esporada. A. Método para obtener la esporada. B. Colores de esporadas. (http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20las%20preparaciones.html) REACCIONES QUÍMICAS Para los estudios sobre micología los reactivos son clasificados en dos grandes grupos: 1) microquímicos, se refiere a reactivos preparados utilizados para testar determinadas características de las setas apreciables solamente con el uso de microscopio óptico de luz, por ejemplo el reactivo de Meltzer, que aplicado a una preparación de esporas en portaobjetos permite diferenciar las esporas por el color que toman con este reactivo. 2) macroquímicos, se refiere a reactivos preparados, o no, que al ser utilizados dan una reacción apreciable a simple vista. Algunas esporas y estructuras de hongos reaccionan presentando una determinada coloración cuando son sometidas a un reactivo químico. Son varios los reactivos utilizados en taxonomía de hongos para observar su reacción con los componentes químicos de las paredes de las esporas o tejidos, según el color que toman, especialmente las paredes de ciertas basidiosporas, y en algunos casos hifas u otros tejidos. Una reacción es negativa cuando no se aprecia ningún cambio de color al añadir el reactivo, el color que observamos es el color propio 101

del reactivo. Una reacción es positiva a un reactivo cuando el color original de la espora o tejido cambia al aplicarle un reactivo.

Las reacciones pueden ser inmediatas, rápidas (varios segundos) o lentas (varios minutos). Se dice que una reacción es negativa a un reactivo, cuando no se aprecia ningún cambio de color al añadir el reactivo, o el color que se observa es el color propio del reactivo. Una reacción es positiva a un reactivo, cuando el color original de la estructura cambia al aplicar el reactivo. Un reactivo que da un test positivo no da siempre al mismo color. Por ejemplo, puede ser positivo en un hongo y dar coloración roja y en otro ser positivo pero da coloración verde.

Reactivos utilizados para colorear esporas. De manera resumida se presenta una relación de algunos químicos y reactivos químicos utilizados para teñir o producir coloraciones mediante reacciones químicas en los micropreparados cuando se pretende la identificación de los caracteres de las esporas para el reconocimiento de géneros o especies de hongos, como con cualquier producto químico se debe tener mucha precaución al usarlos, aunque hay que perder el miedo a los reactivos, tampoco se pueden manipular hasta el punto de verlos como inocuos. Hay que tener un mínimo conocimiento sobre los reactivos que manipulamos. Muchos de ellos son tóxicos y corrosivos y se utilizan muy concentrados por lo cual es necesario ser cuidadoso en el manejo, evitando el contacto de los reactivos con nuestra piel o la ropa López-Alcuten F. (2006). Entre los reactivos frecuentemente utilizados para los estudios sobre hongos se encuentran: Acetocarmín. Usado en basidios de ciertos agáricos, por ejemplo en especies de Lyophyllurn, que contienen partículas largas, las cuales con acetocarmín toman un color púrpura negruzco a violeta negro. Estos basidios son llamados Siderófilos, en algunos textos son denominados Carminófilos. También es usado para teñir basidios, por ejemplo en los géneros Calocybe y Tephrocybe.

Ácido láctico. Observación de la ornamentación de las esporas de Ascomicetos.

102

Ácido sulfúrico. Concentrado o diluido. Las esporas toman un color de marrón a violeta. Ejemplo en los géneros Coprinus y Psathyrellas.

Amoníaco. Se usa diluido o concentrado. Diluido produce intensificación del color de ciertas esporas y concentrado puede disolver las ornamentaciones de tipo verrucoso.

Azul de algodón (Cotton Blue, solución de Amman). Según el color que toman con azul de algodón, las esporas pueden ser: 1.

Cianófilas o Cianofílicas. La espora se tiñe de azul (reacción positiva. Figura 1.44). En algunos taxones se tiñen diferencialmente la ornamentación de la pared y su interior. En estas esporas la ornamentación de la pared colorea más fuertemente que el resto, el cual tiñe ligeramente. Por ejemplo en algunas especies de los géneros Lepista y Gomphus.

2.

Acianofílicas. Si no se tiñe de azul (reacción negativa).

Figura 1.44. Esporas Cianofílicas (http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20las%20preparaciones.html) Azul de Cresyl (Cresyl Blue). Según el color que toman con azul de Cresyl, las esporas pueden ser: 1. Metacromáticas. Si las paredes internas de la espora tiñen toman un color rojizo a violeta (reacción positiva), por ejemplo en los géneros 103

Leucoagaricus, Leucocoprinus y Macrolepiota y la ornamentación de las esporas de ciertas especies de Russula. 2. No metacromáticas. Si no se tiñen (reacción negativa). Eritrosina (Palmer 1955). Se usa para obtener un fondo para estructuras hialinas que no tiñen, tales como el exosporio de ciertas esporas.

Hidróxido de amonio (NH4OH). Esta solución es utilizada como un medio en el cual se colocan secciones de material seco después de ser impregnadas con etanol. En esta solución, las células toman casi su tamaño y forma originales. Además el Hidróxido de Amonio es un buen medio para observar la ornamentación de las esporas y su estructura interna. El color de la espora se puede modificar cuando se utiliza esta solución, por ejemplo, las esporas de las especies de la familia Bolbitiaceae toman un color exageradamente oscuro.

Reactivo de Melzer. Es un reactivo a base de yodo, utilizado para estudiar basidios, ascas, hifas y esporas. Permite diferenciar las esporas por la coloración que toman: La reacción puede ser Melzer positiva, si cambia de color o Melzer negativa si no cambia de color. Las esporas pueden ser: 1.

Amiloides. Del griego ámylon, almidón, y sufijo –oide, de oeídes, semejante. Tiñen de azul con el reactivo de Melzer por contener sustancias amiláceas (Melzer positivas). La coloración puede variar de gris oscuro a azul oscuro, más o menos intenso, a veces sobre la totalidad de la espora y mayoritariamente sobre las rugosidades u ornamentaciones de las esporas (Figura 1.45 A). Algunos ejemplos de reacción amiloide positiva se da en las esporas de algunas especies del género Cystoderma, ornamentación en esporas de Russula y Lactarius. Esta reacción es difícil de constatar, ya que su intensidad no siempre es la misma y se puede ver reducida notablemente, como es el caso de las amanitas, por ejemplo en Amanita citrina, da reacción positiva, mientras que son no amiloides en Amanita muscaria.

104

2.

Inamiloide: Basidiosporas que no reaccionan con el reactivo de Melzer (Melzer negativa), por lo tanto se observan con el color natural del reactivo (amarillo) o hialinas.

3.

Dextrinoide. Del latín dextra, derecha. Debido a que desvía el plano de luz polarizada hacia la derecha, y –oide, del griego –oeídes, semejante. Aplica en basidiosporas que con el reactivo de Melzer, toman un color rojizo o caférojizo (Melzer positivas). También se les llama pseudoamiloides o falsamente

amiloides

(Figura

1.45

B).

Ejemplos

de

reacciones

pseudoamiloides son las esporas en el género Hygrophoropsis o en Paxillus panuoides.

A

B

Figura 1.45. Coloración tomada por las esporas de hongos con el reactivo de Melzer. A. Esporas Amiloides. B. Esporas Dextrinoides. (http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20las%20preparaciones.html) Rojo congo. Diluido y amoniacal. Utilizado habitualmente para la mayoría de las tinciones, especialmente para ascas, hifas, basidios y cistidios, menos indicado para esporas, aunque colorea zonas internas de las esporas (endospora).

SIMETRÍA La espora presenta simetría radial si tiene varios planos que la dividen en dos partes iguales, simetría bilateral, cuando presentan solo un plano de simetría y es asimétrica si ningún plano la divide en dos mitades iguales. 105

A

B

C

Figura 1.46. A. Esporas de simetría radial, en Cyathus lesueurii. B. Esporas de simetría bilateral, en Calostoma cinnabaria. C. Esporas asimétricas, en Coprinus silvatious (Largent et al. 1977). ORNAMENTACIÓN La ornamentación de las esporas de los hongos es difícil de determinarla exactamente bajo el microscopio óptico de luz. La observación de la ornamentación depende, en mayor o menor grado, de la resolución del microscopio, del medio de montaje de las esporas y de que la ornamentación sea bastante marcada, entre otros factores. En el caso que se detecte ornamentación mediante reacciones químicas, cuando la resolución es mala, la tonalidad discontinua indica la presencia de ornamentación.

En las esporas de los hongos, prácticamente se dan todos los tipos de ornamentación del grano de polen (Figura 1.46): Psilada (Lisa). Sin ornamentación. No presenta elementos esculturales. Acostillada. Con crestas. Aculeada. Con espinas muy agudas en el ápice. Alada. Con crestas muy grandes parecidas a alas. 106

Alveolada. Ahondada, cavada. Con hoyos o depresiones profundas llamadas alvéolos. Arrugada. Con pliegues, abundantes y cercanos entre ellos. Asperulada. Esporas con superficie áspera dada por la presencia de puntas muy pequeñas y finas. Baculada. Con báculo, elemento escultural no puntiagudo, más alto que ancho, en forma de bastón, base no constricta. Caliptrada. Cuando el perisporio forma una bolsa o envoltura que cubre parcialmente la espora. Clavada, Claviforme. En forma de clava o mazo. Con clava, elemento escultural no puntiagudo, mas alto que ancho, en forma de mazo, o sea con la parte superior más ancho que la base, la cual es constricta. Costada. Con crestas normalmente de 1 µm o más. Equinada. Con espinas, elemento escultural puntiagudo, más alto que ancho. Cuando la espina es muy corta con relación al tamaño de la espora, recibe el nombre de espínula (espora equinulada). Equinulada. Con espinas cortas y frágiles. Escabrida o escabrada. Cuando presenta proyecciones en forma de diminutas escamas. Esteliforme. Protuberancias tan grandes que la forma de la espora se asemeja a una estrella. Estriada. Con hendiduras o estrías laterales más o menos paralelas. Gemada. Con gemas, elementos esculturales no puntiagudos, cortos o globulosos, cuya anchura es igual o mayor que la altura y son de base constricta. Lacunosa (fenestrada). Espora con baches rodeados por crestas. Nodulosa. Ornamentaciones con protuberancias muy grandes, de punta roma y base ancha. Reticulada. En forma de retículo, o sea con pliegues que se entrecruzan como una red o maya.

107

Rugosa, Rugulada, Rugulosa. Con salientes laterales irregulares, dos veces más largas que anchas. Con pliegues muy finos, abundantes y fácilmente diferenciables. Tuberculada. Con protuberancias conspicuas, aproximadamente de 1µm, con ápices redondeados. Con abultamientos similares a tubérculos. Utriculada. Cuando el perisporio forma una bolsa o envoltura que rodea totalmente la espora. Verrucosa o verrugosa. Con verrugas, elemento escultural no puntiagudo, de ancho igual o mayor que la altura, base no constricta. Verruculosas. Superficies ásperas, con protuberancias moderadas en tamaño.

Figura 1.47. Algunos tipos de ornamentación de las esporas de hongos. A: Punteada. B y C: Verrucosa o verrugosa. D y E: Equinada. F: Falsamente equinulada. G y H: Reticulada. I: Lacunosa. J: Estriada. K: Costada. L: Acostillada. M: Psilada. N: Caliptrada. O: Utriculada. (A, B, D, F, H, I, y K a O según Largent et al. 1977. C, E, G y J según Saenz 1978). 108

TAMAÑO El tamaño de las esporas generalmente permanece constante dentro de la misma especie, pero puede ser afectado por el método de preparación u otros factores externos, llegando a ser un carácter inestable.

En las esporas para hacer las medidas se debe tener en cuenta: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Eje mayor (L). Es la distancia desde el ápice hasta la base de la espora El espesor de la pared El espesor de las capas de la pared, si se observan La altura y las dimensiones de las proyecciones cuando existen (báculas, clavas, espinas, espínulas, gemas, entre otros). El diámetro cuando la espora es globular, esférica o subesférica La longitud desde el ápice hasta la base de la espora, cuando es alargada Altura (medida perpendicular a la superficie de la pared) Dimensiones de los elementos esculturales

FORMA Aunque puede variar aun dentro de un mismo género, la forma es un carácter importante para el diagnóstico de un grupo, ya que es más o menos constante para un determinado taxón. Para determinar la morfología de las esporas se debe indicar si la forma es en vista lateral o en vista frontal, esto es, debe tenerse en cuenta su posición de acuerdo al plano óptico, no es lo mismo observarla lateralmente que frontalmente, las esporas de una misma especie pueden presentar una forma en vista lateral y otra en vista frontal (observadas de lado, vista lateral o de perfil dorsi-ventral).

En vista lateral las esporas muestran un lado cóncavo que corresponde al eje dorsal o adaxial (dirigido hacia el eje imaginario del basidio), el lado opuesto es convexo y corresponde al eje abaxial (dirigido hacia afuera del eje imaginario del basidio). El lado opuesto de la inserción de la espora al basidio se denomina ápice o lado distal y el lado adyacente es llamado base o lado proximal. En una espora asimétrica el lado adaxial se distingue el borde o arista interna de la pared y en el externo se ve a menudo el poro germinativo, y en la base se observa la 109

apícula o apéndice hilar. Observadas de cara (vista frontal) se pueden apreciar las formas del contorno de las esporas.

En términos generales la forma de las esporas de los hongos es básicamente esférica o globosa, pero existe un rango de formas de las esporas según la relación entre el eje mayor (L) y el eje menor (W), extrapolando la definición de formas para los granos de polen, se podría determinar la forma según el Índice Q = L/W, Índice P/E para la forma del grano de polen), cuando se observan en vista lateral o en vista frontal (Figura 1.47). Según este índice algunas de las formas más frecuentes son:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Peroblata. Q < 0,50 Oblata (Subesférica o Hemiesférica). Q = 0,50 – 0,75 Suboblata. Q = 0,75 – 0,88 Oblataesferoidal. Q = 0,88 – 1,00 Esferoidal (Globular o globosa). Q = 1,00 Prolataesferoidal. Q = 1,00 – 1,14 Subprolata. Q = 1,14 – 1,33 Prolata (Elipsoidal). Q = 1,33 – 2,00 Perprolata (oblonga). Q > 2,00

Las formas: Suboblata, Oblataesferoidal, esferoidal, prolataesferoidal y subprolata comprenden la forma general: Subesferoidal.

Otras formas. Existen algunas formas no determinadas por la relación entre eje mayor y el eje menor, ya que son geométricas o parecidas a algún objeto. Por ejemplo:

Cilíndrica,

curvada,

poligonal,

rectangular,

romboidal,

alantoide

(semejante o en forma de salchicha), apiculada, aracniforme, espolonada, estrellada, filiforme, forma de manzana o pera, forma de X, fusiforme, helicoide, heteroapendicular, homoapendicular, lentiforme, ovoide, poligonal, reniforme, vermiforme, entre otras. Igualmente se encuentran esporas con dos paredes circulares (forma pulley-wheel. Figuras 1.47 y 1.48).

110

Otros caracteres morfológicos. Presencia de poro germinativo, ápice o extremo superior truncado, espesor de las paredes de la espora, etc.

Figura 1.48. Formas comunes de las esporas de hongos en vistas lateral y frontal. A: Subesférica sin apícula. B: Esférica. C: Globosa. D–G: Elipsoidal a subelipsoidal. H: Subelipsoidal en vista polar. I: Elipsoide constricta en la parte media J: Oblonga constricta en la parte media. K–M: Cuadrangular a romboidal. N: Hexagonal en vista frontal. O: Triangular en vista frontal. P: Alantoide en vista lateral. Q: Amigdaliforme con ápice obtuso e vista lateral. R: Amigdaliforme con ápice agudo en vista lateral. S: Baciliforme. T: Faseoliforme en vista lateral. U: Fusiformes a ampliamente fusiformes. W – V: Lacrimoide. X: Obovoide. Y: Ovoide. AA: Esporas con dos paredes circulares. BB: Angular. CC: Limoniforme. DD: Navicular. EE: Sigmoide. FF: Obcordada. GG: Nodulosa. (Adaptados de Kapp 1969 y Largent et al. 1977). 111

Figura 1.49. Otros caracteres morfológicos. A. Vermiforme. B. Filiforme. C. Apiculada. D. Cilíndrica. E. Curvada. F. Estrellada. G. Helicoide. H. Forma de X. I. Poligonal. J. Aracniforme. K. Homoapendicular. L. Heteroapendicular (adaptada de Saenz 1978). BIBLIOGRAFÍA ESPORAS DE HONGOS Airaudi D. 1996. Fungal biodiversity in the air of Turin. Mycopathology, 136:95102.

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ESPORAS DE LAS ALGAS Las algas son organismos protistas, talofíticos, relacionados muy remotamente entre sí, pero con algunos caracteres morfológicos comunes debidos a su evolución paralela. La mayoría de las algas presentan reproducción asexual mediante esporas u otras estructuras como quistes, acinetos o hipnósporas, los cuales tienen paredes frágiles poco diferenciadas, de difícil fosilización. Algunas algas son de escaso interés palinológico ya que son muy pocos los grupos fósiles encontrados como por ejemplo el género Tasmanites (Figura 1.50 A), cuyos restos datan desde el Ordovícico y que están evidentemente relacionados morfológicamente con los géneros actuales Pachysphaera (Figura 1.50 B) y Halosphaera de la División Xanthophyta.

115

Figura 1.50. Dos géneros de algas. A: Tasmanites (género fósil). B: Pachysphaera (género viviente. Adaptadas de Saenz 1978). Desde el punto de vista palinológico tienen interés los grupos cuyas estructuras celulares tienen elementos muy resistentes al tiempo y a la descomposición por otros microorganismos, por ejemplo presentar elementos calcáreos, silíceos, quitinosos o celulósicos, que pueden originar microfósiles prácticamente inalterables. Estos microfósiles son de considerable valor como indicadores estratigráficos o

paleoecológicos, tales como:

Pyrrhophyta, Chrysophyta,

Chlorophyta.

PYRRHOPHYTA. Los pirrófitos (dinoflagelados) son organismos unicelulares con dos flagelos: uno transversal, generalmente ondulante y otro longitudinal. Tienen pared celulósica rígida, formada por placas individuales, ornamentadas, unidas fuertemente entre sí según un patrón característico para cada grupo. El tamaño varía de 20 a 350 µm la forma es más o menos globosa o esférica o poligonal, algunas veces con salientes en forma de cuernos, espinas o alas. La superficie de las placas puede ser completamente lisa o estar ornamentada con costillas, gránulos o perforaciones. Los dinoflagelados generalmente son marinos y algunos grupos son de agua dulce o salobre. Los organismos de aguas cálidas presentan un mayor desarrollo de cuernos o espinas (Figura 1.51 A), mientras que los de aguas frías (aun de la misma especie) tienen cuernos menos desarrollados 116

(Figura 1.51 B), se supone que esto es debido a que la mayor densidad del agua hace que la sedimentación sea más lenta. En condiciones adversas los dinoflagelados se enquistan, el quiste se forma en el interior de la pared, quedando en muchos casos unido a ella por apéndices (Figura 1.51 C), al destruirse la pared original se libera el quiste, cuyas paredes (raramente calcáreas o silíceas) están formadas por dos capas separadas o en contacto una con otra. La superficie de los quistes puede ser lisa, granular o reticulada.

Figura 1.51. A y B: Una misma especie del género Ceratium. A: Forma del dinoflagelado de agua caliente. B: Forma del dinoflagelado de agua fría. C: Quiste formado dentro de un dinoflagelado del género Oligosphaeridium, unido a la pared exterior por sus apéndices (Saenz 1978). Los dinoflagelados actuales más frecuentemente encontrados pertenecen a los géneros Ceratium (Figura 1.52. A), Exuviaella (Figura 1.52. B), Gonyaulax (Figura 1.52. C), Gymnodinium (Figura 1.52. D y E) y Peridiniu (Figura 1.52. F). Figura 1.52. Dinoflagelados actuales encontrados frecuentemente. A: Ceratium sp. B: Exuviaella sp. C: Gymnodinium sp. D: Gonyaulax sp. (A y B según de Raven 1991. C y D según Saenz 1978).

117

Generalmente los fósiles encontrados en la mayoría de los estudios son en forma de quistes, en un principio se les agrupó bajo el nombre de histricosferos, los cuales datan desde el Silúrico y alcanzaron su mayor abundancia y diversidad en el Jurásico. Los quistes presentan gran variedad en tipos morfológicos: con un solo cuerno apical (Figura 1.53), con protuberancias tubulares o espinosas ramificadas o no y distribuidas generalmente por toda la superficie, con prolongaciones aplanadas en forma de alas o crestas generalmente rodeando la zona ecuatorial. Se piensa que esta diversidad está relacionada con la variación de las condiciones de sedimentación ya que se encuentran quistes con paredes gruesas en condiciones inestables, cerca de las orillas; y quistes con paredes más delgadas, con protuberancias más desarrolladas en zonas de mar abierto donde las condiciones son más estables, lo que se considera como una adaptación para facilitar la flotación.

Figura 1.53. Histricosferos: Hystrichosphaera sp. (Según Saenz 1978).

Existe un grupo artificial de microfósiles denominado acritarcos (akritos = incierto y arche = origen. Figura 1.54), cuya relación con los dinoflagelados no se ha demostrado satisfactoriamente, algunos autores los consideran vegetales o como cistos de algas microscópicas fitoplantónicas, fitosintetisadoras. Los acritarcos generalmente son marinos, aunque también se han encontrado en aguas dulces. Es uno de los grupos fósiles más antiguos, abundantes en los sedimentos marinos precámbricos; con reducción en el Carbonífero. 118

Los acritarcos presentan diversidad en cuanto a forma, tamaño, estructura y ornamentación de la pared: 1.

Forma. Esférica, elipsoidal, discoidal, alargada o poligonal

2.

Tamaño. Varía entre 7 y 500 µm

3.

Pared. Simple (homogénea) o dupla (múltiple)

4.

Ornamentación. Superfície lisa, equinada, crestada, granular, rugosa o estriada. Los elementos esculturales pueden estar distribuidos al azar o limitados a determinadas áreas del caparazón.

5.

Cavidad central. Cerrada o abierta.

6.

Simetría. Hemimórfica, holomórfica, regular.

Figura 1.54. Acritarcos. A: Acanthodiacrodium sp. B: Domasia sp. C: Leiosphaeridia sp. D: Pterospermosis sp. E: Baltisphaeridium sp. (acritarco no marino. Según Saenz 1978). CHRYSOPHYTA. Los crisófitos de interés palinológico pertenecen a la familia Chrysophyceae (algas crisofíceas) y a la familia Bacillarophyceae (bacilariofíceas o diatomeas). Las crisofíceas presentan dos grupos de interés palinológico: los silicoflagelados, que en el interior de la célula forman un esqueleto silíceo muy complicado (Figura 1.55. A y B) y los cocolitofóridos (Figura 1.55. C), que generalmente en la pared de la célula presentan anillos, pequeñas placas, escamas o bastoncillos calcificados, de forma muy variada, denominados cocolitos,

rabdolitos

o

estefanolitos.

Los

silicoflagelados

son

algas

planctónicas de los mares fríos y los fósiles se conocen desde el Cretácico superior. Las formas vivas de los cocolitofóridos están muy extendidas en los mares cálidos y fueron extraordinariamente abundantes en el Cretácico superior, 119

formando depósitos calcáreos por sedimentación de los caparazones al morir las células

(Figura

1.55.

D

y E).

Las

crisofíceas

frecuentemente

forman

estatósporas, que son un tipo de célula de reposo cuya pared queda silicificada en toda la periferia, excepto en una pequeña abertura taponada por un material no silíceo. Este quiste presenta una ornamentación bién definida formada por verrugas, crestas, estrías u otras proyecciones. En condiciones favorables la estatóspora germina dando lugar a una o dos zoósporas (células flageladas) que salen por la abertura una vez disuelto el tapón (Figuras 1.55. F, G y H).

Figura 1.55. Algunos crisofíceos de interés palinológico. A: Dictyocha sp. B: Distephanus speculum. C: Gephyrocapsa sp. D: Mallomonas sp. E: Syracosphaera sp. F: Estatóspora de Chrysocapsa sp. G a H: Estatósporas de dos especies del género Archaemonas (A, D, E, F, G y H según Saenz 1978. B y C tomadas de Raven 1991). Las bacilariofíceas o diatomeas son muy abundantes en agua dulce y en agua salada (Figura 1.56). Presentan una estructura celular muy complicada, formada por dos mitades llamadas frústulos que encajan entre sí y contienen un alto porcentaje de sílice (hasta 95% del peso total). Las formas y ornamentaciones del frústulo son muy variadas, manteniéndose constante en cada especie, por lo cual 120

son utilizados como caracteres taxonómicos. La ornamentación está constituida por poros, aréolas, estrías, costillas alargadas, etcétera, que adquieren una disposición característica. Las células que poseen simetría radial pertenecen al grupo de las diatomeas céntricas o centrales y en ellas las placas valvares suelen ser circulares o a veces triangulares (Figura 1.56. A), se encuentran preferencialmente en medios marinos y los fósiles datan del Jurásico. Otras diatomeas tienen simetría bilateral y son denominadas diatomeas pennadas o pennales (Figura 1.56. B y C), se encuentran en agua dulce. En el Terciario y períodos interglaciares las diatomeas marinas alcanzaron gran desarrollo y formaron depósitos que se conocen con los nombes de tierra de diatomeas, trípoli, diatomita o harina fósil, entre otros y son utilizados por el hombre para diversos fines.

Figura 1.56. Algunas bacilariofíceas (diatomeas) de interés palinológico. A: diatomea céntrica del género Triceratium. B y C: Diatomeas pennadas de los géneros B: Gomphonema sp. y C: Diploneis sp. (Saenz 1978). CHLOROPHYTA. Los clorófitos (algas verdes) desde el punto de vista palinológico solamente son importantes dos familias: Desmidiaceae y Characeae. En las Desmidaceae la célula vegetativa está formada por dos mitades llamadas placodermas (Figura 1.57), simétricas respecto a un plano. Son conocidas desde el Devónico aunque la mayor parte de los fósiles o subfósiles conocidos son posglaciares. Frecuentemente están ornamentadas con verrugas o diversos tipos de prominencias de la membrana. Generalmente se encuentran en aguas ácidas 121

de las turberas, por ejemplo los géneros Closterium, Cosmarium y Staurastrum (Figuras 1.57).

Las Characeae son algas verdes, talofitas; algunos autores las consideran grupo de transición entre talófitos y briófitos. El órgano reproductor femenino u oogonio tiene una estructura muy característica, que comprende los primeros fósiles conocidos de la familia desde el Devónico.

Figura 1.57. Algas verdes. A: Cosmarium sp. B: Staurastrum sp. C y D: Oogonios de dos especies del género Chara (según Saenz 1978). E: Pediastrum. F: Scenedesmus. G: Zygnema. H: Microspora (G y H son algas verdes filamentosas). I: Micrasterias (Wilson y Loomis 1968). ESPORAS DE LOS LÍQUENES Los líquenes son asociaciones simbióticas generalmente de hongos ascomicetes (algunas veces basidiomicetes) y algas verdes o cianobacterias. El hongo introduce algunas hifas dentro del alga para obtener alimento (Figura 1.58). La morfología del líquen es completamente diferente a la del hongo y a la del alga cuando están separados estos dos organismos. Los líquenes forman ascosporas de morfología y estructura muy característica, por lo cual son de poco valor taxonómico. Las principales variaciones se observan en el número de células por 122

asca, tamaño, núcleos, coloración y ornamentación de la pared. El tipo más frecuente es unicelular ovoide, pared lisa o granulosa, hialina y en número de 8 ascosporas por asca. A partir del tipo básico se reconocen cuatro tipos de ascosporas:

Tipo I: septados transversalmente, con septación numerosa, originados por un aumento de la relación eje polar/diámetro ecuatorial. Típicamente son fusiformes a aciculiformes y vermiformes (Figuras 1.58 A, B y C). Tipo II: cuando esta relación no es muy amplia se originan ascosporas mono, bi o tripseptados y en foma de muros (muchas septaciones transversales y longitudinales. Figuras 1.58 D y E). Tipo III: polarilocular, con un tabique transversal ancho hasta la tercera parte del eje polar y con un canal central que comunica los dos lóbulos que se forman (Figura 1.58 F y G). Tipo IV: macrospórico, con variaciones en la septación y en la ornamentación (Figura 1.58 H).

123

Figura 1.58. Tipo I. A: Bacidia rosella. B y C: Sticta aurata. Tipo II. D: Rhizocarpon viridiatrum. E: Buellia rivasmartinezii. Tipo III. F: Phycia biziana. G: Phlyctis agelaea. Tipo IV. H: Caloplaca erythrocarpa (tomado de Saenz 1978). BIBLIOGRAFÍA ESPORAS DE ALGAS Y LÍQUENES Arai M. & Lana C. C. 2001. Dinoflagelados. In: Carvalho I. S. (ed.). Paleontologia. Editora Interciência, pg. 327 - 353. Colbath G. K. & Grenfell H. R. 1995. Review of biological affinities of Paleozoic acid-resistant, organicwalled eukaryotic algal microfossils (including “acritarchs”). Review of Palaeobotany and Palynology, 86: 287-314. Cramer F. H. 1970. Acritarchs and Chitinozoans from the Silurian Ross Brook Formation, Nova Scotia. The Journal of Geology, 78: (6):745-749.

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el punto de vista nutricional, mientras que el esporofito depende del gametofito y permanece fijo sobre él. Algunos sistemas de clasificación consideran a los briofitos como la División Bryophyta con tres clases: Hepaticae, Anthocerotae y Musci.

Clase I: Hepaticae (hepáticas, 6.000 especies). En varios sistemas de clasificación esta clase es considerada como la División Hepatophyta. Son plantas pequeñas, su nombre deriva del parecido que tienen algunos grupos con el hígado. El gametofito puede ser: 1) Taloso. De forma aplanada sin diferenciación de ejes ni filidios. Por ejemplo los órdenes Marchantiales, Espherocarpales, Metzgeriales, Monocleales. 2) Folioso. Eje con de filidios. Por ejemplo los órdenes Jungermanniales, Calobryales.

Clase II: Anthocerotae (antocerotes, 100 especies). Algunos sistemas de clasificación consideran a esta clase como la División Anthocerophyta. El gametofito es aplanado con crecimiento centrífugo o laminar. Cada célula presenta un único cloroplasto. Los gametangios están inmersos en el talo. El esporofito es elongado, dehiscente por dos líneas longitudinales.

Clase III: Musci (musgos, 9.500). Algunos sistemas de clasificación consideran a esta clase como la División Bryophyta. En los musgos ya se encuentra la heterosporía, en la cual se producen dos tipos de esporas, diferentes en cuanto al tamaño: unas esporas grandes, llamadas macro o megasporas que al germinar producen gametofitos femeninos y otras esporas más pequeñas denominadas microsporas que al germinar producen gametofitos masculinos.

Características de las las esporas de la División Bryophyta: Hepaticae, Anthocerotae y Musci.

Desde hace tiempo se han utilizado las esporas en la sistemática de los briófitos, aunque dentro de cada taxón, solamente se consideraba el tamaño en vistas 126

distal y proximal (Puche et al. 1988, Mateu & Puche 1984, Clarke, 1979, Hirohama 1978, Hirohama 1977, Boros & Jarai-Komlodi 1975, Sorsa et al., 1973, Erdtman & Sorsa 1971, Dickson 1969). Sin embargo, actualmente algunos autores vienen utilizando la morfología de las esporas para delimitar los taxones aportando datos sobre su diversidad en forma, ornamentación, pared, tamaño, etc. Para la caracterización de las esporas de un determinado taxón, se debe indicar si es observada en vista proximal o en vista distal, ya que las características pueden variar dependiendo de la posición de observación.

Aún no está bien definida la estructura de la pared de las esporas de los briófitos, pero se considera que presentan las siguientes capas: una intina celulósica, que es la capa más interna, en contacto con la membrana citoplasmática. Recubriendo a la intina se encuentra la exina, que a su vez tiene dos capas: la exina interna y la exina externa, en la cual se forma la ornamentación característica del grupo. En muy pocos casos se encuentra otra capa más superficial llamada perina, que es de origen extraesporal. Generalmente presentan esporas esferoidales, tetrahédricas o elipsoidales. El tamaño varía entre 5 µm hasta 250 µm: La medida más frecuente está entre 25 µm y 30 µm. La pared presenta ornamentación típica para cada género y algunas veces para cada especie dentro de un género.

En los briófitos se encuentran esporas esféricas, de paredes lisas u ornamentadas con espínulas, verrugas o reticuladas, entre otras (Figura 1.46). En el género Ephemerum las esporas son reniformes (Figura 1.46. I). En esta División ya se encuentra la heterosporía, en la cual se producen dos tipos de esporas, diferentes en cuanto al tamaño: unas esporas grandes, llamadas macro o megasporas que al germinar producen gametofitos femeninos y otras esporas más pequeñas denominadas microsporas que al germinar producen gametofitos masculinos. En los musgos son de importancia palinológica el género Sphagnum, cuyas esporas fósiles se conocen desde el Jurásico. Son tetrahédricas, en el polo proximal presentan un poro dividido en tres. 127

Generalmente la morfología de las esporas de los briofitos presenta las siguientes características en general: 1.

Tamaño. Varía entre 5 a 250 µm, la medida más frecuente está entre 25 y 30 µm.

2.

Forma. Circular, elipsoidal, esferoidal, gemada, ovoide, subcilíndrica, subesférica, tetrahedral, triangular, etc. Contorno: plano convexo, triangular, rómbico, etc.

3.

Ornamentación. Baculada, granulosa, lisa, retícular, verrugosa, etc.

4.

Aberturas. Alete (sin aberturas), monolete (con una abertura), trilete (una abertura dividida en forma de Y).

5.

Polaridad. Apolar, heteropolar, isopolar.

Según la jerarquía taxonómica, algunos briofitos presentan características propias del taxón, por ejemplo: 1) En las hepáticas las esporas son casi esféricas, en el polo proximal pueden presentar una cicatriz en forma de Y, resultante de la posición de cada espora en la tétrada en contacto con las otras tres. El polo proximal generalmente es aplanado y frecuentemente tiene ornamentación diferente a la del polo distal. Los elementos esculturales pueden estar formando papilas, crestas o prominencias irregulares. 2) En los antocerotes las esporas pueden permanecer en tétradas y la ornamentación varía aun dentro de una misma especie (Figura 1.59. H, I). 3) En los musgos se encuentran esporas esféricas, de paredes lisas u ornamentadas con espínulas, verrugas o reticuladas, entre otras. En el género Ephemerum las esporas son reniformes (Figura 1.59).

Figura 1.59. Esporas de briófitos. A, B y C: Esporas de tres especies diferentes del género Sphagnum. D: Polo proximal en una espora del género Riccia. E y F: Esporas de dos especies diferentes del género Fossombronia. G: Esporas de Ricciocarpus. H e I: Esporas de dos especies 128

diferentes de Anthoceros. (Wilson y Loomis 1968, Saenz 1978). BIBLIOGRAFÍA ESPORAS DE LOS BRIOFITOS Boros A. & Jarai-Komlodi. 1975. An atlas ofrecent european moss spores. Akadémiai Kiadó. Budapest.Botany Departmen Press.

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ESPORAS DE LOS PTERIDOFITOS PTERIDOPHYTA.

Plantas

parecidas

a

Pteri

(helechos).

Según

Engler

corresponden a Embryophyta Asifonogama. Los pteridófitos (criptógamas vasculares) son uno de los grupos vegetales más interesantes e importantes, pues representan una especie de eslabón entre los llamados vegetales inferiores y los superiores. Son el primer grupo donde se encuentran plantas con hojas, tallo y raíces verdaderas, esto es, con tejidos conductores bien diferenciados en xilema y floema. Se les llama criptógamas, ya que carecen de flores, frutos y semillas y vasculares porque poseen tejidos vasculares (xilema y floema).

Los pteridófitos, para la mayoría de los autores, se dividen en cuatro clases: Equisetopsida, Lycopodiopsida, Psilotopsida y Filicopsida. Las tres primeras clases son conocidas como “plantas afines a los helechos” y la Clase Filicopsida comprende los llamados helechos verdaderos. Este última clase presenta una diversidad muy alta y no existe un consenso para definir el número de familias ni para posicionar especies. Los representantes fósiles tuvieron gran importancia en la formación de carbón de piedra y petróleo.

La división comprende todas las criptógamas vasculares, con una marcada alternancia de generaciones. El esporofito es la generación más desarrollada con mayor diferenciación morfológica y anatómica. El gametofito, llamado prótalo, puede ser una lámina verde que vive en la superficie del suelo, adherido por rizoides o es subterráneo, incoloro y saprófito. La fecundación siempre se 130

realiza por anterozoides flagelados. Las esporas germinan dando origen a nuevos gametofitos, completándose el ciclo vital.

Los pteridófitos pueden ser homósporos (isósporos) o heterósporos. Son homósporos cuando una especie origina esporas iguales en forma y tamaño. En los heterósporos una misma especie produce esporas diferentes en forma y tamaño. Las más grandes son las esporas femeninas y reciben el nombre de macrosporas o megasporas y las esporas más pequeñas son las masculinas denominadas microsporas. Cuando también hay diferencias en el tamaño de los esporangios

se

denominan

macrosporangios

o

megasporangios

y

microsporangios respectivamente.

Cuando las esporas germinan dan origen al gametofito que recibe el nombre de prótalo debido a su forma talosa. El prótalo está formado por pequeñas capas parenquimáticas casi homogéneas. En los grupos homósporos, los anteridios y los arquegonios se encuentran en el mismo prótalo, excepto en la familia Equisetaceae que tienen prótalos dioicos. En los grupos heterósporos se encuentran dos tipos de prótalos: macroprótalo con arquegonios y microprótalo con anteridios.

Cuando el anterozoide fecunda a la oosfera (gameto femenino) se forma el cigote, el cual por embriogénesis y morfogénesis da origen al esporofito o sea la planta verde conspicua. El esporofito origina esporas haploides (n) en los esporangios desarrollados a partir de células epidérmicas. El arquesporio, en cada esporangio, da origen a células madres de esporas y a una capa de células estériles llamada tapete y localizada entre las paredes del esporangio y el tejido esporógeno. El tapete funciona como reserva alimenticia para las esporas en formación. En las esporas de ciertas briofitas y pteridófitos hay una capa externa, floja, llamada perina o exosporio que rodea a otra interna denominada endosporio o exina. Su composición química no es bien conocida y es poco resistente a ácidos fuertes y a otras sustancias corrosivas. La estructura de esta 131

pared es diferente a la de las angiospermas, frecuentemente parece ser laminar en todo su espesor y no presenta columelas.

En la esporodermis de Pteridophyta son consideradas tres capas o paredes, cuya terminología aun no esta definida exactamente debido a la complejidad y diversidad de la misma. De la pared más interna hacia la más externa se les denomina: endosporio, exosporio y perisporio respectivamente (Figura 1.60). Al parecer el endosporio y el exosporio existen en todas las esporas maduras de las pteridófitas y respectivamente son homólogos de la intina y la exina del polen de las angiospermas. El exosporio generalmente es liso o tenuamente ornamentado. En las pteridófitas más evolucionadas se encuentran esporas con exosporios fuertemente ornamentados. Durante la esporogénesis el exosporio es la primera pared en formarse alrededor de la tétrada, luego se forma el perisporio, generalmente por degradación de las células del tapetum. El perisporio se desarrolla notablemente en esporas de helechos de los géneros Asplenium, Blechnum y Dryopteris. Pero con la ayuda del microscopio electrónico de transmisión se ha comprobado que existe en muchos grupos de pteridófitos.

Figura 1.60. Corte transversal en una espora de Isoetes sp. en el cual se detalla la estructura de la esporodermis de los pteridófitos (Saenz 1978).

ABERTURAS La estructura de la pared de las esporas de las pteridófitos y la de las briofitas es diferente a la de los granos de polen, en las esporas no existe la división sexinanexina y las aberturas no pueden ser descritas como colpos o poros en el sentido exacto, que son caracteres de la sexina. Algunas esporas no presentan aberturas 132

y se denominan inaperturadas o aletes, otras presentan una abertura larga, linear, como una incisión, llamada laesura (por ejemplo en Polypodiaceae) y dicha espora recibe el nombre de monolete, mientras que otras tienen una incisión proximal 3-ramificada en forma de Y y es denominada trilete (este tipo de abertura también se encuentra en algunas briofitas por ejemplo en el género Sphagnum (Figura 1.61 y 1.62).

Tanto en monolete como en trilete, las aberturas son cicatrices originadas por el estado y separación de la tétrada, en lo cual difieren del tipo de abertura de los granos de polen de angiospermas. Las incisiones de las esporas ocurren siempre en el polo proximal, mientras que en el polen se dan en cualquier parte del grano, generalmente en la cara distal, con menor frecuencia en la cara proximal y muchas veces sobre la superficie entera. Las aberturas pueden, o no, tener margen que a su vez puede ser recta o curva, tener forma de labio, reborde o ser lineal. La abertura puede tener casi la misma longitud de la espora o 3/4, 2/3, 1/2, 1/4 de la longitud. Según el relieve la abertura puede ser: Tuberculada, extervermiculada, sinuosa, irregularmente sinuosa.

Figura 1.61. Clasificación de las aberturas de los pteridófitos. A: Monolete. B: Trilete. C: Espiraperturada (espiralada).

133

Figura 1.62. Vistas ecuatorial y polar mostrando como pueden verse las aberturas y las áreas libres de aberturas en las esporas trilete.

ORNAMENTACIÓN Generalmente se encuentra en la perina y prácticamente se dan casi todos los tipos de ornamentación del polen: Psiladas, tuberculadas, reticuladas, rugosas, equinadas, equinuladas, entre otros tipos de ornamentación.

MORFOLOGÍA En términos generales la forma de las esporas de los pteridófitos son básicamente de dos tipos: bilaterales y tetrahédricas. La morfología (Figura 1.63) de las esporas es más o menos constante para un determinado taxón, pero este puede presentar formas intermedias en casos de hibridación, aposporía o apogamia. Para determinar la morfología de las esporas se debe tener en cuenta: 1.

Su forma geométrica en vista distal

2.

La longitud desde el ápice hasta la base de la espora en vista distal, sin incluir la perina

3.

El diámetro cuando la espora es globular, esférica o subesférica.

4.

La longitud del eje mayor y la del eje menor en vista proximal

5.

Altura en vista distal

6.

Espesor de la margen

7.

Espesor de la esclerina sin incluir la perina

8.

Espesor de la perina

9.

Altura (medida perpendicular a la superficie de la pared) 134

10. Diámetro y demás dimensiones de los elementos esculturales como gemas, báculas, clavas, espinas, entre otros.

A

B

C

D

E

F

Figura 1.63. Espora radiosimétrica heteropolar. A: Vista lateral. B: Polo proximal. C: Polo distal. D-F: Espora bilateral heteropolar: D: Vista lateral. E: Polo proximal. F: Polo distal. MORFOLOGÍA DE LA ESPORA MONOLETE Según la forma en vista distal la espora monolete puede ser: 1.

Plano convexa a biconvexa

2.

Plano convexa

3.

Biconvexa

4.

Cóncavo-convexa

5.

Plano convexa a cóncavo-convexa

6.

Convexa

7.

Subcónica

8.

Subcónica

9.

Subhemisférica

10. Hemisférica

Según la forma en vista proximal la espora monolete puede ser: 1.

Elipsoidal. La relación eje mayor/eje menor está entre 1,25 y 2

2.

Subelipsoidal. La relación eje mayor/eje menor es mayor que 2

3.

Globular. La relación eje mayor/eje menor es menor de 1,25

4.

Hemiesférica. La relación eje mayor/eje menor es menor que 1

135

Según la forma geométrica la espora monolete puede ser: 1.

Cóncava

2.

Cónica

3.

Convexa

4.

Plana

MORFOLOGÍA DE LA ESPORA TRILETE Según la forma en vista proximal la espora trilete puede ser: 1.

Globular

2.

Triangular

3.

Triangular equilátera

4.

Subtriangular deltoide

5.

Trilobada

Según los lados la espora trilete puede ser: 1.

Cóncavos

2.

Fuertemente cóncavos

3.

Convexos

4.

Rectos

Según los ángulos la espora trilete puede ser: 1.

Agudos

2.

Obtusos

3.

Truncados

TAMAÑO Tanto en las esporas monoletes como en las triletes para hacer las medidas se debe tener en cuenta:

136

1.

La distancia desde el ápice hasta la base de la espora en vista distal, sin incluir la perina

2.

El espesor de la margen, espesor de la esclerina sin incluir la perina

3.

El espesor de la perina

4.

La altura y las dimensiones de las proyecciones cuando existen (báculas, clavas, espinas, espínulas, gemas, entre otros)

Con base en los registros fósiles parece ser que las esporas tetrahédricas y las triletes son las más primitivas. Las pteridófitas con estos tipos fueron dominantes en el Devónico y Carbonífero y eran isospóricas, con exosporio tenuemente ornamentado y perisporio ausente.

Las cuatro clases de la División Pteridophyta tienen esporas con características morfológicas más o menos estables para cada taxón, así:

CLASE I: EQUISETOPSIDA La clase Equisetópsida viene desde el Devónico, alcanzaron su mayor abundancia y diversidad en el Paleozoico tardío, hace unos 300 millones de años. Comprende

cuatro

órdenes fósiles extintos: Hyeniales, Pseudoborniales,

Sphenophyllales y Calamitales (del final del Devónico y el Carbonífero, arbóreos, hasta de 15 metros de altura y 15 centímetros de diámetro) y un solo orden viviente (Equisetales) con una familia (Equisetaceae) y un único género (Equisetum), llamadas popularmente “colas de caballo”. Es un grupo vegetal derivado de antepasados frecuentemente arbóreos que dominaron la tierra durante el Paleozoico, principalmente en los períodos Devoniano y Carbonífero.

Orden Equisetales Familia Equisetaceae. Familia de la “Cola de caballo”

137

El género Equisetum es isósporo, con esporas globosas con elaterios, también llamados eláteres, higroscópicos que, de acuerdo con el grado de humedad del aire, se enrollan alrededor de la espora o se estiran, mecanismo que facilita la dispersión de las esporas (Figura 1.64). Los elaterios se destruyen fácilmente con el proceso de acetólisis. Aunque las esporas son iguales, los prótalos resultantes de la germinación son masculinos o femeninos, epígeos; anterozoides biflagelados. El tamaño de la espora varía entre 30 y 40 µm.

Figura 1.64. Equisetum sp. A: Espora con los elaterios estirados. B: Espora con los elaterios enrollados.

Según Piñeiro M.R. y M.A. Morbelli (2014), basadas en el estudio de las esporas de las especies argentinas Equisetum bogotense Kunth y E. giganteum L., las esporas son esferoidales, miden 35-64 μm de diámetro ecuatorial, citoplasma con clorofila.

En ambas especies, las esporas presentan una estructura abertural

circular y a ambos lados de la misma poseen un par de eláteres acintados de extremos

espatulados,

no

resistentes

al

tratamiento

de

acetólisis.

La

esporodermis consta de dos paredes, perisporio, delgado, ornamentado, con dos estratos, de 930 nm-1,2 μm de espesor, y exosporio, de 1,4-3,1 μm de espesor, compacto, con dos estratos y superficie levemente ondulada o plegada. Entre ambas paredes se ha observado una capa intermedia de naturaleza laxa, y diferente espesor en esporas con distintos estadios de maduración. Las esporas son similares, en ambas especies, en cuanto a la forma y ultraestructura de la esporodermis; se observan diferencias en el tamaño de las mismas.

138

CLASE II: LYCOPODIOPSIDA La

clase

Lycopodiopsida

comprende

dos

órdenes

fósiles

extintos

(Protolepidodendrales y Lepidodendrales y tres órdenes vivientes (Lycopodiales, Selaginellales e Isoetales). Excepto Lycopodiales los demás órdenes son heterósporos.

Lycopodiopsida es un grupo vegetal derivado de antepasados que jugaron un papel importante en la tierra durante el Paleozoico, principalmente en los períodos Silúrico Superior y Devónico. En el Carbonífero eran muy dominantes, de hábito leñoso arbóreo.

Tanto las microsporas como las megasporas de Lepidodendrales son triletes. Las microsporas miden de 20 a 40 µm de diámetro y las megasporas varían desde 300 µm hasta más de 2 mm de diámetro.

Orden 1. Lycopodiales Familia Lycopodiaceae Familia del “Colchón de pobre”

Los fósiles conocidos son incompletos y datan del Devoniano superior y Cretáceo superior,

eran

arbóreos

con

crecimiento

secundario

(Lycopodites,

del

Carbonífero).

Lycopodiales es un grupo homósporo, con esporas triletes (Figura 1.65. A-C), ornamentación reticulada o rugosa; la ornamentación generalmente es más notoria en el polo distal.

Orden 2. Selaginellales Familia Selaginellaceae. Familia del “helecho pavo, doradilla o palmita japonesa”. 139

Los fósiles conocidos datan del Carbonífero. Tanto las microsporas como las megasporas son triletes. Ornamentación variada: crestas, espinas, gránulos, entre otras (Figuras 1.65. D).

Orden 3. Isoetales Familia Isoetaceae Familia de la “cebolleta de páramo”

Los fósiles conocidos datan del Triásico Superior. Las microsporas son monoletes, con ornamentación equinulada, psilada o verrugosa, entre otros Las macrosporas son triletes con ornamentación crestada, equinada, reticulada o tuberculada, entre otros tipos (Figura 1.65. E-I).

Figura 1.65. Esporas de géneros actuales. A, B y C: Esporas de tres especies diferentes de Lycopodium sp. D - G: Varios tipos de esporas en diferentes especies del género Isoetes. H: Selaginella. I - J: Lycopodium. K: Phylloglossum. L: Espora del género fósil Lepidodendron (tomado de Wilson y Loomis 1968, Saenz 1978).

140

CLASE III: PSILOTOPSIDA La clase Psilotopsida es un grupo de plantas vasculares muy primitivo. Desde el punto de vista filogenético está muy apartado de todas las plantas vasculares actuales, no hay consenso sobre su posición filogenética, Engler & Diels las consideran más evolucionadas que Selaginellales e Isoetales. Para Eames (1936) son las plantas vasculares más primitivas debido a que carecen de raíces y de hojas.

Orden Psilotales Familia Psilotaceae Familia de las “mechas” o “pelucas”

Familia con no más de tres especies, dos géneros vivientes: Psilotum Sw., distribución tropical y subtropical de todo el mundo y Tmesipteris Bernh., occidente de Malasia, Australia y Pacífico. Estos dos géneros son isósporos, con esporas monoletes, diámetro entre 50 y 80 µm, ornamentación finamente reticulada. Un género extinto: Rhynia, con fósiles conocidos de la transición Silúrico-Devónico; en este género las esporas son triletes, con diámetro de 35 a 65 µm, ornamentación en gránulos o papilas (figura 1.66).

Figura 1.66. Espora de Psilotum sp.

CLASE IV: FILICOPSIDA Comprende las plantas comúnmente conocidas como helechos o helechos verdaderos, es la clase principal y más abundante de los pteridófitos. Los helechos tienen una distribución muy amplia, se encuentran desde los bosques tropicales húmedos hasta más allá del círculo ártico, son más abundantes en los 141

bosques tropicales (dos tercios del total de especies vivientes), especialmente en las regiones altas (como los bosques andinos), pero también se encuentran en las zonas templadas, así que su diversidad disminuye al aumentar la latitud y al disminuir la humedad. Crecen a lo largo de las corrientes de agua, al borde de los caminos. Hábitat generalmente húmedo y sombrío, pero algunos se desarrollan a plena luz solar; epífitos, terrestres y algunos acuáticos, raramente xerófitos.

Los primeros representantes de Filicopsida surgieron en el Paleozoico, posiblemente derivados de ancestrales del tipo Psilophytales y alcanzaron su máxima expansión en el Mesozoico. Es una clase muy abundante desde el Carbonífero hasta la actualidad.

Las esporas de los helechos verdaderos tienen una alta diversidad en forma, tamaño, ornamentación y estructura de la pared la cual, al igual que los granos de polen, puede ser utilizada para caracterizar algunos taxones (Figura 1.67).

Figura 1.67. Diversidad de formas y ornamentación en esporas de Filicopsida. A: Ophioglossum sp. B: Botrychium sp. C - D: Polypodium sp. E: Osmunda sp.

142

BIBLIOGRAFÍA ESPORAS DE LOS PTERIDÓFITOS Giudice G.E. y Morbelli M.A. 1988. Análisis palinológico de las especies del género Adiantum L. (Adiantaceae-Pteridophyta) del Nordeste de Argentina. Parte I. Escultura y estructura. Pollen et Spores, Vol. XXX, N° 3-4.

Harris W.F. 1955. A manual of the spores of New Zealand Pteridophyta. New Zealand Dept. Sc. and industrial Research. Wellington. New Tebudi. 185 pp.

Kremp G.O.W. and Kawasaki T. 1972. The spores of the pteridophytes (illustrations of the spores of the ferns and ferns allies). Hirokawa Publishing Co. Inc. Tokyo. 398 pp. Nayar B.K. 1964. Palynology of modern Pteridophyta. Chapter VI, pp. 101 – 141. In Nair’s advances in palynology. Lucknow, India.

Nayar B.K., Lata P. and Tiwari I.P. 1964. Spore morphology of the ferns of West tropical Africa. Pollen et Spores 6 (2) 545-582.

Piñeiro M.R. y M.A. Morbelli. 2014. Morfología y ultraestructura de las esporas de las Equisetaceae (Equisetopsida) del Noroeste de Argentina. Bol. Soc. Argent. Bot. 49 (1): 35-40.

Tryon R.M. and Tryon A.F. 1982. Ferns and allied plants, with special reference to Tropical America. New York: Springer-Verlag. 858 pp.

143

BIOLITOS Biomineralización. Es la precipitación de un mineral como resultado del metabolismo de un organismo vivo, es decir, de su actividad celular. Es un proceso vital mediante el cual los organismos ganan en estructura y masa. En general las biomineralizaciones están relacionadas a una función fisiológica específica, resultando entonces los biominerales beneficiosos para la estructura de los organismos, frente a la acción de la gravedad. Según Metcalfe (1960, 1963) el término biolito fue usado por Ehrenberg en 1854 para designar los cuerpos mineralizados encontrados en el interior de los tejidos tanto de vegetales como de animales, originados como sustancias ergásticas, o sea productos del metabolismo y que se depositan en células o cavidades del cuerpo de esos organismos, donde desempeñan funciones de soporte, resistencia o defensa (Bertoldi del Pomar, 1975). Los caracteres morfométricos de los biolitos son característicos y constantes para cada especie vegetal o animal donde se encuentran.

Los

biolitos

de

origen

vegetal

son

denominados

fitolitos

(phytolitharien, phytoliths) y los de origen animal zoolitos (zoolitharien, zooliths). Según el agente mineralizante se pueden distinguir los calcibiolitos (cuyo agente es una sustancia cálcica) y los silicobiolitos (formados por sílice amorfa). Ambos pueden ser de origen animal (calcizoolitos o silicozoolitos) o de origen vegetal (calcifitolitos o silicofitolitos) respectivamente (Bertoldi del Pomar 1975, Zucol 1992).

FITOLITOS Fitolito (del gr. litos, piedra; con el prefijo fito-, planta) significa “piedra vegetal”. F. Ehrenberg (1854) define al fitolito, como todo cuerpo mineralizado integrante de tejidos orgánicos vegetales y que es producido por sustancias ergásticas (resultantes del metabolismo). Para este autor los fitolitos son biolitos de origen vegetal, de tamaño microscópico y naturaleza química preferentemente silícea o cálcica. 144

Varios autores definen los fitolitos como cristales de sílice o de oxalato de calcio que se originan por deposición en la epidermis o en espacios intercelulares de las plantas utilizando las células como molde, esto es células vegetales que se han mineralizado y se presentan con una estructura cristalina similar a la del ópalo. La sílice o el oxalato de calcio lo toman las plantas disuelto en agua que absorben del suelo y que se deposita principalmente en los espacios intercelulares del tejido epidérmico de hojas, tallos y raíces. Al depositarse esta sustancia toma la forma de las células que recubre y encapsula. Estas partículas presentan formas distintivas según la célula molde y se conservan en el suelo, cuando la materia orgánica de la planta, donde se formaron, ha desaparecido. Mulholland (1985) define a los silicofitolitos como cuerpos microscópicos de sílice opalina producido por las plantas. Esta definición permite incluir a los cuerpos silíceos de los vegetales vivos, como los cuerpos hallados en forma disociada en distintos tipos de sustrato (Zucol, 1992). Los silicofitolitos son entonces biominerales de sílice formados en los tejidos vegetales. El silicio (Si) absorbido por las raíces en forma de ácido monosilícico (H4SiO4) de la solución del suelo es depositado como sílice amorfa hidratada (SiO2.nH2O) en espacios inter o intracelulares (Blackman 1971, Piperno 1988, 2006), el fitolito toma la forma de la célula molde, por lo que es posible asociar una forma fitolítica con una célula o un tejido. De la misma manera que los fitolitos pueden reflejar formas que permiten reconocer tejidos, es posible identificar el taxón de origen. Numerosos estudios han demostrado la relación entre las formas fitolíticas y la sistemática vegetal (Twiss et al. 1969; Brown 1984, Piperno 1988, Wallis 2003). Fitolitos son todos los cuerpos de naturaleza inorgánica que hacen parte integral de las células o tejidos vegetales (células epidérmicas, paredes celulares o en células especializadas), son producidos mediante el metabolismo como sustancias ergásticas (Metcalfe 1960). Generalmente son estructuras de sílice 145

(silicofitolitos), o de oxalato de calcio (calcifitolitos) o carbonatos, que se acumulan en los espacios celulares o intercelulares, especialmente de hojas, tallos, estructuras reproductivas, corteza, madera y raramente de raíces, en algunas

pteridófitos

(como

en

Equisetaceae,

Blechnaceae,

Isoetaceae,

Pteridaceae entre otros), en dicotiledóneas (como en Annonaceae, Asteraceae, Caricaceae, Cucurbitaceae, Ericaceae, Erythroxylaceae, Lauraceae, Malvaceae, Melastomataceae, Rosaceae, Rubiaceae, entre otras) o en monocotiledóneas (Araceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Plantaginaceae,

Piperaceae,

Poaceae,

entre

muchas

otras

familias).

Posiblemente cumplen funciones de soporte, resistencia o defensa en los tejidos donde se desarrollan (Flórez y Parra 1999a). Al parecer su presencia y concentración en el reino vegetal no es uniforme y depende de las etapas del desarrollo o de la fenología del vegetal, así que los fitolitos pueden estar ausentes, o producirse escasa o abundantemente en algunos taxones vegetales. Una vez muertos los órganos o tejidos que los contienen, caen al suelo y por descomposición son liberados los fitolitos. Debido a su composición química son relativamente estables en el suelo y como presentan diversidad en cuanto a forma, tamaño y agrupaciones, su estudio se está constituyendo en un nuevo enfoque para la reconstrucción paleoambiental, climática, uso antrópico de los vegetales tanto en el pasado como en el presente; y también están siendo utilizados como una evidencia más para delimitar grupos taxonómicos.

Por lo general, una misma planta posee varios tipos de fitolitos, con diferente conformación, tamaño y distribución, pero sus asociaciones (conjunto de fitolitos presentes en una especie) son siempre iguales en la misma especie. Los estudios realizados hasta el presente indican que los fitolitos son más frecuentes en las monocotiledóneas principalmente en Arecaceae, Cyperaceae y Poaceae (Del Pomar 1975). Su morfología es muy típica en Poaceae, familia donde se originan principalmente en los tejidos epidérmicos, subepidérmicos y esclerenquimáticos (Hayward & Parry 1973) y su forma y orientación se consideran caracteres 146

significativos en la delimitación de algunos taxones de la familia (Londoño & Kobayashi 1991).

FITOLITOLOGÍA Fitología (de fitolito y –logía) es la disciplina botánica que estudia los aspectos y aplicaciones de los análisis de fitolitos. Es una ciencia muy relacionada con la palinología en cuanto a procedencia, tamaño y aplicaciones del conocimiento del polen y el de los microfitolitos fósiles. Para algunos autores los caracteres morfométricos de los fitolitos son propios y constantes en la respectiva especie vegetal, pero la identificación de los fitolitos es diferente a la identificación de semillas o granos de polen presentes en el suelo. Mientras las semillas y los granos de polen generalmente se pueden identificar con cierta seguridad hasta familia y en algunos casos hasta género o especie, los fitolitos son más difíciles de identificar ya que no se producen uniformemente en todos los grupos vegetales (Piperno 1988) y al parecer no son distintivos de los taxones vegetales donde se encuentran (Pearsall 1988). Además, su formación o acumulación puede depender de las diferentes etapas fisiológicas del vegetal o del desarrollo del órgano (Salgado-Labouriau et al. 1973), como también de las condiciones edáficas donde se desarrolla la planta (Piperno 1988). Pero a pesar de esto, los fitolitos tienen singular importancia para la botánica gracias a sus implicaciones metabólicas, taxonómicas y ecológicas, para la paleontología por su carácter de indicadores para la identificación de sedimentos continentales y para la edafología por constituir registros de biosecuencias y evolución de horizontes entre otros aspectos de esta ciencia (Flórez & Lozano 1999).

BREVE HISTORIA DE LA FITOLITOLOGÍA Saussure, en 1804, citó por primera vez la presencia de células silíceas en plantas, señalando que son comunes en gramíneas y en gran número de dicotiledóneas.

147

Davy, en 1814, se atribuyó la primacía de la observación, al manifestar que él había observado estas células desde 1789 en plantas de avena, trigo y varias especies de equiseto y espadaña. Las descubrió en las hojas y las llamó cellules à fond conique.

Ehrenberg (1829-1875) los estudió en sedimentos continentales, suelos, sedimentos marinos, cineritas, diatomeas, turbas y polvo atmosférico. Si bien fue el creador de la denominación actual y llegó a identificar 89 tipos, para los cuales hizo una clasificación sistemática propia, no siempre los interpretó correctamente.

Struve (1835), Reade (1837), Mohl (1861) entre otros, se ocuparon de la naturaleza química de la sílice y sus relaciones orgánicas con las paredes celulares.

Grob en 1896, publicó el primer trabajo de importancia sobre la anatomía de la epidermis de las gramíneas profusamente ilustrado. Estudió 209 especies, para las cuales estableció cinco tipos de fitolitos típicos que caracterizan tribus.

Douval-Jouve en 1872, 1875 y Holm en1899, estudiaron la sistemática de las ciperáceas, resaltando la presencia de pequeños conos silíceos en ciertas células epidérmicas.

Kaphahn en1905, descubrió los depósitos de sílice en hojas de 23 especies de Rhynchospora.

Pfeiffer (1927) investigó la anatomía comparada de la hoja de varios géneros de Cyperaceae.

Pratt en 1932 y en 1936, se valió de los fitolitos para la clasificación sistemática de las gramíneas, caracterizando tribus por tipos comunes de fitolitos. 148

Metcalfe (1960, 1963) comparte estos criterios para gramíneas y palmas. Metcalfe (1960) utilizó las células cortas y cuerpos de sílice en la descripción anatómica de Poaceae y definió 20 tipos morfológicos.

Algunos autores han estudiado la relación entre el contenido de sílice en el suelo y la producción de silicofilitos por la vegetación respectiva y hasta la incidencia de estos sobre el tracto digestivo de los animales herbívoros.

Jones y Handreck en 1965, calcularon que el total de sílice contenido en las plantas de avena, se distribuía de la siguiente manera: en la lámina de la hoja el 28%, en la vaina de la hoja 17%, en el tallo 10,9%, en la inflorescencia 40,8%, en las cariopsis el 0,5% y en los retoños secundarios el 2,8%. Según estos mismos autores (1967) algunos de los tejidos del xilema pueden estar silicificados, incluyendo fibras, traqueidas y vasos del protoxilema espiralmente engrosados.

Witty J.E. & Knox E.G. (1964) determinaron un contenido total promedio del 3% en plantas de gramíneas, resultado similar al obtenido por otros investigadores sobre el total de las partes aéreas de otras plantas de esta familia. Por lo general, una misma planta posee varios tipos de fitolitos, con diferente conformación, tamaño y distribución topográfica, pero la asociación de esos tipos morfológicos es siempre igual en la misma especie.

Sangster demostró la condición anucleada de estas células en su etapa vegetativa y, al mismo tiempo, la existencia de dos glóbulos en el citoplasma, con anterioridad a la mineralización del fitolito mismo. Desde el punto de vista químico un fitolito es un gel de sílice, forma de sílice amorfa hidratada o ácido silicio polimerizado, impurificado por la presencia de diversos elementos químicos.

Irwin en1971, planteó que el estudio sistemático de los fitolitos tiene múltiples aplicaciones y un énfasis especial en la arqueología en donde se han efectuado 149

muchos esfuerzos con el objeto de reconstruir macroambientes y microambientes, dominados por animales y por el hombre.

Del Pomar (1971, 1976), realiza un estudio de los fitolitos en sedimentos y orígenes botánicos. Logra un apreciable cúmulo de conocimientos anatómicos y fisiológicos acerca de los procesos de formación de los silicofitolitos, su identificación en las plantas y su perdurabilidad en los suelos y sedimentos.

Del Pomar (1975), propone una clasificación morfológica de todos los tipos hasta esa fecha conocidos de silicofitolitos; en ella se establecen 13 morfotribus con 70 variantes, agrupadas según sus dimensiones en dos grupos principales: microsilicofitolitos y macrosilicofitolitos. En este trabajo, cita que son numerosas las plantas proveedoras de silicofitolitos, pero parecen serlo en especial de las monocotiledóneas y, entre ellas, las familias Poaceae, Cyperaceae y Arecaceae. No faltan las pteridófitos y las dicotiledóneas que los poseen abundantemente, por ejemplo Equisetaceae y Podostemaceae, respectivamente.

Ragonese, Gauglinone y Strittmatter (1984), en un estudio realizado en los aquenios de Rhynchospora corymbosa y Rhynchospora scutellata, permitió corroborar que se trata de formaciones originadas en la pared periclinal interna de las células epidérmicas, tal como fue indicado por Jouve (1873) y en otros trabajos ya citados. Estos autores observaron un engrosamiento de esta pared y la deposición de la sílice como un pequeño disco lenticular que crece hacia el lúmen originando el cuerpo silíceo.

Piperno & Pearsall (1998), trabajan en la taxonomía de los cuerpos silíceos de gramíneas tropicales y en el establecimiento de las metodologías para su tratamiento y descripción.

Según Martínez (2004) otros trabajos se han centrado en establecer los porcentajes de sílice acumulados por gramíneas y los tipos de fitolitos 150

encontrados. Jones & Handreck (1965, 1967) calcularon el total de sílice contenido en plantas de avena distribuido de la siguiente manera: lámina de la hoja 28%, vaina de la hoja 17%, tallo 10.9%, inflorescencia 40.8%, cariopsis 0.5% y en retoños secundarios 2.8%.

Otros autores como Zucol (1996, 1998, 1999, 2000, 2001) enfocan sus trabajos en los tipos de asociaciones microfitolíticas en algunos géneros de las Poaceas argentinas.

En Colombia los trabajos sobre fitolitos apenas se están iniciando. Según Flórez & Lozano (1999), materiales de naturaleza opalina – principalmente fitolitos, diatomeas y espículas – han sido reconocidos desde la década de 1960 por Tomas Van der Hammen y colaboradores, en sedimentos de lagunas altoandinas, en estudios relacionados con la paleoecología del Cuaternario colombiano. Sin embargo sólo en la actualidad se les está dedicando trabajos de investigación como una herramienta más para los estudios paleoecológicos y botánicos. Según Martínez (2004) el Departamento de Antioquia ha sido el foco de iniciación de estos estudios, con Flórez & Parra (1999a y b) con los trabajos Atlas de los fitolitos de la vegetación alto andina y Fitolitos en los paleosuelos andicos altoandinos, San Félix, departamento de Caldas, Monsalve (2000) con el Catálogo preliminar de fitolitos producidos por algunas plantas articuladas a las actividades humanas en el suroeste de Antioquia, Flórez & Parra (2001) con los trabajos de Asociaciones vegetales y espectros de fitolitos en la vegetación y en los suelos en el Páramo de Frontino, departamento de Antioquia, Parra & Flórez (2001) con el trabajo Propuesta de clasificación morfológica para los fitolitos altoandinos colombianos y Martínez (2004) con el trabajo sobre fitolitos presentes en algunas especies de Poaceae del Páramo de Frontino (Antioquia).

151

ALCANCES DE LA FITOLITOLOGÍA Gracias a la variedad de formas de los fitolitos, la fitolitología, al igual que las esporas y los granos de polen, es una ciencia que presenta muchas relaciones con otras disciplinas científicas a las cuales puede auxiliar, o recibir ayuda de ellas. En la última década algunos investigadores (biólogos, geólogos, climatólogos, arqueólogos, agrónomos, entre otros) están interesados en estudiar los fitolitos, ya que, además de su significado en taxonomía, filogenia y evolución de las plantas, el estudio de su morfología puede ser importante para el reconocimiento e identificación de los grupos vegetales que se encuentran en una gran variedad de medios: suelo, aire, agua, sedimentos y en muchas otras partes del ambiente.

La fitolitología es una ciencia básica y aplicada. La básica ha realizado importantes contribuciones a ciencias como la taxonomía vegetal, ecología, arqueología, paleobotánica, paleoecología, morfología entre otras. En la rama de las ciencias aplicadas, ha hecho contribuciones en geología, agricultura, etc. Su rápido desarrollo se hace muy promisorio para su aplicación en muchas áreas del saber humano. Algunas de las contribuciones de la fitolitología se hacen manifiestas en:

Agricultura. Principalmente para contribuir en el estudio sobre el origen de la agricultura. Rovner consideró el aspecto antropológico de los orígenes de la agricultura y el papel de los microfitolitos en la demostración de esta actividad antrópica. También para demostrar la relación existente entre el contenido de sílice en los vegetales y la agricultura, la fisiología de este compuesto en las plantas y su producción como defensa contra enfermedades, insectos y herbivoría.

Antropología. Reconstrucción de dietas alimentarias en las comunidades ancestrales, patrones alimenticios y uso de recursos promisorios del bosque y de elementos domesticados por las comunidades prehispánicas. 152

Arqueología. En todas las comunidades las plantas tienen un papel primordial son como fuente de alimento y juegan un importante contexto en las actividades sociales y mágico religiosas, por esto los residuos botánicos recuperados sitios arqueológicos son una fuente de información acerca de diversos aspectos de la vida de las poblaciones antiguas. Al igual que el estudio de los granos de polen y esporas, la presencia de fitolitos en sitios arqueológicos cumplen un papel importante en la reconstrucción del ambiente natural en el cual se desarrollaron las diferentes culturas prehispánicas (Herrera y Urrego, 1996) por ejemplo el manejo de los recursos vegetales, la evidencia de lugares de vivienda, huertas, cementerios y sitios para rituales. El análisis de fitolitos es una de las técnicas arqueobotánicas usadas en la identificación de restos vegetales en contextos arqueológicos que consiste en la identificación e interpretación de cuerpos opalinos de sílice o de oxalato de calcio. Los fitolitos recuperados de muestras de suelos de contextos arqueológicos permiten la identificación de la vegetación existente en el pasado. La recuperación, identificación y análisis de los fitolitos provee específicamente información para determinar patrones de subsistencia, dieta, desarrollo de técnicas agrícolas, uso de plantas, identificación y reconstrucción de antiguas vegetaciones. El análisis de los fitolitos presentes en muestras de suelos obtenidas en excavaciones arqueológicas, es una herramienta que auxilia a proyectos de investigación con interés en la aplicación de estudios paleoetnobotánicos en todas aquellas actividades humanas relacionadas con los recursos vegetales, principalmente a través del estudio con el objetivo de realizar estudios etnobotánicos, etnohistóricos y nutricionales que permitan un mejor entendimiento del uso y aprovechamiento de las plantas. Esto permitirá una mejor interpretación de los materiales, además de la posible participación en proyectos de otras

153

subdisciplinas de la antropología como la etnología y la antropología física para estudiar:

1.

Condiciones paleoambientales

2.

Subsistencia y dieta

3.

Técnicas agrícolas

4.

Definición de áreas de actividad

5.

Identificación de materiales usados en cestería o cuerdas

6.

Identificación de plantas usadas como materiales constructivos

7.

Otros estudios de interés arqueológico

Medicina. En trabajos realizados para determinar la posible relación entre el consumo de alimentos vegetales y el cáncer esofágico o enfermedades de la cavidad bucal, se cita la presencia de fitolitos en mandíbulas humanas (Fox et al. 1996).

Medicina veterinaria. Los efectos de la ingesta de sílice por animales, han sido demostrados por la presencia de fitolitos en el tracto digestivo (Armitajge 1975).

Paleoecología. Actualmente se están usando los estudios sobre fitolitos, como una herramienta más para la reconstrucción del clima y de ambientes pasados, ya que los fitolitos pueden suministrar información de las plantas que crecen o que crecieron en un determinado lugar. Al morir estas plantas o sus órganos por lo general dejan en el suelo sus restos, los cuales permiten seguir el rastro de las plantas que generaron los fitolitos (Fredlund & Tieszen 1997). Según Flórez y Parra (1999b), los fitolitos fósiles permiten establecer algunos procesos pedogenéticos ocurridos durante la formación de los Andisoles, entre ellos la hidratación y la corrosión de los fitolitos como respuesta a condiciones de alta humedad y acidez en presencia de sustancias orgánicas y también la susceptibilidad selectiva de los fitolitos a la alteración en el ambiente edáfico, lo cual se manifiesta como modificación, creación o pérdida de la ornamentación. 154

Taxonomía y sistemática vegetal. La diversidad en forma y tamaño que presentan los fitolitos de los grupos vegetales en los cuales se encuentran, pueden ser utilizados para la delimitación taxonómica o para indicar parentesco o relación filogenética de estos grupos (Piperno & Pearsall, 1998).

NOMENCLATURA DE LOS FITOLITOS. Según Salgado-Labouriau (1973) los fitolitos aparecen con formas de:

Láminas epidérmicas sin estomas (Figura 1.68).

Figura 1.68. Láminas epidérmicas sin estomas.

Láminas epidérmicas con estomas. Estos últimos llamados estomas asociados (Figura 1.69). Los estomas pueden ser circulares.

155

Figura 1.69. Láminas epidérmicas con estomas (estomas asociados).

Fitolitos con forma de estomas aislados (Figura 1.70).

Figura 1.70. Fitolitos con forma de estomas aislados.

156

Fitolitos en forma de cuerpos alargados constrictos en el centro. Son llamados huesos por su parecido con ellos. Estas formas de fitolitos pueden estar aislados (Figura 1.71) o en hilera (Figura 1.72).

Figura 1.71. Fitolitos en forma de

cuerpos

constrictos

en

alargados el

centro,

llamados huesos aislados.

Figura 1.72. Fitolitos en forma de cuerpos alargados constrictos en el centro, llamados huesos en hilera.

157

Láminas con tricomas (Figura 1.73 A) o con tricomas y estomas (Figura 1.73 B).

Figura 1.73. Tricomas y estomas de algunos géneros de gramíneas entre los cuales se encuentra el género Zea. A: Láminas con tricomas. B: Láminas con tricomas y estomas. (Metcalfe, 1960).

A

B

Para Flórez y Parra (1999a y 1999b) no existe un sistema único de clasificación o de nomenclatura de los fitolitos actuales o fósiles, y al parecer, está muy lejos de conseguirse. Esto es una necesidad apremiante en la medida que nuevos descubrimientos e investigadores se interesan por este tema. Basados en la revisión realizada por Rapp & Mulholland (1992), estos autores reconocen dos grandes tendencias generales para la clasificación de los fitolitos:

SEGÚN EL ORIGEN BOTÁNICO DEL FITOLITO Tiene en cuenta los fitolitos de la vegetación actual. Es la nomenclatura de mayor uso por parte de botánicos y fisiólogos vegetales. Se basa en el hecho de que los fitolitos son moldes o partes de órganos específicos de las plantas. Al fitolito se le da un nombre según uno de los siguientes criterios:

Según el órgano donde se forma el fitolito toma el nombre de dicho órgano. Por ejemplo: complejo estomatal, tricoma, etcétera. 158

Según la jerarquía taxonómica a la cual pertenece el taxón donde se encuentra el fitolito. Por ejemplo bambusoide, panicoide (fitolitos en forma de cruz delgada, cruz gruesa), pooide (en luna creciente, circulares). Como se puede apreciar algunos fitolitos son denominados según la forma y ornamentación. Por ejemplo: en cruz, en pesa de gimnasia, cónicos, etcétera.

Varios autores como Metcalfe (1960), Bertoldi (1971), Piperno (1982), Pearsall y Dinan (1992), Twiss (1992) combinan estos criterios en mayor o menor grado, según la importancia relativa que se le debe dar a cada criterio y en el nivel jerárquico que este determina en la taxonomía.

SEGÚN LA MORFOLOGÍA DEL FITOLITO Es la nomenclatura seguida por los paleontólogos, geólogos y biólogos. Toma como único criterio de clasificación válido, el fitolito individual no articulado y sus parámetros morfológicos, sistema de clasificación propuesto por Bertoldi de Pomar (1975). Los nombres de los fitolitos siguen las reglas del Código de Nomenclatura Botánica por lo cual son binomiales latinizados, que corresponden a género y especie. El nombre del género incluye tanto la forma general como la ornamentación (prefijo) y está acompañado de un sufijo propio para los fitolitos (fites).

Zucol (2001) describió los elementos fitolíticos en 49 elementos morfológicos agrupados como formas articuladas (cuando el fitolito está conformado por más de un elemento anatómico). Las formas articuladas puede a su vez tener formas geométricas u otras formas (redondeadas, poliédricas, flaveladas, entre otros) y formas aisladas (cuando el fitolito está compuesto por un único elemento anatómico), también pueden tener subformas, variaciones en las paredes, entre otros Estos grupos son:

159

Formas articuladas 1.

Elementos subepidérmicos

2.

Elementos buliformes

3.

Células largas

4.

Células cortas

5.

Aguijones

6.

Ganchos

7.

Pelos enteros o fragmentados

8.

Aparatos estomáticos

9.

Fitolitos no identificados

Formas aisladas. Clase Pooide: 10.

En luna creciente

11.

Circulares

12.

Rectangulares

13.

Redondeados

14.

Elípticos

15.

Crenados y oblongos

16.

De doble contorno

17.

Trapezoidales

Clase Chloridoide: 18.

Chloridoide normal

19.

Chloridoide delgado

20.

En silla de montar

160

Clase Panicoide: 21.

Cruz gruesa

20.

Cruz delgada

21.

Halteriformes de centro cóncavo y final convexo

22.

Halteriformes de centro corto y final convexo

23.

Halteriformes de centro largo y final convexo

24.

Halteriformes de centro corto y final recto

25.

Halteriformes de centro nodular

26.

Halteriformes de centro espinoso

27.

Halteriformes complejos y regulares

28.

Halteriformes complejos e irregulares

29.

Halteriformes crenados

Clase Elongados: 30.

Elongados lisos

31.

Elongados sinuosos

32.

Elongados espinosos

33.

Elongados espinosos con piso

34.

Elongados de final cóncavo

Clase en Abanicos y Poliédricos: 35.

Abanicos lisos

36.

Abanicos crenados

37.

Abanicos con piso

38.

Poliédricos lisos

39.

Poliédricos crenados

40.

Poliédricos con piso

161

Clase Aguzados: 41.

Porciones medias de pelos

42.

Ápices de formas aguzadas (pelos, aguijones o ganchos)

43.

Pelos unicelulares

44.

Aguijones enteros

45.

Ganchos enteros

46.

Formas triangulares

47.

Espacios intercelulares

BIBLIOGRAFÍA FITOLITOS Arai M. & Lana C. C. 2001. Dinoflagelados. In Carvalho I. S. ed.: Paleontologia. Editora Interciência, pg. 327 - 353. Armitajge P.L. 1975. The extraction and identification of opal phytoliths from the teeth of ungulates. Journal of archaeological Science. Bertoldi del Pomar H. 1975. Los silicofitolitos: sinopsis de su conocimiento. Darwiniana. Vol. 19, nº 2-4: 173-206. Bertoldi del Pomar H. 1971. Ensayo de clasificación morfológica de los silicofitolitos. Ameghiniana 8(3-4): 317-328. Bignot, G. 1988. Los microfósiles. Editorial Paraninfo, S.A. 284 págs. Madrid Blackman E. 1971. Opaline silica bodies in the range grasses of southern Alberta. Canadian Journal of Botany 49: 769-781. Brown D. 1986. Taxonomy of midcontient grasslands phytolith key. En: Rovner, I. Ed. Plant opal phytolith analysis in archeology and paleoecology, 89-102. Raleigh. Brown D. A. 1984. Prospects and limits of a phytolith key for grasses in the Central United State. Journal of Archaeological Science 11: 345-368. 162

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GRANOS DE ALMIDÓN En ambientes de difícil preservación de restos orgánicos, como son los suelos tropicales, debido a condiciones de alta humedad y temperatura, los restos microbotánicos como polen, fitolitos y almidones están siendo de gran importancia para estudiar las relaciones paleoecológicas de los seres humanos con su entorno ambiental. La aplicación de estos análisis en Colombia está abriendo muchas posibilidades para abordar el tema de la explotación de los recursos vegetales, superando el enfoque tradicional de reconstruir la economía de los grupos del pasado con base en la cultura material, como la cerámica o los artefactos líticos. De ahí la importancia creciente que está adquiriendo la microbotánica como subdisciplina paleoecológica, donde interceptan disciplinas como la biología y la arqueología.

Los granos de almidón son hidratos de carbono insolubles en agua fría que se encuentran en los órganos almacenadores de las plantas tales como raíces, tallos subterráneos (bulbos, rizomas y tubérculos) y semillas (Gurni y Wagner 2006), constituyen la principal reserva de alimento de las plantas. Desde un punto de vista químico, el almidón está formado por dos polímeros: amilosa y amilopectina, que las plantas sintetizan a partir del dióxido de carbono, que absorben de la atmósfera y del agua del suelo, en forma de glucosa y uniones moleculares para formar las largas cadenas de almidón.

El crecimiento de los granos de almidón se produce a partir del hilum o cruz de malta, en forma de capas o anillos concéntricos de amilasa y amilopectina que a veces pueden ser visibles (Pagan et al. 2005). El grano de almidón puede ser un grano simple -cuando presenta un solo hilum- ó compuesto -cuando presenta más de un hilum-. La ubicación del hilum puede ser central o en un extremo del grano (Gurni y Wagner 2006). La forma del hilum puede ser estrellado, circular y lineal (Figura 1.74) y puede estar en uno de los extremos del grano, las formas 167

son variables (Figura 1.75). En concreto la morfología depende de la cantidad de amilasa que contienen los granos (Pagan et al. 2005) y para su descripción, son tomados en cuenta el tamaño, la posición del hilum y la forma del grano.

Su especificidad morfológica junto a su buena preservación, ha convertido a los granos de almidón en uno de los principales restos microbotánicos para estudiar el manejo de las plantas en contextos arqueológicos e históricos donde no se cuenta con otro tipo de evidencias. Por ejemplo, gracias a la recuperación de granos de almidón junto al polen fósil, se sabe que desde la transición Pleistoceno/Holoceno, se intensificó fuertemente la manipulación de plantas en el continente americano, dando como resultado la domesticación de algunos de los principales cultivos actuales como son el maíz (Zea mays), yuca (Manihot esculenta), mafafa (Xanthosoma saggitifolium), aguacate (Persea americana), Maranta arundinacea, Lagenaria siceraria, ají (Capsicum sp.), etc. (Gnecco y Aceituno 2006).

Otra de las aplicaciones de los granos de almidón es que complementan muy bien la información obtenida de los granos de polen, los restos microbotánicos por excelencia para estudiar la evolución de la cobertura vegetal. A diferencia del polen, los almidones se pueden recuperar directamente de artefactos, como recipientes

cerámicos

e

instrumentos

líticos,

y

de

piezas

dentales

proporcionándonos información directa sobre las plantas manipuladas y consumidas por el ser humano. Aplicando las tres técnicas de análisis (esporas y polen, fitilitos y granos de almidón) se puede obtener una buena imagen de la flora local y de los recursos manipulados, esperando hallar una buena correspondencia taxonómica entre ambos tipos de partículas, debido a que lo lógico es que la mayor parte de las plantas procesadas procedan de la flora local recolectada en las áreas de captación próximas a los asentamientos humanos.

168

Figura 1.74. Morfotipos de los granos de almidón.

Figura 1.75. Forma del hilum de los granos de almidón.

169

BIBLIOGRAFÍA Gurni A. A. y Wagner M. L. 2006. Farmacobotánica: trabajos prácticos. Centro de estudiantes de Farmacia y Bioquímica. UBA. Buenos Aires.

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PALEOPALINOLOGÍA ANÁLISIS PALINOLÓGICO DE SEDIMENTOS Cuando el polen cae en lugares de baja oxidación como en suelos, turberas, lagunas y lagos, se va acumulando en capas sucesivas y puede ser fosilizado por miles o millones de años, los granos de polen conocidos como los más antiguos, datan de aproximadamente 300 millones de años. El estudio de estos granos de polen fosilizados permite la reconstrucción de las sucesiones florísticas y cambios climáticos que ocurrieron en una zona determinada. En los sedimentos se encuentran fósiles de semillas, granos de polen y otras estructuras de la vegetación que existieron en la tierra desde hace miles o millones de años. Con base en dichos fósiles se puede comprobar que una región desértica pudo haber sido una zona boscosa. La sucesión estratigráfica de los fósiles en el sedimento, permite formar una idea de los cambios sufridos por la vegetación a lo largo del tiempo geológico.

170

La palinología se centra fundamentalmente en el análisis de la morfología externa del polen la cual presenta patrones estructurales diferentes en la superficie de la exina, que es la pared externa de los granos de polen. El estudio y análisis microscópico de su unidad polínica, aberturas en las paredes, contorno en vista ecuatorial y en vista polar, forma, tamaño, polaridad, simetría, entre otros tiene un alto valor taxonómico y permite distinguir taxones diferentes a distintos niveles (familia, géneros, especies). En la paleontología alcanza su máxima aplicación, pues el polen tiene gran resistencia a la descomposición gracias a las características químicas de la exina.

El estudio de las esporas y granos de polen fósiles o subfósiles contenidos en sedimentos, recibe el nombre de paleopalinología y tiene amplias perspectivas de aplicación tales como: trazar la historia de taxones o comunidades vegetales y sus habitats, datación de depósitos, estudio de la historia climática, influencia del hombre sobre el ambiente, control de la profundidad en sondeo de petróleo, análisis de carbón mineral. La paleopalinología se basa en la propiedad de fosilización que tienen el polen, las esporas y otros microfósiles de origen animal o vegetal, denominados palinomorfos.

Con el término palinomorfo se indican las partículas de origen terrestre, lacustre o marino que provienen de materia orgánica y se encuentran en sedimentos y rocas sedimentarias, tales como: esporas, polen, restos de algas de agua dulce, dinoflagelados, etc. cuyos tamaños oxilan entre 5 y 500 micrómetros. Los palinomorfos, al igual que el polen y las esporasp son importantes en la correlación de unidades litoestratigráficas y son utilizados en la bioprospección de petróleo. Los palinomorfos pueden ser transportados por el viento, o a través de otros vectores como los animales, el agua, entre otros y depositados sobre diferentes materiales. Estos microfósiles sedimentados en un determinado lugar a lo largo del tiempo experimentan procesos de fosilización de manera que se pueden 171

extraer, datar e identificar y deducir cómo era la vegetación en el pasado, la evolución vegetal, extinciones de especies vegetales y todos aquellos aspectos relacionados con la biogeografía histórica de las plantas (geobotánica o fitogeografía). Además se pueden inferir otras características del paisaje, que en conjunto con otras disciplinas (arqueozoología, paleoantropología, paleobotánica), permita la reconstrucción de ambientes fósiles en el tiempo y espacio. Por ejemplo, según la enciclopedia Wikipedia, la paleoclimatología, emplea la paleopalinología como herramienta frecuentemente. Este uso se debe a que las especies vegetales mantienen óptimos ambientales bajo distintas circunstancias climáticas. Una simplificación del mecanismo inductivo que se emplea para la reconstrucción climática es el siguiente: si una especie que hoy es típica de ambientes fríos y húmedos es hallada depositada en materiales de una determinada época del pasado podemos inferir que el clima durante ese periodo era frío y húmedo. Por supuesto el proceso de interpretación de la ecología de ambientes pasados no es tan simple y se deben considerar numerosos aspectos como la interacción entre las diferentes especies dentro de una comunidad vegetal, la amplitud ecológica de los taxones, entre otros. Los depósitos polínicos en los sedimentos, tienen su inicio en la formación y transporte de los granos de polen desde la antera hasta el estigma receptor. Durante la floración pasa a la atmósfera un gran número de granos de polen, aún de plantas zoófilas. Sólo una mínima parte cae a los estigmas durante el proceso de polinización para efectuar la fecundación. La mayor parte del polen se deposita sobre la tierra, nevados, océanos, lagos. Gran parte de esos granos es destruida, pero en casos especiales, por ejemplo cuando hay deficiencia de oxígeno, la pared de los mismos puede conservarse casi intacta. Esto ocurre principalmente en lodos anaeróbicos del fondo de los lagos y en turberas en formación. Al irse acumulando

material,

las

deposiciones

polínicas

van

siendo

cubiertas

172

consecutivamente formando un archivo de la vida orgánica en en la cual se formó el depósito.

El polen fósil se encuentra en muchos tipos de sedimentos de diferentes edades, incluyendo depósitos de basuras en grutas, coprolitos, dunas de arena fosilizada, depósitos glaciales y de sales. Preferentemente se encuentra polen fósil en sedimentos donde no hubo posibilidad de que se oxidaran los palinomorfos o se destruyeran por acción de microorganismos, por ejemplo las rocas silicoalumínicas (arcillas, pizarras), las combustibles (turba, lignito, hulla) y los barros lacustres. El color de los sedimentos es un excelente indicador de la presencia de palinomorfos, ya que estos se encuentran en rocas que toman color oscuro producido por su contenido orgánico. Al inicio de los estudios palinológicos de los sedimentos, el cuaternario fue una de las épocas geológicas más estudiadas, pero actualmente se ha incrementado este estudio a otras épocas geológicas.

NOMENCLATURA PARA LOS GRANOS DE POLEN Y PALINOMORFOS FÓSILES.

Para identificación de los granos de polen y palinomorfos fósiles, se comparan los caracteres morfológicos de estos con especies actuales, para clasificarlos en familias, género y especies. Para dar los nombres al polen fósil se les aproxima a un taxón actual y se agrega el sufijo dites, ejemplos: Cyathidites sp., Podocarpidites sp. Para las esporas agrega el sufijo sporites, por ejemplo Cicatricosisporites sp., Emphanisporites sp. A medida que nos alejemos en la escala cronológica, menos exactas se van volviendo las relaciones con la flora actual. Si no hay afinidad conocida se crean géneros y especies artificiales, por ejemplo Diporites reticulatus, tricolpites sp.

DIAGRAMA POLÍNICO. Con los métodos palinológicos es posible reconstruir la flora del Cuaternario (hasta 2,5 millones de años) pero de ahí hacia atrás cada vez es más difícil, 173

haciéndose casi imposible por debajo del Terciario (que va hasta 65 millones de años). El polen del Cuaternario es posible identificarlo hasta nivel genérico y del Cretáceo hasta familia. Para las épocas más remotas, es necesario crear grupos artificiales de clasificación del material poco a poco descubierto.

Aun en el caso de que no se consiga identificar ni un solo polen fósil y se tengan que describir con números, letras u otro sistema, igualmente ofrecen un instrumento científico de gran valor, ya que la ubicuidad de estos microfósiles y la regularidad de los cambios de su frecuencia, suministran una escala de tiempo a la que se puede referir todos los acontecimientos de los períodos cubiertos por la deposición de los sedimentos poliníferos. El conocimiento de la identidad de los granos de polen aumenta la posibilidad de conocer los cambios de la vegetación y los cambios climáticos.

En la estratificación de sedimentos, con miras a facilitar el uso de la información obtenida, para cada uno de la serie de niveles verticales se calcula el espectro polínico, o sea el porcentaje de composición de cada taxón en el nivel analizado, los datos se representan gráficamente. A esta representación gráfica de los espectros polínicos se le denomina diagrama polínico (Figura 1.76).

174

Figura 1.76. Perfil de polen de los sedimentos de un lago de Nueva escocia. Los números del eje horizontal se refieren a la abundancia relativa de cada tipo polínico (D.A. Libingstone, Ecological Monographs 38, 87-125, 1968).

En la elaboración de un diagrama polínico se debe conocer el tipo de sedimento donde se tomaron las muestras, se puede escribir el nombre o dibujar un símbolo para sedimentos, turbas acuáticas o turbas terrestres. Se expresa el grado de pureza del tipo, mediante una escala de 1 a 4, en la cual 4 representa el tipo más puro e indicar el grado de destrucción o humedad de la turba. Las profundidades de los niveles se representan en ordenadas y los espectros de cada nivel en abscisas. También pueden existir diagramas combinados en los cuales unas “líneas polínicas” unen los espectros representados por signos convencionales, lo que permite observar simultáneamente las variaciones de varios taxones.

Al interpretar los resultados del análisis polínico de un determinado sedimento se debe tener en cuenta: 1.

No pueden tratarse de igual manera las plantas de polinización anemófila y las de polinización entomófila, pues las primeras tienen un ámbito de polinización más amplio. Las plantas de polinización entomófila pueden ser consideradas como indicadoras, pero no deben ser incluidas en los porcentajes totales, ya que su ausencia en el depósito no significa que no existieron en el área estudiada. Sólo la presencia de un taxón es significativa, pero no lo son su ausencia ni su frecuencia.

2.

Las esporas y granos de polen depositados no deben estar deformados cualitativa ni cuantitativamente, para que su conteo permita reconstruir el pasado.

3.

Las esporas y granos de polen depositados en un punto deben permitir reconstrucción con fidelidad la vegetación existente en la época del depósito.

175

ALCANCES DE LA PALEOPALINOLOGÍA Los palinomorfos fósiles, juntamente con los granos de polen y esporas de pteridofitas,

se

utilizan

para

estudios

paleoambientales,

paleoecología,

fitogeográficos, correlaciones y bioestratigrafía de carbones. La importancia principal de los palinomorfos fósiles radica en su aplicación en la bioprospección de hidrocarburos fósiles (Armstrong & Brasier, 2005).

Algunas de las aplicaciones de la paleopalinología son: Historia climática y de la vegetación. El estudio de los depósitos polínicos (principalmente del cuaternario) en yacimientos de turba o lodos, suministra datos sobre la vegetación, cambios climáticos, deforestación, agricultura, otras influencias humanas y cambios morfológicos del terreno. El diagrama de un análisis palinológico es un resultado valioso, ya que registra la historia de la vegetación de un área, permitiendo deducir los eventos que han afectado la vegetación. Los fósiles vegetales son muy importantes debido a que las plantas evolucionan más lentamente que los animales, lo cual hace que la identificación de especies de épocas remotas pueda realizarse con mucha aproximación por comparación con especies recientes.

La historia de las comunidades vegetales presenta diversos intereses. Ellas formaron el ambiente que influyó en otras poblaciones vegetales y animales, de tal manera que no se puede interpretar la historia de la fauna y la flora sin su adecuado conocimiento. Eran así mismo el hogar de las razas humanas prehistóricas, cuya supervivencia y cultura dependía de su ambiente. Además, la existencia de dichas comunidades vegetales quedó determinada por las condiciones climáticas prevalentes, de modo que el estudio climatológico del pasado está implícito en las investigaciones de los tipos vegetales extintos.

La historia climática siempre ha sido un clásico y complejo problema. La vegetación no es un instrumento meteorológico universal y los principales factores climáticos que la afectan, son una parte del complejo climatológico. Por ejemplo, 176

en regiones húmedas y muy frías hay suficiente disponibilidad de humedad, pero la temperatura es demasiado baja para un desarrollo óptimo de los tipos de vegetación más exigentes y la vegetación reaccionará drásticamente a los cambios de temperatura: con el incremento de la temperatura, las especies que requieren calor estarán en condiciones favorables y conquistarán grandes áreas. Con la disminución de la temperatura retrocederán nuevamente. Así, las fluctuaciones climáticas registradas en un diagrama polínico de esas regiones son principalmente de temperatura.

Por otra parte, los períodos de principal aplicación del análisis palinológico son el postglacial y el interglacial que son precisamente aquellos en los que faltan las escalas cronológicas. El tiempo transcurrido en éstos fue demasiado breve para la evolución y dispersión de los organismos que podrían haber servido de fósiles de zonación geológica y los posibles índices alternativos, por ejemplo los restos de culturas humanas, se dan sólo local y esporádicamente. Los cambios geológicos no se detuvieron durante dichos períodos: se han dado las grandes y repetidas desviaciones climáticas glaciales a interglaciales, los correspondientes ciclos de acción atmosférica, erosión, acarreo y deposición, alteración de los niveles oceánicos por congelación y deshielo de las grandes masas árticas y antárticas y por la curvatura diferencial de la corteza terrestre debida al peso de estas masas, formación de lagos, desarrollo de turberas, modificación de ríos y costas, entre otros Relacionadas con dichos fenómenos, se han producido las migraciones, la evolución de la fauna y flora y del hombre mismo.

Además del clima, el cultivo es un importante factor que influye directamente en los diagramas polínicos. Cuando un área es despejada para agricultura u otros propósitos, cambia la composición cuantitativa de la flora. Algunas especies desconocidas en la región o de distribución muy limitada, llegan a ser dominantes y consecuentemente su polen llega a ser un constituyente de la sedimentación polínica y puede ser de gran valor como indicadores de cultivo permitiendo formar una idea de la vida real en el pasado. 177

Datación. El análisis palinológico fue un importante instrumento de datación, pero la datación con carbono radiactivo (radiocarbono) ha tornado este trabajo más barato y eficiente. Sin embargo, solamente suministra información cronológica, mientras que el análisis palinológico da información adicional sobre la situación biológica, por lo cual todavía es apreciado para datación de sedimentos.

Geología. Permite trazar horizontes de una misma edad y hacer escalas cronológicas de aplicación en la solución de los problemas geobotánicos.

Arqueología. En los estudios arqueológicos ayuda en la datación de objetos y para la identificación de plantas cultivadas por las culturas indígenas que tuvieron asentamiento en determinadas regiones del país, mostrando la intervención del hombre precolombino en la modificación de la vegetación. Los objetos arqueológicos son los más frecuentemente datados por análisis palinológicos para aclarar el contexto biológico de ciertos artefactos, establecer correlaciones entre culturas

humanas,

evidenciar

rituales

hasta

entonces

desconocidos

y

modificaciones de la vegetación causadas por el hombre, suministrando información sobre deforestación e inicio de la agricultura (Melhem, 1978). Según Fægri & Iversen (1966), la deforestación se indica por la marcada disminución cuantitativa de los granos de polen de especies arbóreas y el inicio de la agricultura muestra el aumento progresivo de los granos de polen de especies nativas cultivadas pero no presente en períodos anteriores, o la aparición repentina de granos de polen nuevos, cuando la especie es introducida.

Otros palinomorfos analizados en líticos y objetos arqueológicos son los fitolitos y los granos de almidón, cuya morfología al igual que los granos de polen permanece constante en las especies, permitiendo crear relaciones filogenéticas.

PREPARACIÓN DE POLEN FÓSIL Las técnicas de análisis palinológico de sedimentos encierran dos pasos principales: la toma de la muestra en el campo y el trabajo en el laboratorio. En la 178

toma de las muestras se debe tener mucha precaución para evitar contaminación. El material recogido debe manipularse con pinzas y espátulas limpias, indicar el lugar de recolección, condiciones, tipo de sedimento y estratificación. En épocas lluviosas no es correcto tomar muestras, debido al alto riesgo de contaminación, lo cual se traduce en resultados erróneos del análisis. Cuando el material es duro (por ejemplo carbones, pizarras) hay que triturarlo y homogenizarlo.

El lugar de muestreo depende del objetivo del trabajo: si se pretende realizar estudios sobre fisonomía de la vegetación, las muestras se recogen en lagunas que dependan del clima y la vegetación.

Para un estudio integral de la vegetación, la toma de muestras se debe realizar preferiblemente en depósitos de lagos que no estén rodeados de pantanos, ya que en estos lagos, la formación madre no influye en la preservación del polen como ocurre en las turberas. El muestreo debe hacerse en sitios sin vientos, lejos de las corrientes y cuencas de ríos para evitar contaminación y oxidación. Debe tenerse en cuenta que suelos con menos del 1% de materia orgánica posiblemente no contengan polen.

Según Pearseall (2000) a partir de sus trabajos en Centro y Sur América, afirma que los peores ambientes para la preservación del polen son: ambientes con alcalinidad elevada, suelos o sedimentos con depósitos de agua, suelos con alto porcentaje de hojas enmohecidas y suelos arcillosos de los ríos y en cambio que, los suelos ácidos, los depósitos de sedimentos ácidos, la presencia de sales metálicas (ejemplo sales cúpricas), y el alto contenido de áridos (áreas desérticas, cuevas secas) tienen mayor probabilidad de preservación del polen, ya que éstos factores inhiben el crecimiento microbiológico, el cual es crucial para la preservación del polen. Una vez seleccionado el sitio de muestreo, se limpia la superficie con un cuchillo y se introduce el tubo de muestreo presionando hacia dentro de la superficie. Si se quiere analizar la superficie, se corta un pedazo de suelo a la profundidad 179

deseada. Para toma de muestras profundas, existen diversos tipos de aparatos que introducen el tubo recolector mediante mecanismos de torsión que aíslan la muestra (Figura 1.77) o las canaletas de aluminio inoxidable, utilizadas para recoger directamente la muestra por presión en el sedimento.

Para procesar el material se tritura y luego se ataca con ácidos que suprimen los minerales y permite aislar la materia orgánica y los microfósiles, tales como: Ácido clorhídrico para atacar los carbonatos, ácido fluorhídrico para la disolución de la sílice, ácido nítrico para oxidar y eliminar el exceso de materia orgánica, blanquear y limpiar el polen y las esporas que se van estudiar. Los estudios se realizan con microscopio óptico o en microscopio electrónico de barrido.

Figura 1.77. Barreno modificado para muestreo de sedimentos, presenta un tubo de acero que encierra un pistón retractable. PALEOMICOLOGÍA Los hongos raramente producen tejidos duros y resistentes por lo cual dejan pocos residuos fósiles en los sedimentos. Los filamentos simples o ramificados (hifas), esporas y cuerpos fructíferos son las principales estructuras fósiles que se pueden encontrar y son estudiados por la paleomicología. Los restos fosilizados de

hongos,

generalmente

pertenecen

a

la

División

Eumycota,

clases

Deuteromycetes (hongos imperfectos) y Ascomycetes (hongos perfectos). La primera clase comprende un grupo grande de hongos donde está ausente la fase sexual y en la segunda clase se incluyen los hongos que presentan las dos fases reproductivas. (Traverse 1988, Elsik W.C. 1996, Kalgutkar R.M. & Jansonius J. 2000, Pedrão-Ferreira E. et al. 2005).

180

Para estudios palinológicos, los microfósiles de los hongos pueden ser recuperados a partir de la trituración de las rocas de los sedimentos. Los análisis químicos realizados en esporas de hongos fósiles o recientes, generados en cualquiera de las dos fases del ciclo reproductor muestran composiciones diferentes, las paredes de las esporas asexuales están compuestas de polisacáridos, la mayoría de los componentes orgánicos son β-carotenos (esporopolenina) y en las paredes de las esporas sexuales predomina la quitina sobre la esporopolenina (Shaw G. 1971, Pedrão-Ferreira E. et al. 2005). Los representantes fósiles de los hongos son identificados y clasificados hasta nivel genérico y específico con base en las características morfológicas, ya que las esporas se encuentran aisladas del tejido del micelio. La morfología de los restos fósiles de los hongos es muy diversa, siendo la espora (figuras ) uno de los elementos básicos para la clasificación. Las principales estructuras morfológicas utilizadas en la identificación y clasificación de las esporas son los septos, las aberturas, la pared y la ornamentación. El color de las esporas de los hongos fósiles varía de amarillo transparente a negro opaco. A pesar de la preservación parcial de los hongos en los registros fósiles, los especímenes se asemejan morfológicamente a los taxones recientes, permitiendo muchas veces una nomenclatura basada en estos mismos.

C A

B

A: Inapertisporites sp., B: Diporisporites sp., C: Fusiformisporites crabbii (Tomadas de Pedrão-Ferreira E. et al. 2005). 181

Los hongos son identificados en casi todas la columnas geológicas. En las rocas precambrianas son observadas formas semejantes a hongos, las cuales son denominadas Cryptarcha (Tiffney B.H. & Barghoorn E.S. 1974, Pedrão-Ferreira E. et al. 2005). Son raros los registros de hongos en rochas paleozoicas, hecho considerado como una consecuencia de la baja evolución de las partes duras de los hongos. Sin embargo, muestran que los hongos desempenaron importante papel en la conquista de la tierra por las plantas (Rhyniophitas) en el Silurico Superior, a través de asociaciones del tipo micorrizas con estas plantas (Taylor T.N. & Taylor E.L. 1993, Diagrama polínico). A partir del Mesozoico, su presencia se hace más frecuente y diversificada. Kalgutkar R.M. & Jansonius J. (2000), reportan que el aumento de la frecuencia y variedad morfológica de los hongos registrados en depósitos del Cenozoico está relacionado con la evolución de las angiospermas (Pedrão-Ferreira E. et al. 2005).

En las interpretaciones paleoclimáticas los hongos son utilizados como indicadores de clima caliente y húmedo (Staplin F.L. 1976; Jarzen D.M. & Elsik W.C. 1986; Pedrão-Ferreira E. et al. 2005) y para sugerir los cambios en la vegetación causados por las alteraciones climáticas (Wolf F.A. 1966 a, b; 1967; Van Smeerdijk D.G. 1989; Pedrão-Ferreira E. et al. 2005). En términos paleoambientales, estos palinomorfos son reportados más frecuentemente en ambientes marginales (Muller J. 1959, Pedrão-Ferreira E. et al. 2005), estuarios y en áreas resurgentes (Cross A.T. et al. 1966, Pedrão-Ferreira E. et al. 2005). Algunos géneros de hongos son indicadores de aguas dulces (Elsik W.C. 1996, Pedrão-Ferreira E. et al. 2005).

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PÁGINAS WEB O ENLACES SOBRE PALEOPALINOLOGÍA www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl www.biol.ruu.nl/%7Epalaeo/glossary/glos-int.htm www.invdes.com.mx/forma01.cfm?id=688&publicant=oct%202004 www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.biol.ruu.nl/%7Epalaeo/glossary/glos-int.htm www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl/palinologia.html www.paleobotanica.uchile.cl AASP – American Association of Stratigraphic Palynologists (Web oficial)

188

AEROBIOLOGÍA Y AEROPALINOLOGÍA Según Mandrioli (1998), en el aire se encuentra un amplio número y diversidad de partículas en suspensión, las cuales constituyen el aerosol atmosférico (Figura 1.78). Entre éstas se encuentran las llamadas biopartículas del aire que comprenden: 1.

Esporas, hifas y otras estructuras de hongos de tamaños entre 1 y 100 μm

2.

Esporas de musgos de tamaño entre 6 y 30 μm

3.

Esporas de helechos de tamaños entre 20 y 60 μm

4.

Granos de polen de gimnospermas y angiospermas de tamaños entre 10 y 100 μm y

5.

Otras partículas provenientes de organismos o restos de organismos.

Figura 1.78. (placa que muestre hongos y polen o esporas)

AEROBIOLOGÍA El estudio de biopartículas contenidas en el aire, recibe el nombre de aerobiología, disciplina que busca comprender la dispersión de enfermedades en el hombre, animales y plantas y con ello buscar su prevención (Lacey & West 2006). El término Aerobiología fue introducido por F. Meier en la década de 1930, para denominar los estudios sobre la diversidad del polen, las esporas de hongos y bacterias contenidos en la atmósfera y su repercusión en el entorno (Gregory 1973). 189

Las variaciones de las biopartículas en la atmósfera tienen un origen multifactorial, su contenido es influido positivamente por la temperatura y negativamente por la lluvia, además de otros factores determinantes, por ejemplo la altitud o las corrientes y direcciones del aire. Después de estas consideraciones, podemos definir la Aerobiología como: una disciplina dedicada al estudio de todas las partículas biológicas microscópicas, presentes en el aire, que son transportadas pasivamente por el viento. La aerobiología es una ciencia multidisciplinaria que comprende la liberación, retención, dispersión, deposición e incidencia atmosférica de esporas, granos de polen y otros microorganismos aerovagantes, así como su repercusión en el ambiente. Desde entonces, se han ido incluyendo en esta ciencia el estudio de otras partículas biológicas aéreas como: virus, microalgas, microhongos, fragmentos de líquenes (soredios), pequeñas semillas, fragmentos de plantas superiores, protozoos, pequeños insectos, entre otros. La Aerobiología es una ciencia que ha ido abarcando cada vez más campos y aplicaciones científicas para diagnosticar y solucionar problemáticas biológicas y ambientales

en

aéreas

como

la

medicina,

fitopatología,

entomología,

meteorología, medio ambiente, agricultura y criminalística (Brown 2004; Dopazo et al. 2000), toda vez que también se considera de gran importancia, en los estudios sobre aerobiología, la propagación de enfermedades en el hombre, animales y plantas, incluyendo las infecciones hospitalarias y la interacción entre la materia biótica y los contaminantes atmosféricos. La aerobiología realiza correlaciones con factores meteorológicos como la lluvia, la temperatura y la humedad, para conocer como fluctúan las partículas aerovagantes. Los procesos aerobiológicos se dividen en: liberación, transporte, deposición y resuspensión de las aeropartículas (Spieksma 1992): El proceso de liberación consiste en el paso de partículas (polen, esporas y otros palinomorfos) desde la fuente de producción hacia la atmósfera. Normalmente, 190

estas partículas son liberadas por medio de procesos pasivos como la acción del viento o de procesos mecánicos de las plantas (Gregory 1973). Los procesos relacionados con la permanencia, transporte y dispersión en el aire, están fuertemente ligados a los eventos atmosféricos. Esta parte de la aerobiología está determinada por el estudio de los factores físicos, como: las turbulencias del aire, la insolación, la lluvia, entre otros Pero también hay que tener en cuenta los aspectos aerodinámicos de las partículas como: forma, volumen, tamaño, peso, elasticidad, entre otros (Spieksma 1992). El proceso de deposición de las partículas en la superficie (agua, suelo, vegetación) se produce por efecto de la acción de la gravedad. Nilsson (1992) distingue dos tipos de deposición: deposición seca y deposición húmeda, en función de que intervenga o no la lluvia. Referente a los granos de polen, estos pueden quedar depositados, siendo retenidos por el sustrato, o bien impactar en diferentes tipos de receptores, dando lugar a la polinización o causando enfermedades en los humanos, este último efecto es el que los relaciona directamente con la alergología. En último lugar, después de la deposición de las partículas en los sustratos, existe la posibilidad de reflotación o resuspensión en el aire, repitiéndose los fenómenos de transporte y deposición. AEROPALINOLOGÍA La aerobiología comprende varias disciplinas especializadas, dentro de las cuales se encuentra la Aeropalinología, que estudia la distribución y frecuencia en la atmósfera de polen, esporas de los hongos, briófitos y pteridófitos y

otros

palinomorfos transportados por el aire y los relaciona con aspectos médicos por ser causantes de alergias. La aeropalinología es centro de atención científica desde que el estadounidense Blackley, en 1865, realizó la primera prueba de escarificación cutánea como medio de diagnóstico del catarro conocido como 191

fiebre del heno, demostrando que el polen de las gramíneas era capaz de inducir síntomas de alergia, y desde que Dunbar, a comienzos del Siglo XX, confirmara que la fiebre del heno era causada por inhalación del polen atmosférico a través de las vías respiratorias. Actualmente, se incluye también dentro de esta disciplina el estudio y análisis de las partículas y los gases abióticos que afectan a los organismos vivos, como asbesto, cadmio, dióxido sulfúrico, mercurio, monóxido de carbono, ozono, plomo, entre otros. Todas estas partículas son datos importantes que pueden ser usados en medicina (alergias) y en las ciencias forenses. Las partículas y los gases contaminantes pueden influir en la forma, ultra-estructura y viabilidad de los granos de polen y las esporas, así como modificar sus proteínas (alergénicos), aunque la importancia de esta interacción y el efecto final en los humanos son todavía poco conocidos (Nilsson 1992). POLEN ANEMÓFILO Cuando ocurre el florecimiento y polinización de las plantas, se producen grandes cantidades de granos de polen que pueden pasar a la atmósfera en mayor o menor grado (polen anemófilo o aerófilo). Este polen es transportado por el viento a grandes distancias según el tipo polínico. Otros granos de polen son transportados por animales (polen zoófilo) y recibe varios nombres según el agente que los transporta (entomófilo, por insectos; ornitófilo, por aves, entre otros), por varias causas el polen zoófilo también se encuentra en la atmósfera, aunque en menor cantidad. Las principales fuentes del polen presente en la atmósfera son las plantas anemófilas, especialmente gimnospermas y varias familias de angiospermas, principalmente gramíneas (cereales, pastos, etc.). La polinización anemófila en las plantas angiospermas es un carácter derivado que ha aparecido de forma independiente y está presente en cerca del 10% de este grupo de plantas (Ackerman 2000). El polen de las plantas anemófilas es de menor tamaño que el 192

de las zoófilas y presentan un menor rango de variación en su tamaño (17–58 µm), comparado con el polen transportado por animales (5–200 µm), lo cual representa una menor inercia y facilita la dispersión del grano desde las anteras Friedman & Barrett (2009). En el trópico, la ocurrencia de plantas con polen dispersado por el viento, es mucho menor en cuanto a cantidad y diversidad. A pesar de que se ha planteado que en bosques húmedos tropicales la anemofilia es un fenómeno raro o ausente, diversos estudios y autores han definido la ocurrencia de este síndrome en un amplio número de especies tropicales tanto arbórea como herbácea. Dependiendo de la especie vegetal sus granos de polen anemófilos pueden ser transportados por el viento hasta 300 km. Uno de los principales componentes del polvo ambiental es el polen aerófilo y ocasionalmente el entomófilo cuando es muy abundante. El polen que se encuentra en la atmósfera es dispersado por el viento, se eleva según las corrientes de aire ascendentes y luego comienza a descender lentamente. El polen y las esporas que se encuentran en la atmósfera y que se depositan en capas sucesivas sobre el suelo, tienen un doble origen: autóctono procedente de las plantas de los alrededores y alóctono, procedente de otras regiones y que son trasladados por las corrientes atmosféricas. La caída de polen autóctono y alóctono recibe los nombres de

precipitación,

sedimentación polínica o lluvia polínica. Las esporas de hongos y helechos también constituyen un importante porcentaje de componentes del aerosol atmosférico. Entre las esporas fúngicas halladas más comúnmente en la atmósfera se encuentran Alternaria, Cladosporium, Didymella, Epicoccum, Ganoderma y Leptosphaeria (Oliveira et al. 2009). El estudio de las esporas atmosféricas resulta de gran importancia ya que muchas de ellas pueden actuar como patógenos de plantas o generadores de enfermedades respiratorias y alergénicas en humanos (Oliveira et al. 2009).

193

POLINOSIS Las molestias respiratorias causadas por polen son denominadas genéricamente como polinosis. La primera definición científica de polinosis fue realizada por el estadounidense Bostock en 1819, la cual fue descrita como: un caso de una afección periódica de los ojos y el tórax, describía síntomas respiratorios que se presentaban en la primavera durante los meses de crecimiento de los pastos en Inglésaterra (junio-julio). Desde entonces hasta nuestros días, los avances tecnológicos aplicados a la aerobiología y en concreto a la palinología han permitido un mejor y más exhaustivo abordaje de esta disciplina, teniendo como fin último la aplicación práctica en un diagnostico preciso y tratamiento adecuado del paciente polínico. Actualmente la polinosis es definida como: la inflamación de la mucosa nasal, conjuntival y o bronquial causada por alérgenos contenidos en los granos de polen, a través de un mecanismo inmunológico mediado por IgE. La polinosis es un problema alérgico de importancia clínica y social de primer orden. Se calcula que una de cada 10 personas, padece esta enfermedad atópica sintomática. La más común es la rinitis alérgica que, por lo general, es la alergia que aparece en determinadas estaciones del año, es una de las enfermedades más molesta y persistente entre las enfermedades no fatales (Saa et al. 1996). La polinosis posiblemente es causada en el cuerpo humano por la reacción anafiláctica de las proteínas o glucoproteínas del polen (de la intina, exina o del mismo contenido protoplasmático). Los granos de polen y las esporas de algunos hongos, además de varias especies de ácaros microscópicos, son los alérgenos inhalados más comunes responsables de la polinosis. Aproximadamente el 50% de los casos de polinosis es causado por granos de polen de gramíneas (pastos, cereales, etc.), 20% por especies del género Ambrosia (altamisa o artemisia) y otros géneros de la familia Asteraceae, el resto por especies de las familias Betulaceae, Oleaceae, Urticaceae y otras.

194

Los granos de polen que desencadenan reacciones alérgicas provienen principalmente de varias especies de las siguientes familias o géneros: •

Amaranthaceae: Amaranthus.

•

Anacardiaceae: Mangifera, Schinus.

•

Arecaceae (Palmas).

•

Asteraceae (Compositae): Ambrosia, Artemisia, Taraxacum, Xanthium.

•

Betulaceae: Alnus.

•

Boraginaceae.

•

Cannabaceae: Cannabis.

•

Caprifoliaceae: Sambucus.

•

Chenopodiaceae: Chenopodium.

•

Cupressaceae, Pinaceae y otras gimnospermas.

•

Cyperaceae.

•

Euphorbiaceae: Ricinus.

•

Fabaceae.

•

Fagaceae: Quercus.

•

Hongos de los géneros: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium y Ustilago.

•

Juglandaceae.

•

Juncaceae.

•

Moraceae.

•

Oleaceae: Fraxinus, Ligustrum, Olea.

•

Plantaginaceae: Plantago.

•

Poaceae (gramíneas).

•

Polygonaceae: Polygonum, Rumex.

•

Salicaceae: Salix.

•

Tiliaceae.

•

Urticaceae: Parietaria, Urtica.

•

Otras plantas vasculares. 195

Según Valero & Cadahía (2002), las gramíneas son la causa más importante de polinosis en toda Europa, lo cual es atribuido a la alta alergenicidad polínica y a la amplia distribución de las especies. Los tipos polínicos de las gramíneas poseen un amplio patrón de bandas proteicas en análisis inmunoblot, a las cuales se les atribuye una alta capacidad de fijar IgE. Estos autores reportan también polen de la familia Urticaceae como uno de los principales generadores de alergias en el mediterráneo, especialmente en zonas costeras, siendo en el caso de España, el tipo polínico responsable del 0.9% al 43.1% de la polinosis incidente.

En Colombia no hay muchas gimnospermas que produzcan las llamadas lluvias de azufre ni las denominadas fiebres del heno. Pero si hay muchas especies de plantas con polinización anemófila principalmente de la familia Asteraceae (Compositae), Poaceae (Gramineae), Polygonaceae y otras, que dispersan su polen con las corrientes de aire. La identificación de las especies de los granos de polen presentes en la atmósfera será dato muy útil en la determinación de alergias causadas por polen (polinosis) y para estudios de sedimentación polínica aplicados en trabajos de paleopalinología. ALERGIA La palabra alergia procede de los términos griegos allos (otro) y ergon (trabajo) y se define, según el Diccionario de la Lengua Española, como el conjunto de fenómenos de carácter respiratorio, nervioso, o eruptivo, producidos por la absorción de ciertas sustancias que dan al organismo una sensibilidad especial ante una nueva acción de tales sustancias, aún en cantidades mínimas. Las alergias son trastornos del sistema inmunitario. Algunos palinomorfos, principalmente los granos de polen y los ácaros, presentan proteínas que son capaces de afectar el sistema inmunológico de una alta parte de la población humana. Las enfermedades respiratorias de origen alérgico se han incrementado en los últimos 20 años incidiendo en la calidad de vida de las personas afectadas: aproximadamente un 10 - 25% de la población mundial (Olabuenaga et al. 2007), 196

cerca de 23% en España (Domínguez et al. 1992) y 20% en adultos en los Estados Unidos. Se calcula que para el año 2020 cerca del 50% de la población mundial será sensible a este tipo de alergia (Valero S, A. L. & Cadahía G., A. 2002). El porcentaje de personas alérgicas a granos de polen y esporas de hongos puede alcanzar cifras altas en zonas densamente pobladas, las cuales tienen el agravante problema de la presencia de contaminantes tóxicos en la atmósfera. Los granos de polen y las esporas de hongos presentes en la atmósfera de estas ciudades pueden estar relacionados con la alta prevalencia de patología alérgica encontrada en la ciudad, cómo fue reportado por Dennis et al. (2004). ANTÍGENOS O ALÉRGENOS Son tejidos, células, proteínas y algunas moléculas, que se ponen en contacto con el organismo y que pueden, o no, desencadenar reacciones alérgicas. El organismo reconoce los antígenos identificándolos como inocuos o perjudiciales, y los ignora o se defiende de ellos. Existen en el organismo determinadas células que reconocen al antígeno, al disponer en su superficie de receptores específicos. Cuando la respuesta, ante la exposición del antígeno, es la formación de anticuerpos específicos Ig E, se dice que la hipersensibilidad o reacción es de tipo I o inmediata. Los anticuerpos Ig E específicos son esenciales en la reacción alérgica. Las glicoproteínas (glucoproteínas) de los granos de polen son capaces de inducir esta formación de Ig E específica en los pacientes atópicos. El polen o las esporas de algunas plantas y hongos, cuando está en suspensión en la atmósfera, especialmente en el polvo casero, puede causar alergias a muchas personas sensibles. Estas alergias se manifiestan como irritación en ojos, nariz, piel y principalmente como problemas respiratorios: estornudos, rinitis, bronquitis, faringo-traqueitis, o asma bronquial. Tales reacciones alérgicas son conocidas en Europa y Norteamérica con el nombre de fiebre del heno y son 197

provocadas por las mal llamadas lluvias de azufre, que no son otra cosa que polen en suspensión en el aire atmosférico. ESTUDIOS

DE

SEDIMENTACIÓN

POLÍNICA

APLICADOS

A

LA

AEROPALINOLOGÍA La técnica de procesamiento del material para estudios de aeropalinología consta de cuatro pasos fundamentales: 1.

Recolecta de las muestras

2.

Tratamiento químico

3.

Montaje de las preparaciones y

4.

Estudios cuantitativos y cualitativos realizados al microscopio de luz.

Para recolectar el polen aéreo existen diferentes metodologías que van desde toma de muestra en sedimentos por gravedad (método gravimétrico) hasta recolección por succión mecánica del aire (método volumétrico). Por el método gravimétrico se recolectan los granos de polen y esporas que se depositan naturalmente en las llamadas lluvias polínicas. Mientras que por el método volumétrico, además de la lluvia polínica, se recogen los granos que flotan en las corrientes de aire.

Los aparatos muestreadores de partículas del aire reciben el nombre de captadores aerobiológicos. Los estudios sobre captura e identificación de polen y esporas aerotransportadas, se han realizado desde mediados del siglo XVIII, aunque en sus fases iniciales se efectuaban de forma muy precaria e inadecuada, dándose una transformación de esto con el bacteriólogo francés Pierre Miquel (1885-1922), quien a inicios del siglo XX, diseñó el primer captador volumétrico de polen aéreo, con capacidad de succionar un volumen de 20 litros de aire por hora, concluyendo que el número de microbios en el aire variaba enormemente en el mismo sitio a diferentes horas, estaciones o altitud (Hervés 2005). Miquel

198

muestreó en diferentes lugares del mundo el contenido de esporas de hongos en el aire y estableció los parámetros de variación estacional y diaria de éstos.

La disminución de los microorganismos con la altitud, también había sido demostrada por Pasteur, en un experimento que realizó en 1860 desde las orillas del río Jura hasta los 2000 Metros sobre el nivel del mar, cerca del Mont Blanc. En 1952 Hirst desarrolló un nuevo método de captación de biopartículas atmosféricas, que permitía evidenciar las diferencias horarias, diarias y semanales de la carga de polen y esporas aerotransportadas.

Los captadores se basan en uno de estos cuatro principios físicos: Precipitación gravimétrica, impacto, filtración y filtración-succión. Cada uno de ellos presenta una serie de ventajas y desventajas que se deben tener en cuenta a la hora de elegir el método más adecuado para el análisis que se quiere efectuar: 1.

Captadores por precipitación: Gravimétrica, electrostática, térmica.

2.

Captadores por impacto: Impacto por succión, impacto en cascada, captadores inerciales y captadores ciclónicos.

3.

Captadores por filtración: Filtros sólidos, filtrado en medio líquido.

4.

Captadores por filtración-succión

5.

Muestreo biológico: Técnicas de biología molecular, técnicas de inmunolgía.

CAPTADORES POR PRECIPITACIÓN GRAVIMÉTRICA 1.

Como captadores de sedimentación por gravedad se usan:

2.

Cajas de Petri

3.

Portaobjetos

4.

Captador Durham (1946)

5.

Captador Pla Dalmau (1957)

6.

Captador Tuber (1974)

7.

Captador Individual de Polen

199

Este tipo de captadores se basan en la exposición al aire de una superficie horizontal cubierta de una sustancia adhesiva, sobre la cual se depositan las partículas por acción de la gravedad. Presentan las ventajas de ser de bajo costo, no utilizan energía eléctrica, fácil manejo y manipulación de las preparaciones. Presentan desventajas tales como: el volumen de aire no se puede calcular, baja captura de partículas, son afectados por la lluvia y el sol, generalmente no se oriental hacia los cambios de las corrientes aéreas.

Aunque los captadores por precipitación gravimétrica son los más simples, no permiten calcular concentraciones por unidad de volumen, solamente dan una idea de la presencia de determinadas partículas, por lo cual los resultados obtenidos no son comparables ni en tiempo ni lugar.

Las placas de Petri y los portaobjetos. Suelen usarse para recoger partículas que luego serán “cultivadas”, por lo cual contienen un medio de cultivo. Se usan para recoger esporas que luego podrán germinar y así se puede reconocer el hongo de donde provienen. Esto es muy importante para algunos géneros de hongos como Penicillium, donde las esporas de las distintas especies son iguales, pero las colonias que forman las esporas al germinar son diferentes. Así se pueden determinar las especies del género. Captador Durham. Es el captador gravimétrico universalmente usado.

Para

evitar el efecto de la lluvia y el desecamiento debido al sol intenso, Durham adoptó un mecanismo que se ha usado durante muchos años y que consiste en un portaobjetos impregnado de vaselina o de gelatina glicerinada coloreada, situado entre dos discos de 22,7 cm de diámetro, separados entre sí por una distancia de 8 a 16 cm. El viento incide oblicuamente sobre el portaobjetos el cual queda parcialmente protegido de la lluvia y de los rayos solares. El aparato de Durham debe ponerse en un sitio alto, más o menos a 15 metros del suelo. Los portaobjetos se exponen durante 24 horas y después se cambian. Este método fue propuesto por la Academia Americana de Alergia en 1946 y posteriormente 200

adoptado en casi todo el mundo, pero actualmente está en desuso y solamente se emplea para docencia. Con el captador de Durham, para calcular el promedio de esporas o granos de polen sedimentados en el suelo por m2/día, en el portaobjetos se demarca un cuadrado de 22 x 22 mm (Figura 1.79), haciéndose el conteo de polimorfos depositados en dicha área. Se calcula el espectro polínico y se lleva a un área de un metro cuadrado.

El captador de Durham presenta algunas desventajas. Por ejemplo los granos de polen pequeños (menores de 20 µm, como los de Urticaceae, o los de Piperaceae) no sedimentan frecuentemente, y sobre el portaobjetos caen muchas partículas de hollín, arena, entre otros que ensucian la preparación. Además, las lluvias oblicuas y el sol intenso pueden barrer el portaobjetos. Este método gravimétrico ha caído en desuso para investigación y sólo se deja con fines docentes o estudios no comparativos.

Figura 1.79. Colector por gravedad (tipo Durham). Placa 22 x 22

Captador Pla Dalmau. Modifica el captador Durham colocando los portaobjetos inclinados, formando un ángulo de 16,5 º e incorporando también un dispositivo de

veleta,

para

que

las

superficies

de

captación

se

encuentren,

permanentemente, en la dirección del viento. Captador Tauber (1974). Diseñado para recoger partículas durante largos periodos de tiempo. Consiste en un recipiente cilíndrico con cuello, cubierto de 201

manera aerodinámica y con un orificio central por donde entran las partículas, que quedarán retenidas por una capa de glicerol o glicerina situada en el fondo del cilindro. Este aparato se maneja sin protección o con una “tapa” para protegerlo de la lluvia. Su eficacia varía en función de la velocidad del viento. Recoge grandes cantidades de partículas y “dura” largos periodos de tiempo. Captador Individual de Polen (Leuschner & Boehm 1977). Consiste de un portaobjetos con adhesivo, protegido en el interior de una caja que permite el paso del aire. Es un captador utilizado por los pacientes de polinosis, facilita la identificación del polen o esporas a los que realmente se encuentran expuestos los pacientes. CAPTADORES POR IMPACTO 1.

Impacto por succión: Captador Hirst

2.

Impacto en cascada: Captador Andersen

3.

Impacto de rotación o inerciales: Captador Rotorod

4.

Captadores ciclónicos: Captador ciclónico

Captadores por impacto de succión (captador Hirst). Usado para capturar polen, esporas y demás partículas aerovagantes (Figura 1.80B). Con el objetivo de eliminar los inconvenientes de otros captadores gravimétricos, Hirst ideó un método que consiste en enviar una corriente de aire sobre un aparato que contiene el portaobjetos y rota continuamente. Por medio de una bomba de vacío u otro dispositivo similar, absorben el aire donde están contenidas las partículas. Este aparato tiene dos características fundamentales: Impacto de una masa de aire sobre una cinta adhesiva y desplazamiento por un mecanismo de cuerda. Está dotado de un mecanismo de relojería, que desplaza una cinta transparente impregnada con sustancia adhesiva, a una velocidad de 2mm/h, frente a un orificio de 2x14 mm, a través del cual se aspira un flujo de aire con un volumen de 10 litros/min, considerado como el que respira una persona adulta. Una veleta orienta el aparato de tal manera que siempre esté situado en la dirección del viento. Las partículas impactan sobre la sustancia adhesiva y la cinta debe ser 202

cambiada semanalmente, cortada en segmentos equivalentes al desplazamiento diario del tambor y finalmente prepararla para su lectura. Presenta como ventajas la fácil manipulación, lectura rápida y la aproximación horaria. Como desventaja requiere energía eléctrica para su funcionamiento. Con este método volumétrico se recoge una mayor cantidad de granos de polen y esporas, pero no indica la sedimentación normal. Entre los captadores de impacto por succión se encuentra, el spore trap o captador de Hirst que en la actualidad es comercializado por las marcas: Burkard y Lanzoni.

A

B

Figura 1.80. A y B. Colectores volumétricos. Captadores por impacto de succión (Captador Hirst). Captadores por impacto de cascada (Captador Andersen). Se basan en un choque violento de una cosa con otra, especialmente si una de ellas es de menor tamaño. Uno de los más complejos es el captador diseñado por Andersen (1958), usado para capturar esporas de hongos. Consta de una serie de placas sucesivas, perforadas con agujeros de diámetros cada vez más pequeños. Gracias a este sistema hace una separación por tamaño: las partículas más grandes impactarán en las primeras placas y las más pequeñas en las últimas. Entre cada placa perforada se pone una caja de Petri con un medio de cultivo para atrapar las partículas. Capta las partículas en una serie de placas con medio de cultivo a un caudal de aire de 28,3 I/min por medio de una bomba de vacío. El 203

número de filtros que se pueden usar varía de uno a seis. Es el modelo más utilizado hoy en día para el estudio de partículas en el interior de edificios, tanto de esporas de hongos como bacterias.

Captadores por impacto de rotación o captador por inercia. Fueron introducidos durante los últimos 35 años y se fundamentan en el hecho de que las partículas, al viajar horizontalmente por el aire, lo hacen con la inercia suficiente como para no desviarse lateralmente cuando se encuentran con un obstáculo, por lo que al chocar quedan retenidas sobre su superficie. Es un choque del aire contra una superficie vertical que intercepta y retiene las partículas que transporta. Presentan las ventajas que son de bajo costo y fácil manejo. Tienen como desventajas que el volumen de aire es desconocido y la captura de las biopartículas depende de la presencia de corrientes de aire. Entre estos captadores el más conocido es el “Rotorod” (Perkins 1957). El rotorod posee dos brazos verticales en forma de “U”, que giran a 2500 r.p.m., mediante un pequeño motor, produciéndose el impacto de las partículas sobre una especie de celo que se coloca previamente sobre cada uno de los brazos teniendo en cuenta el sentido de giro. La eficiencia varía en función de la velocidad del viento, las características de la partícula y el tiempo de uso. Puede llegar a sobrecargarse en periodos de tiempo prolongados, dificultando la lectura de las muestras. Posteriormente se diseñó otro modelo “Rotoslide”, que simplemente consiste en incorporar al mecanismo anterior, unas cubiertas metálicas que protegen la superficie de captación cuando está en reposo. Es muy utilizado en la captura de polen en América.

CAPTADORES POR FILTRACIÓN 1.

Filtros sólidos: Captador Cour, Filtros de fibra, Filtros de membrana, Filtros de Cassettes

2.

Filtros en medio líquido: Captador McLeod, Captador Multi\Stage Liquid Impinger 204

Hacen pasar el aire por un filtro en el que quedan retenidas las partículas según el tamaño del poro. Los filtros para el muestreo, varían de tamaño de la malla, según el tipo de muestreo a realizar. Tienen las ventajas de bajo costo y no requieren de energía eléctrica. Como desventajas el procesamiento de las muestras es demasiado complejo y el volumen de aire es muy difícil de calcular. Entre estos se encuentra:

Captador de cour (1974. Filtros sólidos). Usa filtros sólidos de fibra. Fue diseñado para una campaña realizada en zonas áridas del Norte de África, donde la escasa vegetación existente, así como el bajo contenido polínico en la atmósfera, descartaban el uso de técnicas convencionales. Cour utilizó una superficie de filtración a través de la cual pasa el aire de forma pasiva y no mediante bomba. El captador consta de una estructura metálica en forma de “T”, en el extremo de los brazos se sostiene un eje metálico perpendicular al mismo, sobre el que se fijan verticalmente dos filtros protegidos de la lluvia mediante unas cubiertas. En la parte posterior se sitúa una veleta para que los brazos giren a favor del viento, consiguiéndose en todo momento que las unidades filtrantes estén constantemente orientadas cara al mismo. En la barra que porta el captador se encuentra un anemómetro o se coloca uno al lado. Las unidades filtrantes poseen 5 capas de gasa hidrófila de algodón, previamente embebida en una solución de silicona y esencia de trementina al 50%, lo cual favorece la adherencia de las partículas e impide la acción de la lluvia y el desarrollo de cualquier colonia bacteriana o fúngica. Las gasas tienen un cuadrado de 20 cm de lado cada uno, y exponen por tanto, una superficie total de 400 cm2, durante un periodo de 3 ó 4 días. Este dispositivo móvil, se puede completar con otro inmóvil, situando la superficie de la gasa, horizontalmente, a 1 m del suelo y de este modo se recoge, tanto el polen sedimentado por gravedad como el aerovagante.

Captador ciclónico. Captador centrífugo, las partículas caen por una trayectoria en espiral. Usado para capturas proteínas alergénicas. Actualmente los muestreos aerobiológicos que están orientados a la valoración de la carga 205

alergénica atmosférica tratan de determinar: Medida de la concentración de polen y esporas (indirecta), medida de las moléculas aeroalergénicas (directa).

Captadores por filtración (Filtros sólidos). Filtros de membrana. Captadores por filtración (Filtros sólidos). Filtros de cassettes. Captadores por filtración (Filtros líquidos). Captador McLeod, Multi\Stage.

CAPTADORES POR FILTRACIÓN-SUCCIÓN Entre estos captadores está el “captador de aeroplancton” CAP (Suárez Cervera & Seoane Camba 1983). Se basa en la filtración activa del aire con un filtro de celulosa que se hace transparente con aceite de inmersión. Posee una bomba de vacío. El aire atraviesa un filtro de celulosa de 7 cm de diámetro y 5 µm de poro, que retiene o permite el paso de las partículas dependiendo de su tamaño. Está provisto de una bomba de succión de 4-5 m3 por día, relazándose la medición del aire filtrado mediante un contador de gas. Este aparato fue muy utilizado en España a finales de los años ochenta. Tiene como ventajas ser de fácil manipulación, exactitud volumétrica, cultivo simultáneo de los filtros para identificación de esporas, detección directa de proteínas por immunoblotting (Se utiliza

la

electroforesis

en

gel

para

separar

las

proteínas

nativas

o

desnaturalizadas por la longitud del polipéptido (condiciones desnaturalizantes) o por la estructura 3-D de la proteína (nativo/condiciones no desnaturalizantes). Las proteínas se transfieren a una membrana (por lo general de nitrocelulosa o PVDF), donde se detectan, utilizando anticuerpos específicos para la proteína diana. Como desventaja presenta la lectura incompleta de los filtros.

Características mínimas de los captadores Además de estar basados en uno de los cuatro principios físicos (precipitación, succión, impacto, filtración), los captadores de biopartículas deben tener las siguientes características: 1.

Tener alta eficiencia de captación para las partículas de interés 206

2.

Muestrear un volumen de aire lo suficientemente grande para que sea un muestreo

representativo,

incluso

cuando

las

concentraciones

de

biopartículas sean bajas

3.

Conocer el volumen de aire por unidad de tiempo, o poder calcularlo con facilidad y además que el flujo sea lo más constante posible

4.

Permitir de forma rápida y sencilla el cambio, examen y almacenamiento de las muestras

5.

Ser resistente a las condiciones atmosféricas y ser fácil de transportar

Aspectos para tener en cuenta antes del muestreo 1.

Reconocimiento de la flora del entorno de muestreo y tener o hacer y micropreparados palinológicos de esta flora

2.

Reconocimiento del clima y precipitaciones

3.

Numero de replicas en diferentes zonas

4.

Ubicación del Captador de Polen

Ubicación de los captadores El lugar en el cual se coloca un captador debe cumplir con los siguientes requisitos: 1.

Ser una zona libre de obstáculos (pantallas) donde la circulación del aire local sea libre, sin interferencias. Preferentemente en el medio de una terraza, de un tejado, de una azotea, etc.

2.

La altura aproximada ideal es de 15 a 20 m sobre el nivel del suelo

3.

El aparato ha de estar lejos de paredes y barandillas. El orificio de entrada del aire deberá estar más alto que la barandilla, para evitar las turbulencias de aire provocadas en estas zonas

4.

Se ha de evitar las proximidades a parques o plantas industriales

5.

Características locales físicas y geográficas y la vegetación que rodea al posible lugar de ubicación (sobrerrepresentación polínica) 207

LECTURA DE LOS MICROPREPARADOS Para la identificación y el recuento de las partículas capturadas se requiere de un análisis microscópico de las muestras, este recuento requiere de mucho tiempo para la lectura, lo cual retrasa el análisis de los resultados. Con la finalidad de tomar muestras representativas y confiables, la Red Europea de Aeroalergenos (EAN) propone la realización de submuestreos en los cuales se delimitan cuatro barridos longitudinales y equidistantes entre sí y entre los bordes superiores e inferiores de la cinta quedando así representado de un 12 a un 13% de la muestra. Las muestras se analizan con objetivos de 40x y 100x y oculares de 10x, ya que el uso de un aumento menor no permite la identificación de esporas y granos de polen muy pequeños y un aumento mayor disminuye el campo de visión. Para fines de comparación con otros trabajos similares, los datos se expresan en granos/m3. Para estimar el total de granos por m3 en los muestreos, se utiliza un factor de corrección calculado mediante las características del captador utilizado, volumen de aire aspirado por unidad de tiempo, tamaño del orificio de entrada, área, superficie de muestreo, el número de líneas de conteo por placa y las características propias del microscopio (los datos para calcular el factor de corrección son suministrados con el equipo). Los cálculos realizados para obtener el factor de corrección utilizando el captador Lanzoni VPPS 2000, son los siguientes: Factor diario: La bomba de succión del captador esta calibrado en 10 litros/min y el volumen de aire aspirado diariamente es: 10 litros/min x 60 min x 24 h= 14.400 litros= 14.4 m3. Ancho de la cinta melinex = 14 mm Diámetro del objetivo 40x del microscopio utilizado para las lecturas= 0.365 mm Numero de barridos en la placa: 4 Diámetro del objetivo 40x * No. barridos= 1.46 mm Ancho cinta/ 1.46 mm x 1/14.4 = 0.67 208

Para el caso de estimación de granos de polen y esporas por hora por m 3, entonces se debe realizar otra conversión: 14 mm / 1.46 mm x 600 / 1000= 5.7 El coeficiente de 600 / 1000 busca dividir los litros que aspira el captador por hora en los litros contenidos en 1 m3.

209

ANÁLISIS DE RESULTADOS Los resultados se presentan discriminados por su importancia relativa de los diferentes palinomorfos, considerando su proporción respecto al total. Para ello se presentan cuatro categorías: Para cada uno de los tipos polínicos principales se presenta la variación mensual y la variación diaria en los días más representados: 1. 2.

Registro polínico total Tipos polínicos principales. Constituido por los palinomorfos de mayor proporción 3. Tipos polínicos secundarios. Palinomorfos con un porcentaje de participación entre… en el total contabilizado 4. Tipos polínicos minoritarios: Representados entre ….. y …..% del total 5. Otros tipos polínicos. Palinomorfos con participación inferior al 1% de la muestra total 6. Se presentan las concentraciones diarias de polen por m3, considerando que el captador, aspira diariamente 14.4 m3 7. Análisis de regresión simple y múltiple se realizan con el fin de obtener una ecuación que permita explicar el comportamiento de los niveles atmosféricos de polen y esporas. En los análisis se toma como variable dependiente los valores polínicos transformados a logaritmo neperiano más uno, con la finalidad de normalizar. La variable independiente en el análisis fueron los parámetros meteorológicos considerados 8. Datos polínicos. Gráficas de la variación por semanas del total del polen. Gráficas, mostrando polen, precipitación y semanas 9. Conteos de polen. Identificación y clasificación. La determinación de los tipos polínicos debe hacerse por comparación con los micropreparados presentes en una palinoteca local o de flora más o menos similar a la zona donde se realiza el estudio de aeropalinología, se complementa la identificación con fotografías de polen, revisión bibliográfica de la fenología de las especies encontradas en la lluvia polínica, bibliografía especializada sobre palinotaxonomía 10. Caracterización del periodo máximo mensual 11. Calendario Polínico. Tipos polínicos por meses o semanas 12. Modelos de comportamiento intradiario. Variación en el día para los tipos de polen más representados 13. Influencia de los parámetros meteorológicos. Para semanas y para especies, incluyendo regresiones simples y múltiples.

210

Los granos de polen capturados en la lluvia polínica se dividen en tres grandes categorías: 1.

Árboles y arbustos. Por ejemplo pino, ciprés, fresno y otras especies arbóreas, entre las cuales se encuentran especies reconocidas como alergogénicas

2.

Gramíneas (pastos y cereales). Presentan granos de polen muy similares, por lo cual es muy difícil conocer su identificación hasta género o especie. El polen de las gramíneas es altamente alergénico durante la época de floración de las especies

3.

Otras plantas herbáceas. Comprende plantas sin xilema secundario (madera o leño). Muchas de las especies de este grupo son reconocidas como altamente

alergénicas.

Por

ejemplo:

artemisa

(Asteráceas),

bledo

(Amaranthaceae), ortigas o pringamozas (Urticáceas), papiros (Ciperáceas)

En aeropalinología se debe trabajar en estrecha asociación con factores climáticos y geográficos, elaborando pronósticos para cada región en particular. Existe una gran complejidad en las relaciones establecidas entre el clima y el espectro de polen en el aire (Figura 1.82). La influencia de los factores meteorológicos es muy variable según las especies; sin embargo, como característica general, se considera que el aumento de la temperatura, de las horas de luz y vientos moderados, favorece la emisión y dispersión de granos de polen. La humedad relativa elevada, disminuye las concentraciones polínicas, ya que los granos de polen se sedimentan. Y por último las precipitaciones, durante el periodo en el cual se produce la diseminación mayoritaria del polen de cada taxón (estación polínica), ejercen un efecto negativo sobre el nivel polínico ya que provocan un lavado de la atmósfera.

211

Figura 1.82. Distribución a través de un año de precipitación pluviométrica y precipitación polínica (datos 1965-1966, Salgado-Labouriau 1973). IMPORTANCIA DE LOS ESTUDIOS SOBRE AEROPALINOLOGÍA Calendario polínico. La importancia de los conteos aeropalinológicos radica en la posibilidad de prevenir la presencia de los síntomas de rinitis alérgica o “fiebre de heno” en individuos sensibles a los granos de polen presentes en una determinada época del año. Con un conteo continuo a lo largo del tiempo se pueden realizar calendarios polínicos cada vez más exactos, lo que ayudaría a mejorar la calidad de vida de los individuos alérgicos. 212

El calendario polínico es una representación gráfica que resume la dinámica anual o periódica de los principales tipos polínicos de una localidad, ordenados según su periodo de polinización o presencia en la atmósfera. Esta representación, compendia en una sola figura toda la información aerobiológica de una localidad, facilita la comprensión polínica de la atmósfera en todo el año o en una época del año y da información sobre los granos de polen que pueden causar alergia en el año o en un periodo del año, destacando la importancia relativa de unos granos de polen sobre otros. El calendario polínico es más exacto cuando es elaborado con datos promedio de varios años de estudio, puesto que en ellos queda reflejada la variabilidad que tiene a través de los años como causa de la meteorología o aquella que presentan determinadas especies que alternan años de elevada producción polínica con años de baja producción polínica.

El calendario polínico permite prever los momentos en los que hay más polen y partículas en la atmósfera y, por lo tanto, determinar cuándo las personas alérgicas podrían tener más problemas. La información recogida es muy útil para determinar tanto la presencia, como la actividad del polen y otras partículas alergénicas. Utilidad clínica de los calendarios polínicos 1.

Identificar los granos de polen alergénicos en una determinada región

2.

Relacionar la presencia de los tipos polínicos con los períodos de síntomas de alergias

3.

Detectar nuevos tipos polínicos posiblemente responsables de polinosis

4.

Explicar la prevalencia de sensibilizaciones

5.

Explicar la variabilidad de la polinosis a través del tiempo

6.

Iniciar, reducir o finalizar tratamientos profilácticos

7.

Predecir los períodos y severidad de la polinosis

213

Información sobre presencia de polen alergénico

En casi todos los países del Viejo Mundo existen sitios donde se hace el conteo de granos de polen aéreo y pueden tener un pronóstico de cuales tipos polínicos pueden estar presentes, basándose especialmente en los datos obtenidos en otros años. Estos centros en general pueden dar información sobre el polen presente en el aire en una fecha determinada. Lamentablemente en el continente Americano son muy pocos los lugares donde se hace conteos de polen con las normas internacionales.

Calidad biológica del aire El manual de calidad y gestión de la Red Española de Aerobiología plantean que la calidad biológica del aire no solo debe estar medido en términos de la concentración de biopartículas contenidas, sino también en la presencia simultánea de uno o más tipos polínicos con capacidad alergógena. Además de conocer si el contenido polínico de la atmósfera es bajo, moderado, alto o muy alto, es necesario determinar el grado de calidad del aire debido a la posible presencia simultánea de uno o más tipos polínicos con capacidad alergógena. Para ello se establece que la Calidad Biológica del Aire* en una zona determinada es: 1.

Buena. Cuando los tipos polínicos presentes en el aire se mantienen en niveles de concentración polínica bajos

2.

Aceptable. Si las concentraciones de granos de polen son bajas para la mayoría de tipos polínicos, pero alguno de ellos presenta un mayor potencial alergógeno ó son moderadas pero se trata de tipos polínicos de baja capacidad alergógena

3.

Regular Si las concentraciones de granos de polen de tipos con un mayor potencial alergógeno se encuentran dentro de categorías moderadas, o cuando están próximas a moderadas, pero están presentes al mismo tiempo dos tipos polínicos o más, de elevado potencial alergógeno 214

4.

Mala. Siempre que alguno de los tipos de mayor potencial alergógeno esté presente en concentraciones altas, o cuando existan concentraciones moderadas de dos tipos polínicos de elevado potencial alergógeno de forma simultánea

* (Manual de Calidad y Gestión de la Red Española de Aerobiología 2007).

Existen tablas de referencias que indican el grado de polinosis. La tabla a continuación está confeccionada por la NAB (National Allergy Bureau) y es aceptada internacionalmente. En la misma se detallan las categorías (gramíneas, árboles e hierbas) con los distintos valores de referencia para cada una de las concentraciones de granos de polen por metro cúbico de aire. B SCALE NAB SCALE NAB SCALE Gramíneas

Árboles

0

Ausente

0

Ausente

0

Ausente

1–4

Bajo

1 – 14

Bajo

1-9

Bajo

5 – 19

Moderado

15 – 89

Moderado

10 - 49

Moderado

20 – 199

Alto

90 – 1499

Alto

50 - 499

Alto

>200

Muy Alto

>1500

Muy Alto

>500

Muy Alto

Categoría

Hierbas

del Las personas alérgicas a estos granos de polen pueden

conteo

experimentar síntomas de rinitis alérgica o asma

Ausente

Sin síntomas

Bajo

Sólo individuos extremadamente sensibles a estos granos de polen presentarán síntomas.

Moderado

Algunos individuos sensibles a estos granos de polen expresarán síntomas.

Alto

La mayoría de los individuos con sensibilidad a estos granos de polen expresarán síntomas.

Muy Alto

Todos los individuos sensibles a estos granos de polen 215

expresarán síntomas. Las personas extremadamente sensibles pueden presentar síntomas severos.

En los últimos años se ha puesto de manifiesto un incremento global de las enfermedades alérgicas. Existen grandes diferencias regionales que llegan a observarse incluso entre ciudades próximas. La rinitis alérgica constituye la enfermedad crónica más común de las vías respiratorias altas; en los Estados Unidos de América (EUA) se presenta en aproximadamente 10% de los niños y en más de 20% de los adolescentes y adultos jóvenes. Los granos de polen son considerados como uno de los agentes causales más importantes de las enfermedades alérgicas, siendo considerados como la causa más frecuente de rinoconjuntivitis y responsable de más del 30% de los casos de asma bronquial. La importancia clínica, epidemiológica y económica derivadas de la alta prevalencia de esta patología, han suscitado un continuo interés para el alergólogo, para poder ofrecer al paciente polínico un manejo integral de su patología. Los síntomas que con mayor frecuencia se producen en personas alérgicas a los granos de polen son de tipo respiratorio, puesto que es la vía a por la cual el individuo entra en contacto con el polen produciendo algunos o todos de las siguientes entidades (sintomatología): 1.

Conjuntivitis (prurito ocular, lagrimeo, fotofobia)

2.

Rinitis alérgica (estornudos, obstrucción nasal, rinorrea, prurito nasal)

3.

Síntomas respiratorios de vías bajas (tos, disnea, sibilantes)

4.

Neumonitis por hipersensibilidad

5.

Ciertas formas de asma

6.

En escasas ocasiones se puede presentar urticaria o angioedema, entre otros síntomas.

216

Sus efectos dependen de la localización de la reacción alérgica: en la nariz y nasofaringe produce rinitis y en los bronquios y bronquiolos se traduce en asma, que es el caso más grave. La comprensión de los síntomas de la alergia respiratoria requiere el conocimiento de las partículas alergénicas aéreas, de sus propiedades dinámicas, así como de los procesos aerobiológicos que actúan sobre las mismas (Spieksma 1992).

La sensibilización hacia un polen determinado en una población puede depender del nivel de exposición, predisposición genética de cada uno de los individuos y características propias de las plantas que cohabitan en cada región. Una cifra superior a 30 granos de pólenes por metro cúbico de aire, puede producir sintomatología. Una sola espiga de trigo, por ejemplo, genera unos 4 millones de granos de polen. El porcentaje de personas alérgicas alcanza cifras muy altas en zonas densamente pobladas. En estas regiones se deben realizar seguimientos, mínimo por dos años, para identificar las distintas esporas y granos de polen que se sedimentan en un área determinada, para elaborar un calendario polínico del área y determinar su relación con brotes de alergia y con la sedimentación polínica.

Las plantas más importantes desde el punto de vista alergénico son las que dispersan sus granos a través del viento (anemófilas). Así, las plantas entomófilas, de flores vistosas, tales como rosas, claveles, entre otras, no suelen tener tanta importancia alergénica, puesto que su polen no vuela con facilidad.

El conocimiento de los granos de polen suspendidos en la atmosfera de una zona determinada puede considerarse como un fiel reflejo de su flora anemófila, con información detallada de los granos de polen que pueden ser causa de polinosis y precisar los períodos de polinización de cada taxón, constituyendo así, para el alergólogo y las autoridades de salud locales, un elemento básico para el correcto diagnóstico etiológico del paciente polínico. 217

No todos los tipos polínicos son alergénicos. En general, su alergenicidad depende de varios factores como: 1.

Especie del vegetal

2.

Tamaño del polen

3.

Reacciones cruzadas alérgicas con otras proteínas (entre otros granos de polen de otras especies, o alimentos en algunos casos)

4.

Dispersión o permanencia en el aire (en general el polen que se comporta como anemófilo, o sea, que es trasladado por el viento, puede ser más alergénico)

5.

Representación en la flora local, a mayor cantidad de especímenes mayor polinización

6.

Fenotipo de la población, ya que el grupo humano define la especificad de la sensibilización alérgica

La polinosis ha sido estudiada tratando de eliminar sus causas o de contrarrestar sus efectos, suministrando

antihistamínicos (su

uso

prolongado

no es

recomendable) o por aislamiento geográfico del paciente durante la época de florecimiento y polinización de las plantas causantes de la polinosis, lo que no es viable en la mayoría de los casos. La polinosis también puede ser tratada vacunando al paciente paulatinamente con polen específicamente alergógeno. De estos tratamientos se concluye que el conocimiento del vegetal productor de la polinosis es previo o indispensable a toda acción. Para prevenir las alergias debidas al polen, evitar o minimizar los síntomas y mejorar la calidad de vida de las personas susceptibles a la polinosis, tanto los médicos alergistas como sus pacientes necesitan conocer las épocas del año en las cuales se producen las diferentes clases de polen y esporas que las causan. Para esto es necesario: 1.

Hacer análisis diario de la atmósfera mediante trampas captadoras de polen y esporas

218

2.

Comparar los datos palinológicos con datos meteorológicos, ya que las condiciones climáticas influyen en el contenido y dispersión anemófila de las esporas y granos de polen

3.

Comparar la cantidad y tipos polínicos presentes en el aire, con los casos de alergias presentados durante un período determinado

4.

Determinar el potencial alergógeno de los diferentes tipos polínicos anemófilos

En las regiones templadas las épocas en las que se liberan los granos de polen son cortas y claramente determinadas. Al contrario de los trópicos en donde las plantas florecen durante todo el año, pero con períodos en los cuales determinados granos de polen son abundantes. La concentración de polen en la atmósfera también está influenciada por las épocas de lluvia, por la fuerza y dirección de los vientos y por la flora de donde provienen. Por esto en los estudios sobre aeropalinología se debe trabajar en estrecha asociación con factores climáticos y geográficos, elaborando pronósticos para cada región en particular.

NORMAS AMBIENTALES PARA EVITAR EL CONTACTO CON GRANOS DE POLEN ALERGÉNICOS Es muy difícil evitar el contacto con los granos de polen durante las épocas de floración o polinización de las especies de vegetales. Si se quiere evitar el contacto 100% con los granos de polen, se tendría que vivir adentro de una “burbuja”, por lo cual algunas de las indicaciones, que deben seguir los pacientes en épocas de recuento alto de granos de polen alergénico, son: 1.

Conocer las épocas de polinización de las especies vegetales con granos de polen causantes de polinosis

2.

Permanecer, el mayor tiempo posible, dentro de las viviendas, con puertas y ventanas completamente cerradas

3.

Usar filtros especiales contra polen en el aire acondicionado de vehículos y viviendas 219

4.

Disminuir las actividades al aire libre entre las 5 y 10 de la maña (horario en el cual generalmente ocurre la liberación de los granos de polen desde las anteras de las flores) y entre las 6 y 9 de la noche, cuando el aire se enfría y desciende junto con los granos de polen

5.

Evitar ponerse en contacto con el césped

6.

No secar la ropa en el exterior, el polen se fija en la ropa

7.

Evitar trasladarse a sitios geográficos donde prevalezcan las especies vegetales que producen polen alergénico

8.

Tomar los medicamentos prescritos

TRATAMIENTOS MÉDICOS A SEGUIR EN CASO DE ALERGIAS POR POLEN Si no se puede evitar el contacto con el alergeno, algunos de los tratamientos médicos son: 1.

Si el paciente es alérgico a granos de polen de especies vegetales que tienen una época de floración definida y corta (como es el caso de algunas especies de árboles) se pueden indicar antihistamínicos o esteroides tópicos nasales o bronquiales, dependiendo de los síntomas referidos por el paciente

2.

En caso de sensibilidad a granos de polen de especies vegetales que tienen largos periodos, o sensibilidad a especies con reacciones cruzadas con otros granos de polen, lo que prolonga los síntomas del paciente, se recomienda un tratamiento desensibilizante específico con los granos de pole a los cuales es alérgico el paciente. Este último tratamiento es prolongado, pero es el único que puede cambiar la historia natural de la enfermedad y mejorar el pronóstico del paciente

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227

ANÁLISIS

PALINOLÓGICO

DE

LA

MIEL

DE

ABEJAS La miel es una sustancia, dulce, espesa y viscosa que preparan en su estómago ciertos insectos, principalmente la abeja melífera occidental (Apis mellifera L.), por transformación del néctar que recogen en las flores y que luego depositan por la boca en alvéolos especiales de los panales. Desde la antigüedad el hombre ha cultivado las abejas con el propósito de obtener su miel, considerada como un alimento apreciado por sus virtudes médicas y por sus cualidades alimenticias, además de su valor comercial.

La miel contiene más de 70 componentes químicos con posible aplicación para la salud, por ejemplo todas las vitaminas (excepto la vitamina A), sales minerales, oligoelementos, ácidos orgánicos, glucósidos y aminoácidos. La miel presenta diferencias en cuanto a sabor, aroma, grado de viscosidad y tonalidad de su color amarillo, diferencias que caracterizan cada tipo de miel y en las que radica la calidad y apreciación que de ellas hace el consumidor (Figura 1.83 A y B). Esta variedad de miel depende de las especies vegetales de las cuales la abeja tomó el material y por lo tanto, de la región geográfica donde se encuentran localizadas las colmenas.

A

B 228

Figura 1.83. A y B. Clasificación de la miel de abejas según la tonalidad de su color.

Debido a sus características físicoquímicas, al tiempo de almacenamiento y temperatura, toda miel tiende a solidificarse. Cuando la miel provien del néctar de las flores, sin adición de azúcar o panela (glucosa) o sin alimentar las abejas con esta sustancia, la miel se solidifica homogéneamente proceso en el cual se forman dos capas: una sólida en el fondo y otra viscosa en la parte superior. Cuando las abejas son alimentadas con glucosa (azúcar o panela) o se altera la miel con esta sustancia, tiende a solificarse en grumos por toda la superficie del envase (Figura 1.84 A y B).

A

B

C

D

Figura 1.84. A y B: Característica visual de la miel “líquida”. A: Miel pura. B: Miel adulterada con glucosa, empieza a formar grumos. C y D: Característica visual de la miel “sólida”. C: Miel adulterada con glucosa, se solidifica en grumos. D: Miel pura, se solidifica homogéneamente de abajo para arriba. El término “abejas” agrupa a todos los insectos de la Superfamilia Apoidea, del Orden Hymenoptera. Esta Superfamilia comprende 10 familias y cerca de 20.000 especies descritas en el mundo. El género Apis comprende las denominadas 229

abejas melíferas o abejas mieleras, de las cuales la más comercial en nuestro medio es la Apis mellifera L. Pero los análisis palinológicos son válidos para cualquier especie de abeja que se quiera estudiar. Los granos de polen existentes en la miel de abejas proceden principalmente de los recolectados de las anteras por las abejas para la alimentación de la colmena, como también aquellos granos de polen que caen de las anteras en el momento de tomar el néctar y que se adhieren a alguna parte del cuerpo de la abeja y luego son depositados accidentalmente en los alvéolos de los panales.

Las plantas apícolas (nectaríferas, poliníferas o ambas) pueden ser identificadas por medio de los granos de polen encontrados en la miel o por el análisis del contenido de las partes del cuerpo de los insectos donde estos transportan el polen, como por ejemplo las corbícolas o cestas de polen de las patas traseras de las abejas (Figura 1.85). Igualmente el contenido polínico de la miel estomacal, el de las celdas melíferas y el de las pelotillas (carga de polen, vendidas comercialmente con el nombre de polen), dan evidencias de las plantas visitadas por las abejas.

Figura 1.85. Abeja con granos de polen en una corbícola. Técnicamente la miel de abejas se considera de dos tipos: miel biche o verde y miel madura. La miel biche se encuentra en las celdas destapadas (sin opercular, Figura 1.86 A), es la miel recién llevada a la colmena, es muy líquida, con mucho contenido de agua y aun con muchos azúcares sin invertir por la acción enzimática. La miel madura es la miel completamente elaborada, densa, asimilada y deshidratada, siempre se encuentra en celdas operculadas o sea tapadas con cera (Figura 1.86 B). 230

A

B

Figura 1.86. Contenido de miel biche y madura. A: Celdas sin opercular (miel biche). B: Celdas operculadas (miel madura).

Los granos de polen encontrados en las celdas sin opercular, se consideran que provienen de plantas visitadas por las abejas en procura de néctar y se encuentra ahí por contaminación durante la visita de la abeja a la planta nectarífera. Mientras que los granos de polen presentes en la carga de polen colectada por la abeja, se considera que provienen de plantas visitadas en procura de polen (plantas poliníferas). Estos dos tipos de estudio se constituyen en el apoyo para la identificación de la flora apícola de una región dada y se puede tener un mejor aprovechamiento de las plantas útiles para las abejas, ya que de ellas depende el buen desarrollo de las colonias y la producción de miel de buena calidad.

La rama especializada de la palinología que se dedica al estudio de los granos de polen contenidos en la miel de abejas y en el polen comercial, recibe el nombre de Melisopalinología (de melissa, abeja) o Melitopalinología (de melition, bebida hecha con miel) y se basa en el hecho de que toda miel natural debe contener granos de polen, los cuales permanecen aún después de la colecta y centrifugación para ser envasada. Melitopalinología es el término más frecuentemente usado en esta disciplina.

231

ANÁLISIS PALINOLÓGICO DE LA MIEL DE ABEJAS Las muestras pueden ser tomadas de miel centrifugada y envasada para su expendio. En este caso se colectan 300 ml de muestra por apiario. Para efectos de comparación, también se colectan muestras directamente de la colmena, para lo cual con un cuchillo se corta un pedazo de panal operculado. Tanto la miel como los pedazos de panal, se ponen separadamente en frascos de boca ancha y rotulada, indicando su procedencia y fecha de recolección.

Durante la época de colecta de las muestras de miel de abejas y posteriormente, se recolectan e identifican ejemplares de la flora en un diámetro de 5 km alrededor de la colmena. Las enteras de estos ejemplares se ponen en pequeñas bolsas de papel con su correspondiente identificación, para luego ser trasladadas a ácido acético glacial y procesadas según la técnica de acetólisis de Erdtman (1952, 1969) con el fin de obtener micropreparados de referencia.

La identificación de los granos de polen se hace por comparación con el material de referencia, o sea con los micropreparados polínicos procedentes de la flora en un diámetro de 5 km alrededor del apiario y teniéndose como base las características morfológicas observadas, tales como: unidad polínica, número, posición, y carácter de las aberturas, escultura, forma y tamaño del polen. Posteriormente se comprueba la identificación por medio de bibliografía especializada. Cuando no sea posible la identificación hasta especie, los granos de polen se agrupan según sus semejanzas morfológicas y cada familia, género o grupo, se considera como un tipo polínico.

Después del montaje de las placas, para el conteo e identificación de los tipos polínicos encontrados en la miel de abejas, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X y se procede a la búsqueda de los granos de polen. Para el análisis cuantitativo la frecuencia de los tipos de polínicos encontrados en la muestra, se calcula contando por lo menos 500 granos, al menos en tres placas por muestra. Para esto en cada placa se demarcan 11 232

recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. El conteo se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con el conteo de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces un mismo grano.

Se deben contar todos los granos de la placa, en caso de completar los 500 granos de polen antes de finalizar los 11 recorridos, se continuará contando, así que muchas veces serán contados más de 500 granos de polen por muestra. Cuando sean muy escasos los granos de polen, son necesarias más de tres placas para contar el mínimo de 500 estructuras, teniéndose presente que se debe completar el conteo hasta terminar la placa en la cual se complete el número indicado. Si se utiliza más de tres portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes.

El conteo se expresa en porcentaje para estimar la frecuencia de cada tipo polínico e indicar su origen botánico. Para determinar la importancia de las especies poliníferas o nectaríferas, al parecer no existe un análisis estadístico de uso universal, por lo cual en el laboratorio de palinología de la Universidad de Antioquia, se propone utilizar algunos de los análisis usados para el estudio de composición florística de los bosques tales como los cálculos de diversidad, dominancia, equidad, correlación y regresión (Shannon-Weaver 1949¸ Simpson (1949, Pielou 1984) y realizar matrices de similitud con base en el índice de Morisita y Czekanowsky, para construir los dendrogramas respectivos, cuyos resultados fueron muy significativos en el estudio realizado por Girón (1996). Con estos datos se elaboran los diagramas polínicos de interés apícola así: del total de palinomorfos contados e identificados, se obtiene la densidad relativa de cada tipo polínico, taxón o agrupamiento respecto al total de granos contados por muestra.

233

Cuando se busca identificar las plantas utilizadas por las abejas en procura de néctar, se utilizan muestras de miel tomadas de celdas no operculadas. Para esto se recogen muestras de miel biche de las celdas sin opercular, se corta un pedazo de panal y se guarda en frascos debidamente rotulados. Se debe tener mucho cuidado para no incluir celdas operculadas, las cuales presentan polen almacenado por las abejas.

Si el objetivo es identificar las plantas poliníferas, se debe realizar el análisis de las pelotillas de polen. A las colmenas seleccionadas se les ponen trampas en las piqueras para retirar la carga de polen que la abeja lleva en las corbícolas de las patas posteriores. Cada dos horas, desde las seis de la mañana hasta las seis de la tarde, se deben recoger las pelotillas y almacenarlas en frascos debidamente rotulados. En el laboratorio las pelotillas se separan por colores con la ayuda de un estereomicroscopio, ya que se supone son de una sola especie vegetal. Las pelotillas de cada color se pesan en una balanza analítica y se guardan en frascos debidamente rotulados. Con base en el peso mensual se determina el porcentaje de las pelotillas de cada color. Para estar seguros que corresponden a una especie, se hace un análisis en fresco para observar su morfología.

Tanto a las muestras de miel madura como a las de miel biche, a las pelotillas de polen y al material vegetal polinífero, se les hace análisis con o sin acetólisis según la metodología a seguir.

En la miel de abejas generalmente se realizan dos tipos de análisis:

1.

Análisis cualitativo. Proporciona la cantidad total de granos de polen por unidad de peso, indica el espectro polínico o sea el porcentaje (frecuencia) de granos de polen de cada especie, encontrados en la miel de abejas o en el polen comercial.

234

2.

Análisis cuantitativo. Se efectúa midiendo el volumen de sedimento centrifugado y el número de granos de polen por unidad de peso. Indica que especies vegetales y en que proporción se encuentran en una determinada muestra de miel, debido a la cantidad total de granos de polen por unidad de medida o de peso de miel de abejas o de polen comercial. (Maurizio & Louveauz 1965, Louveaux et al. 1970, 1978). El porcentaje de polen contenido en la miel recibe el nombre de espectro polínico.

El análisis cuantitativo no es exacto ya que no hay relación entre el néctar y el polen producido por una planta determinada. En el análisis cuantitativo se debe tener en cuenta que no todas las plantas producen la misma cantidad de granos de polen, existen especies vegetales que producen grandes cantidades de polen, mientras que otras lo producen en menor cantidad. Además la cantidad de granos de polen transportada por una abeja en cada visita depende de la especie de abeja, de la planta y del tamaño del polen, mientras más grande sea el tamaño del grano, menos cantidad es llevada por la abeja. Por otra parte el comportamiento de la abeja cambia cuando se les suministra alimento artificial o se les obliga a visitar un solo tipo de flor por técnicas de monocultivo. Estos problemas deben ser tenidos en cuenta al realizar estudios de miel de abejas.

La presencia accidental de algunas esporas de hongos o de algas no debe incluirse para calcular el espectro polínico de la miel de abejas.

Zander (1935) y Maurizio (1960), según el espectro polínico dividen los granos de polen presentes en la miel, en tres categorías según el porcentaje en que se encuentran (actualmente modificadas a cuatro categorías):

1. 2. 3. 4.

Polen Dominante (P.D.) Presente en más de 45%. Polen Acompañante o Secundario (P.S.). Presente de 16% a 45%. Polen Aislado Importante (P.A.I.). De 3% a 15%. Polen Aislado (P.A.). Presente en menos de 3% 235

Cuando en una muestra existe un tipo de polen dominante, es llamada miel unifloral. Cuando no existe polen dominante recibe el nombre de miel de abejas multifloral o mixta. Pero para esta clasificación es necesario saber que algunas especies vegetales como la Mimosa pudica (adormidera) producen enormes cantidades de granos de polen y están representadas en exceso en los análisis polínicos, por lo cual para considerar una miel unifloral de estas plantas, la frecuencia debe estar por encima del 45%. Otras especies, por ejemplo del género Citrus, Rosmarinus, Salvia, entre otras, producen pocos granos de polen y las mieles se pueden considerar monoflorales con frecuencias hasta de 20%

IMPORTANCIA DE LOS ESTUDIOS MELISOPALINOLÓGICOS

En resumen, los resultados de un estudio melitopalinológico suministran valiosos datos sobre: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Pureza de la miel de abejas Conocer la flora apícola Conocer la procedencia geográfica de una miel Conocer el comportamiento biológico de las abejas Apicultura y agricultura Otras aplicaciones

Pureza de la miel de abejas. Es muy baja la cantidad de proteínas contenida en el néctar de las plantas, siendo el polen de vital importancia, tanto para las abejas, como para el hombre, ya que el polen es la principal fuente de las proteínas, vitaminas, minerales y otros compuestos químicos presentes en la miel de abejas. De tal manera que una miel, mientras más cantidad de granos de polen posea, tiene mayor valor nutritivo. La más importante aplicación del análisis palinológico de la miel comercial, es el control de su pureza, ya que el espectro polínico nos indica si las abejas han sido alimentadas artificialmente con sustancias azucaradas o si la miel ha sido adulterada por adición fraudulenta de polen, melaza o sustancias azucaradas, ya que estas mieles se caracterizan por la ausencia o poca cantidad de granos de polen (Figuras 1.86. A, B y C) y por la presencia de esporas y fragmentos de micelios de hongos. 236

A

B

C

Figura 1.87. Contenido de granos de polen en A: Miel pura. B: Miel ligeramente adulterada. C: Miel adulterada.

En algunos países de Europa y en Estados Unidos para que la miel se considere de buen valor nutritivo, debe tener más de 20.000 granos por 10 ml de miel. Los trabajos realizados en Colombia demuestran que una miel pura debe tener más de 100.000 granos de polen por 10 ml de miel (Fonnegra 1986). El bajo contenido de granos de polen que pueda poseer una muestra de miel, no debe considerarse como originado por pérdida durante la centrifugación de la miel en los apiarios para eliminar la cera, aunque muchos granos de polen puedan quedar fijados en las paredes de la centrífuga. Pero al analizar y comparar muestras directamente tomadas del panal con muestras centrifugadas tomadas el mismo día y de la misma colmena (Fonnegra 1986), las diferencias en el contenido numérico de los granos de polen no son tan significativas como para indicar disminución en el número de granos de polen por centrifugación. La poca cantidad de granos de polen puede ser atribuida a la práctica de utilizar trampas (caza polen) para obtener polen puro o adulteración por adición de melazas (Fonnegra, 1986).

Las contaminaciones originadas con mieles exóticas son fácilmente detectadas por un análisis cualitativo: la presencia de ciertos tipos polínicos extraños es indicativo de contaminación, ya que esos tipos no derivan de la vegetación local. Los análisis cuantitativos son aún más reveladores, ya que una muestra de miel 237

con poca cantidad de granos de polen indica que esta fue adulterada por adición de mielatos o sustancia azucaradas artificiales o que hay una sobre explotación de polen.

La pureza de la jalea real también se puede detectar con el análisis polínico directo, o sea sin tratamiento químico, ya que debe contener muchos granos de polen y estos sólo deben presentar la exina, ya que para elaboración de la jalea, las abejas digieren completamente el contenido de los granos.

Conocer la flora apícola. Conocer la diversidad de la flora melífera de una región determinada ayuda a corregir o mejorar esta flora introduciendo, seleccionando o eliminando ciertas especies florales (según su importancia apícola) o para favorecer la polinización de las plantas cultivadas al ser usadas por las abejas.

La industria apícola colombiana puede llegar a convertirse en una importante fuente de divisas para el país, sí se toma conciencia de la importancia que tiene el conocimiento de la flora apícola, con evaluación del papel que estas plantas tienen en el sostenimiento y rendimiento de los apiarios. La elaboración de una lista de plantas de gran valor apícola, favorece no sólo esta industria, sino también, a la agricultura, por establecer la práctica de localizar colmenas cerca de las plantas cuyo interés económico radica en frutos o semillas y requieren de polinización por Apis mellifera L., sin embargo son pocos los trabajos realizados en nuestro medio sobre melitopalinología o sobre las plantas apícolas.

En los estudios melitopalinológicos sobre la flora apícola, se debe tener en cuenta que, a la misma hora, unas abejas de una colmena o apiario pueden colectar néctar, otras colectar polen y otras están colectando néctar y polen al mismo tiempo (Fonnegra 1986, 1985b y 1991, Girón 1996).

Conocer la procedencia geográfica de una miel. El análisis polínico de la miel, también indica su origen geográfico, ya que en áreas muy delimitadas, la 238

presencia o no de una determinada especie de la flora puede ser característica de la miel de dicha región. Para esto, es necesario que el material de referencia haya sido preparado con flora de la misma área geográfica.

Conocer el comportamiento biológico de las abejas. El espectro polínico depende, en primer lugar, de la riqueza floral de la región donde se halla la colmena, pero debe tenerse en cuenta que aunque una región sea de gran riqueza florística, las abejas no aprovechan más de una cuarta parte de las especies vegetales allí localizadas, debido al comportamiento de la misma abeja o a la adaptación de la planta a un agente polinizador diferente a la abeja melífera occidental. Además, cuando las abejas tienen a su disposición diferentes fuentes de polen o de néctar, fijan su preferencia sobre una especie vegetal en particular, comportamiento que se conoce con el nombre de fidelidad floral de las abejas. La actividad pecoriadora (búsqueda de alimento – forraje) de las abejas es mayor en las horas de la mañana y disminuye a medida que avanza el día, es casi nula al medio día.

Apicultura y agricultura. La descripción del polen de las plantas con polinización entomófila, especialmente por abejas, auxilia los estudios relacionados con apicultura y agricultura. Un campo específico del análisis polínico, estrechamente relacionado con melitopalinología, es la investigación sobre polinización. El polen contenido en la miel de abejas y el polen adherido a animales visitantes de las flores indican las plantas que fueron visitadas.

Otras aplicaciones. Además de ser útiles a la apicultura, la melitopalinología, tienen aplicación en fitografía, ecología, agricultura y bromatología.

239

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242

ANÁLISIS PALINOLÓGICO DE MATERIAS FECALES El análisis palinológico de las materias fecales recibe el nombre de copropalinología. El polen encontrado en el contenido estomacal y excrementos de humanos y animales herbívoros, da información sobre su dieta, ya que el polen pasa por el aparato digestivo sin que se altere su pared. Con base en este estudio cuando hay muerte de un organismo, se puede determinar si la muerte fue causada por la ingestión de una planta tóxica y aún identificar dicha planta.

Nuevamente debe recordarse que si bien solamente se consigue registrar plantas en floración o cercanas a florecer, son una evidencia importante en la dieta de grandes animales, hombres prehistóricos y actuales y de sus animales domésticos. Parmente, G. C. and Folger D.W. 1974. Eolian biogenic detritus in deep-sea sediment - possible index of equatorial ice age aridity. Science 184:695. APLICACIÓN DEL ANÁLISIS PALINOLÓGICO EN ASUNTOS JUDICIALES El estudio del polen para resolver problemas judiciales recibe el nombre de criminopalinología

o

palinología

forense.

Las

partículas

del

suelo

frecuentemente presentan espectro polínico característico. Los granos de polen encontrados en dichas partículas, reflejan más o menos la vegetación de una localidad y sus alrededores. Estos granos de polen pueden ayudar a resolver un crimen al comparar el polen de la vegetación del lugar de los hechos, con el encontrado en la piel, cabello, mugre de las uñas, fosas nasales de un cadáver o de un sospechoso de crimen, polvo y tierra adherida a la ropa y zapatos del sospechoso,

Según Martínez-Sánchez et al. en varias investigaciones penales diversos palinomorfos obtenidos de las fosas nasales de cadáveres han proporcionado pruebas valiosas sobre las causas de la muerte, incluso después de que las 243

mucosas nasales se hayan descompuesto. La palinología forense ha conseguido reunir resultados importantes, principalmente cuando se trata de plantas cuya dispersión es conocida o plantas introducidas en el área como ornamentales, es lógico pensar que una conclusión negativa es más confiable que una positiva. En la época actual esta nueva disciplina de la botánica surge como promisoria herramienta de apoyo a la investigación criminal (Nassar 2005). Por razones obvias, pocas publicaciones se han hecho respecto a examen de polen en investigaciones de crímenes y por lo tanto, pocos casos se encuentran en archivos policiales.

En los estudios de palinología forense se debe conocer y saber interpretar muy bien el concepto de lluvia polínica, esto es la producción y dispersión del polen y de las esporas, ya que estos dos factores son las consideraciones más importantes en la palinología forense. Si se conoce la producción esperada y los modelos de dispersión de polen y esporas en una región dada, se sabrá que tipos de granos se esperar encontrar en muestras que vienen de ese área (Bryant 1990). Por consiguiente, el primer paso del palinólogo forense es intentar encontrar una coincidencia entre el polen de una región geográfica conocida, con el polen presente en una muestra forense.

Según Bryant y Mildenhall (1990, citado por Carma 2008), la palinología forense debe seguir criterios rigurosos y estandarizados en la recolección de las evidencias, que permitan un alto grado de confiabilidad, independientemente del lugar donde se haya obtenido dicha evidencia. Por ejemplo, las muestras de polen deberían

ser

recogidas

por

un

palinólogo

competente,

preferiblemente

relacionado con el campo forense. Es importante garantizar que las muestras sean colectadas libres de contaminantes y que las mismas permanezcan así durante su almacenaje y análisis en el laboratorio. Por otra parte, algo muy importante y a la vez muy difícil de lograr, es que la información generada a partir de la evidencia botánica sea descrita en un lenguaje sencillo y comprensible, que pueda ser interpretada por el jurado de un caso. Sólo así se podrá masificar e 244

incentivar el uso de este recurso en la investigación criminal. Es necesario dar a conocer las diversas técnicas de análisis que ofrece la botánica forense pensando en diferentes tipos de usuarios, desde personal especializado, policías y abogados, hasta el ciudadano común que puede participar como jurado.

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247

COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL POLEN Composición de la pared. La composición química del polen no es aún bien conocida y es posible que pasen muchos años más antes de conocerla completamente. Además, es lógico suponer que existen diferencias entre los distintos grupos vegetales. Sin embargo se han citado los siguientes componentes característicos:

De 20 a 40% del peso seco de la pared es de esporopolenina, la cual es una sustancia con propiedades bien diferentes a las otras paredes vegetales. La esporopolenina recibe dicho nombre por hacer parte no solo de la exina del polen de gimnospermas y angiospermas, sino también de las esporas de pteridófitos. Gracias a esta sustancia la pared del grano es elástica, extremadamente resistente a los ácidos fuertes y a otros reactivos corrosivos. Sólo se disuelve con ácido crómico y con monoetanolamina a 97ºC y es difícil de saponificación. Su resistencia a ser degradada y su irregular solubilidad dificultan su estudio químico.

Zetzsche y colaboradores (1932) establecieron que la exina probablemente es de naturaleza politerpénica con fórmula C90H144Ox con muchos hidróxidos libres y numerosas uniones etilénicas. La proporción de O/H de la esporopolenina varía en muchas especies estudiadas, lo que indica que en realidad se trata de un grupo de sustancias relacionadas. Esta afirmación es comprobada por la diferencia de colores y deformación plástica que se puede observar en los granos de polen acetolisados y pertenecientes a diferentes especies con morfología polínica igual.

Shaw & Yeadon (1964, 1966) divergen completamente de Zetzsche. Ellos demostraron que las paredes de las esporas de Lycopodium clavatum y del polen de Pinus sylvestris están constituidas de 10 a 15% de celulosa, cerca de 10% de hemicelulosa, 50 a 65% de una fracción lipídica y 15% de lignina o una fracción semejante a una lignina que a su vez muestra analogía con la esporopolenina. 248

Los polisacáridos serían los componentes de la intina. La exina estaría constituida de dos fracciones: una lipídica y otra de tipo lignina. Actualmente sólo es posible afirmar que la pared externa del polen (exina) y la de las esporas (exosporio) no es celulosa y que los productos de su degradación son ácidos alifáticos de cadena ramificada, lo cual excluye la estructura isoprenoide.

La teoría más aceptada es que la esporopolenina sea un polímero oxidativo de carotenos y ésteres de carotenoides (Brooks & Shaw 1968 a b). Según Southworth (1971), al estudiar la biosíntesis de la exina en anteras en desarrollo, mediante marcadores radiactivos, los carotenoides posiblemente sean los precursores de la esporopolenina.

Otros componentes químicos del polen. Además de los posibles componentes de la pared celular, en los granos de polen y esporas se han citado los siguientes componentes (Sáenz, 1978):

Carbohidratos. Aproximadamente 50% del peso del polen seco está constituido por polisacáridos entre los cuales se encuentran: •

Azúcares de bajo peso molecular, por ejemplo: fructosa, glucosa, sacarosa, rafinosa, ramnosa y una pentosa que se encuentra asociada a una proteína alergénica del polen de Ambrosia (Asteraceae).

•

Almidón: de 1,4 a 12%, siendo más abundante en granos de polen anemófilos, al parecer como reserva alimenticia. La concentración de almidón parece tener una relación ecológica ya que las plantas de clima frío presentan mayor concentración de almidón en sus granos de polen que las de tierras más cálidas.

•

Calosa. Constituyente de la pared de la célula madre de la microspora y del polen maduro. En Pinus ocupa una banda situada entre la intina (celulosa y pectina) y la exina (esporopolenina). 249

•

Pectina y hemicelulosa. Localizadas en la intina del polen maduro.

•

Celulosa. En microfibrillas que constituyen la intina y parte de la nexina.

Ácidos orgánicos, lípidos y esteroles. •

Trazas de los siguientes ácidos orgánicos: fórmico, acético, valérico, oléico, linoléico, palmítico, mirístico. El ácido ascórbico (vitamina C) es muy abundante, se encuentran aproximadamente 50 mg/gramo de polen, lo cual parece ser la causa del poder atiinfeccioso del polen.

•

Lípidos: 1,5 a 25% del peso seco, representado en los siguientes ácidos grasos insaturados como linoléico, mirístico, esteárico, palmítico, oléico, láurico y araquidónico. Además fosfolípidos como cefalina y lecitina.

•

Terpenos. Como farnesol, geraniol, linalol y ß-ionona.

•

Esteroles. Como colesterol, estigmasterol y la hormona humana ß-estradiol. Los esteroles exógenos parecen ser necesarios para el desarrollo de muchos insectos como las abejas.

Aminoácidos y proteínas. Proteínas del 16 al 30%. Los aminoácidos representan el 6% del peso del polen seco. Todos los aminoácidos esenciales se hallan libres en el polen en cantidades mayores que en cualquiera otra parte de la planta. El más abundante es la Prolina (1,65% del peso seco), al parecer tiene una función metabólica relacionada con el tubo polínico.

La fracción proteica del polen comprende de 7 a 40% del peso seco y está compuesta por globulinas, albúminas, prolaminas, glutelinas, más las proteínas unidas a grupos no protéicos como las nucleoproteínas, fosfoproteínas, lipo y glucoproteínas. Entre los valores nutritivos de un polen para la abeja y su contenido en proteínas parece ser que no hay correlación, sino un factor cualitativo.

250

Ácidos nucléicos y enzimas. En el polen también se hallan presentes ácidos nucléicos (DNA y RNA), así como enzimas relacionadas con el crecimiento del tubo a través del ovario y con el desarrollo de las paredes del polen. Entre las enzimas que se encuentran presentes en el polen están: amilasa, catalasa, sistemas citocrómicos, diaforasa, diastasa, dehidrogenasa láctica, pectasa, fosfatasa, sacarasa y dehidrogenasa succínica.

Vitaminas. Se encuentran principalmente las vitaminas A, D, E, K, C y el complejo B. Este último es muy abundante por lo cual el polen de maíz se ha utilizado en la polineuritis de la rata. El polen de gimnospermas es pobre en vitaminas contrario al de angiospermas que es muy rico en ellas.

Pigmentos. Las diversas coloraciones que presentan los granos de polen en distintas especies, frecuentemente se deben a pigmentos carotenoides y flavonoides presentes en las entrantes y canales de la exina. Estos pigmentos pueden ser: antocianinas, antoxantinas y carotenóides. Los carotenóides del polen generalmente son ésteres de anteroxantina y de luteína con trazas de carotenos.

El

polen

transportado

por

insectos

generalmente

contiene

carotenóides, mientras que el polen anemófilo raramente presenta estos pigmentos.

Hormonas. Existen hormonas reguladoras del crecimiento, como la auxinas (Ácido Indol Acetico: AIA) que favorecen la formación del fruto a partir del ovario después de la polinización.

Minerales. Se encuentra de 20 a 50% de agua y un 2,8 a 10,6% de minerales entre los cuales principalmente están presentes: potasio, sodio, fósforo, calcio, magnesio y azufre, en proporciones que varían según el grupo vegetal, por ejemplo el polen de gimnospermas contiene menos potasio y fósforo que el de angiospermas. Otros elementos como aluminio, cobre, sílice, manganeso y titanio, se encuentran en microcantidades. El boro se encuentra en cantidades variables 251

e influye favorablemente en la germinación del polen in vitro, por lo cual se utiliza para incrementar la producción de frutos.

NOTA: las enzimas, las hormonas, las vitaminas y los pigmentos se encuentran en trazas.

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252

MICROSPOROGÉNESIS EN ANGIOSPERMAS El estudio de la microsporogénesis se ha realizado más en angiospermas que en gimnospermas, debido a que las angiospermas crecen mucho más rápido para producir flores en condiciones controladas. Además en las gimnospermas el desarrollo del polen en los microsporangios de un estróbilo y muchas veces en el mismo microsporangio, no es sincrónico. Sin embargo en sentido amplio, se puede decir que la microsporogénesis ocurre más o menos de manera similar en gimnospermas y angiospermas.

El polen se forma en la antera que es parte del órgano reproductor masculino de la flor (Figura 1.88). La antera joven en corte transversal muestra una masa homogénea

de

células

meristemáticas

rodeada

de

protodermis.

Por

diferenciación, algunas de estas células subepidérmicas se hacen más grandes, con citoplasma más denso y pared celular más gruesa, originando las células arqueosporiales, las cuales se dividen periclinalmente formando varias capas celulares. Las más internas se transforman en células madres del polen o microsporocitos y las externas dan origen a la capa parietal primaria que se divide periclinalmente formando dos capas parietales secundarias. La externa origina el endotecio y la más interna el tapetum.

253

Figura 1.88. Desarrollo del polen a partir de una célula madre. A: Estambre. B: Corte transversal de una antera. C: Desarrollo de la tétrada. D: Cuatro microsporas haploides. E: Polen maduro. F: Germinación del polen (formación del tubo polínico).

La pared de la antera madura de algunos grupos vegetales consta de tres capas:

Epidermis. Originada de la protodermis.

Endotecio. Capa de células subepidérmicas con engrosamiento en las paredes anticlinales y periclinales y que está relacionada con la dehiscencia de la antera.

Tapetum. Capa más interna especializada de la pared microsporangial, con función nutritiva, cuyo desarrollo ocurre simultáneamente con el de las microsporas.

El tapetum está formado por células secretoras caracterizadas por presentar citoplasma abundante, ricas en organelas tales como: ribosomas, retículo endoplasmático liso y rugoso, mitocondrias, dictiosomas, entre otros cuyo número y actividad varían durante el desarrollo del tapetum, presentan núcleo endopoliplóidico, o más de un núcleo por célula. El tapetum cubre el tejido esporógeno, constituyéndose en el ambiente inmediato y vía de translocación de material hacia la microspora. La presencia de cordones citoplasmáticos uniendo el tapetum y el tejido esporógeno, muestran la vía de estas translocaciones en la fase joven de la microspora. El intenso metabolismo del tapetum durante la esporogénesis se verifica por las modificaciones internas de sus células: cambios de pH, aumento del contenido de auxinas, transporte de carbohidratos, de proteínas y de material de ácido nucléico. Todo indica que el tapetum no es solamente un tejido de reserva y debe tener un papel activo en la esporogénesis, ya que en esta fase todo el tejido de cada lóculo de la antera se convierte en sincicio, que termina en la formación de granos de polen. 254

El tejido esporógeno envuelto por el tapetum, está constituido por células que son potencialmente capaces de dar origen a las microsporas. Frecuentemente algunas de estas células se degeneran y son absorbidas por las otras, las restantes son las que se convierten en células madres de granos de polen que presentan citoplasma denso, con muchos ribosomas, gotas lipídicas, amiloplastos y gran cantidad de plasmodesmos. Los granos de polen se originan a partir de las Células Madres por divisiones meióticas, sincrónicas en toda la antera originando tétradas de células haploides. Durante las divisiones premeióticas, las células del tejido esporogénico están envueltas por paredes pécticas y después de la última división premeiótica, se deposita sobre esta pared otra de calosa. Los cordones citoplasmáticos se rompen y cada célula del tejido esporogénico queda aislada tanto de sus células hermanas, como del tapetum. De esta manera, se originan las Células Madres de la microspora que inician la división meiótica. En la antera, cada célula madre del polen se divide por meiosis para producir cuatro microsporas haploides unidas en la tétrada. Las microsporas también son encerradas por una pared de calosa formada en el centro de la pared de la célula madre.

La diferenciación de las microsporas hasta granos de polen se inicia cuando están todavía dentro de la pared de calosa, la cual aísla físicamente cada una de las tétradas de microsporas dentro del lóculo de la antera. Como las divisiones no alcanzan la pared, las cuatro microsporas permanecen unidas y envueltas por la pared de calosa de la célula madre. Esta pared actúa como pionera molecular y su presencia impide la entrada de macromoléculas originadas en la antera y portadoras de información genética.

En la mayoría de las dicotiledóneas, las tétradas son tetrahédricas, mientras que en la mayoría de las monocotiledóneas, son bilaterales. Generalmente las microsporas se separan rápidamente formando los granos de polen libres unos de otros llamados mónadas. En muchos casos permanecen unidas y reciben el nombre de diádas (por ejemplo en Scheuchzeria), tétradas (en Mimosa, o en 255

Ericaceae), políadas (en Asclepias curassavica), polinias (como en algunos géneros de Asclepiadaceae o de Orchidaceae). Aunque los granos de polen eventualmente están aislados unos de otros, el estado de tétrada constituye una importante etapa de desarrollo y los patrones de la superficie muestran características relacionadas con la orientación del polen en la tétrada.

El polen recién formado presenta citoplasma denso, comienza a aumentar de volumen y se inicia la deposición de la exina. En el citoplasma se forma una vacuola que disloca al núcleo desde el centro hacia las proximidades de la pared. Sigue luego un período aparentemente de poca actividad, que varía de acuerdo a la especie, luego ocurre la primera división meiótica formando dos células llamadas célula (núcleo) vegetativa y célula (núcleo) generativa. Está última puede permanecer como tal y dividirse meióticamente después de entrar al tubo polínico. Los granos de polen que presentan este patrón son llamados bicelulares o binucleados. Otras veces la división del núcleo generativo ocurre dentro del polen antes de la formación del tubo polínico y reciben el nombre de tricelulares o trinucleados. En un principio se creía que estos núcleos no estaban separados por paredes, pero gracias a los estudios de ultraestructura en microscopía electrónica, se ha observado plasmalema separando los núcleos, así que básicamente son células. De esta forma, el polen se libera de la planta como una unidad celular compuesta por dos o tres células: una célula vegetativa y una o dos células generativas (gametos masculinos o anterozoides) y recubierta por una pared celular compleja cuya estructura fina, composición química y desarrollo, son todavía objeto de investigación. Cuando los granos de polen están maduros, la pared de calosa se rompe y son liberados quedando disponibles para ser transportados hacia el pistilo (generalmente de otra flor) donde ocurre la fertilización.

Desarrollo de la esporodermis. Un aspecto muy interesante en la ontogénesis del polen, es el proceso de formación de la pared. Existen numerosas investigaciones tendientes a explicar el desarrollo de la esporodermis, 256

especialmente el origen de la exina. Generalmente se postulan dos patrones de desarrollo: para unos investigadores la esporopolenina se forma directamente del protoplasma de la microspora. Para otros, su desarrollo está asociado con fenómenos externos, incluyendo material de origen tapetal después de que las microsporas se liberan de la pared de calosa para quedar como células individuales. Dentro de las células del tapetum se forman placas de esporopolenina a partir de mitocondrias. Estas mitocondrias desaparecen y los pequeños bloques de esporopolenina migran hacia la superficie de las células del tapetum y se depositan sobre la pared de celulosa de la microspora formando el patrón preestablecido para esta pared. Esto es demostrado con el estudio de granos de polen estériles de Silene pendula en los cuales el protoplasma se degenera prontamente, pero la deposición y patrón de la exina son normales, indicando que la deposición posiblemente sea un mecanismo externo a la microspora. Las investigaciones realizadas todavía no permiten descartar ninguna de las dos hipótesis. Aunque de tiempo atrás y con base en estudios de microscopía de luz, microscopía electrónica, marcación isotópica, afinidad de colorantes, resistencia a la acetólisis y numerosos microensayos, se sustenta la posible formación de esporopolenina en el tapetum antes del surgimiento de la exina.

El patrón característico de deposición de la exina, sería entonces, el resultado de la interacción de dos procesos diferentes y complementarios: la biosíntesis de la esporopolenina en el tapetum (proceso inespecífico en lo que se refiere al arreglo especial del depósito en la superficie de la microspora) y la organización específica de la deposición según el código genético característico de la microspora. Como es muy grande la diversidad de tipos polínicos se puede esperar, como en realidad sucede, que existan diferentes mecanismos de desarrollo de la pared del polen.

El principal rasgo del patrón de la pared aparece en cada microspora cuando está todavía encerrada en la pared de calosa de la célula madre del polen, así que el 257

patrón no se produce como resultado del contacto con algún tejido parental de la antera. El proceso de formación del patrón de la pared comienza al principio del período de tétrada cuando cada célula es independiente y completamente aislada de las otras células por una gruesa pared de calosa. En este estado, una capa de celulosa se forma entre el plasmalema de la microspora y la pared de calosa que la recubre. Esta capa de calosa recibe el nombre de primexina y es considerada como la matriz sobre la cual se deposita la exina según el patrón específico del grano.

La primexina está formada por microfibrillas de celulosa atravesadas por bastoncillos de un material denso y denominados probáculos. La primexina forma una cobertura continua en el grano, excepto en las áreas que serán aberturas en el grano maduro. En estas áreas, una capa del retículo endoplasmático se yuxtapone al plasmalema, el cual se orienta contra la pared de calosa de la tétrada, de tal forma que el retículo endoplasmático actúa como un clisé que permite deposición de celulosa por todas partes, excepto en las áreas donde está bloqueada. Generalmente las microsporas se disponen en tétrada tetrahedral con tres caras en contacto con sus hermanas, la mayoría de las veces las aberturas se forman en esos tres lados.

En las áreas inperturadas la primexina es atravesada radialmente por probáculos laminares llamados procolumelas compuestas de lipoproteínas, observándose los primeros vestigios de exina con probáculos y protectum sobre estos últimos, pero aún no hay deposición de esporopolenina. De modo que antes de la deposición de ésta, ya se han formado los tres principales caracteres: distribución de los báculos (columelas), número y posición de las aberturas.

La pared de calosa se rompe enzimáticamente, las microsporas con sus superficies patrón se separan de la tétrada y permanecen en el lóculo de la antera, expuestas a una variedad de sustancias, inclusive del tapetum. El polen aumenta rápidamente de tamaño (32 veces en el género Poa) y hace que la 258

primexina se estire y adelgace. Se desintegra la capa de celulosa de los probáculos

dejando

solamente

un

residuo

entre

ellos.

Se

desarrollan

proyecciones en la base y entre las cabezas de los probáculos para formar la capa basal (foot layer) y el tectum respectivamente. Los probáculos se vuelven sólidos y desaparece su estructura laminar, los granos se vuelven resistentes a los ácidos fuertes por lo que se cree que en este estado ya ocurrió la deposición de esporopolenina y se forma el infratectum y tectum de la exina madura. La nexina-2 y la intina se forman después de la disolución enzimática de la calosa y separación de la tétrada. Se cree que la nexina-2 se forma desde el interior de la pared de la microspora.

La pared de calosa corta todo intercambio de materiales con la cavidad de la antera y con las otras microsporas. Sin embargo, después de la disolución de la calosa, la espora queda libre en la antera en estrecho contacto con el tapetum. La secreción de esporopolenina de naturaleza lipídica, parece tener su origen en las células del tapetum donde existen pequeños corpúsculos al parecer de material lipídico y que proceden del retículo endoplasmático de las células del tapetum. Estos gránulos se denominan corpúsculos de ubisch. Este material lipídico está formado de carotenoides y ésteres de carotenoides, que son precursores de la esporopolenina. Por estudios de ultraestructura, se tiene demostrado que los corpúsculos de Ubisch son liberados en la cavidad de la antera cuando se rompen las paredes de las células del tapetum. Una vez libres, adquieren la cubierta de esporopolenina. El papel de estos corpúsculos no es claro, pero se cree que se ponen en contacto con la exina en desarrollo y le transfieren la cubierta de esporopolenina. Por otro lado, también se cree que no juegan ningún papel en la transferencia de la esporopolenina y lo que ocurre es que son cubiertos con esporopolenina debido a que se encuentran libres, junto con los granos de polen, en la cavidad de la antera y la deposición de esporopolenina se da en todas las superficies posibles.

259

Más tarde se forma la segunda pared del polen o intina. Esta pared se inicia en las regiones de las aberturas y se extiende en círculos debajo de la exina hasta envolver todo el grano. La intina queda en contacto directo con el citoplasma y dará origen a la pared externa del tubo polínico. Finalmente se depositan muchas otras sustancias derivadas de la desintegración del tapetum y cubren el polen maduro. El conjunto de estas sustancias recibe el nombre de trifina y “pollenkitt” y constituyen los pigmentos característicos y materiales pegajosos (viscosos) u olorosos que intervienen en el proceso de polinización.

El tapetum suministra también otra clase de compuestos de la parte externa de la exina y de los espacios entre las columelas de algunos granos de polen. Estas sustancias son de carácter proteico y reciben el nombre de proteínas de reconocimiento, las cuales garantizan que el polen germine únicamente sobre un estigma compatible. Si el estigma es incompatible, las proteínas de reconocimiento inician una reacción que detiene el crecimiento del tubo polínico.

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261

POLINIZACIÓN: DISPERSIÓN DEL POLEN El mecanismo mediante el cual el polen es llevado desde la antera hacia el estigma compatible recibe el nombre de polinización y es de gran importancia para el desarrollo analítico de los estudios palinológicos. Dependiendo del agente transportador del polen, la polinización puede ser:

POLINIZACIÓN ANEMÓFILA Polinización en la cual el medio de transporte es el aire. Las plantas con este tipo de polinización, son las que dispersan más activamente el polen en la atmósfera.

Las plantas con polinización anemófila generalmente tienen granos de polen poco ornamentados y forma esférica o aerodinámica para facilitar su dispersión por el viento. Se considera que las leyes que rigen la dispersión y sedimentación del polen aerovagante, son idénticas a las que rigen la dispersión y sedimentación de las partículas en general, con su correspondiente velocidad de caída, la cual depende de la densidad de la partícula, densidad del aire, viscosidad, entre otros De todos modos, el polen posee unas características intrínsecas diferentes a las relacionadas con su ornamentación y a las ligadas con su harmomegatia: hidratación y deshidratación del polen en función de las condiciones atmosféricas, que se traducen en una fuerte sedimentación en condiciones de humedad (lluvia, rocío, niebla), mientras que, en condiciones de sequedad, el polen se hace menos denso y su permanencia y dispersión en la atmósfera puede ser mucho mayor.

Debido a la extraordinaria cantidad de polen necesaria para que esta polinización tenga éxito, los estambres son muy numerosos. Además, para que las hojas no obstaculicen la circulación de polen, las plantas han desarrollado diversas adaptaciones. Así, las flores están situadas en lugares expuestos al viento o la floración se produce antes que el desarrollo de las hojas. En las plantas herbáceas, el mismo efecto se consigue gracias a la reducción de la superficie foliar. De igual forma, la superficie captadora de polen de la flor femenina, tiene 262

una disposición externa y suele ser pegajosa. Los granos de polen que se dispersan por el viento tienen diferentes destinos: •

La atmósfera: el polen que flota en la atmósfera en condiciones de humedad se hidrata instantáneamente, libera diversas proteínas y queda inactivo. Se sedimenta y puede volver a resuspenderse en la atmósfera por el viento.

•

Estigma de su especie: el polen llega hasta el estigma de la flor de su especie, se hidrata gradualmente y libera proteínas que serán reconocidas por el estigma. Así, el grano germinará, formará el tubo polínico y fecundará los óvulos. Solo unos pocos granos llegarán a completar este ciclo.

•

Estigma de otra especie: El polen llega hasta el estigma de otra especie, se hidrata variablemente y libera proteínas. Estas no son reconocidas por el estigma por lo que el polen no germinará.

•

Las mucosas respiratorias: el polen entra en contacto con las mucosas, se hidrata y libera diversas proteínas. Se producirá el reconocimiento antígenoanticuerpo y podrá desencadenarse una reacción alérgica en las personas sensibles.

POLINIZACIÓN HIDRÓFILA Polinización en la cual el medio de transporte es el agua. El polen de estas plantas presenta adaptaciones a esta polinización como son: forma filamentosa, ausencia de exina, flexibilidad o densidad próxima a la del agua. Las especies estrictamente hidrófilas son poco numerosas. Ni siquiera en las plantas acuáticas, esta polinización está difundida de manera general, puesto que la mayoría de estas plantas son anemófilas o zoófilas porque la floración y polinización tienen lugar fuera del agua, gracias a mecanismos muy especiales como el desarrollo de largos pedúnculos que sacan las flores del agua, (ejemplo el género Elodea). Así únicamente las plantas que viven totalmente sumergidas y en las cuales la floración y la polinización tienen lugar en el agua, pueden recibir la denominación de hidrófilas, (ejemplo el género Zostera L). 263

POLINIZACIÓN ZOÓFILA Polinización en la que el agente de transporte son los animales, así tenemos: entomofilia, ornitofilia, malacofilia y quiropterofilia, si los agentes de transporte son, respectivamente, los insectos, los pájaros, los gusanos y los murciélagos. Los granos de polen zoófilos tienen la exina más o menos ornamentada con el fin de facilitar su adhesión a los animales polinizadores. Las plantas zoófilas necesitan producir menos cantidad de polen que las anemófilas para llevar a cabo la polinización, pero requieren características ópticas (dimensión, forma, color) u olfativas (olores), para atraer a los polinizadores y asegurarse de este modo las visitas. Además, algunas flores ofrecen a los animales alimentos como el néctar.

Debe señalarse también que puede ocurrir polinización zoófila por agentes ocasionales, generalmente algunos mamíferos medianos o pequeños como perros, zarigüellas, entre otros, que al estar husmeando entre las hierbas o matorrales en busca de alimento o vivienda, impregnan el pelambre de sus cuerpos con el polen de las flores abiertas que rozan, llevándolo a otras en iguales condiciones.

Unas pocas plantas acuáticas, de los géneros Zostera, Ceratophyllum, Zannichellia, son polinizadas bajo el agua. Los granos de polen de esas plantas, tienen paredes celulares muy delgadas y sus fósiles no se han encontrado hasta el presente. Otro grupo muy pequeño presenta flores autógamas. En casos extremos las flores son cleistógamas, es decir, no abren, y el polen no es expuesto y germina en el estigma dentro del periantio cerrado. Las flores casmóganas abren únicamente después de que los granos de polen han germinado y la mayor parte están entretejidos y pegados al estigma por los tubos polínicos. Generalmente los granos de polen no son liberados en ninguno de los casos anteriores, el número de granos producidos es muy reducido (menos de 100 granos por antera) probablemente debido a la gran efectividad de su proceso de polinización. Aún en estas plantas autógamas donde algunos granos de polen al menos son expuestos, su número es extremadamente pequeño comparado con 264

el de las plantas alógamas. La liberación al aire de polen de plantas autógamas depende de las condiciones externas.

Hay un grupo muy grande de plantas zoógamas en las cuales el polen es llevado por algún vector animal (insectos, aves, murciélagos, entre otros) desde la antera de una flor hasta el estigma compatible de otra. En algunos casos extremos esas flores son altamente especializadas y el polen es liberado únicamente cuando el animal apropiado visita la flor con un determinado comportamiento. En estos casos el polen se deposita firmemente sobre el vector y es retirado de él únicamente por el estigma. A no ser que el animal que lleva el polen muera en un lago o en un pantano, o la flor entera o las anteras caigan accidentalmente en el agua, los granos de polen de este tipo de flor, al igual que las autógamas tienen pocas oportunidades de ser preservados como fósiles en sedimentos.

En las plantas zoógamas las anteras están más o menos cubiertas, puede haber baja producción de granos de polen (alrededor de 1.000 granos por antera) o muy baja producción (alrededor de 100 granos por antera, en unidades polínicas) con casi ninguna dispersión o liberación en el aire, como ocurre en los tipos más especializados y efectivos de polinización zoógama. En estas plantas los granos de polen frecuentemente poseen una superficie altamente esculturada, recubierta de aceite o sustancias viscosas que permiten su unión con otros granos o con el cuerpo del animal vector. Existen casos de especialización extrema como las másulas de Orchidaceae, las polinias de Asclepiadaceae o las tétradas con viscina que unen los granos de polen de Rhododendron o Bejaria (Ericaceae). Estos grupos de polen son dispersados como una unidad, su existencia tiende a reducir altamente el número de unidades de polen dispersos. Estos grupos pueden separarse durante el proceso de fosilización, por lo tanto, aunque los granos de polen de especies zoógamas obligadas, ocasionalmente se encuentren en sedimentos, son de poca frecuencia y ocurren irregularmente. Por consiguiente, en los estudios de depósitos fósiles, no pueden ser tratados de igual forma que las especies anemógamas. Su presencia puede suministrar datos de 265

gran valor, pero nada se puede concluir de su ausencia. Sin embargo, por otra parte, también se pueden presentar especies zoógamas que producen granos de polen en cantidades tan grandes que su presencia en el aire puede ser comparada con las especies de polinización anemófila. De tal manera, aquellas especies de polinización definida que presentan a su vez la facultad adaptativa de ser polinizadas por otro medio en ausencia de su vector, son conocidas como ambófilas, como en el ejemplo anterior, plantas zoógamas ocasionalmente son polinizadas por el viento, cumpliendo así la encomienda biológica de la reproducción.

El tipo más importante para estudios de sedimentos es el polen de especies de polinización anemófila. Tales especies presentan anteras expuestas, proyectadas fuera del periantio, producen gran cantidad de granos de polen (se han citado casos con más de 70.000 granos por antera) que son liberados al aire y dispersados todos sobre el ambiente en forma de la llamada “lluvia polínica” y por consiguiente caen en pantanos y lagos. Este tipo de polen es liso o poco ornamentado, con forma circular o aerodinámica, seco y los granos caen separadamente (individuales), así producen el máximo número de unidades dispersas y aseguran una distribución regular de los granos sobre un área amplia. Como la polinización mediante el viento es menos eficiente que la realizada por insectos y depende más del azar, se compensa con esa mayor producción de polen. Se estima que una hectárea de pino silvestre (Pinus sylvestris) produce anualmente entre 10 y 80 kilogramos de polen.

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267

FORMACIÓN Y DESARROLLO DEL TUBO POLÍNICO Los estudios de germinación del polen (formación del tubo polínico) se iniciaron con Amice, quien describió por primera vez este mecanismo en 1824. A partir de 1834, despúes de que von Mohl consiguió por vez primera la germinación in vitro del polen se vienen desarrollando muchos estudios controlados sobre la formación del tubo polínico, que han dado origen a muchas publicaciones sobre la fisiología y germinación del polen. Varias sustancias químicas rigen la formación del tubo polínico, entre las cuales se encuentran azúcares, principalmente la sacarosa y otros compuestos orgánicos como el ácido ascórbico, riboflavina, giberelinas, entre otros.

Cuando el polen cae en un estigma compatible, la formación del tubo polínico se inicia con una protuberancia originada por la intina que emerge a través de una de las aberturas del polen y va creciendo y desarrollándose con la apariencia de un tubo. Cuando el polen tiene varias aberturas se pueden formar varios inicios de tubos polínicos, pero solamente uno se desarrolla como tal.

Una vez formado el tubo polínico en el extremo se localiza la célula vegetativa y en el caso de los granos de polen bicelulares (binucleados) la célula generativa pasa al tubo polínico y da origen a dos gametofitos, en los granos de polen tricelulares (trinucleados) pasan al tubo polínico las dos células generativas. El tubo polínico va creciendo en dirección al saco embrionario, donde ocurre la fecundación.

El crecimiento del tubo polínico depende de la constante formación de su pared por la producción continua de celulosa, calosa, pectinas y proteínas, a partir de sustancias almacenadas en el mismo polen o provenientes del pistilo a través del tejido conductor. Esta es la explicación de porqué in vitro no se consigue el mismo crecimiento y velocidad de formación del tubo polínico como se da in vivo.

268

VIABILIDAD DE LOS GRANOS DE POLEN La “viabilidad” ha sido definida como “tener la capacidad para vivir, crecer, germinar y desarrollo” (Lincoln et al. 1982). El término “viabilidad” también ha sido utilizado para describir los granos de polen con capacidad de germinar en el estigma (Morse 1987, Preston 1991, Vaughton & Ramsey 1991, Niesenbaum 1992) o germinar in vitro (Beardsell et al. 1993, Lindgren et al. 1995) o teñir cuando son sometidos a colorantes específicos (Bernhardt et al. 1980, Becker & Ewart 1990, Mione & Anderson 1992, Nyman 1992). Sin embargo, los granos de polen considerados como “viables” en realidad no puede germinan (in vitro o in vivo) si las condiciones ambientales no le son favorables.

En los estambres de la gran mayoría de las especies vegetales se originan granos de polen no viables. Estos granos de polen generalmente son más pequeños o delgados que los granos de polen viables de la especie vegetal, carecen completamente de citoplasma o lo contienen en cantidades muy pequeñas, pero en la exina conservan las características propias de la especie.

MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE VIABILIDAD Para estudios de viabilidad las flores se recogen en la mañana, después de la antesis e inmediatamente se tratan las anteras para el estudio de viabilidad o las anteras se fijan en solución de Carnoy (3 partes de metanol: 1 parte de ácido acético), se almacenan a -20°C hasta el momento de utilizarlas.

En términos generales existen seis métodos o pruebas para realizar los estudios de viabilidad del polen: 1.

Medidas de la respiración o la conductividad de la química del polen (poco frecuente). Debe hacerse con anteras sin fijación previa.

2.

Técnicas de tinción (colorantes vitales para la determinar la presencia de citoplasma y los tintes que indican actividad de la enzima), puede realizarse con anteras fijadas o sin fijación previa. Un método común para evaluar la viabilidad del polen es la coloración del citoplasma (Barrett 1985, 269

Dudash 1991, Willis 1999). Las anteras se sumergen a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante dos horas, en una solución con un colorante como el acetocarmín, azul de anilina en lactofenol, azul de metileno, rojo neutro, TTC (2,3,5 trifenil clorato de tetrazolio) 5% en solución acuosa de sacarosa 5% ó al 50%, FDA (diacetato fluoresceína) a 6.25 µg/ml 5% en solución acuosa de sacarosa 25% (esta última debe ser analizada con microscopio de fluorescencia con filtro de longitud de onda de excitación de 460-490 nm y de emisión de 515-550 nm).

Los granos viables o potencialmente viables absorben el colorante, mientras que los granos inviables no lo absorben. Los colorantes usados indican la presencia de citoplasma en los granos considerados como viables, pero se debe tener muy claro que la presencia de citoplasma no necesariamente indica capacidad de fertilización ya que el citoplasma se puede encontrar en polen inmaduro y aun en polen muerto o secado artificialmente. El porcentaje de viabilidad se establece contando, al menos en cinco (5) portaobjetos, 500 granos de polen que tomen o no el colorante. 3.

Análisis microscópico para comparar la forma o el tamaño del diámetro en los granos viables e inviables. La viabilidad se puede apreciar por la variación en la forma de los granos de polen viables con relación a la forma de los no viables (Stanley & Linskens 1974, Heslop-Harrison & Shivanna 1984). Según Kelly et. al. (2002) el diámetro promedio de los granos de polen viables es de mayor que el diámetro promedio de los granos inviable. Esta diferencia es lo suficientemente grande para ser detectada y se puede utilizar para obtener un indicador de la viabilidad del polen. El porcentaje de viabilidad se establece contando, al menos en cinco (5) portaobjetos, 500 granos de polen que tomen o no el colorante.

4.

Germinación (in vitro). Con esta técnica la viabilidad se dertermina por la germinación del grano de polen, en el cual se debe formar tubo polínico de 270

un tamaño igual o superior al tamaño del grano. Debe hacerse con anteras sin fijación previa, por lo menos en cinco (5) portaobjetos. Se utiliza un medio de cultivo líquido ensayando con diferentes concentraciones de solución acuosa de sucrosa al 5%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30% (se puede continuar variando la concentración de 5% en 5% hasta llegar a 60%), dejadas a temperatura ambiente durante 24 horas. Es aconsejable añadir solución acuosa de ácido bórico (H3BO3) 0.01% ó 0.03%. El porcentaje de viabilidad se establece contando, al menos en cinco (5) portaobjetos, 500 granos de polen que tomen o no el colorante. 5.

Contenido de prolina. determinó la prolina colorimetricamente usando el método de Bates et al.

6.

Capacidad de fertilización o sea la formación de semillas (Stanley y Linskens 1974). Debe hacerse con anteras sin fijación previa.

Todas estas pruebas tienen sus ventajas y desventajas y factores de error. Ninguna determina exactamente la viabilidad del grano de polen, por lo cual se recomienda hacer varias de las anteriores pruebas, para tener un acercamiento lo más exacto posible (Thomson et al. 1994, Rodríguez- Riaño & Dafni 2000).

IMPORTANCIA DE LOS ESTUDIOS SOBRE VIABILIDAD DE LOS GRANOS DE POLEN Los estudios de viabilidad de los granos de polen tienen muchas aplicaciones prácticas y básicas, principalmente en agricultura y genética vegetal o relacionar la viabilidad con el heteromorfismo floral para determinar posibles hibridaciones. La evaluación de la viabilidad del polen es fundamental para el estudio de los siguientes aspectos: •

Monitoreo de polen durante el almacenamiento.

•

La genética y la interacción polen-estigma.

•

Programas de mejoramiento de cultivos.

271

•

Estudios agro-biológicos y que incluye tanto la viabilidad como la capacidad de germinación del grano de polen.

•

Mantenimiento del banco genético.

•

Estudios de incompatibilidad y fertilidad.

•

Evaluación de la germinación del polen después de la exposición a ciertas condiciones.

•

Evaluación de la dispersión y flujo de genes (Stanley & Linskens 1974, Heslop-Harrison et al. 1984, Heslop-Harrison 1992, Dafni 1992, Mulugeta et al. 1994, Shivanna & Rangaswamy 1992).

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281

GLOSÁRIO A- del griego a, sin. Prefijo que denota carencia o negación. Abertura, f. Hueco o hendidura en la pared del polen acetolisado, inglés apertura. Abporal, adjetivo. Lagunas situadas opuestamente a los poros en los granos de polen lofados, por ejemplo en el género Sonchus. Laguna abporal, inglés abporal lacuna. Acetolisis, f. Técnica de preparación de polen y esporas para su estudio, inglés acetolysis. Aeropalinología, f. La parte de la palinología que estudia el polen y las esporas que flotan en la atmósfera, inglés Aeropalynolocy. Acolpado, da, adjetivo. De a-, sin y colpado. Sin colpos. Alergeno. Es un antígeno que provoca la producción de la inmunoglobulina IgE por parte del sistema inmune e induce, tras unirse a esta inmunoglobulina, una reacción alérgica. Los alérgenos más comúnmente asociados a enfermedades alérgicas son los inhalados, llamados aeroalérgenos (ácaros, partes de animales, granos de polen y hongos), son partículas transportadas por el aire, capaces de producir alergia respiratoria, cutánea o conjuntival. Los aeroalérgenos que con mayor frecuencia producen cuadros alérgicos, a través de la inhalación, son los granos de polen, los cuales afectan la mucosa respiratoria. Alógamo, ma, adjetivo. Del gr. alos, otro, y gamos, unión sexual. La flor que es fecundada por el polen procedente de otro indivíduo de la misma especie. Antónimo de autógamo. Alveolado-da, adjetivo. Del latín alveolos, diminutivo de alveus, cavidad hueca. Se aplica al infratéctum que presenta huecos de talla y forma irregulares, por ejemplo en el gén. Pinos, inglés alveolate. Ámbito. m. Del latín Ambitus, ámbito. Contorno de un polen o espora visto con el eje polar exactamente perpendicular al plano de la preparación (vista polar), es decir, con uno de los polos en el lugar más elevado. Contorno de un grano de polen o espora en vista polar. Amb. Abreviación de ámbito, término en desuso. 282

Ana- pref. Del gr. ana, distal. Indica la posición de las aberturas en la cara distal. Anacolpado-da; anaporado-da; anasulcado-da; Anatremo-ma, inglés anacolpate; anaporate: anasulcate; anatreme. Anacata-, prefijo del gr. ana, distal y cata, proximal. Anacatacolpado-da; anacataporado-da; anacatatremo-ma, inglés anacatacolpare; anacataporate; anacatatreme. Anacatacolpado, da, adjetivo. De anacata- y colpado. Con una abertura colpada en cada una de las caras proximal y distal, ing. anacatacolpate. Análisis LO, OL. L = luz, O = oscuridad. Análisis de la superficie de la pared del polen o de la espora, que por diferencia en la refracción de la luz, mediante altura de enfoque, muestra el tipo de ornamentación de la pared. Cuando el enfoque es alto la ornamentación saliente se ve clara (L) y el fondo oscuro (O) y cuando el enfoque es bajo las salientes se ven oscuras (O) y el fondo claro (L). Anemofilia. Dícese de las plantas polinizadas por el viento. Angulaperturado, da. Grano de polen cuyas aberturas están localizadas en los ángulos (vértices) del ámbito triangular o poligonal, inglés angulaperturate. Angustimurado-da, adjetivo. Del latín angostos, estrecho. Con los muros estrechos. Se aplica a los granos de polen reticulados cuando la sección de los muros es menor que la quinta parte de la anchura de los lúmenes, inglés angustimurate. Anillo, m. Área de ectexina que rodea un poro y que se diferencia del resto de la superficie por su grosor u ornamentación, inglés annulus. Apertura, del latín aperire, abrir, f. Rotura, adelgazamiento o zona diferenciada del resto de la superficie del polen o de la espora, a cuyo través puede salir el tubo polínico. Sin, de abertura germinal, inglés apertura. Aperturado, da. Dícese del grano provisto de aberturas. Puede ser mono, di, tri, tera, penta, poli o multiaperturado, inglés aperturate. Aperturoide, adjetivo. Semejante a una apertura, inglés aperturoid. Ápice, del latín apex -icis, m. Extremo superior o punta. Se aplica a los ángulos del contorno en las esporas trilesas, inglés ápex. Apo-. Privación, alejamiento. 283

Apocolpio. Apocolpo. Área en los polos, delimitada por las líneas imaginarias que unen los ápices de los colpos o de los cólporos en granos zonoaperturados y que limita hacia el ecuador con los límites polares del mesocolpo, inglés apocolpium. Apolar, adjetivo. Sin polos definidos, inglés apolar. Apoporo, m. Área polar delimitada por la línea que une los bordes de los poros en los granos de polen zonoporados, inglés apoporium. Arco, m. Engrosamiento de sexina que se extiende de una apertura a otra en forma de banda curvilínea, por ejemplo en el génnero Alnus, inglés arcus. Área polar. Área en los polos libre de aberturas. Areolado-da, del latín areolatus y éste de areola, diminutivo de area, adjetivo. Se aplica al grano de polen con áreas circulares o poligonales de ectexina separadas por hendiduras, cuyo conjunto forma un relieve invertido. Sinónimo de insulado, inglés areolate. Areolado-da, del latín areolatus y éste de areola, diminutivo de area, adjetivo. Se aplica al grano de polen con áreas circulares o poligonales de ectexina separadas por hendiduras, cuyo conjunto forma un relieve invertido. Dícese del polen cuya sexina tiene ornamentación constituida por islas salientes, de formas irregulares, separadas por espacios deprimidos, estrechos y curvos. Sinónimo de insulado, inglés areolate. Aspidado-da, adjetivo. Se aplica al grano de polen provisto de áspide, por ejemplo en el género Betula, inglés aspidate. Áspide, m. Engrosamiento de exina en forma de escudo que sobresale de la superficie del grano de polen y rodea las aberturas poradas. Saliente sobre la cual se localiza un poro, inglés aspis. Aspidote. Dícese de los poros localizados en salientes (áspides) más o menos circulares. Es frecuente en los granos de polen de Apocinaceae. Atremo-a, adjetivo. Desprovisto de aberturas, inglés atreme. Atrio, del latín atrium, m. Vestíbulo, inglés atrium. Bácula. Del latín hacolos, bastón. Elemento de ectexina en forma de bastón cuya longitud es mayor de 1 µm. 284

Bácula infrategilar. Dícese de las columnelas que están debajo del tectum o tegilo. Baculado-da, adjetivo. Grano de polen polen con báculas, inglés Baculate. Basal, adjetivo Relativo a la base. Véase capa basal. Base, del latín bo.sis, f. Estrato más interno de ectexina, que soporta los báculos cuando éstos existen. Sin, de nexina-l, inglés foot-layer. Bilateral, adjetivo. Se aplica al grano de polen o a la espora con un único plano principal de simetría, inglés bilateral. Bordeado-da, adjetivo. Se aplica al polen que tiene las aperturas rodeadas de una exina diferente del resto de la superficie, bien sea por un cambio en la densidad de la ornamentación o por un diferente grosor. Véase anillo, margen. Brevicolpado, da. Dícese del polen con colpos cortos y anchos, inglés brevicolpate. Brocbado-da, del latín broccos, prominente, dentón, adjetivo. Reticulado, inglés brochate. Cabeza, f. Ápice engrosado de un elemento escultural como el pilo, inglés caput. Cámara, f. Cavidad entre dos capas de la cubierta de una espora. Canaliculado-da, adjetivo. Sinónimo de fosulado. Capa, f. Cada parte diferenciada de la esporodermis, como la exina y la intina. Capa basal. Sinónimo de base, inglés layer. Capitado-da, del latín capitatos. De capot, cabeza, adjetivo. Se aplica a la parte apical globulosa de un elemento escultural, inglés capitate. Cara, f. Parte de la superficie de un grano de polen o espora. Cara distal: entre el ecuador y el polo distal. Cara proximal: entre el ecuador y el polo proximal, inglés distal face, proximal face. Cata, prefijo. Indica la posición de las aberturas en la cara proximal. Cavado, da. Dícese del polen o de sexina con clavas. Cavado-da, adjetivo. Del latín cavatus, hueco. Se aplica al grano de polen con cáveas, inglés cavate.

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Cávea, del latín cavéa, f. Cavidad entre sexina y nexina que se extiende hasta las márgenes de los colpos, donde se reunen, por ejemplo en Asteraceae, inglés cavea. Cerebriforme, adjetivo. Del latín cerebriformis, de forma parecida al cerebro. Se aplica al relieve de algunos granos tectados, por ej. En el género Ulmos. Cicatriz, f. Lesura. Cíngulo, m. Del latín cingulum, cinturón. Anillo masivo en la región ecuatorial de una espora, inglés cingulum. Circumpolar, adjetivo. De polar con el prefijo latino Circum, alrededor de. Se aplica a las lagunas situadas alrededor del polo en los granos de polen lofados. Laguna circumpolar, inglés circumpolar lacuna. Clava, del latín clava. f. Saliente de la sexina mayor de 1µm de altura, cuya parte superior es más ancha que la base, inglés clava. Clavado-da, adj. Provisto de elementos esculturales en forma de clava, inglés clavate. Claviforme. Dícese de cualquier saliente con forma de clava. Colpado. Dícese del polen cuyas aberturas son colpos, inglés colpate. Colpo. Abertura alargada en la cual la relación entre sus dos diámetros es mayor que 2:1. Colpoide, adjetivo. Semejante a un colpo pero no bien definido, inglés colpoid. Colporado, da. Dícese del polen cuyas aberturas son cólporos, inglés colporate. Cólporo. Abertura compuesta formada por un colpo y otro abertura en el colpo, generalmente central, llamada ós o endoabertura. Constricto, a. Dícese del culpo o de la endoabertura de diámetro más estrecho que largo. Columela, de ectexina en formade columna que sostiene el téctum o la cabeza del pilo. Báculo infratectal. Comisura, f. Línea de dehiscencia en la lesura de las esporas, inglés commissure. Contorno, m. Ambito. Corpus, m. La parte del grano de polen situada entre dos vesículas, inglés corpus. 286

Costilla, del latín costa, costilla. f. Engrosamiento de endexina alrededor de un coIpo o de un poro, inglés costa. Crasi-, prefijo derivado del latín crassus, grueso, inglés crassiCrasimarginado, a. Con margen gruesa. Cresta. f. Del latín Crista. Arista prominente más o menos compleja, formada por elementos esculturales que se unen lateralmente, inglés crista. Cresta Ecuatorial: en los granos lofados se extiende a lo largo del ecuador. Cresta interlagunar: en los Granos lofados separa lagunas entre si. Cresta paraporal: limita la abertura y se extiende en el sentido de los meridianos. Crestado-da, del latín Cristatus, adjetivo. Provisto de crestas, inglés cristate. Cribelado-da, del latín Cribellum, diminutivo de cribum, criba. Con abeturas redondedas delimitadas por áreas adelgazadas y regularmente empotradas en la exina, inglés cribellate. Cripto-, oculto. Criptopolar; criptocolpado. Crustado-da, adjetivo. Del latín Crusta, costra. Provisto de membranas aperturales reforzadas por gruesas excrecencias, inglés crustate. Cuello, del latín collum. m. La parte del pilo que sostiene la cabeza, inglés collum. Curvimurado-da, adjetivo. Con muros curvados, inglés curvimurate. Di- dos. Dicolpado; dicolporado. Díada. Dícese de los granos de polen unidos en grupos de dos, inglés díade. Diámetro ecuatorial (E). Línea imaginaria que pasa por el centro del polen. Eje mayor del grano en vista polar. Diámetro polar. Línea imaginaria que une los centros de los polos. Dicolpado, da. Dícese del grano con dos colpos. Dicolporado, da. Dícese del grano con dos cólporos. Diorado-da, adj. Con dos endoaperturas en forma de poro, inglés diorate. Distal, adjetivo. Se aplica al polo o a la cara del grano de polen y de la espora más alejada del interior de la tétrada. Polo distal, cara distal. Duplicolumelado-da, adjetivo. Columelado con el prefijo derivado del latín duplicare, duplicar. En los granos de polen reticulados cuando los muros están 287

soportados por dos filas

de

báculos

infratectales o

columelas,

inglés

duplicolumellate, duplibaculate. E. Abreviatura de Diámetro ecuatorial. Ecto-, ect-, prefijo, fuera, al exterior. Ectexina, f. Capa más externa de la exina, que se tiñe con fuchsina básica, inglés ectexine. Ectoabertura, f. Abertura de la ectexina. Ecuador, m. La línea que divide el grano de polen o la espora en dos caras, proximal y distal, inglés equator. Ecuatorial, adjetivo. Perteneciente o relativo al ecuador. Eje ecuatorial. Diámetro ecuatorial. Elemento escultural, m. Cualquier proyección de ectexina hacia afuera de la superficie del polen. Según su forma puede ser: báculo, pilo, clava, verruga, gránulo, espina y gema. Elipsoidal. Elíptico. En forma de elipse. Endo-, end-, dentro. Endexina, f. Capa interna de la exina. Generalmente lisa y homogénea, que no se tiñe con fuchsina básica y tiene una baja densidad electrónica en las preparaciones para el M. E. T. Sin, de nexina-2, inglés endexine. Endoabertura, f. Abertura de la endexina, inglés aperture. Endocíngulo, m. Endoabertura en forma de anillo continuo que rodea los granos de polen en el ecuador, inglés endocingulum. Endóspora, f. Espora que se forma en el interior de un esporangio. Endosporio, m. Capa más interna de la pared de una espora, de naturaleza celulósica, inglés endospore. Epíspora, f. Sinónimo de episporio. Episporio, m. Membrana externa de cualquier espora, inglés epispore. Exosporio. Epispore Epísporo. Sinónimo de episporio.

288

Equinado. Del latín echinatus, derivado de echinus, erizo. Dícese del grano con espinas. Equinolofado-da, adjetivo. Se aplica al grano de polen lofado con las crestas provistas de espinas, inglés echinolophate. Equinulado, da. Dícese del grano con espínulas. Escábrido, da. Áspero. Dícese de la superficie con protuberancias muy pequeñas, menores de 1 µm, inglés scabrate. Escabroso. Escábrido. Esclerina, f. Se aplica al conjunto de las capas de la esporodermis de las esporas excluida la intina, inglés sclerine. Escrobiculado-da, del latín scrobiculatos, derivado de scrobiculus, hoyito, adjetivo. Con los lúmenes muy pequeños, más o menos circulares, inglés scrobiculate. Escultura. Ornamentación en relieve en la superficie del grano. Esférico, a. Dícese del polen o espora con la relación P/E = 1 (ver P/E). Espina, f. Elemento escultural puntiagudo, de altura mayor de 3 µm, inglés spina. Espínulas. Espinas pequeñas, menores de 3µm de longitud. Espina. Dícese elementos esculturales en la superficie del grano, de forma puntiaguda, con longitud mayor a 3µm. Espínula, f. Diminutivo de espina. Espina cuya longitud es menor de 3 µm, inglés spinule. Espiraperturado-da, del latín spira, espiral y apertorado, adjetivo, inglés spiraperturate. Espora, semilla. Unidad reproductiva sexual o asexual de las plantas criptógamas. Inglés spore. Esporodermis, del griego semilla y piel, f. Cubierta que rodea y protege la espora y el grano de polen, inglés sporoderm. Esporomorfo-fa, adjetivo. Con forma de espora. Se aplica a los microfósiles asimilables por su forma al polen o a las esporas. Sinónimo de palinomorfo. sporomorph. 289

Esporopolenina. Sustancia química de la que está constituida la exina del polen o de las esporas en algunos musgos y pteridofitas, inglés sporopollenin. Estéfano-, prefijo. Corona. Se aplica a la posición de las aberturas en una corona o zona. Sinónimo de zono-, Stephano-. Estéfanoporado, estéfanocolpado, inglés stephanoporate, stephanocolpate. Estenopolínico-ca, de polínico con el prefijo estrecho, adjetivo. Se aplica a ciertos grupos taxonómicos caracterizados por presentar muy poca variación en los tipos polínicos o esporales, inglés stenopalynous. Estratificación. Dícese de la disposición de la exina en capas. Generalmente son dos capas llamadas nexina y sexina, cada una puede también presentar capas. Estrato, del latín stratus, manta, m. Subdivisión de la exina, se aplica al téctum, al infratéctum y a la base, inglés stratum. Estriado, a. Dícese del grano cuya ornamentación está constituida por estrías más o menos salientes, inglés striate. Estriado-reticulado. Dícese del grano cuya ornamentación está constituida por estrías y retículos. En la descripción del polen de la familia Lamiaceae es conveniente destacar la diferencia entre un retículo simple y un retículo complejo (birretículo sensu Harley 1992). Un retículo se define como un patrón tipo red, cuyas aristas (muri) encierran espacios de diferente tamaño y forma (lumina); en aquellos casos en que el lumen es menor a 1 μm se le denomina microrretículo (Punt et al. 2007). El retículo simple es una red única donde cada lumen puede ser perforado (en granos semitectados) o no (en granos tectados); en este último caso, la reticulación es supratectal. Cuando cada lumen presenta más de una perforación se forma un segundo retículo o retículo secundario, llamándose entonces retículo complejo o birretículo. Los muri del retículo principal son, en la mayoría de los casos, supratectales, por lo cual se observan de mayor altura que los muri del retículo secundario. Estructura, del latín structura f. Disposición interna de los elementos de la esporodermis, inglés structure.

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Euripolínico-ca, de polínico con el prefijo amplio, adjetivo. Se aplica a ciertos grupos taxonómicos caracterizados por presentar amplias variaciones de sus tipos polínicos o esporas, inglés europalynous. Exina. Capa externa del polen formada por otras dos capas llamadas nexina y sexina. La exina está compuesta de esporopolenina. Exospora, f. Espora exógena o formada en el exterior del esporangio. Exosporio, del latín exosporium, m. Membrana gruesa, resistente y cutinizada que envuelve la espora por fuera del endosporio y a menudo presenta grabaduras o relieves de forma diversa, inglés exospore. Fenestrado. Dícese del polen con muros muy altos y lúmenes muy amplios como ventanas o lagunas, inglés fenestrate. Fisura, del latín fissura, f. Hendidura que presentan durante la germinación algunos granos de polen inaperturados, por ejemplo en el género Cupressus, inglés fissura. Foramen, del latín foramen, agujero, m. Poro, inglés foramen. Foraminado-da, adjetivo. Se aplica al grano de polen provisto de aberturas circulares en disposición global. Sinónimo de pantoporado, inglés foraminate. Forma, f. Dada al grano de polen, basada en la relación entre el eje polar (P) y el diámetro ecuatorial (E), inglés shape classes. Fosaperturado, Fosiaperturado-da, del latin fossa, hoyo y aperturado, adjetivo. Dícese del polen con el contorno lobado y las aberturas situadas en los huecos que dejan entre sí dos lóbulos contiguos. Ver lobulado, inglés fossaperturate. Fosulado-da (del lat. fasso/o, dim. de fasso, hoyo), adj. Se aplica a los granos de polen carentes de relieve escultural, con la superficie provista de diminutas hendiduras alargadas e irregulares, inglés escrobiculado. Fovéola (del lat. foveola, diminutivo de fovea, hoyo, f. Concavidad de la superficie de los granos de polen sin relieve escultural, generalmente redonda, mayor de 1 µm de diámetro, inglés foveola. Foveolado, a. Superficie del grano con hoyos de más de 1 µm de diámetro. Se aplica al grano de polen con fovéolas cuya distancia entre si es mayor que su diámetro, inglés foveolate. 291

Gema, del latín gemma, yema, f. Elemento escultural de proyección radial isodiamétrica, alturamayor de 1 µm, anchura igual o mayor que la altura y con la parte basal consticta, inglés gemma. Gemado-da, adjetivo. Con gemas, inglés gemmate. Geminicolpado-da, del latín geminos, gemelo y colpado, adj. Con los colpos agrupados a pares, geminicolpate. Geniculado-da, del latin geniculatos, de genus, rodilla, adjetivo. Se aplica a la forma curvada que toman algunos colpos, por ejemplo en el género Quercus, inglés geniculate. Germen, del latín germen, m. Rudimento de un nuevo ser orgánico. Germinal, del latín germinalis, adjetivo. Relativo al germen. Por ejemplo abertura germinal, poro germinal, surco germinal, inglés germinal. Granulado. Dícese del polen con ornamentación en forma de granos. Gránulo de granulum, diminutivo de granum, grano), m. Elemento escultural menor de 1 µm, de contorno más o menos redondeado, inglés granulum. Halo, del latín halos, m. Halo o zona despejada alrededor de una apertura o de un elemento escultural, inglés halo. Hamuloso-sa, del latin hamulus, diminutivo de hamus, anzuelo, adjetivo. Se aplica a la espora con elementos esculturales parecidos a pequeños anzuelos, irregularmente colocados a modo de laberinto, inglés hamulate. Harmomegatia, f. Mecanismos específicos relativos a la posibilidad de acomodación del polen a los cambios de volumen, por ejemplo mediante los surcos germinales, inglés harmomegathy. Hetero-. Desigual. Heterocolpado-da, adjetivo. Dícese del grano de polen con colpos simples y compuestos, inglés heterocolpate. Heteropolar, adjetivo. Dícese del grano de polen o espora, cuyos polos distal y proximal son diferentes entre si, inglés heteropolar. Heterósporo-ra, adjetivo. Se aplica a la planta que tiene más de una clase de esporas, como los pteridófitos, que producen macrosporas y microsporas, inglés heterosporous. 292

Hexa-, seis. Por ejemplo hexacolpado, hexatremo. Hilo, del latín hilum, m. Abertura más o menos circular y muy reducida de las esporas de algunos briófitos y hongos, inglés hilum. Hilado-da, adj. Con hilo, inglés hilate. Homospóreo. Homósporo. Homósporo-ra, igual, parecido, adjetivo. Se aplica especialmente a los pteridófitos con una sola clase de esporas, inglés homosporous. Inaperturado-da, del latín

inaperturatus),

adjetivo. Sin

aberturas, inglés

inaperturate. Infra-, prefijo del latínn infra, debajo de. Infratéctum,de infra- y téctum, m. Estrato de la esporodermis situado debajo del téctum, que reposa sobre la base, generalmente compuesto por columelas, gránulos o alvéolos, inglés infratectum. Infratectal, adjetivo. Relativo al infratéctum. Infrategilar. Sinónimo de infratectal. Ínsula, f. Isla. Pequeñas áreas de sexina generalmente circulares o poligonales, separadas entre sí por hendiduras, inglés insula. Insulado-da, adjetivo. Con ínsulas. Intectado-da, sin téctum, inglés intectate. Inter-, prefijo del latín ínter, entre dos cosas. Intercolpo, m. Sinónimo de mesocolpo, inglés intercolpium. Intercolpio. Intercolpo. Interlagunar, adjetivo. Se aplica a las crestas o a los huecos que dejan entre sí las lagunas en los granos de polen lofados, inglés interlacunar ridges; interlacunar gaps. Interporal, adjetivo. Se aplica a las lagunas situadas entre dos ectoaperturas y adyacentes al área polar de los granos de polen lofados, laguna interporal, inglés interporal lacuna. Interporo, m. Mesoporo, inglés interporium. Interporio. Interporo. 293

Intina, dentro, f. Capa más interna de la esporodermis que rodea el citoplasma, usualmente poco resistente a la acetolisis por su naturaleza celulósica, inglés intine. Iso-. Igual. Isodiamétrico-ca, adjetivo. Se aplica a la tétrade cuyos miembros son de igual tamaño, inglés isodiametrie tetrad. Isopolar. Dícese del polen cuyos dos polos son iguales. Isóspora, f. Planta que produce una sola clase de esporas inglés isospore. Isospóreo, adjjetivo Isósporo. Isospórico-ca, isosporo. Isósporo, adjetivo. Homósporo, inglés isosporous. Labro, del latín labrum, margen, m. Engrosamiento de la lesura en esporas fósiles, inglés labrum. Laguna, del latín lacuna, f. Depresiones limitadas por crestas en los granos de polen lofados, inglés lacuna. Laguna ecuatorial: laguna situada en el ecuador de los granos de polen lofados. Lalongado, a. Dícese de un cólporo con endoabertura alargada ecuatorialmente, inglés lalongate. Latimurado-da, del latín latus, ancho, adjetivo. Con los muros anchos, inglés latimurate. Leptoma, fino, m. Area adelgazada de exina situada en el polo distal del grano de polen, que funciona como una apertura, por ejemplo en el género Pinus, inglés leptoma. LO, OL. L, del latín lux, luz y O, obscuritas, oscuro. Siglas que representan un modelo de análisis de la superficie del polen a niveles sucesivos de enfoque con el tornillo micrométrico del microscopio óptico de luz, de modo que con un enfoque alto aparezcan islas claras (L) separadas por canales oscuros (O) y con un enfoque bajo aparezcan islas oscuras (O) separadas a por canales claros (L), inglés LO, OL-pattern. -leso-sa, del latín laedere, herir. Sufijo que denota la presencia o ausencia de lesura, inglés –lete. 294

Lesura, del latín laesura-ae, daño, detrimento, f. Marca o rasgadura simple o tripartita de una espora cuyo centro está en el poío proximal, inglés laesura. -leto-ta. Sinónimo de –leso, inglés –lete. Liras, del latín lira, surco, f. Crestas estrechas que separan los surcos en las esporas o en los granos de polen estriados, muros, inglés lira. Lobado-da, adjetivo del latín lobatus). Se aplica al polen con el ámbito dividido en gajos o porciones redondeadas, inglés lobate. Lobulado. Lobado. Ámbito con aberturas localizadas en depresiones de tal manera que dividen el grano en lóbulos. Lofado-da, adjetivo. Cresta. Se aplica al grano de polen con crestas que rodean depresiones o lagunas, inglés lophate. Longicolpado-da, del latín Iongus, largo y colpado, adjetivo. Con colpos largos, inglés longicolpate. Lolongado-da, del latín longus y elangatus, adjetivo. Dícese del cólporo con endoaberturas alargadas en sentido de la longitud del colpo, por ejemplo en el género Rurnex, inglés lolongate. Loxocolpado, oblicuo, adjetivo. Dícese del polen zonocolpado, cuando los coIpos convergen a pares, inglés loxocolpate. Lumen, del latín lumen, amplitud de un orificio, m. Espacio entre los muros de un retículo en el polen reticulado. El lumen puede ser liso o con pilos, inglés lumen. Macrospora, grande, f. Se aplica principalmente a las esporas de gran tamaño de los pteridófitos heterósporos, originadas en macrosporangios, que al germinar producen macroprotalos, inglés macrospore. Malla. Retículo. Parte del retículo constituido de lúmen y dos muros que lo cercan. Margen, del latín margo, margen, m. Área diferenciada de la exina por el grosor o por la ornamentación, que rodea una apertura colpada. Parte que se encuentra alrededor de una abertura y es diferente al resto de la pared del grano, ya sea por color, engrosamiento u ornamentación, inglés margo. Másula, del latín massula, diminutivo de massa, masa, f. Masa constituida por numerosos granos de polen que componen una unidad, por ejemplo en las orquidáceas y en las mimosáceas, massula. 295

Megaspora, f. Macrospora, inglés megaspore. Melisopalinología, de melisso, abeja y palinología, f. Parte de la Palinología que trata del polen contenido en la miel de abejas así como del polen transportado por las abejas, melissopalynology. Melitopalinología,

de

melito,

miel

y

palmologia,

f.

Melisopalinologia,

melitopalynology. Membrana apertural. Dícese de la membrana que recubre las aberturas y que se rompe fácilmente, generalmente es parte de la nexina. Otras veces también está constituida de sexina. Muchas veces presenta ornamentación y en este caso no se rompe fácilmente. Meridional, adjetivo. Relativo a la superficie perpendicular al ecuador de un grano de polen o de una espora, inglés meridional. Mes-, meso-. Intermedio, mediano. Mesocolpio, Mesocolpo, m. Área delimitada por dos colpos adyacentes y por líneas imaginarias, perpendiculares, que unen los ápices de los colpos, inglés mesocolpium. Mesoporio. Mesoporo. Área delimita por dos poros adyacentes y por las líneas imaginarias tangentes, paralelas y comunes a los dos poros, inglés mesoporium. Micro-. Pequeño. Elementos esculturales cuya longitud es menor de 1 µm, ejemplos microverrugoso, microespinuloso. Micróspora, f. Se aplica principalmente a las esporas de pequeño tamaño de los pteridófitos heterósporos, se originan en microsporangios y forman microprótalos. La micróspora es homóloga al grano de polen uninucleado, inglés microspore. Mónada, mónade, del lat. monas-adis, unidad. f. Unidad orgánica formada por una sola estructura, inglés monad. Mono-,

único.

monosulcado,

Por

ejemplo

monotremo,

monoporado,

monoleso,

inglés

monocolpado, monoporate,

monosaccado, monocolpate,

monosaccate, monosulcate, monotreme, monolete. Monoaperturado. Grano con una sola abertura. Multibaculado-da, de baculado con el prefijo del latín multus, mucho, adjetivo. Con los muros sostenidos por más de dos filas de báculos, inglés multibaculate. 296

Muro, del latín murus, muro, m. Mallas de un retículo que son salientes y perpendiculares a la superficie del grano. Muro o cresta que separa dos lúmenes en los granos de polen reticulados, o dos estrías en los estriados, inglés murus. Nexina. Capa más interna de la exina, generalmente homogénea. Algunas veces se encuentra dividida en dos capas llamadas nexina1 la más externa y nexina2 la más interna. Nomotremo-ma, legítimo, adjetivo. Se aplica al grano de polen o a la espora con aberturas regulares, inglés nomotreme. N.P.C. Sigla que representa el sistema de clasificación morfológica de las aberturas en los granos de polen y esporas: N, representa el número. P, la posición. C, el carácter o forma de las aberturas, inglés N.P.C.-classification. Oblato-ta, del latín oblatus, adjetivo. Muy ancho. Dícese del polen y esporas radiosimétricos isopolares, cuando la relación eje polar/diámetro ecuatorial (P/E) está en el rango 0,50 – 0,75, inglés oblate. Ver P/E. Oblato-esferoidal. Dícese del polen con relación P/E = 0,88 – 1,00, inglés oblatespheroidal. Ver P/E. Oblongo. Grano con contorno en forma de rectángulo alargado y extremos redondeados. P/E = Ver P/E. Opérculo. Membrana apertural gruesa o saliente como una tapa que cierra un poro, inglés operculum. Operculado, con opérculo, inglés operculate. Ornamentación. Dícese de cualquier saliente morfológica de la pared del grano, inglés ornamentation. Ortocolpado-da, recto y colpado, adjetivo. Se aplica al polen zonocolpado cuyos colpos son rectos, alargados en el sentido de los meridianos, inglés orthocolpate. Ós. Término en desuso, reemplazado por Endoabertura. Parte interna de una abertura compuesta, generalmente localizada en el centro de la abertura. Puede ser circular, lalongado, lolongado o constricto en el centro. Ovado. Contorno en forma de elipse con un extremo más ancho que el otro parecido a un huevo. Ovoide. Con forma de huevo. 297

P. Abreviatura de eje polar. Paleopalinología, antiguo, f. Tratado del polen y de las esporas fósiles, inglés palaeopalinology. Palino-, esparcir, inglés palyno. Palinograma, palino-, palinología y grama-, escritura. Representación gráfica de un grano de polen o espora que muestra sus principales caracteres: polaridad, tamaño, forma, aperturas, estratificación y omamentación, inglés palynogram. Palinología, de palino-y logos. Tratado del polen y de las esporas, inglés palynology. Actuopalinología, palinología actual, se ocupa del polen y esporas actuales, inglés actuopalynology. Palinomorfo-fa, palino- y forma. Todas las formas similares al polen y a las esporas encontrados en las preparaciones palinológicas, inglés palynomorph. Palinoteca. Colección de preparaciones microscópicas de polen y de esporas.

Pantoaperturado. Dícese del grano cuyas aberturas se localizan por toda la superficie de la pared. Pantocolpado. Dícese del grano cuyos colpos se localizan por toda la superficie de la pared. Pantoporado. Dícese del grano cuyos poros se localizan por toda la superficie de la pared. Parasincolpado. Dícese del grano cuyos colpos o cólporos son bifurcados y sus ramificaciones se encuentran en la región polar dejando el apocolpio intacto. Patrón crotón. Ornamentación constituida por unidades prismáticas en número de 5 a 7, organizadas radialmente como los pétalos de una flor sobre una capa de la sexina. Se encuentra en los granos de polen de algunos géneros de Euphorbiaceae. P/E. Relación entre el diámetro polar y el diámetro ecuatorial que determina la forma del polen en vista ecuatorial. Perforado, a. Grano o superficie del grano con pequeños hoyos de menos de 1 µm de ancho. 298

Perisporio, del latín perisporium, m. Capa de la esporodermis no siempre resistente a la acetolisis, situada alrededor de la exina de muchas esporas, aplicado especialmente a los pteridófitos, inglés perisporium. Peroblato. Dícese del polen con relación P/E menor que 0,50. Ver P/E. Perprolato. Dícese del polen con relación P/E mayor que 2,00. Ver P/E. Pilo, del latín pilum, lanza, dardo. Saliente cilíndrica en la superficie de la sexina, inglés pilum. Pilado. Dícese del grano con pilos. Planoaperturado. Dícese del grano cuyas aberturas están localizadas en los lados del ámbito, inglés planaperturate. Plano ecuatorial: el plano perpendicular al eje polar en su punto medio. Polar, adjetivo. Relativo al polo. Área polar, la que rodea un polo. Vista polar, con el eje polar del grano de polen o de la espora en el centro de la la visión del observador. Eje polar (P), línea que une los polos proximal y distal. Laguna polar, situada en el polo de un grano de polen lofado. Polen, del latín pollen-inis, polvo muy fino, la flor de la harina, m. Células de forma y tamaño variables, dotadas de una cubierta muy resistente o esporodermis, que se forman dentro de los sacos polínicos del estambre y tienen como misión, una vez formado el microgametófito pluricelular,fecundar el óvulo, inglés pollen. Políada. Dícese de los granos de polen unidos en grupos de más de cuatro granos. Poliaperturado. Dícese del grano con más de seis aberturas. Policolpado. Dícese del grano con más de seis colpos. Policolporado. Dícese del grano con más de seis cólporos. Polínico-ca, adjetivo. Propio del polen o relativo al mismo: cemento polínico, material pegajoso producido por el tapete, que agrupa los granos de polen durante la dispersión, inglés pollen kitt. Tipo polínico, categoría morfológica que incluye táxones de rango diverso que se distinguen por un carácter aislado o por una combinación de caracteres, inglés pollen type. Polinio, del latín pollinium, m. Masa de granos de polen que comprende la totalidad de

los existentes en cada teca, por ejemplo

en orquídeas, 299

asclepiadáceas. En general está sostenido por un pedículo o caudícula y un ensanchamiento viscoso basilar o retináculo, inglés polliníum. Poliporado. Dícese del grano con más de seis poros. Polo. Dícese del área dirigida hacia el centro u opuesta al centro en los granos cuando están en estado de tétrada. En los granos zonoaperturados los polos son las áreas opuestas, desprovistas de aberturas. Polo distal. Dícese del área de los granos, aun en estado de tétrada, opuesta al centro de la tétrada. En estado de mónada no es posible distinguir el polo distal. Poloproximal. Dícese del área de los granos, aun en estado de tétrada, localizada en el centro de la tétrada. En estado de mónada no es posible distinguir el polo proximal. Porado. Dícese del grano cuyas aberturas son poros. Poro, del latín porus, vía o camino, m. Dícese de la abertura más o menos circular, en la cual la relación P/E es menor que 2:1. Ver P/E. Es el espacio por donde sale el tubo polínico al germinar el grano de polen. El poro es de contorno más o menos isodiamétrico, suele situarse en un surco germinal (poro germinal). En las esporas fúngicas, el poro es una aréola de membrana más delgada por donde sale el tubo germinativo. Pororado-da, de poro y orado, adjetivo. Con ectoaberturas y endoaberturas, ambas, en forma de poro, inglés pororate. Primexina, del latín primus, primero y exina, f. Capa de polisacáridos que rodea el grano de polen en desarrollo y que al parecer es precursora de la exina, inglés primexine. Probáculo, delante, anteriormente, m. Se aplica a los báculos o bastoncillos radiales de primexina, probaculum. Prolato. Dícese del polen con relación P/E = 1,33 – 2,00. Ver P/E. Prolato-esferoidal. Dícese del polen con relación P/E = 1, 00 – 1,14. Ver P/E. Proximal, del latín proximus, adjetivo. Se aplica al polo o a la cara del grano de polen y de la espora más próximos al interior de la tétrada. Polo proximal, cara proximal, inglés proximal. pseudo-, falso o falsa apariencia. 300

Pseudoabertura. Abertura con forma de colpo pero que no tiene la función de una verdadera abertura. Pseudocolpo. Abertura con forma de colpo pero que no tiene la función de un verdadero colpo. Psilado. Dícese del grano con sexina lisa o sea sin ornamentación. Radial, adjetivo. Referente al radio. Regularmente simétrtco con respecto a un centro. Radiosimétrico-ca, adjetivo. Se aplica al grano de polen y a la espora con más de dos planos verticales de simetría y en el caso de ser sólo dos los planos, siempre con los ejes ecuatoriales de igual longitud, inglés radially symmetric. Reticulado, a. Dícese del grano o espora con ornamentación en forma de mallas salientes. Se aplica a los granos de polen o esporas con la superficie provista de muros o crestas que bordean lúmenes de más de 1 µm de anchura, ordenados conforme a las mallas de una red, inglés reticulate. Reticulado. Grano o sexina cuya ornamentación forma un retículo de mallas más o menos salientes. Retículo. Dícese de la ornamentación que forma un retículo de mallas más o menos salientes. Ver malla. Retículo-estriado. Dícese del grano cuya ornamentación está constituida de un retículo con mallas dispuestas en filas. Rugulado-da, del Ialín rugulatus, derivado de rugula, diminutivo de ruga, arruga, adjetivo. Se aplica al polen o esporas con los elementos esculturales de más de 1 µm de longitud, distribuidos irregularmente por la superficie, por ejemplo en el género Ulmus. Intermedio entre estriado y reticulado, inglés rugulate. Semitectado. Grano con tectum parcialmente ausente. Sexina. Capa más externa de la exina. Sincolpado. Dícese del grano cuyos colpos o cólporos casi se unen en los polos. Sinuoso. Dícese del ámbito cuya región del mesocolpio es saliente. Subelíptico. Casi elíptico. Subesferoidal. Casi esferoidal. Subisopolar. Casi isopolar. 301

Suboblato. Dícese del polen con relación P/E = 0,75 – 0,88. Ver P/E. Subprolato. Dícese del polen con relación P/E = 1,14 – 1,33 Subtriangular. Casi triangular. Sulcado-da, del latín sulcatus, surcado, adjetivo Se aplica al grano de polen con sulcos, por ejemplo en las gimnospermas y monocotiledóneas, inglés sulcate. Sulco, del latin sulcus, surco, m. Ectoabertura latitudinal situada en el polo proximal (catasulcado) o en el polo distal (anasulcado) del grano de polen. Surco germinal: concavidad o surco que dará paso al tubo polínico inglés sulcus. Supratectal, del latin supra y tectal, adjetivo. Posición superior. Se aplica a la situación sobre el téctum de los elementos esculturales en los granos de polen tectados, inglés supratectal. Tectum. Capa más externa de la exina localizada sobre las columelas. Tegilado. Dícese del grano con tegilo. Tegilo. Sinónimo de téctum. Parte superior de la sexina o del muro (en un retículo), sostenida por columnas llamadas báculas infrategilares. Tetracolpado. Grano con cuatro colpos. Tetracolporado. Grano con cuatro cólporos. Tétrada. Dícese de los granos unidos en grupos de cuatro. -tremo-ma, orificio. Aberturado. Monotremo; ditremo; tetratremo; politremo, según el número de aberturas de un grano de polen o de una espora, inglés –treme. Triaperturado. Grano con tres aberturas. Tricotomocolpo. Dícese del colpo trifurcado en el cual las tres ramificaciones parten del mismo punto y son del mismo tamaño. Trilobulado. Trilobado. Dícese del grano con tres lóbulos. Turbera. La turba es un material orgánico, de color pardo oscuro y rico en carbono, se forma como resultado de la putrefacción y carbonificación parcial de la vegetación. Está formado por una masa esponjosa y ligera en la que aún se aprecian los componentes vegetales que la originaron. Se emplea como combustible y en la obtención de abonos orgánicos. Ulcerado-da, del latin ulcerate, ulcerado, adjetivo. Con una úlcera en la cara distal (anaulcerado) o en la proximal (cataulcerado), inglés ulcerate. 302

Úlcera, del latín ulcus, úlcera, f. Ectoapertura redondeada, inglés ulcus. Unditegilado-da, del latin unda, ola, y tegilado, adjetivo. Con el téctum provisto de ondulaciones debidas a diferencias de grosor del mismo, o a la longitud de las columelas que lo sostienen, inglés unditegillate. Velo, del latin velum, velo, cortina, m. Envoltura de algunos granos de polen vesiculados, inglés velum. Verrugoso. Dícese del grano con verrugas. Verruga del latín verruca, prominencia, excrecencia, f. Saliente en la superficie del grano, aislada, más ancha que larga o de forma más o menos irregular, de diámetro mayor de 1 µm, no puntiagudo y con la parte baja no constricta, por ejempl en el género Plantago, inglés verruca. Vista equatorial. Posición del grano en la que se observan los dos polos. Cuando las aberturas son alargadas (colpos, cólporos, surcos) algunas se observan longitudinalmente. Vista ecuatorial, con el plano ecuatorial del grano de polen o de la espora en el centro de la visión del observador. Vista polar. Posición en la que el grano está con un polo dirigido hacia el observador. Cuando las aberturas son alargadas (colpos, cólporos, surcos) se observan solamente los ápices en forma de V. Zona oral. Área de una abertura compuesta, donde se localiza la endoabertura. Zonoaperturado. Dícese del grano cuyas aberturas se localizan en la superficie del ecuador. Zonoporado. Dícese del grano cuyos poros se localizan en la superficie del ecuador. Zonorado. Grano con cólporos en los cuales la endoabertura (ós) es muy ancha formando con los otros cólporos una zona oral continua en el ecuador del grano.

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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES INSTITUTO DE BIOLOGÍA

INTRODUCCIÓN A LA PALINOLOGÍA TEORÍA Y PRÁCTICA SEGUNDA PARTE – MÉTODOS DE ESTUDIOS PALINOLÓGICOS

Ramiro Fonnegra G.

Medellín – Colombia 2015

304

TABLA DE CONTENIDO Muestras para análisis Equipos Material fungible Químicos para análisis (puros) y reactivos preparados Preparación de reactivos y medios de montaje Prácticas de campo y laboratorio para montaje y estudio de palinomorfos Recolección del material vegetal polinífero Mediciones de palinomorfos Análisis al natural del material polinífero Acetólisis de Erdtman Acetólisis de Erdtman para muestras con poco material polinífero (micrométodo de acetólisis en portaobjetos) Acetólisis de Erdtman para muestras con poco material polinífero (micrométodo de acetólisis en tubos de centrífuga) Acetólisis modificada para granos de polen con pared delgada Diafanización de los granos de polen Acetólisis láctica (aclac) (método de raynal & raynal) Método de wodehouse Análisis de esporas de hongos Análisis de esporas de pteridofitos: método de potasa: KOH Análisis de fitolitos de plantas actuales Extracción de fitolitos del suelo Análisis de granos de almidón Análisis de polen fósil (método clásico) Análisis de polen fósil (método para muestras de turba o sedimentos con poco material mineral) Análisis de polen fósil (método para muestras de turba o sedimentos con bastante material mineral) 305

Análisis de sedimentos marinos (primera técnica) Preparación de muestras foraminíferos Análisis de sedimentos marinos (segunda técnica) Análisis de lluvia polínica Análisis de sedimentación polínica para estudios de aeropalinología Análisis palinológico de la miel de abejas Análisis de viabilidad de los granos de polen Microscopía electrónica de transmisión Microscopía electrónica de barrido Microscopia de luz de alta resolución

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TÉCNICAS DE CAMPO Y DE LABORATORIO PARA OBTENER MICROPREPARADOS DE PALINOMORFOS A. MUESTRAS PARA ANÁLISIS Cuerpos fructíferos de hongos Esporangios de pteridofitos Material polinífero de gimnospermas y angiospermas Muestras de miel de abejas Muestras de sedimentos actuales y fósiles Muestras para biolitos Polen conservado en glicerina

B. EQUIPOS Aparato de ultrasonido (opcional). Para fragmentar y limpiar palinomorfos. Baño de María. Algunos reactivos necesitan esta técnica para acelerar las reacciones. Campana (cámara de extracción de gases). Para manipular reactivos químicos cuyo manejo debe realizarse en campana de extracción de gases, pues los vapores liberados son altamente corrosivos y tóxicos. Captador de Durham. Muestreo de aeropartículas. Captador de Hirst. Muestreo de aeropartículas. Centrífuga. Separación de material particulado. Cernidores (cribas o cedazos). Para separación de material particulado. Debe tener mallas de 100 a 200 μm de diámetro, según el tamaño del palinomorfo (observado previamente). Cobertor iónico (opcional). Cubrir con oro-paladio u otro, el material a observar en microscopía electrónica de rastreo. 307

Computadores. Con programas de computación para bases de datos, para el control de micropreparados palinológicos, descripciones morfológicas, etc. Cuchillas de vidrio o diamante. Para hacer cortes en micrótomo para preparados a ser observados en microscopía electrónica. Estereomicroscopio. Para observación de las flores, esporangios u otro material cuando se trituran para liberar los granos de polen, esporas y otros palinomorfos. Estufa o fogón eléctrico o a gas Mechero de alcohol. Flamear compuestos. Micrométrico ocular (opcional). Microscopio compuesto (microscopio óptico de luz). Para observar la morfología básica de los palinomorfos, bajo cualquier técnica de preparación del material, se requieren altos aumentos, por lo cual este equipo debe ser de buena resolución, provisto con oculares mínimo de 10x (10 aumentos) y objetivos de 10X, 40X y 100X (objetivo de inmersión). El aumento de los objetivos depende del tamaño de los palinomorfos: 10x y 20x para palinomorfos grandes y gigantes, 40x para palinomorfos de tamaño mediano y 100x (inmersión) para palinomorfos muy pequeños. Para la estratificación y escultura de la pared, generalmente se requiere objetivo de inmersión o microscopía de contraste de fases. Microscopio compuesto (microscopio óptico de luz) con cámara digital. Para observación y fotomicrografías de palinomorfos. Microscopios electrónicos (opcionales). De transmisión o de barrido (rastreo), no son indispensables, pero son necesarios cuando se requieren estudios de ultraestructura y para definir morfología de difícil observación bajo la microscopía de luz. Palinoteca. Para almacenar los micropreparados. Placa de calentamiento (placa de Malassez). Hacer montajes de palinomorfos. Tambor ocular micrométrico o una laminilla ocular micrométrica. Para hacer las mediciones en micrómetros (µm) de los palinomorfos o de sus paredes, ornamentaciones, etc. Para hacer estas mediciones se requiere, además, una Placa milimetrada que tiene una retícula milimetrada, para calibrar los microscopios con los cuales se harán las mediciones. 308

Ultramicrótomo

(opcional).

Para

hacer

cortes

micrométricos

para

ser

observados en microscopía electrónica o de alta resolución.

C. MATERIALE FUNGIBLE Agitadores de plástico. Puntiagudos, de 2,5 mm de diámetro y 15 cm de longitud. Para triturar el material que contiene los palinomorfos y para agitar con el fin de homogenizar las preparaciones y reactivos. Se usa con reactivos que pueden diluir el vidrio, por ejemplo el ácido fluorhídrico (HF). Agitadores de vidrio. Puntiagudos, de 2,5 mm de diámetro y 15 cm de longitud. Para triturar el material que contiene los palinomorfos y para agitar con el fin de homogenizar las preparaciones y reactivos. Agujas de disección (estiletes o lancetas). Son instrumentos de madera o metal, con un mango largo que termina en una aguja puntiaguda. Se utiliza para triturar las anteras y esporangios. Se pueden fabricar con bolígrafos inservibles o con mangos de madera (por ejemplo los utilizados para pinchos o chusos asados), los cuales se recortan y les inserta una aguja de coser. Algodón. Para limpieza con líquidos. Beakers de vidrio y de plástico de 20, 50, 100, 500 y 1000 ml. Medir líquidos, preparar soluciones, entre otros usos propios de cada técnica de preparación de las muestras. Bisturí o cuchillas (hojas) de afeitar. Hacer cortes o limpiar exceso de parafina. Bolsas plásticas, bolsitas o sobres pequeños de papel. Para colecciones de muestras en el campo, herbarios y diferentes laboratorios donde se almacenen especímenes biológicos para sus estudios. Brochas. Limpieza de depósitos y material polinífero, etc. Cajas (platos) de Petri grandes y pequeñas. Portar o manipular muestras y medios de cultivo. Cinta transparente adhesiva de doble faz. Unir superficies. Cinta de enmascarar. Rotular material de vidrio o plástico. Unir superficies. Copos de algodón. Limpieza de materiales y equipos. 309

Cucharas de odontología. Permiten transferir secciones de gelatina glicerinada, más fácilmente que con el uso de estiletes. Cuchillas (hojas) de afeitar. Hacer cortes en materiales que contienen palinomorfos. Limpiar exceso de parafina en montaje de micropreparados. Existen algunas de un solo filo, de venta en tiendas especializadas para reactivos y equipos científicos. Cuando se manipula cualquier clase de cuchilla de afeitar se debe tener cuidado para que no ocurran accidentes, principalmente heridas en los dedos de la mano. Cuchillas de vidrio o diamante (opcionales). Para cortes en ultramicrótomo. Estiletes (agujas de disección, lancetas). Diferentes usos en campo y laboratorio. Estilete (agujas de disección, lancetas) doblado en L. Para el sellado con parafina. Frasco con gotero (cuenta gotas). Frascos con un gotero asegurado con tapa rosca, son útiles para reactivos químicos o preparados que se utilizan en gotas. Frascos de vidrio o de plástico de 1000 ml de capacidad y al menos 8 cm de diámetro. Muestreo de palinomorfos, lluvias polínicas y mediciones de sustancias líquidas. Frascos de vidrio o de plástico, de diferentes tamaños, capacidad volumétrica, de tapa hermética. Muestreo de palinomorfos y mediciones de sustancias líquidas. Para almacenaje de químicos y material fijado en reactivos líquidos. Gasa. Sellar envases con líquidos o palinomorfos. Limpieza de equipos. Goteros o pipetas Pasteur. Uso de líquidos por gotas. Guantes de látex libres de talco. Protección de las manos. Lápiz de grafito negro, de 2 mm de diámetro. Para tomar apuntes y hacer Rótulos autoadherentes que estarán en contacto con agua u otras sustancias o reactivos químicos. El uso de bolígrafos no se recomienda porque la tinta tiende a borrarse en contacto con agua o sustancias líquidas. Marcadores de tinta indeleble. Para marcaciones varias. 310

Morteros y pistilos de maceración. Triturar químicos sólidos o material con palinomorfos. Palillos mondadientes. Ultra-observación de estructuras. Varios usos en técnicas de laboratorio. Papel absorbente. Es necesario para absorber el exceso de líquidos o colorantes. Por ejemplo papel higiénico, toallas de papel o pañuelitos faciales. Papel blanco o parafinado. Varios usos. Papel aluminio. Tapar envases con químicos o material en procesos. Papel de filtro o gaza. Retirar excesos de químicos sólidos cuando se hacen soluciones para reactivos. Papel higiénico o toallas de papel. Limpieza y utilizar como papel absorbente. Papel para limpiar lentes. Papel no abrasivo para limpiar lentes de microscopio, es un papel suave utilizado para retirar partículas de polvo, etc. y líquidos, como el aceite de inmersión, que se depositen en las lentes. Se consigue en tiendas de artículos científicos y en ópticas. Papel parafinado. Varios usos en laboratorio. Película transparente autoadherente (usada para envolver para alimentos). Tapar envases con químicos o material en procesos. Pincel de pelo de camello. Para manipular los diferentes palinomorfos libres o en partículas. Pinzas de punta fina (pinzas de relojero o joyero). Para retirar los estambres o los esporangios. Igualmente para limpiar o sostener estos materiales para liberar las esporas, granos de polen y otros palinomorfos. Pipetas de 1 y 10 ml. Para medir químicos, agua u otras soluciones. Pipetas Pasteur. Para medir químicos, agua u otras soluciones usadas en bajas cantidades o en gotas. Placas milimitradas. Para calibrar los microscopios. Plastilina de moldear. Para montaje de granos de polen y otros palinomorfos altos. Portaobjetos (placas) de 76 x 26 mm (3 x 1 inch) y cubreobjetos (laminillas) de 22 x 22 mm. Para montaje de los palinomorfos (micropreparados). Deben ser 311

lo suficientemente delgados que no distorsionen el haz de luz cuando los atraviesa al momento de observar las muestras. Portaobjetos cóncavos (placas), de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch). Varios usos en el laboratorio. Probetas de 15 ml. Para medir químicos, agua u otras soluciones. Rótulos autoadherentes. Varios usos en campo y laboratorio. Sobres o bolsitas pequeñas de papel. Varios usos en trabajos de campo y laboratorio. Tubos de centrífuga, cónicos, graduados de 15 ml (de vidrio y de plástico). Para medir químicos, agua u otras soluciones. Tubos de laboratorio o frascos. Para almacenar líquidos y muestras. Varillas de plástico y de vidrio de 2,5 mm de diámetro. Para hacer los agitadores. La varilla de plástico se puede reemplazar por pedazos de gancho plásticos redondos, usados para colgar la ropa. Vidrios de reloj o cajas de Petri pequeñas. Varios usos en el laboratorio.

D.

QUÍMICOS PARA ANÁLISIS (PUROS) Y REACTIVOS

PREPARADOS Son varios los reactivos químicos utilizadas para obtener muestras o micropreparados de palinomorfos. En las metodologías para el estudio de los palinomorfos es necesario tener un conocimiento básico sobre el manejo de los químicos y reactivos preparados, para obtener resultados satisfactorios y evitar posibles accidentes. Las sustancias químicas se deben manejar con mucho cuidado, pero sin tener pánico a su manipulación. Muchas de estas sustancias son tóxicas y/o corrosivas y se utilizan puras o en altas concentraciones por lo cual es necesario tener mucho cuidado para su manejo y evitar su contacto con la piel o la ropa o con los microscopios y otros equipos de laboratorio. Si algún reactivo se pone en contacto con la piel o con la ropa, debe lavarse inmediatamente con abundante agua y jabón aproximadamente durante 15 312

minutos. Los reactivos deben ser guardados o preparados en frascos o elementos completamente limpios y secos, pues pueden reaccionar con residuos de otras sustancias y causar accidentes y reducir o anular su eficacia. Algunos de estos reactivos son: Aceite de inmersión. Para observar palinomorfos muy pequeños, ornamentación y estratigrafía de la pared se requieren aumentos altos, dados por el objetivo de 100x. Con este objetivo es necesario el uso de aceite de inmersión para igualar la refracción y hacer observaciones correctas. Acetato de uranilo. Acetato férrico. Acetocarmín. Acetona. Ácido acético glacial. Para preparar otros reactivos y para fijar muestras con materiales para estudio. Ácido bórico. Ácido clorhídrico (HCL) 10%, 50%. Ácido clorhídrico (HCL) para análisis. Ácido fluorhídrico 40%. Ácido fluorhídrico puro (HF). Ácido láctico. Ácido sulfúrico (H2SO4) puro. Agar 1%. Agua destilada. Varios usos. Alcohol ácido. Se usa antes del montaje de los palinomorfos para limpiar los portaobjetos y cubreobjetos, con el fin de retirar la grasa con la cual vienen de fábrica. Alcohol etílico absoluto (etanol) 95 %. Varios usos. Alcohol etílico comercial 70 a 95%. Varios usos. Amortiguador fosfato 0.1M, pH 7.1. Anhídrido acético puro. Varios usos. Azul de Cresyl. 313

Azul de metileno. Bálsamo del Canadá u otro medio de montaje de micropreparados. Para el montaje y sellado de micropreparados permanentes. Buffer fosfato 0,1M, pH 7,1. Citrato de plomo. Colodión o formvar. Para el montaje y sellado de micropreparados permanentes. Colorante azul de algodón o anilina azul. Colorante carmín en polvo. Colorantes varios. Cristales de fenol. Esmalte (brillo) incoloro para uñas. Sellar algunos micropreparados. Cubrir rótulos para protejerlos contra daño por insectos u otros. Etanol absoluto puro (ver alcohol etílico). Varios usos. Éter. Varios usos. Fenol. Fucsina básica. Gelatina glicerinada coloreada. Gelatina glicerinada. Glicerina 50%. Glicerina bidestilada. Glutaraldehido 2,5%. Goma arábiga. Para el montaje y sellado de micropreparados permanentes. Hexametafosfato de sodio 5%. Hidrato de cloral. Para colorear esporas de hongos. Se utiliza como colorante de granos de polen cuando se requiere mejorar la observación de las aberturas. Debe tenerse en cuanta que esta metodología altera las dimensiones naturales del grano y por lo tanto no debe ser empleada si se requiere conocer su tamaño. Hidróxido de amonio - (NH4OH). Hidróxido de potasio (KOH) 10%. Hidróxido de potasio (KOH). Hidróxido férrico - Fe (OH). 314

Hipoclorito de sodio comercial 5,25% (Clorox o lejía). Usado cuando se requiere aclarar las esporas, polen y otros palinomorfos. Jabón no enzimático. Lactosa o sucrosa 10%. Lugol. Nafta (kerosene o varsol). Nitrato de calcio. Parafina 57-59 ºC (o sellador seleccionado para el montaje de las placas). Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada). Reactivos para acetólisis de Erdtman. Reactivos para coloración de esporas. Resina plástica. Safranina, Solución acuosa de glicerina 50%. Soda cáustica. Solución acuosa de glicerina al 50%. La glicerina vuelve translúcido el palinomorfo facilitando el paso de la luz y consecuentemente la mejor observación de los detalles de la pared. Solución acuosa diluida de fucsina básica. Solución acuosa saturada de clorato de sodio. Solución de acetólisis. Usada para eliminar los componentes del citoplasma del grano de polen, lo cual hace que la exina quede más brillante y permite observarla con detalles e incrementar el contraste bajo el microscopio de luz. Tetraóxido de osmio. Vaselina. Vaselina o gelatina glicerinada coloreada. Verde de metilo. Verde yodo. Violeta de genciana. Xilol puro. Se utiliza para limpiar el exceso de parafina en los micropreparados. Antiguamente se utilizaba para limpiar las lentes de aceite de inmersión y las suciedades depositadas en todas las lentes de los objetivos y condensadores de 315

los microscopios. Actualmente no se recomienda su uso para limpiar las lentes de los objetivos ya que es un disolvente fuerte que puede retirar la pega de las lentes y oxida el metal de los objetivos.

316

PRÁCTICAS DE CAMPO Y LABORATORIO PARA MONTAJE Y ESTUDIO DE PALINOMORFOS No es posible la identificación de esporas, granos de polen y demás palinomorfos sin que se disponga de colecciones de placas con micropreparados de especies conocidas, debidamente identificadas y catalogadas por medio de dibujos, fotomicrografías y descripciones. Referente a las esporas y granos de polen, a partir de 1900 comenzó a aumentar el número de investigadores sobre morfología polínica, se establecen extensos sistemas de terminología y técnicas de estudio para el análisis del polen y esporas. Los catálogos ya realizados para las plantas de Europa y del Hemisferio Norte, y que continuamente están siendo aumentados con nuevos datos, no pueden ser usados en nuestro medio, ya que la flora es muy diferente. Con este texto se pretende conocer las técnicas para obtención de datos en morfología y taxonomía polínica de nuestra flora con el objetivo de elaborar catálogos que serán de gran utilidad para futuros estudios palinológicos, por

ejemplo:

paleopalinología,

melisopalinología,

aeropalinología,

palinotaxonomía, entre otros. Para el estudio de otros palinomorfos, solamente se están estableciendo los protocolos de tomas de muestra, montaje de los micropreparados y terminología para sus descripciones, temas que también serán tenidos en cuenta en este trabajo.

317

RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL POLINÍFERO Materiales y equipos Computador Bolsas plásticas, bolsitas o sobres pequeños de papel Ejemplares de herbario Frascos pequeños de vidrio o de plástico, de tapa hermética Herbario Horno para secado de ejemplares de herbario Lápices o portaminas de grafito de 2 mm de diámetro Material polinífero de gimnospermas y angiospermas Palinoteca Papel periódico Tijeras podadoras Ácido acético glacial o alcohol etílico comercial

Existen dos métodos de adquirir material polinífero (botones florales, flores o estructuras fértiles de otros vegetales):

1. En fresco. Realizado directamente de las plantas en el campo, huertas o jardines. Al colectar el material polinífero, también se deben colectar ejemplares de la planta para su posterior identificación y herborización.

2. En seco. Toma de polen de exsicados, los cuales son ejemplares vegetales depositados en un herbario. En ambos métodos el material polinífero se colecciona en sobres o bolsitas pequeñas de papel (Figura 2.1.) con su correspondiente identificación con todos los datos de recolección (colector, número de colección, localidad, fecha, entre 318

otros) o número de exsicado (ejemplar de herbario) para la determinación correcta del especímen. Para evitar el desarrollo de microorganismos (bacterias y hongos), el material polinífero debe ser fijado lo más pronto posible en ácido acético glacial, o en último caso, aunque no es recomendable, en alcohol etílico comercial. No se debe utilizar FAA ni otro fijador para tejidos biológicos pues estos, al igual que el secado con calor artificial, producen artificios que dificultan la observación del polen (Figura 2.2.).

Figura 2.1. Bolsita de papel (comercial)

Figura 2.2. Artificios en el citoplasma originados por el secado o la fijación del material polinífero.

319

OBSERVACIONES 1.

La fijación en alcohol o en ácido acético glacial y la conservación del material polinífero, se hacen en frascos pequeños de vidrio o de plástico, herméticamente cerrados. En estos recipientes el material puede ser guardado hasta el momento de utilizarlo o indefinidamente.

2.

Cuando se planeen trabajos de campo con más de un día de duración, los ejemplares de herbario deben ser fijados con alcohol etílico comercial, siguiendo la metodología empleada en estudios de taxonomía y sistemática vegetal.

3.

Tanto en la etapa de colección como en las de preparación del material polinífero, se debe tener mucha precaución para evitar contaminación de una especie o muestra con otra.

4.

En los dos métodos se recomienda utilizar botones florales cercanos a la antesis, o sea la apertura natural de la flor, para garantizar una madurez adecuada del polen y evitar contaminación con granos de polen de otras especies, llevados a las flores abiertas por insectos, viento u otro agente polinizador. Debido a esta posible contaminación con granos de polen de otras especies, no es aconsejable utilizar flores abiertas

CONTROL DE ALMACENAMIENTO DE MICROPREPARADOS PALINOLÓGICOS (ACETOLISADOS O NO) PARA LAS BASES DE DATOS En un formato o programa de computación para la base de datos correspondiente, se escriben los siguientes caracteres para el control de micropreparados palinológicos, los cuales pueden ser necesarios en prácticas o estudios posteriores: 1.

Identificación de la preparación: Que incluya el nombre científico y familia de la especie vegetal en estudio; nombre y número secuencial del colector del ejemplar del cual se tomó la muestra; o indicar el trabajo al que corresponde la muestra (estudios de estratificación, arqueología, melisopalinología, 320

aerobiología, entre otros) con toda la información necesaria para su correcta identificación. 2.

Número secuencial de la preparación de los palinomorfos en el laboratorio.

3.

Nombre del investigador.

4.

Fecha de preparación de la muestra.

5.

Número de la placa (si va a ser guardada en la palinoteca).

321

MEDICIONES DE PALINOMORFOS Materiales y equipos Microscopio compuesto (o un microscopio con analizador de imágenes) Oculares micrométricos de tambor o programas digitales (software) para mediciones Placas milimetradas Portaobjetos (placas) con micropreparados a medir

El tamaño de los granos de polen y esporas, el de las aberturas y la espesura de la pared esporopolínica, son parámetros utilizados para caracterizar un determinado taxón, pero es muy importante escoger y estandarizar el método de preparación del material polínico, ya que algunas veces, dependiendo del método aplicado y de la especie en particular, pueden ocurrir alteraciones en el tamaño.

Las mediciones, se realizan bajo el microscopio compuesto (microscopio óptico de luz) o el analizador de imágenes (microscopio óptico de luz adaptado a equipos y programas digitales) y se utilizan los oculares micrométricos de tambor (Figura 2.3) y las placas milimetradas (Figura 2.4 A). Los oculares micrométricos de tambor pueden ser reemplazados por oculares micrométricos de vidrio, pero estos últimos no son aconsejables por su marcada imprecisión, por lo cual están siendo descontinuados. También existen programas digitales (software), algunos de los cuales se pueden bajar gratuitamente de internet, cada uno con su metodología y con las ventajas y desventajas propias.

Ocular micrométrico de tambor (Figura 2.3). El tambor se coloca en el portaoculares del microscopio. Dependiendo de la casa productora, el ocular micrométrico tiene una escala óptica interna dividida en 8 ó 10 intervalos. Cada intervalo dividido en otros 100 intervalos (indicados en el tambor externo). Una 322

rotación completa del tambor es igual un intervalo de la escala interna. Al girar el tambor se desplaza el cursor, el cual tiene forma de una línea simple o una línea doble en uno de sus extremos, o una X grande. El cursor sirve para delimitar el objeto que va a ser medido.

Figura 2.3. Ocular micrométrico de tambor.

Placa milimetrada. Esta placa (Figura 2.4 A) es un portaobjetos de vidrio. En el interior tiene una escala de 1 mm dividida en 10 intervalos, cubierta y sellada con una laminilla generalmente esférica (Figura 2.4 A y B). Cada intervalo mide 0,01 mm = 10 µm (10 micrómetros). Generalmente la escala tiene 10 intervalos indicados cada uno por una línea grande, cada uno correspondiente a 100 µm. Cada uno de estos intervalos grandes, a su vez, están divididos en dos subintervalos, por una línea pequeña, cada subintervalo corresponde a 50 µm y finalmente cada uno de estos subintervalos está dividido en cinco intervalos más pequeños, indicados por línes pequeñitas, por lo cual cada uno corresponde a 10 µm (Figura 2.4 B).

323

A

B

Figura 2.4. A. Placa milimetrada, B: Mitad de la escala de la Placa milimetrada.

OBSERVACIONES

1.

Cuando se pretende comparar varias especies o especímenes con base en el tamaño del polen, esporas o palinomorfos, para las mediciones es recomendable la utilización de un solo microscopio y un solo ocular micrométrico de tambor o usar el mismo programa digital.

2.

Al referirse al término “µ” como unidad de medida, debe ser indicado como “µm” (micrómetro o micrómetros). Expresarlo como “micra o micras” es incorrecto, o mejor, es generalizado para µm (micrómetro), µl (microlitro), µg (microgramo).

METODOLOGÍA A. Calibrar el microscopio. Consiste en calcular el valor en micrómetros (µm) del intervalo del ocular micrométrico con cada objetivo. Para calibrar el microscopio al equipo o al programa digital de medición, se requiere de una placa milimetrada (Figura 2.8). Si son usados diferentes microscopios o diferentes oculares micrométricos, cada

microscopio

debe

ser calibrado

para

cada

ocular

micrométrico de la siguiente manera:

324

1. Introducir el ocular micrométrico de tambor en uno de los portaoculares del microscopio. 2. Con la ayuda del anillo de corrección de dioptría del ocular micrométrico, enfocar la escala interna del ocular. 3. Poner la placa milimetrada en la platina del microscopio, enfocar la escala y hacerla coincidir con la escala del ocular micrométrico. 4. Girar el tambor del ocular micrométrico hasta llevarlo a cero. 5. Mover el carro del microscopio y hacer coincidir una línea de la escala de la placa milimetrada con el cursor del ocular micrométrico. 6. Recorrer un número arbitrario de intervalos de la placa milimetrada (se recomiendan 50 µm). Anotar este valor y ajustar nuevamente el ocular a cero. Al realizar este paso se debe tener en cuenta que si comienza el recorrido en el lado externo de una línea se debe finalizarlo en el lado interno y viceversa (Figura 2.9).

Figura 2.5. Recorrido del cursor para calibrar el microscopio.

Mover el carro del microscopio para hacer coincidir otra línea y girando el tambor recorrer el mismo número arbitrario de intervalos. Anotar este nuevo valor y ajustar el ocular a cero. 7. Repetir varias veces los pasos 5 y 6 para obtener varias medidas. Se recomiendan 10 medidas como mínimo. Pero para análisis estadístico de medidas de objetos microscópicos, para que la muestra sea representativa, se recomienda tomar 30 medidas tanto para calibrar el microscopio como para medir las estructuras. 325

8. Calcular la medida aritmética (ẋ) de los valores tomados. 9. Hallar el valor en micrómetros (µm) del intervalo del ocular micrométrico utilizando la siguiente fórmula: VI = IR ÷ IO. Donde: VI = Valor del Intervalo. IR = Intervalos Recorridos en la Placa milimetrada.

÷ = Símbolo de división IO = Intervalos indicados por el Ocular micrométrico. 10. Anotar este valor (se debe calcular para cada objetivo de cada microscopio y con los diferentes oculares micrométricos que se pretenda utilizar).

Las mediciones utilizando un programa digital (software) se pueden realizar (entre otros) con: • Paint, editor de imágenes incluido en Windows. • Programas libres de pago (se pueden bajar gratuitamente de Internet) tales como: IrfanView, Micro-Manager. • Programas con pago, entre otros: Image-Analyser, Image Measurement, PhotoShop. Al igual que con el uso del tambor micrométrico, con los programas digitales (software) se debe calibrar el microscopio utilizando una Placa milimetrada.

B. Medición de un objeto. Realizar las siguientes etapas: 1. Con la ayuda del anillo de corrección de dioptría del ocular micrométrico, enfocar la escala interna del ocular. 2. Colocar y enfocar el micropreparado. 3. Girar el tambor del ocular micrométrico para colocarlo en cero. 4. Mover el carro del microscopio y hacer coincidir el objeto con el cursor del ocular micrométrico y girando el tambor recorrer la estructura. Anotar este valor. Se deben hacer varias mediciones y sacar la media aritmética. 5. Hallar el valor real del objeto en micrómetros (µm) así: 326

VR = VT x VI, donde VR = Valor Real. VT = Valor Tomado con ayuda del ocular micrométrico. VI = Valor Intervalo del ocular micrométrico, según el objetivo y el microscopio usado. Ejemplo: si el VI con objetivo de 100x es de 0,06 µm y para un determinado objeto medido con dicho objetivo se obtienen 709 intervalos. El Valor Real será: VR = 0,06 x 709 = 42,54 µm

MEDICIONES EN GRANOS DE POLEN, ESPORAS Y DEMÁS PALINOMORFOS El método de acetólisis de Erdtman (1969) causa una elasticidad plástica en la pared del polen, el cual con el paso del tiempo tiende a variar progresivamente de tamaño, y es necesario estandarizar el intervalo de tiempo para medir el polen. Después de la acetólisis, la preparación debe ser dejada en reposo un mínimo de 12 horas antes de iniciar las mediciones, esto debido a la alteración plástica que sufre la pared con el tratamiento. Igualmente se recomienda tomar las medidas en el transcurso de un plazo máximo de una semana después de la acetólisis, para tener uniformidad en la toma de medidas haciéndolas comparables con otros resultados, después de una semana de haber hecho la acetólisis las mediciones se consideran incorrectas para fines de comparación.

Para las medidas de los caracteres morfológicos se toman al azar 30 granos distribuidos por lo menos en tres placas, para lograr uniformidad de la muestra. En los casos de espesor de la exina y de la margen de las aberturas, donde las mediciones son muy difíciles de tomar, aún con objetivo de inmersión, se toman 10 medidas en cada caso estudiado. 327

Después del montaje en los portaobjetos, para las mediciones de los granos de polen, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 10X, 20X, 40X o 100X (u otro objetivo de inmersión), según el tamaño del grano o de la parte de la pared que se desee medir y se procede a la búsqueda de los granos de polen que estén en una posición más o menos exacta en vista ecuatorial o en vista polar. Para esto, en cada portaobjetos se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. Las medidas se hacen en los granos de polen encontrados en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con las mediciones de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita medir varias veces un mismo grano.

Conforme muestran las Figuras 2.6 A y 2.6 E, donde están representados en vista ecuatorial un polen 3-colporado y un polen 4-colpado, las mediciones de los diámetros polar y ecuatorial se hacen cuando los granos de polen presentan una de las aberturas en posición central y dos aberturas en la posición lateral, ya sea que los granos queden en posición vertical, horizontal u oblicua. En algunos casos, los granos de polen 4-aperturados y 5-aperturados tienen posición preferencial de caída en el portaobjetos con el micropreparado y en este caso, las mediciones de los diámetros polar y ecuatorial se pueden hacer cuando los granos de polen presentan dos aberturas hacia arriba y otras dos hacia abajo o según la posición de caída en cualquier plano. En vista ecuatorial también se hacen las mediciones de longitud, ancho y margen de las aberturas (Figuras 2.6 B y 2.6 E).

En vista polar (Figuras 2.6 C, 2.6 G y 2.6 H), se hacen las mediciones del diámetro ecuatorial, usando objetivos de un determinado aumento según el tamaño del polen en esta vista. Generalmente con objetivo de inmersión se hacen las mediciones del lado de apocolpio, lado de mesocolpio y la espesura de la 328

exina (nexina, sexina y tectum, Figuras 2.6 D y 2.6 I). Ésta última, es recomendable que se hagan las mediciones en los mesocolpios de granos que muestran dos o más aberturas para lograr mayor uniformidad, pues en muchos casos ocurren variaciones de espesor en otras partes de los granos de polen. En granos asimétricos o pantoapeturados las mediciones se pueden hacer en cualquier región del perímetro polínico no interrumpido y en monoaperturados en el lado opuesto a la abertura.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS MEDIDAS Como se explicó en la parte teórica, para cada parámetro que represente una muestra de 30 granos de polen medidos, se hace el análisis estadístico, indicándose el rango de variación (R, representado por los tamaños mínimo y máximo), la media aritmética (ẋ), más o menos la desviación típica, estándar o patrón de la media (Sẋ), la desviación típica de la muestra (s), el coeficiente de variación (V) y el intervalo de confianza (I.C.) a 95%, dados por el test de Student. En parámetros representados apenas por una muestra de 10 granos de polen medidos, se da únicamente la media aritmética (ẋ). Si es necesario y para visualizar variaciones en tamaño, las mediciones se pueden presentar en tablas organizadas en tamaños crecientes o decrecientes según el interés del investigador. También en caso de ser observado un claro di- o polimorfismo en el tamaño, pueden realizarse las mediciones para cada grupo que logre aislarse visualmente e indicarlo en la descripción, señalando también la proporción cercana en la que se encuentra cada tipo, examinando 5 campos del microscopio en 100x para granos pequeños, 40x para granos medianos, 10x para granos grandes y 4x para granos gigantes, los datos se representan en forma de porcentajes (%). El mismo procedimiento se hace cuando se observan variaciones en el número de aberturas.

329

Figura 2.6. Mediciones en los granos de polen. A: Vista ecuatorial de un polen 3-colporado, con una abertura en la posición central en primer plano (representada en línea continua) y dos aberturas laterales en segundo plano (representadas en línea discontinua). B: Detalle del cólporo central. C: Vista polar del polen 3-colporado. E: Vista ecuatorial de un polen 4-colpado, con dos aberturas en primer plano (representadas en línea continua) y dos aberturas en segundo plano (representadas en línea discontinua). F: Detalle del colpo. G-H: Vista polar del polen 4-colpado y 5-colpado. D e N. Estructura de la exina.

a. Lado de apocolpo. b. Báculos. cC. Longitud del colpo. cO. Longitud de la endoabertura. e. espesor de la exina. E. Diámetro ecuatorial. E1. Diámetro ecuatorial tomado de abertura a abertura. E2. Diámetro ecuatorial tomado de mesocolpo a mesocolpo. LC. longitud del colpo. LO. Longitud de la endoabertura. M. Mesocolpo. mC. Margen del colpo. n. Espesor de la nexina. P. Longitud del eje polar. s. Espesor de la sexina. t. Espesor del téctum.

330

ANÁLISIS AL NATURAL DEL MATERIAL POLINÍFERO Esta técnica consiste en observar al microscopio compuesto (microscopio óptico de luz), el polen o las esporas sin ningún tipo de procesamiento químico, excepto excepto el medio de montaje cuando se requiere. El medio de montaje debe ser una sustancia no deformante tal como aceite de cedro, bálsamo del Canadá, glicerina bidestilada o gelatina glicerinada, entre otras. Esta metodología permite examinar el grano con sus caracteres más o menos intactos (forma, tamaño, aberturas, entre otros). Presenta las desventajas de que, debido al contenido protoplasmático que impide el paso de la luz, no se pueden observar nítidamente los detalles de la pared de los granos y las placas no pueden ser conservadas por períodos largos, excepto si son montadas en bálsamo del Canadá el cual permite conservarlas indefinidamente. El montaje en gelatina glicerinada permite la conservación por un tiempo más o menos largo, pero no indefinitivo.

Si el montaje es en glicerina bidestilada, mediante golpes suaves en el portaobjetos o en la platina del microscopio, se obliga a los granos a girar sobre su eje, con lo cual se consigue mejorar la observación de sus características, principalmente las aberturas, sobre todo si el grano fue coloreado.

MATERIALES Y EQUIPOS Microscopio compuesto Estereomicroscopio Pinzas de punta fina Agujas de disección (estiletes) Estilete doblado en L, para el sellado con parafina Agitadores puntiagudos, hechos con varillas de vidrio de 2,5 mm de diámetro Bisturí o cuchillas de afeitar 331

Cribas (cedazos) de diferente tamaño del poro Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Vidrios de reloj o cajas de Petri pequeñas Rótulos autoadherentes Cinta de enmascarar Copos de algodón Palillos mondadientes Papel aluminio Papel absorbente Papel higiénico o toallas de papel Papel de filtro Plastilina de moldear Papel parafinado Película transparente autoadherente (usada para envolver para alimentos) Agua destilada Alcohol ácido Gelatina glicerinada Colorantes Parafina Esmalte incoloro para uñas Bálsamo del Canadá u otro medio de montaje Xilol Botones florales de angiospermas mono y dicotiledóneas, estróbilos masculinos de gimnospermas y esporangios de pteridofitos. Hipoclorito de sodio comercial 5,25% (Clorox o lejía) si se requiere aclarar los palinomorfos.

METODOLOGÍA Se realiza directamente sobre los portaobjetos. 332

1.

Sobre un portaobjetos limpio, desengrasado con alcohol ácido, y con la ayuda de un estereomicroscopio, pinzas de punta fina y estiletes (agujas de disección), extraer los estambres de varios botones florales, según el tamaño y número de los estambres. Debido a posible contaminación con granos de polen transportados por agentes polinizadores de otras especies, no es aconsejable utilizar flores abiertas, pero en numerosos casos es necesario procesar las flores enteras porque son muy pequeñas y ofrecen dificultad para extraer los estambres. Con el propósito de obtener una muestra representativa, se procesan anteras por lo menos de tres flores de la misma planta de cada especie. Para evitar contaminación en el laboratorio con granos de polen de otras especies, después de cada extracción de los estambres, sustituir el papel de filtro y limpiar bien todo el material utilizado.

2.

Observando bajo el estereomicroscopio triturar suavemente los estambres y retirar la mayor parte posible de resíduo vegetal.

3.

Agregar una o dos gotas del medio de montaje y una gota del colorante, si se desea colorear el micropreparado. Poner el cubreobjetos.

4.

Sellar con parafina o con esmalte (laca o brillo) incoloro para uñas, untándolo por todo el borde del cubreobjetos. Dejar secar antes de observar al microscopio.

Si se desea hacer placas permanentes, el material se monta y se sella utilizando bálsamo del Canadá o adaptando el montaje en gelatina glicerinada explicado más adelante para los granos acetolisados.

OBSERVACIONES

1.

Si se pretende observar detalles de las aberturas el polen puede ser montado en una sustancia acuosa, por ejemplo hidrato de cloral, con lo cual gracias a la harmomegatia, se aumenta el volumen del grano sin dañar la 333

pared; las aberturas se abren y se pueden observar fácilmente sobre todo si el grano fue coloreado. Debe tenerse en cuanta que esta metodología altera las dimensiones naturales del grano y por lo tanto no debe ser empleada si se requiere conocer su tamaño. 2.

Algunos granos de polen y esporas, son muy oscuros e impiden el paso de luz en el microscopio, dificultando la observación de sus detalles. Para esto, se pueden aclarar los granos agregando 1 ml de hipoclorito de sodio comercial 5,25% (Clorox) a 15 ml de agua destilada, dejar actuar durante 5 minutos. Después de este tiempo lavar con agua destilada tres veces. El procedimiento debe ser realizado en tubos de centrífuga. También pueden ser aclarados siguiendo el método de potasa: KOH, indicado más adelante.

3.

El polen y las esporas pueden ser teñidos usando una solución que no produzca deformación, o si lo hace, que sea mínima. Se pueden utilizar diferentes colorantes tales como: violeta de genciana, verde de metilo, fucsina básica, safranina, verde yodo o azul de Cresyl. Dos fórmulas de buenos resultados son:

Primera fórmula

Segunda fórmula

Glicerina bidestilada

15 g

Azul de Cresyl

1g

Alcohol etílico

30 ml

Agua

99

destilada Agua destilada Colorante

ml

45 ml

a saturación

Al preparar cualquiera de las fórmulas, se deben agitar hasta conseguir una mezcla homogénea, luego se dejan reposar de 5 a 10 minutos y se filtran. Una o dos gotas de la solución se añade a los granos de polen o esporas previamente depositados en un tubo de ensayo o sobre un portaobjetos. Se espera de 3 a 5 minutos, sin dejarlos secar, para que el colorante actúe. Se lava con agua destilada y se hace el montaje y sellado. 334

Observación de micropreparados para la descripción morfológica de los granos de polen Después del montaje en los portaobjetos, para la descripción morfológica de los granos de polen, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 10X, 20X, 40X o 100X (inmersión), según el tamaño del polen que se desee describir, y se procede a la búsqueda de los granos de polen o esporas que estén en una posición más o menos exacta en vista ecuatorial o en vista polar, para medirlos, describirlos y fotografiarlos. Para esto, en cada portaobjetos se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro, se observan y describen los granos encontrados en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con las observaciones y descripciones de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita describir varias veces un mismo grano.

335

ACETÓLISIS Como la intina y el protoplasma de esporas y granos de polen impiden la transmisión de la luz, no permitiendo visualizar claramente los detalles de la exina, es necesario en los estudios palinológicos someter los granos de polen a una serie de tratamientos químicos que, además de eliminar tales componentes, hacen que la exina quede más brillante permitiendo observarla con detalles e incrementando el contraste bajo el microscopio de luz. La exina generalmente permanece intacta, pues su componente principal, la esporopolenina, es muy resistente a las altas temperaturas y a las sustancias corrosivas, tales como ácido acético glacial, ácido sulfúrico y anhídrido acético, entre otras. Mientras que la celulosa y demás componentes orgánicos de la pared y de los restos vegetales (tallos, hojas, flores, entre otros) se destruyen con dicho tratamiento químico.

El método generalmente utilizado para la preparación del material de referencia en las investigaciones palinológicas, es el de la acetólisis de Erdtman (1969). La técnica consiste en la hidrólisis ácida del material polínico, empleándose una mezcla de ácido sulfúrico concentrado (una parte) y anhídrido acético (nueve partes). Estos dos reactivos son muy corrosivos, motivo por el cual son utilizados para degradar los tejidos orgánicos y el protoplasma del polen, haciendo que la exina se vuelva transparente y con el mismo aspecto del grano fosilizado. Los granos de polen y esporas fósiles han perdido el protoplasma pero conservan las características de la exina o del exosporio, por lo tanto pueden ser identificados y estudiados morfológicamente. Además, como no poseen protoplasma, aumenta su transparencia facilitando la observación al microscopio de luz.

La acetólisis permite hacer comparaciones entre materiales fósiles y actuales, frescos o de herbario, para fines de identificación. El método permite la conservación permanente de las placas preparadas con el material polínico. Aunque generalmente no se utiliza coloración, para facilitar la observación de los 336

detalles de la exina y de las aberturas, en ciertos casos es necesario teñir los granos de polen de algunas especies utilizando fucsina básica en solución acuosa bien diluida.

La acetólisis de Erdtman causa arrugamiento y deformación en las esporas y granos de polen de especies de varias familias. Este material debe ser preparado con el método de acetólisis láctica (ACLAC) de Raynal & Raynal (1971). Este método no permite montar placas permanentes y altera las medidas de las esporas y granos de polen, pero presenta la ventaja de permitir acompañar al microscopio la salida del contenido protoplasmático, posibilitando suspender el proceso antes de que ocurra la deformación polínica.

Para estudios complementarios de la morfología polínica, algunas veces es necesario recurrir al método de Wodehouse (1935), el cual permite observar mejor las aberturas, debido al contraste dado por coloración con fucsina básica u otro colorante. Este método sirve también para definir el tipo de tétrada en algunas especies.

OBSERVACIONES En cualquiera de las técnicas de preparación del material se deben tener en cuenta las siguientes precauciones: 1.

El material a utilizar (tubos de centrífuga, cajas de petri, vidrios de reloj, varillas de vidrio o de plástico, portaobjetos, cubreobjetos, diales, pinzas, estiletes, agujas de disección, bisturí, cribas o cedazos, entre otros) debe estar completamente limpio y seco. Este material se debe tener listo antes de cada trabajo.

2.

Las cribas o cedazos se deben limpiar muy bien; y si es necesario, flamearlas al rojo vivo cuando la criba es especial para resistir el calor.

337

3.

Los tubos de centrífuga se deben rotular cuidadosamente para cada muestra. Se rotula con cinta de enmascarar y se escribe con lápiz, nunca con tinta ni con marcador indeleble.

4.

En cualquier práctica o fase, cuando se va a centrifugar se deben equilibrar los tubos, ya sea pesándolos o igualando el volumen y en la centrífuga ponerlos uno al frente de otro. Cuando existen tubos impares, otro tubo debe ser llenado, equilibradamente, con agua destilada para ponerlo al frente del impar. Si el equilibrio no se hace correctamente la centrífuga vibra demasiado y no ocurre la precipitación del material y si los tubos son de vidrio generalmente se quiebran.

5.

Cuando pare la centrífuga se debe dejar que se detenga sola; no se puede detener con la mano ni con utensilios adicionales, pues la muestra se agitará nuevamente y se corre el riesgo de botarla al decantar.

6.

Al extraer los tubos de la centrífuga debe hacerse cuidadosamente, no agitarlos, ni caminar con ellos y la decantación debe ser inmediata, de lo contrario la muestra se agitará nuevamente y se corre el riesgo de botarla.

7.

Para cada muestra se debe utilizar un agitador diferente.

8.

Se

debe

utilizar

las

cantidades

exactas

de

reactivos

y

trabajar

cuidadosamente con ellos para evitar accidentes y contaminaciones de los reactivos limpios con los usados. 9.

Evitar al máximo la contaminación de las muestras.

338

ACETÓLISIS DE ERDTMAN El método generalmente utilizado para la preparación de material polinífero es el de acetólisis de Erdtman (1969). La técnica consiste en una hidrólisis ácida del material polínico, con la cual se degrada la intina y el protoplasma del polen y esporas; solamente permanece la pared externa de esporopolenina. Con esta técnica, la pared se vuelve transparente, permite el paso de la luz, facilitando la observación de los detalles de estructura y escultura de la pared.

MATERIALES Y EQUIPOS Microscopio compuesto Estereomicroscopio Campana (cámara de extracción de gases) Baño de María Centrífuga Placa de calentamiento (placa de Malassez) Pinzas de punta fina Estiletes (agujas de disección) Estilete doblado en L, para el sellado con parafina Bisturí Cribas o cedazos de diferente tamaño del poro Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Tubos de centrífuga graduados, de 15 ml Pipetas de 1 y 10 ml Probetas de 15 ml Beakers de 20 o 50 ml Varillas de vidrio de 2,5 mm de diámetro Frascos de vidrio de 10 ml Rótulos autoadherentes 339

Cinta de enmascarar Copos de algodón Palillos mondadientes Papel aluminio Papel absorbente Papel higiénico o toallas de papel Papel de filtro Plastilina de moldear Parafina 57-59 ºC Ácido acético glacial puro Ácido sulfúrico puro Anhídrido acético puro Etanol absoluto puro Solución acuosa de glicerina 50% Gelatina glicerinada Xilol Agua destilada Botones florales de angiospermas mono y dicotiledóneas, estróbilos masculinos de gimnospermas o esporangios de teridofitas.

METODOLOGÍA: ACETÓLISIS DE ERDTMAN 1.

Extraer los estambres por disección de los botones florales o de las flores sobre papel de filtro, con ayuda de estereomicroscopio, pinzas de punta fina y estiletes o agujas de disección. En numerosos casos es necesario procesar las flores enteras cuando son muy pequeñas y ofrecen dificultad para extraer los estambres. Para evitar contaminación, después de cada extracción, sustituir el papel de filtro y limpiar bien las pinzas y los estiletes. Con el propósito de obtener una muestra representativa, se procesan anteras por lo menos de dos flores de la misma planta de cada especie.

340

2.

Echar los estambres a un tubo de centrífuga limpio y seco, usar un tubo para cada especie vegetal, con la correspondiente identificación del material. El tejido se tritura con la ayuda de una varilla de vidrio de 2,5 mm de diámetro y 15 cm de longitud, haciendo presión contra las paredes del tubo, lo cual destruye los tejidos de la antera y se liberan los granos de polen. Para conseguir un micropreparado lo más limpio posible, libre de la mayor parte de restos vegetales que contiene el preparado, se aconseja pasar el material triturado por una criba o cedazo con orificios hasta de 200 um, según el tamaño del polen (observado previamente), recibiéndolo en otro tubo de centrífuga y haciendo por lo menos un lavado del primer tubo y de la criba con ácido acético glacial, para recuperar granos que hayan quedado adheridos a estos objetos.

3.

Fijar el material polínico agregando al tubo 5 ml de ácido acético glacial. Con esto el protoplasma y otros materiales orgánicos, comienzan a ser destruidos por corrosión, pero la esporopolenina permanece intacta. La fijación debe hacerse por un período mínimo de 24 horas. Esta fijación prolongada ayuda a evitar el arrugamiento de muchas especies durante las etapas posteriores a la preparación. Si el material polinífero proviene de ejemplares herborizados, secados por calor artificial, o fijados en FAA, formol u otro fijador biológico es necesario dejarlo en ácido acético glacial por un período mínimo de dos semanas, de lo contrario el protoplasma se hace muy sólido, como petrificado, y forma artificios que dificultan la observación de la pared.

4.

Centrifugar el material durante 5 minutos a 2.000 r.p.m., con posterior descarte del sobrenadante (ácido acético glacial y residuos de material vegetal).

5.

Adicionar al tubo de centrífuga, 5 ml de solución de acetólisis (anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado en proporción de 9:1, la cual debe ser preparada en el momento de su uso, con la precaución de añadir lentamente el ácido sulfúrico al anhídrido acético y no al contrario, debido a que es una reacción altamente exergónica (exotérmica), y los ácidos en 341

contacto brusco pueden causar explosión y quemaduras en la piel y ropa. Con el objeto de acelerar la degradación del contenido protoplasmático, esta mezcla (material más solución de acetólisis) se pone en baño de María a 100ºC, agitando cuidadosamente con varilla de vidrio por períodos de tiempo comprendidos entre 1 ½ y 3 minutos dependiendo del material polínico. La mayoría de los granos de polen requieren hasta tres (3) en la solución de acetólisis para degradar la totalidad de la intina y protoplasma sin destruir la exina. En varias familias, principalmente monocotiledóneas, la exina de los granos de polen es muy delgada o contiene poca esporopelenina y después de 1 ½ minutos de sometidos a la solución de acetólisis los granos se arrugan, deforman o se fragmentan. 6.

Este procedimiento debe realizarse en campana de extracción de gases, pues los vapores liberados son altamente corrosivos y tóxicos. Igualmente tener la precaución de que la solución de acetólisis no caiga accidentalmente sobre el agua cuando se está agitando, pues al contacto con el agua se proyecta fuertemente hacia arriba, a más de 1 m de distancia, y puede causar quemaduras en la piel, rostro o vestimenta. Par evitar estos accidentes no se puede agitar con fuerza ni golpear el fondo del tubo con la varilla de vidrio.

7.

Centrifugar la mezcla, todavía caliente, durante 3 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte de la solución sobrenadante. La decantación debe hacerse dentro de la campana de extracción de gases, en recipientes totalmente secos, y cuidadosamente, por los peligros que ofrece su mal manejo.

8.

Lavar el precipitado (polen con parte del tejido vegetal particulado) con 10 ml de agua destilada más 3 gotas de alcohol etílico, con agitación del material por 2 minutos. El alcohol hace disminuir la tensión superficial del agua permitiendo el hundimiento de los granos de polen eventualmente flotantes. Este lavado debe hacerse con el tubo dirigido en sentido opuesto al cuerpo de quien está trabajando, pues la reacción puede ser explosiva y causarle quemaduras. 342

9.

Centrifugar esta mezcla por 5 minutos a 2.000 r.p.m., con posterior descarte del sobrenadante.

10.

Lavar dos veces con 10 ml de agua destilada pura, agitando el material durante 2 minutos. En este paso, si el material no está muy limpio, es conveniente tamizarlo para retirar el exceso de material vegetal no degradado.

11.

Centrifugar después de cada lavado, durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

12.

Adicionar al tubo 5 ml de solución acuosa de glicerina al 50%. Deje el material en esta solución por un tiempo mínimo de 15 minutos y máximo de 24 horas. Tapar el tubo con papel aluminio o algodón para evitar contaminación. La glicerina vuelve translúcido el polen facilitando el paso de la luz y consecuentemente la mejor observación de los detalles de la pared.

13.

Montar una gota del preparado en un portaobjetos y observarlo a través del microscopio de luz para analizar el estado de los granos de polen y resolver si se continúa o no con la acetólisis. Algunos granos de polen presentan exina muy gruesa y generalmente quedan oscuros y es necesario aclararlos para observar sus detalles (ver Diafanización de los granos de polen), por eso no se deben desechar en este paso.

14.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante. Sin enderezar el tubo, ponerlo boca abajo sobre un beacker pequeño (20 o 50 ml) al cual previamente se le puso en el fondo papel absorbente, papel higiénico o toallas de papel. De esta forma el material queda en condiciones de montaje.

OBSERVACIONES 1.

Preparar únicamente la cantidad necesaria de la solución de acetólisis, para su cálculo recordar que son 5 ml o 10 ml por tubo de centrífuga con muestra.

343

2.

Al preparar la solución de acetólisis ésta debe quedar con un color blanco amarillento, si adquiere color amarillo oscuro fue mal preparada y alterar la acetólisis del material.

3.

Para cada tubo debe haber un agitador (de vidrio o de plástico según la práctica) y se debe tener mucho cuidado para no confundirlos y así evitar la contaminación de la muestra.

4.

Nunca golpee el fondo del tubo con la varilla de vidrio, pues lo romperá y además de perder el material puede causar quemaduras en el cuerpo o en el vestido.

5.

La reducción en el tiempo de lavado con agua o la reducción del número de veces que debe hacerse el lavado, puede derivar en el deterioro y desaparición, a largo plazo, de los granos de polen por corrosión sostenida causada por los restos de la solución de acetólisis que puedan quedar en el micropreparado.

6.

Las muestras nunca deben ser guardadas en solución de acetólisis, pues esta las corroerá en exceso y los granos de polen o las esporas pueden desaparecer completamente.

7.

El descarte de la solución de acetólisis o la de ácidos y otros reactivos fuertes, debe hacerse en un frasco de vidrio, nunca en el vertedero. El líquido descartado se entrega a especialistas para su eliminación.

8.

El material nunca debe ser almacenado en la solución de acetólisis, pues esta lo destruye o lo deforma con un tiempo diferente al recomendado.

9.

Los granos de polen de algunas especies, presentan una pared gruesa y se observan oscuros, para distinguir sus detalles se hace necesario aclararlos mediante un proceso de diafanización (ver práctica sobre la diafanización de los granos de polen).

10. Es necesario enfatizar que las anteras o flores se pueden conservar dentro del ácido acético glacial en frascos pequeños, por tiempo indefinido; pero no se pueden conservar en ningún otro tipo de fijador, pues el protoplasma se 344

solidifica y en la acetólisis aparece como artefactos que dificultan la observación de la pared al microscopio (Figura 2).

METODOLOGÍA: MONTAJE DE LAS PLACAS Las

placas

permanentes

pueden

montarse

usando

gelatina

glicerinada

(glicerogelatina), preparada según la fórmula de Kisser (1935, en Erdtman, 1971). El montaje en glicerogelatina también puede ser usado en las preparaciones de esporas y polen al natural. Para obtener suficiente material de estudio y para intercambio con otros investigadores, se aconseja montar por lo menos cuatro placas por espécimen, siguiendo los pasos propuestos a continuación:

1.

Tomar, con la ayuda de un estilete limpio, un trozo de gelatina glicerinada, de aproximadamente 0,5 cm por lado e impregnarlo con el precipitado que se encuentra en el fondo del tubo de centrífuga, el cual todavía debe estar y permanecer en posición invertida.

2.

Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado con alcohol etílico, poner el trozo de gelatina glicerinada con el precipitado adherido. Con la ayuda del mismo estilete dividirlo en cuatro pedazos y poner cada trocito sobre el primer tercio de cada uno de los cuatro portaobjetos limpios y desengrasados como se muestra en la Figura 2.7. Observar que la muestra queda un poco corrida hacia la derecha.

Figura 2.7. Montaje de una placa: cada trocito de gelatina glicerinada, impregnada con la muestra, se pone sobre el primer tercio de cada uno de los cuatro portaobjetos limpios y desengrasados. 345

3.

Llevar los portaobjetos, así preparados, a la placa de calentamiento hasta la fusión de la gelatina pero sin dejarla hervir para que no se formen burbujas. Una vez derretida la gelatina y con la ayuda del estilete, homogenizar suave y circularmente la preparación, cuidando de no levantar el estilete, también con el fin de evitar la formación de burbujas. Esto hace que los granos de polen se distribuyan homogéneamente.

4.

Dejar solidificar nuevamente la gelatina glicerinada y sobre ella poner el cubreobjetos y ponerla nuevamente en la placa de calentamiento hasta la fusión de la gelatina glicerinada, sin dejarla hervir. El cubreobjetos se pone de esta manera para evitar la deformación de los granos de polen causada por el peso de la laminilla.

5.

Sellar la placa con parafina 57ºC – 59ºC, según Erdtman (1969), aplicada en uno de los lados del cubreobjetos con la ayuda de un estilete doblado en L, manteniendo la preparación sobre la placa de calentamiento, levantándola de vez en cuando para que no se formen burbujas. Con esto la parafina penetra rápidamente por capilaridad entre el portaobjetos y el cubreobjetos, rodeando la gelatina glicerinada que contiene el precipitado (Figura 2.8 A). Luego retirar el portaobjetos de la placa y ponerlo boca abajo sobre papel absorbente o periódico sin imprimir.

Figura 2.8. A y B. Montaje de una placa.

6.

Retirar el exceso de parafina de la placa, inicialmente raspando con un bisturí y después lavando con un copo de algodón impregnado de xilol. 346

7.

Rotular cada placa con su correspondiente identificación de referencia. El espacio libre de cada placa se destina a la rotulación (Figura 2.8. B). Las placas así preparadas deben conservarse siempre en posición horizontal y no expuestas a altas temperaturas, para evitar posible deslizamiento del material polínico.

8.

Sellar la placa de la forma indicada tiene la ventaja de que las capas de parafina y de gelatina glicerinada quedan muy delgadas y los granos de polen son forzados a disponerse junto al cubreobjetos, facilitando de esta forma su observación al microscopio de luz. Pero tiene la desventaja de que la parafina puede no penetrar homogéneamente, dejar espacios libres y no sellar completamente la preparación. Además, hacer penetrar la parafina toma tiempo y es muy fácil que la gelatina llegue a hervir y que la preparación quede con muchas burbujas.

Para evitar las anteriores desventajas se puede hacer el montaje de la siguiente manera: 1.

Realizar normalmente los pasos 1, 2 y 3.

2.

Dejar solidificar nuevamente la gelatina glicerinada.

3.

Con un gotero caliente o aplicador de vidrio, rodear la preparación con parafina 57 – 59 ºC en forma circular un poco alejada de la gelatina (Figura 2.9).

Figura 2.9. Montaje de una placa: forma de rodear circularmente la preparación con parafina. 4.

Poner el cubreobjetos o laminilla y llevar nuevamente la preparación a la placa de calentamiento hasta la fusión de la gelatina y la parafina, sin dejar 347

hervir la primera. Con la ayuda del estilete se rectifica la posición de la laminilla respecto del portaobjetos (Figura 2.10).

Figura 2.10. Montaje de una placa: forma de rectificar la posición de la laminilla respecto al portaobjetos.

NOTA. Si se trata de granos de polen pequeños, se invierte la lámina portaobjetos con la preparación aun caliente sobre papel periódico, con el propósito de eliminar por absorción, los excesos de parafina. Luego al solidificarse la parafina sobrante se retira con una cuchilla y se limpia con xilol. En granos de polen grandes no se invierte la lamina portaobjetos, sino, que se pone sobre una superficie metálica fría sin hacer presión sobre la laminilla.

Los micropreparados hechos de esta forma pueden quedar algo gruesos y los granos de polen quedan muy embebidos en la gelatina, lo cual dificulta la observación de los detalles de la pared, debido a la distancia focal en el microscopio.

Las esporas y granos de polen de algunas especies, por ser demasiado altos, necesitan un montaje especial, consistente en el uso de cuatro pelotillas de plastilina de moldear, con cerca de 1 mm de diámetro. Éstas se ponen en cada esquina del cubreobjetos, de tal manera que al fundirse al ser llevadas a la placa de calentamiento, queden entre el portaobjetos y el cubreobjetos con el propósito de disminuir la acción directa del peso de la laminilla sobre la preparación, evitando así la deformación de los granos de polen gigantes.

Después del montaje, los tubos se colocan en su posición normal y a cada uno se le agrega 3 ml de glicerina bidestilada, agitando con varilla de vidrio y se vierte 348

esta mezcla en frascos de vidrio pequeños para guardar el material testigo, posibilitando su uso en estudios posteriores. El material sobrante también puede ser conservado agregando gelatina glicerinada al tubo de ensayo, colocándolo en baño maría para derretir la gelatina. La suspensión se vierte en los frascos pequeños. Para usar el material así conservado, con un palillo se toma un trozo y se monta de la manera indicada.

OBSERVACIÓNES

1.

Antes de montar las placas, cuando el material se tiene en la solución de glicerina 50%, se debe tomar una muestra, se pone en un portaobjetos y se observa al microscopio. Si la muestra es buena se continúa con el montaje.

2.

Al limpiar el exceso de parafina con xilol, se usan pequeños topos de algodón, para limpiar únicamente el portaobjetos y el cubreobjetos. De esta forma no se corre el riesgo de despegar el cubreobjetos.

Preparación de la gelatina glicerinada (Según Kisser, 1935; en Erdtman, 1971) 1.

Disolver 50 g de gelatina en polvo en 175 ml de agua destilada hirviendo, agitando continuamente con una varilla de vidrio o con agitador magnético. Conserve caliente la mezcla. Para minimizar la formación de grumos, vierta el agua sobre la gelatina y no al contrario.

2.

Disolver 7 g de fenol en 150 ml de glicerina bidestilada. Agregue poco a poco esta solución a la gelatina con agua, agitando continuamente con la varilla de vidrio o con agitador magnético.

3.

Filtre la mezcla final a través de lana de vidrio o gasa doblada y utilizando un embudo caliente.

4.

Vierta la gelatina glicerinada en pequeños frascos de vidrio y consérvela en la nevera. Si se requiere conservar por largo tiempo la gelatina glicerinada, se envasa en frascos de color ámbar o en recipientes oscuros.

349

OBSERVACIONES 1.

El fenol tiene como función evitar el crecimiento de hongos y bacterias. Puede ser reemplazado por nipagina 1% o benzoato de sodio 5%.

2.

Si no se dispone de gelatina pura para análisis, se puede utilizar gelatina dietética comercial (sin color, sabor ni azúcar) como la usada en repostería.

3.

La gelatina glicerinada debe quedar sólida pero de consistencia blanda. Al parecer con la altura y clima de la región, se deben hacer pequeñas variaciones para conseguir el estado ideal, de lo contrario quedará o muy dura o semisólida. En la tabla de modificaciones de la fórmula de preparación de la gelatina, se indica la usada en el laboratorio de palinología de la Universidad de Antioquia (U de A).

Tabla 2. 1. Algunas modificaciones de la fórmula de preparación de la gelatina glicerinada. Gelatina glicerinada

Kisser

U.

(1935)

A.

de

Bogotá

Sao PauloBrsil

Gelatina pura (g)

50

21

49

49

Agua destilada (ml)

175

126

175

175

Glicerina

150

150

149,8

147.8

7

3

7

7

bidestilada

(ml) Fenol (g)

350

ACETÓLISIS DE ERDTMAN PARA MUESTRAS CON POCO MATERIAL POLINÍFERO (Micrométodo de acetólisis en portaobjetos) Cuando la cantidad de material polinífero es muy pequeña y los escasos granos se pueden perder en los diferentes pasos de la acetólisis, o cuando los granos de polen tienen esporodermis muy delgada o con poca esporopolenina y por consiguiente se deforman o trituran durante la preparación, se utiliza el micrométodo de acetólisis así:

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estereomicroscopio Campana (cámara de extracción de gases) Baño de María Centrífuga Placa de calentamiento (placa de Malassez) Pinzas de punta fina Estiletes (agujas de disección) Estilete doblado en L, para el sellado con parafina Bisturí Portaobjetos cóncavos (placas), de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Pipetas de 1 y 10 ml Probetas de 15 ml Varillas de vidrio de 2,5 mm de diámetro Frascos de vidrio de 10 ml Rótulos autoadherentes Cinta de enmascarar Copos de algodón Palillos mondadientes Papel absorbente 351

Papel higiénico o toallas de papel Papel de filtro Plastilina de moldear Parafina 57-59 ºC Ácido acético glacial puro Ácido sulfúrico puro Anhídrido acético puro Etanol absoluto puro KOH 10% Solución acuosa de glicerina 50% Gelatina glicerinada Xilol Agua destilada Botones florales de angiospermas mono y dicotiledóneas, estróbilos masculinos de gimnospermas o esporangios de pteridofitas.

Metodología 1.

Poner la flor o la antera sobre un portaobjetos cóncavo, limpio y desengrasado.

2.

Agregar tres gotas de la solución de acetólisis y calentar suavemente a la llama o en placa de calentamiento.

3.

Añadir dos gotas más de la solución de acetólisis y dejar actuar durante un minuto.

4.

Si se desea se puede seguir la reacción hasta que los granos estén acetolisados, observando

bajo

el microscopio

compuesto, con

la

precaución de no aspirar la solución ni impregnar con ella el microscopio. Si este paso se hace continuamente, el microscopio se estropea rápidamente.

352

5.

Con la ayuda de papel absorbente, puesto en un borde, retirar la solución cuidadosamente para no arrastrar los granos de polen.

6.

Neutralizar durante un minuto agregando una gota de KOH 10% sin dejar secar, para lo cual se puede adicionar más KOH si es necesario.

7.

Con la ayuda de papel absorbente, puesto en un borde, retirar la solución cuidadosamente para no arrastrar los granos de polen.

8.

Lavar con agua destilada mínimo tres veces absorbiendo de la manera indicada.

9.

Montar y sellar las placas de la manera ya descrita.

353

ACETÓLISIS DE ERDTMAN PARA MUESTRAS CON POCO MATERIAL POLINÍFERO (Micrométodo de acetólisis en tubos de centrífuga)

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estereomicroscopio Campana (cámara de extracción de gases) Baño de María Centrífuga Placa de calentamiento (placa de Malassez) Pinzas de punta fina Estiletes (agujas de disección) Estilete doblado en L, para el sellado con parafina Bisturí Cribas o cedazos de diferente tamaño del poro Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Tubos de centrífuga graduados, de 15 ml Pipetas de 1 y 10 ml Probetas de 15 ml Beakers de 20 o 50 ml Varillas de vidrio de 2,5 mm de diámetro Frascos de vidrio de 10 ml Rótulos autoadherentes Cinta de enmascarar Copos de algodón Palillos mondadientes Papel aluminio Papel absorbente Papel higiénico o toallas de papel 354

Papel de filtro Plastilina de moldear Parafina 57-59 ºC Ácido acético glacial puro Ácido sulfúrico puro Anhídrido acético puro Etanol absoluto puro Solución acuosa de glicerina 50% Gelatina glicerinada Xilol Agua destilada Botones florales de angiospermas mono y dicotiledóneas, estróbilos masculinos de gimnospermas o esporangios de teridofitas.

Metodología 1.

Echar los estambres de por lo menos tres flores, o las flores enteras, en un tubo de ensayo con 3 ml de ácido acético glacial.

2.

Con la ayuda de una varilla de vidrio, disecar el material suavemente en las paredes del tubo.

3.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante cinco minutos.

4.

Decantar y descartar el sobrenadante.

5.

Agregar 5 ml de la solución de acetólisis y llevar a baño maría por 3 minutos, agitando con la varilla de vidrio.

6.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante cinco minutos.

7.

Decantar y descartar el sobrenadante.

8.

Lavar con 10 ml de agua destilada agitando con la varilla de vidrio.

9.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante cinco minutos.

10.

Decantar y descartar el sobrenadante.

355

11.

Agregar 5 ml de la solución acuosa de glicerina 50%, agitando con la varilla de vidrio.

12.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante cinco minutos.

13.

Decantar y descartar el sobrenadante

14.

Sin enderezar el tubo, ponerlo boca abajo sobre un beacker pequeño (20 o 50 ml) al cual previamente se le puso en el fondo papel absorbente, papel higiénico o toallas de papel. De esta forma el material queda en condiciones de montaje.

15.

Montar las placas de la manera ya indicada (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

356

ACETÓLISIS MODIFICADA PARA GRANOS DE POLEN CON PARED DELGADA Muchos de los granos de polen de angiospermas, especialmente los de especies pertenecientes a la clase Liliopsida (monocotiledóneas), presentan un delgada y plástica pared que bajo las condiciones normales de trituración, centrifugación y sometimiento químico, sufren deformaciones mecánicas que alteran su forma original, llegando incluso a la fragmentación parcial o total, lo que imposibilita cualquier caracterización y preparación de placas permanentes. Por lo anterior, existe la necesidad de estandarizar un método que permita aminorar dichos detrimentos, mediante una sistemática reducción de los factores mencionados, para lo cual se propone el siguiente Metodología:

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estereomicroscopio Campana (cámara de extracción de gases) Baño de María Centrífuga Placa de calentamiento (placa de Malassez) Pinzas de punta fina Estiletes (agujas de disección) Estilete doblado en L, para el sellado con parafina Bisturí Cribas o cedazos de diferente tamaño del poro Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Tubos de centrífuga graduados, de 15 ml Pipetas de 1 y 10 ml Probetas de 15 ml Beakers de 20 o 50 ml Varillas de vidrio de 2,5 mm de diámetro 357

Frascos de vidrio de 10 ml Rótulos autoadherentes Cinta de enmascarar Copos de algodón Palillos mondadientes Papel aluminio Papel absorbente Papel higiénico o toallas de papel Papel de filtro Plastilina de moldear Parafina 57-59 ºC Ácido acético glacial puro Ácido sulfúrico puro Anhídrido acético puro Etanol absoluto puro Solución acuosa de glicerina 50% Gelatina glicerinada Xilol Agua destilada Botones florales de angiospermas mono y dicotiledóneas, estróbilos masculinos de gimnospermas o esporangios de teridofitas.

Metodología 1.

Macerar muy suavemente el material polinífero previamente fijado con ácido acético, sólo hasta percibir que los tejidos estén rotos y los granos de polen hayan sido liberados.

2.

Adicionar 5 ml de ácido acético glacial para concluir la fijación del material polínico, dejando reposar por 5 minutos.

358

3.

Centrifugar el material durante 4 minutos a 2.000 r.p.m., y luego decantar la solución sobrenadante

4.

Adicionar la solución de acetólisis en una proporción de 9 partes de anhídrido acético por 0,5 parte de ácido sulfúrico, preparada en el momento mismo de su utilización.

5.

Llevar al baño de María a 70 – 80ºC durante 1 ½ minutos.

6.

Centrifugar la mezcla en caliente por 2 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar cuidadosamente.

7.

Realizar un primer lavado con 5 ml de agua destilada y 3 gotas de etanol absoluto agitando por 1 minuto.

8.

Centrifugar durante 4 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

9.

Realizar un segundo lavado con agua destilada y etanol absoluto en la misma cantidad agitando durante un minuto. Luego, pasar la mezcla a través de una criba, previo conocimiento del tamaño aproximado del polen procesado o un taxón afín cuando sea posible.

10.

Centrifugar durante 4 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

11.

Adicionar de 5 ml de solución acuosa de glicerina al 50%, agitar con varilla de vidrio durante 1 minuto.

12.

Tomar una gota de la solución con polen y ponerla en una lámina portaobjetos, observar al microscopio de luz el estado actual del proceso acetolítico. En caso de ser observados restos de protoplasma en los granos de polen, se procede a centrifugar nuevamente durante 4 minutos a 2.000 r.p.m., repitiendo los pasos 4,5 y 6; lavando sólo una vez con 5 ml de agua destilada y 3 gotas de etanol absoluto. Adicionar luego, 5 ml de glicerina al 50% y agitar con varilla de vidrio durante 1 minuto.

13.

Dejar el material en reposo durante un tiempo mínimo de 15 minutos y máximo de 24 horas, con el propósito de hacer translúcidos los granos de polen.

14.

Centrifugar por 4 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

359

15.

El tubo se pone invertido en beackers pequeños con papel absorbente en el fondo.

16.

Montar las placas con glicerogelatina y sellar con parafina (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

360

DIAFANIZACIÓN DE LOS GRANOS DE POLEN Cuando los granos de polen tienen exina gruesa pueden quedar muy oscuros después de acetolisados y algunas veces es necesario aclararlos antes de continuar con la acetólisis después de haber sido tratados con glicerina 50%. Este proceso recibe el nombre de diafanización y el método más usual es la diafanización con cloro naciente. Debe tenerse en cuenta que los granos de polen diafanizados no deben ser usados para mediciones, pues el proceso altera el tamaño del grano acetolisado. El método se usa como una ayuda en la observación de los detalles de estructura y escultura de la pared.

Materiales y equipos Microscopio compuesto Campana de extracción de gases Centrífuga Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Tubos de centrífuga graduados de 15 ml Varilla de vidrio de 2,5 mm de diámetro Papel aluminio Ácido acético glacial Solución acuosa saturada de clorato de sodio Ácido clorhídrico puro Solución acuosa de glicerina 50% Agua destilada Sedimento de polen en glicerina 50%

Metodología 1.

Agitar el tubo que contiene el polen en solución acuosa de glicerina 50% y verter aproximadamente una tercera parte a un tubo de centrífuga limpio. 361

2.

Agregar a este tubo 3 ml de ácido acético glacial, 3 gotas de clorato de sodio y 3 gotas de ácido clorhídrico. Agitar con varilla de vidrio. Con esta mezcla se forma cloro naciente o clorina, el cual blanquea el polen en menos de 30 segundos.

3.

Centrifugar por 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar la solución blanqueadora.

4.

Lavar dos veces en 10 ml de agua destilada, agitando el material durante dos minutos.

5.

Centrifugar por 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el agua.

6.

Adicionar al tubo 5 ml de glicerina 50% en agua, dejar en esta solución por 15 minutos como mínimo y hasta 24 horas como máximo.

7.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m., descartar el sobrenadante y sin enderezar los tubos, ponerlos boca abajo en beackers con papel absorbente.

8.

Montar y sellar las placas de la forma indicada (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

362

ACETÓLISIS LÁCTICA (ACLAC) (Método de Raynal & Raynal)

La acetólisis de Erdtman causa arrugamientos y deformaciones en las esporas y polen de especies de varias familias. Este material deberá ser preparado con el método de acetólisis láctica (ACLAC) de Raynal & Raynal (1971). Este método no permite montar placas permanentes y altera las medidas de los granos de polen, pero presenta la ventaja de permitir acompañar al microscopio la salida del contenido protoplasmático, posibilitando suspender el proceso antes de que ocurra la deformación polínica.

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estereomicroscopio Placa de calentamiento Pinzas de punta fina Estiletes Algodón Gelatina glicerina Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Parafina Ácido sulfúrico puro Anhídrido acético puro Ácido láctico Alcohol etílico 95 % Agua destilada Botones florales o flores

363

Metodología 1. Hidratar el material herborizado (botones florales o flores) calentándolo en agua. El material fresco no necesita de hidratación previa. 2. Disecar los botones florales utilizando pinzas limpias para retirar las anteras. 3. Triturar las anteras sobre un portaobjetos con una gota de la mezcla Acetólisis láctica (10 ml de ácido sulfúrico, 30 ml de anhídrido acético y 60 ml de ácido láctico), preparada en el momento de ser usada. 4. Transferir el portaobjetos con el material polínico para una placa de calentamiento a 50ºC. Examinar la placa al microscopio de vez en cuando para controlar la duración de la acetólisis. En esta etapa es posible acompañar la rotación de los granos para observar su forma, posición de las aberturas, ornamentación, entre otros 5. Poner una gota de alcohol etílico a 95% y con la ayuda de algodón, envuelto en la punta de un estilete o palillo para dientes, limpie el halo grasoso que se forma alrededor de la preparación. 6. Rehidratar con agua caliente a 40 – 50ºC. 7. Montar las placas con gelatina glicerinada, sellarlas con parafina (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

364

MÉTODO DE WODEHOUSE Para estudios complementarios de la morfología polínica, algunas veces es necesario recurrir al método de Wodehouse (1935), el cual permite observar mejor las aberturas, debido al contraste dado por la coloración con fucsina básica. Este método sirve también para definir el tipo de tétrada de algunas especies.

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estereomicroscopio Estiletes Mechero de alcohol Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Solución acuosa diluida de fucsina básica Alcohol etílico Algodón Palillos para dientes Gelatina glicerinada Parafina

Metodología 1.

Retirar las anteras y ponerlas en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado.

2.

Poner una gota de alcohol etílico y con un estilete limpio, abrir las anteras para liberar los granos de polen. Agregar una nueva gota de alcohol a medida

que

este

se

vaya

evaporando,

para

no

dejarlo

secar

completamente. 3.

Con la ayuda de un copito de algodón, limpiar el halo grasoso que se forma alrededor de la preparación. 365

4.

Secar completamente el alcohol del portaobjetos, flameando con el mechero de alcohol o en placa de calentamiento, controlando la temperatura con el dorso de la mano.

5.

Agregar una gota de fucsina en solución acuosa bien diluida y secar flameando en el mechero de alcohol, controlando la temperatura con el dorso de la mano.

6.

Montar las placas con gelatina glicerinada y sellar con parafina.

OBSERVACIONES 1.

El paso 5 se puede eliminar si en el 6 se usa gelatina glicerinada ya preparada con el colorante. En este caso se aconseja usar safranina (Melhem, 1980).

2.

Una gran variedad de colorantes puede ser usada: verde de metilo, safranina, violeta de genciana, fucsina básica, azul de metileno, azul de Cresyl, entre otros Si se desea mostrar un contraste entre exina y contenido celular, el polen puede ser coloreado primero con una solución acuosa diluida de eosina y después con verde de metilo: la exina teñirá de verde y la intina de rojo (Ver preparación de reactivos, colorantes y medios de montaje de palinomorfos).

366

ANÁLISIS DE LAS ESPORAS DE HONGOS

Obtención de las esporas. Existen dos métodos de adquirir las esporas: 1.

En fresco. Realizado directamente de los hongos frescos. Se deben colectar ejemplares de los hongos para su posterior identificación y conservación en la micoteca.

2.

En seco. O sea tomar esporas de exsicados, los cuales son ejemplares de hongos depositados en un herbario o en una micoteca.

En ambos métodos el material esporonífero se colecciona con su correspondiente identificación con todos los datos de recolección (colector, número de colección, localidad, fecha, entre otros) o número de exsicado (ejemplar de herbario o micoteca) para la determinación correcta del especímen.

Examen al microscopio óptico de luz. Esta técnica consiste en observar las esporas bajo el microscopio compuesto (microscopio óptico de luz). El medio de montaje debe ser una sustancia no deformante, tal como aceite de cedro, bálsamo del Canadá, glicerina bidestilada o gelatina glicerinada, entre otras. Esta metodología permite examinar las esporas con sus caracteres más o menos intactos (forma, tamaño, aberturas, ornamentación, entre otros). Presenta las desventajas de que, debido al contenido protoplasmático que impide el paso de la luz, no se pueden observar nítidamente los detalles de la pared de las esporas y las placas no pueden ser conservadas por períodos largos, excepto si son montadas en bálsamo del Canadá el cual permite conservarlas por un tiempo prolongado.

Si el montaje es en glicerina bidestilada, mediante golpes suaves en el portaobjetos o en la platina del microscopio, las esporas giran sobre su eje, con lo cual se consigue mejorar la observación de sus características, principalmente las aberturas. 367

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estereomicroscopio Agujas de disección (estiletes o lancetas) Bisturí o cuchillas de afeitar Cajas (platos) de Petri Cepillo de pelo de camello Cinta de enmascarar Copos de algodón Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Estiletes doblados en L Estufa o fogón eléctrico o a gas Goteros Papel absorbente Papel blanco o parafinado Papel de filtro o gaza Pinzas de punta fina Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Rótulos autoadherentes Vasos o frascos de boca ancha Vidrio de reloj Cuerpos fructíferos con esporas

Químicos y reactivos preparados (Ver preparación de reactivos, colorantes y medios de montaje de palinomorfos) Agua destilada Alcohol ácido Alcohol etílico absoluto Bálsamo del Canadá u otro medio de montaje Esmalte incoloro para uñas Gelatina glicerinada 368

Hidrato de cloral 50% KOH 3% Parafina Reactivos para coloración de esporas Xilol

Metodología 1.

Realizar la esporada: Consiste en obtener las esporas a partir de un hongo maduro y fresco

2.

Seleccionar un ejemplar maduro

3.

Cortar el estipe dejando el píleo lo más próximo a las lamelas

4.

Colocar el píleo con las lamelas hacia abajo sobre la superficie donde se quiere dejar la impresión de la esporada (papel blanco)

5.

Tapar el píleo con un vaso (Figura 1.43 A)

6.

Dejar que se depositen las esporas y se sequen totalmente durante 24 horas en ambiente seco

7.

Retirar cuidadosamente el píleo

8.

Para evitar contaminación en el laboratorio con esporas de otras especies, después de cada esporada sustituir el papel y limpiar bien todo el material utilizado.

Otra forma de obtener la esporada es coger un ejemplar lo suficientemente maduro, cortar una porción de lámina y sobre un pequeño vidrio de reloj con agua destilada, se destruye con la ayuda de estiletes de disección (lancetas). Una porción se deposita sobre el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos para detectar si hay presencia de esporas en la preparación. Montaje de los micropreparados. A partir de este paso se pueden hacer distintas preparaciones con los diferentes reactivos y colorantes habituales en este tipo de estudios. 369

1.

Limpiar

y

desengrasar

con

alcohol

ácido,

varios

portaobjetos

y

cubreobjetos. 2.

Colocar

parte

de

la

esporada

sobre

los

portaobjetos

limpios

y

desengrasados. Si se trata de material seco, tomar con unas pinzas un pequeño trozo del píleo y ponerlo sobre el portaobjetos. 3.

Añadir unas gotas de agua destilada a cada portaobjetos, de forma que todas las esporas queden sumergidas en el agua.

4.

Agregar una gota del reactivo para teñir las esporas. La tinción mediante reacción química de las esporas es de gran importancia para ver si reaccionan o no con el colorante. Usar al menos cuatro portaobjetos para cada uno de los reactivos de Melzer, Azul de algodón y Azul de Cresyl).

5.

Agitar suavemente con la aguja de disección y poner el cubreobjetos.

6.

Sellar con esmalte (laca o brillo) incoloro para uñas, untándolo por todo el borde del cubreobjetos. Dejar secar antes de observar al microscopio.

7.

Observar al microscopio para medir y describir la morfología de las esporas.

Si se desea hacer placas permanentes, el material se monta y se sella utilizando bálsamo del Canadá o adaptando el montaje en gelatina glicerinada para granos de polen acetolisados (ver acetólisis de Erdtman).

METODOLOGÍA PARA USAR

ALGUNOS DE LOS COLORANTES DE

ESPORAS DE HONGOS

REACTIVO DE MELZER. Colocar el material a ser estudiado en una gota de Melzer y cubra. Una reacción positiva por lo general ocurre de inmediato, pero en casos dudosos es necesario dejar el material en la solución durante 20 minutos. ACETOCARMÍN. Según Grund & Marr (1965):

370

1.

Sumergir un pedazo de lamela, ligeramente mayor de 4 mm 2, o un poco más grande, en 2 ml de una de las soluciones mordientes en un vidrio de reloj y dejar hervir por aproximadamente 1 minuto a fuego directo.

2.

Transferir el pedazo de lamela a un segundo vidrio de reloj que contiene 2 ml de solución de acetocarmín y dejar hervir nuevamente durante 1 minute a fuego directo.

3.

Colocar este pedazo de lamela sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y agregarle unas pocas gotas de una solución hidrato de cloral 50%.

4.

Cubrir con laminilla de vidrio y observar inmediatamente.

ACETOCARMÍN. Según Henderson et. al. (1969): 1.

Colocar un pequeño pedazo de lamela en unas pocas gotas de la solución sobre un portaobjetos de vidrio, limpio.

2.

Calentar en fuego directo.

3.

Cuando el líquido empiece a evaporarse y se forme una película, pasar el fragmento de lamela a otro portaobjetos de vidrio, limpio y agregarle otras gotas de la solución.

4.

Repetir dos o tres veces.

AZUL DE ALGODÓN. (Solución de Amman. Anilina azul): 1.

Colocar el material a ser estudiados en una gota de algodón azul en un portaobjetos de vidrio, limpio. Cubrir con laminilla de vidrio.

2.

Observar con microscopio compuesto.

3.

Para obtener una reacción positiva, colocar la preparación al calor durante una hora.

AZUL DE CRESYL: 1.

Coloque el material a ser estudiados en una gota de azul de Cresyl en un portaobjetos de vidrio, limpio.

2.

Estudiar después de cubrir con un cubreobjetos. 371

PREPARACIÓN DE REACTIVOS, COLORANTES Y MEDIOS DE MONTAJE DE ESPORAS DE HONGOS

Acetocarmín. Fórmula 1. (Grund & Marr 1965): 1.1.

Solución madre. Hacer una mezcla 1: 1 (v: v) de ácido acético

glacial y agua destilada y disolver en ella acetocarmín hasta saturación. Dejar reposar durante 6 horas. 1.2.

a.

Usar como mordiente una de las dos siguientes soluciones:

Solución acuosa de cloruro férrico (FeCl3) 5%. Disolver 5 gramos de

cloruro férrico en 95 ml de agua destilada. b.

Sulfato férrico de amonio ((NH4).SO4) 3%. Mezclar 3 gramos de

sulfato férrico de amonio, 1 ml de ácido acético glacial y 0.1 ml de ácido sulfúrico. Con agua destilada, llevar esta mezcla a 100 ml.

Fórmula 2. (Henderson, Orton and Watling 1969): 1. Diluir 45 ml de ácido acético glacial en 55 ml de agua destilada y disolverle carmín hasta saturación. 2. Calentar durante media hora y, después de este tiempo, filtrar. 3. Medir la solución resultante y agregarle el doble de una solución de 45 ml de etanol absoluto en 55 ml de agua destilada. 4. Añadir 2 - 4 gotas de hidróxido férrico.

AZUL DE ALGODÓN. (Solución de Amman. Anilina azul). La solución de azul de algodón generalmente es usada mezclada con ácido láctico y fenol. Fórmula 1 (Henderson, Orton y Watling 1969): Disolver 50 ml de solución acuosa 1% de azul de algodón (1 g de azul de algodón en 99 ml de agua destilada) en una solución hecha con 100 g de ácido láctico, 372

100 g de fenol, 150 ml de glicerina 50% (75 ml de glicerina y 75 ml de agua destilada).

Fórmula 2: Disolver 1g de azul de algodón en 99 ml de ácido láctico.

AZUL DE CRESYL. Preparación de soluciones acuosas 0.5 a 1%. 1. Disolver 0.5 – 1 g de azul de Cresyl en 99.5 – 99 ml de agua destilada.

2. Dejar reposar durante 5 a 10 minutos y filtrar para retirar el exceso de colorante.

AZUL DE METILENO. Preparación de solución acuosa 1%: Disolver 1 g de azul de metileno en 99 ml de agua destilada.

ERITROSINA (Palmer 1955). Hacer una solución saturada de eritrosina A en hidróxido de amonio.

FUCSINA ÁCIDA. Hacer una solución saturada de fucsina en ácido clorhídrico 10%.

HIDRATO DE CLORAL. Solución acuosa 50%: Disolver 50 g de hidrato de cloral en 50 ml de agua destilada.

HIDRÓXIDO DE AMONIO (NH4OH). Preparación de soluciones acuosas 3 y 10%.

Para preparar la solución del porcentaje deseado, disuelva X g de hidróxido de amonio en X ml de agua destilada. Por ejemplo NH 4OH 10% se prepara disolviendo 10 g de NH4OH en 90 ml de agua destilada. 373

HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH). Soluciones acuosas 3 ó 5%. Disolver 3 ó 5 g de hidróxido de potasio en 97 ó 95 ml de agua destilada. HIDRÓXIDO DE SODIO (NAOH. Soluciones acuosas 3 – 5%. Disolver 3 – 5 g de hidróxido de sodio en 97 – 95 ml de agua destilada.

REACTIVO DE MELZER. Mezclar y calentar, sin dejar hervir, los siguientes reactivos: Yodo (Iodine): 1.5 g Yoduro de Potasio (Potassium-Iodide): 5 g Hidrato de cloral (Chloral Hydrate): 100 g Agua destilada: 100 ml

Nota: No mezclar Melzer con ningún tipo de álcali, pues se podría formar un precipitado inmediatamente.

REACTIVO DE MELZER (OTRA FÓRMULA). Mezclar y calentar, sin dejar hervir, los siguientes reactivos: Yodo (Iodine): 0.5 g Yoduro de Potasio (Potassium-Iodide): 1.5 g Hidrato de cloral (Chloral Hydrate): 22 g Agua destilada: 20 ml

Nota: No mezclar Melzer con ningún tipo de álcali, pues se podría formar un precipitado inmediatamente.

ROJO CONGO. Preparación de solución acuosa 1%: Disolver 1 g de Rojo Congo en 99 ml de agua destilada. Filtrar la solución.

374

ROJO CONGO. Preparación de solución saturada en hidróxido de amonio (NH4OH): Disolver Rojo Congo en hidróxido de amonio hasta obtener una solución saturada. Filtrar para eliminar el exceso del colorante.

375

ANÁLISIS DE ESPORAS DE PTERIDOFITOS: MÉTODO DE POTASA: KOH Un método muy usado en palinología es el tratamiento del material polinífero con KOH 10% (Fægri & Iversen, 1950. Con este método no se elimina completamente la intina ni el contenido celular y esto dificulta la observación de los detalles de estructura y escultura de la pared. Sin embargo, es un tratamiento menos fuerte que la acetólisis de Erdtman, por lo cual se usa para tratar esporas de teridofitos cando se requiere conservar la perina y en granos de polen que no resisten la acetólisis. El método puede ser usado en esporas de peridófitos y en granos de polen tanto fósiles como actuales o para tratar sedimentos, antes de realizar la acetólisis en preparaciones de granos de polen fósiles. (Ver preparación de reactivos, colorantes y medios de montaje de palinomorfos).

Materiales y equipos Material polinífero o esporas Microscopio compuesto Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Mechero de alcohol Tubos de centrífuga graduados de 15 ml Hidróxido de potasio (KOH) 10% Colorantes Gelatina glicerinada

Metodología: En portaobjetos 1.

Si el material está fresco (recién colectado) previamente debe ser deshidratado con alcohol absoluto.

2.

Disecar el material polinífero sobre un portaobjetos.

3.

Agregar una o dos gotas de KOH 10%.

4.

Flamear hasta hervir en llama no oxidante de mechero de alcohol. 376

5.

Agregar una gota de colorante.

6.

Flamear nuevamente en la llama de mechero de alcohol.

7.

Montar las placas en gelatina glicerinada (ver Montaje de las placas).

Metodología: En tubo de centrífuga 1.

Si el material está fresco (recién colectado) previamente debe ser deshidratado con alcohol absoluto

2.

Poner el material polinífero en tubos de centrífuga

3.

Agregar 5 ml de KOH 10%

4.

Hervir la mezcla durante 5 minutos o dejar en frío durante 24 o 48 horas

5.

Centrifugar y decantar el sobrenadante

6.

Lavar dos o tres veces con agua destilada

7.

Montar las placas en gelatina glicerinada (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

377

ANÁLISIS DE FITOLITOS DE PLANTAS ACTUALES

Al igual que en palinología, en los trabajos fitolitológicos existen dos métodos de adquirir material para estudio: el primero es en fresco, realizado directamente de las plantas en el campo, huertas o jardines. Al colectar el material también se deben colectar ejemplares de la planta para su posterior identificación y herborización. El segundo método es en seco o sea, toma de partes de exsicados (ejemplares de herbario). En ambos casos el material se colecciona en sobres de papel con su correspondiente identificación o número de exsicado para la identificación correcta del espécimen. Tanto en la etapa de colección como en las de preparación del material, se debe tener mucha precaución para evitar contaminación de una especie o muestra con otra. Según Pearsall (1978), en esta técnica se toman fragmentos pequeños del material a analizar, por ejemplo de una hoja madura, tallos, flores o frutos. La muestra se pone en glicerol por varios días. Esto hace que se vuelva lo suficientemente suave de modo que la epidermis superior y el tejido interno de la hoja se puedan separar fácilmente con la ayuda de una cuchilla de afeitar, dejando la epidermis inferior y al tejido vascular intactos. Así los cuerpos celulares de los fitolitos que se encuentran a través de las nervaduras quedan visibles y se pueden medir y contar. Posteriormente los cortes se montan en bálsamo de Canadá.

Extracción de fitolitos de plantas actuales. (Piperno 1988, modificado por Martínez 2004) 1.

Tomar una muestra de la penúltima hoja (la que se encuentra inmediatamente por debajo de la terminal) en una innovación estéril (retoño), siguiendo la metodología de Zucol (2001). Se recomienda tomar al menos tres muestras por especie a estudiar. Flórez & Parra (1999a) utilizan las hojas más maduras y de mayor tamaño. 378

2.

Lavar las muestras con agua destilada, con el fin de retirar las posibles contaminaciones que se encuentren sobre las superficies (impurezas y adherencias) como tierra, excrementos orgánicos y otras partículas que pudieran introducir artificios en las observaciones.

3.

Cortar las muestras en trozos de 1 cm aproximadamente.

4.

Llevar las muestras a una porcelana, taparlas con papel de aluminio y ponerlas en una mufla graduada a 500 a 600 ºC durante una hora, hasta obtener

cenizas

(Salgado-Labouriau,

1983).

Las

muestras

deben

permanecer tapadas en la mufla para evitar contaminaciones. 5.

Echar las cenizas en un tubo de centrífuga graduado, de 10 ml y adicionarles 3 a 5 ml de peróxido de hidrógeno (H 2O2) al 30%. Esta digestión se debe realizar en un horno a 40ºC, durante 8 a 12 horas.

6.

Centrifugar por cinco (5) minutos y decantar el sobrenadante.

7.

Agregar 3 ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado para asegurar la eliminación de todo el material orgánico.

8.

Centrifugar por cinco (5) minutos y decantar el sobrenadante.

9.

Lavar tres veces con agua destilada más 3 ó 4 gotas de alcohol etílico para romper la tensión superficial del agua y hacer que los fitolitos se precipiten.

10. Centrifugar y decantar el sobrenadante después de cada lavado. Si se quiere conservar el material, preservarlo en alcohol etílico al 70% hasta cuando se desee continuar con la preparación y montaje. 11. Agregar al precipitado 3 ml de ácido clorhídrico (HCl) al 10%. Llevar esta solución a baño de maría por 10 minutos hasta que cese la reacción. Con esto se eliminan los carbonatos. 12. Lavar con 5 ml de agua destilada, centrifugar y descartar el sobrenadante. 13. Agregar al precipitado 3 ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado para asegurar la eliminación de todo el material orgánico. 14. Lavar y decantar el sobrenadante.

379

15. Lavar el precipitado con 3 a 5 ml de alcohol etílico (CH3-CH2-OH) o con acetona (CH3-C=O-CH3). 16. Llevar el precipitado a un volumen de 2 ml en agua destilada alcoholizada. Agitar esta solución y con la ayuda de una pipeta calibrada, tomar una alícuota determinada (ul) de la solución con fitolitos.

NOTAS. Después del paso 12 se puede realizar una flotación del precipitado por medio de un líquido cuya densidad sea de 2.3 g/cm3, como el tetrabromato. Este paso es opcional para ser aplicado en algunas muestras con el fin de separar, por densidad, los fitolitos del resto de materiales.

Para el estudio de los fitolitos articulados, se tratan las muestras con peróxido de hidrógeno al 30%, con pequeños intervalos de calentamiento para evitar daños en las estructuras.

Montaje de las muestras 1.

Depositar la muestra tomada en un cubreobjetos limpio y desengrasado y distribuirla por toda el área de este.

2.

Poner el preparado sobre una placa de calentamiento para secar la muestra.

3.

Al mismo tiempo, sobre un portaobjetos limpio y desengrasado poner una gota de pegante, el cual puede ser Naphrax 1.74; Bálsamo de Canadá 1.54 o entelan. Debe utilizarse uno de estos pegantes ya que los fitolitos tienen un índice de refracción de 1.48, por lo cual exigen uno de esos medios para poder observarlos al microscopio.

4.

Poner sobre el pegante el cubreobjetos con la muestra ya seca.

5.

Rotular con el nombre de la especie, colector y número de colección.

6.

Completar el secado en una estufa a 25ºC.

7.

Observar el micropreparado bajo un microscopio de luz de buena resolución o un petrográfico.

380

Análisis de los micropreparados con fitolitos de plantas actuales

Después del montaje en los portaobjetos, para la identificación de los fitolitos, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X y se procede a la búsqueda de los fitolitos. Para la descripción de los fitolitos encontrados en la muestra en cada placa se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. La observación se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa la observación de los fitolitos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces una misma estructura.

Por ser de uso más generalizado, se recomienda hacer las descripciones de los elementos fitolíticos actuales, de acuerdo a la terminología de Zucol (2001), la cual está basada en 49 elementos morfológicos agrupados como formas articuladas (cuando el fitolito está formado por más de un elemento anatómico) y por formas aisladas.

381

EXTRACCIÓN DE FITOLITOS DEL SUELO (Modificación de la metodología de Piperno 1988)

Las muestras de microfósiles para análisis de alta resolución se deben tomar a intervalos de 1 cm de grosor, a lo largo de todo el núcleo, y a intervalos aleatorios de 5 o 10 cm de grosor en sitios arqueológicos. Estos criterios de distancias se basan fundamentalmente en el interés de cada investigador o según el tipo de investigación.

Trabajo de campo y preparación de la muestra de sedimento (Flórez y Parra 1999b) 1.

Hacer la limpieza superficial del talud que contiene el perfil tipo. La limpieza se efectúa retirando los primeros 5 cm de suelo y la vegetación que se encuentra por encima de este. Demarcar un área cuadrada de 20 cm para enterrar un muestreador cilíndrico de aluminio de 30 cm de largo y 3 pulgadas de diámetro.

2.

Enterrar cada cilindro verticalmente en el suelo. Sacar la muestra y sellar los cilindros con parafina en ambos extremos, marcarlos y guardarlos en bolsas plásticas para evitar pérdida de humedad, hasta su procesamiento en el laboratorio.

Trabajo de laboratorio 1.

Cortar longitudinalmente los cilindros en dos mitades, con el objeto de ser descritos y submuestreados.

2.

Homogenizar y cuartear cada horizonte hasta obtener finalmente 1 ml para tratamiento químico. Para medir esta cantidad, con la ayuda de una espátula se echa suelo a un tubo de centrífuga plástico previamente marcado a 1 ml. 382

3.

Agregar a la muestra un poco de detergente en polvo y disolverla en 200 ml de agua destilada. Con esto se dispersa el contenido orgánico como semillas, tejidos, entre otros

4.

Dejar reposar y luego decantar el sobrenadante a través de un tamiz de 200 um.

5.

Repetir este lavado varias veces hasta que el líquido quede lo más claro posible.

6.

Echar el precipitado en un tubo de ensayo de 10 ml y agregarle 3 ml de peróxido de hidrógeno al 30% y llevarlo a una placa de calentamiento hasta hervir durante 8 a 12 horas.

7.

Dispersar nuevamente el precipitado con una solución de bicarbonato de sodio al 5%, durante 3 a 4 horas. Centrifugar y descartar el sobrenadante.

8.

Lavar el precipitado con agua destilada. Centrifugar y descartar el sobrenadante.

9.

Adicionarle al precipitado 3 ml de ácido clorhídrico al 10% y llevarla a baño maría durante 10 minutos, hasta que cese la reacción. Con esto se eliminan los carbonatos.

10.

Lavar, centrifugar y decantar el sobrenadante.

11.

Adicionar al precipitado 3 ml de ácido nítrico concentrado para asegurar la eliminación de todo el material orgánico.

12.

Lavar, centrifugar y decantar el sobrenadante.

13.

Lavar el precipitado con 3 o 5 ml de alcohol etílico o acetona para secar y eliminar los residuos de agua.

14.

Agregar al precipitado 2 ml de agua destilada alcoholizada y agitar esta solución en un Vortex y tomar con una pipeta calibrada una alícuota determinada (ul) de la solución.

Montaje de las placas 1.

Depositar la muestra tomada en un cubreobjetos limpio y desengrasado y distribuirla por toda el área de este. 383

2.

Poner el preparado sobre una placa de calentamiento para secar la muestra.

3.

Al mismo tiempo, sobre un portaobjetos limpio y desengrasado poner una gota de pegante, el cual puede ser Naphrax 1.74; Bálsamo de Canadá 1.54 o entelan. Debe utilizarse uno de estos pegantes ya que los fitolitos tienen un índice de refracción de 1.48, por lo cual exigen uno de esos medios para poder observarlos al microscopio.

4.

Poner sobre el pegante el cubreobjetos con la muestra ya seca.

5.

Observar el micropreparado bajo un microscopio de luz de buena resolución o un petrográfico.

ANÁLISIS DE LOS MICROPREPARADOS CON FITOLITOS DEL SUELO Después del montaje en los portaobjetos, para el conteo e identificación de los fitolitos del suelo, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X y se procede a la búsqueda de los fitolitos. Para el análisis cuantitativo la frecuencia de los tipos de fitolitos encontrados en la muestra, se calcula contando por lo menos 500 estructuras, al menos en tres placas por muestra. Para esto en cada placa se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. El conteo se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con el conteo de los fitolitos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces una misma estructura.

Se deben contar todos los fitolitos de la placa, en caso de completar las 500 estructuras antes de finalizar los 11 recorridos, se continuará contando, así que muchas veces serán contados más de 500 fitolitos por muestra. Cuando sean muy escasos los fitolitos, son necesarias más de tres placas para contar el mínimo de 500 estructuras, teniéndose presente que se debe completar el conteo 384

hasta terminar la placa en la cual se complete el número indicado. Si se utiliza más de tres portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes.

Con estos datos se pueden realizar análisis de agrupamientos y componentes principales, entre otros y, en caso de análisis de fitolitos obtenidos del suelo se elaboran los diagramas en el programa Tilia, Tiliagraph (u otro que se disponga) y se construyen los grupos mediante el programa Connis (o su equivalente para otros programas), el cual utiliza varias distancias para su análisis.

Por ser de uso más generalizado, se recomienda hacer las descripciones de los elementos fitolíticos, de acuerdo a la terminología de Zucol (2001), la cual está basada en 49 elementos morfológicos agrupados como formas articuladas (cuando el fitolito está formado por más de un elemento anatómico) y por formas aisladas.

Las abundancias relativas de las clases de fitolitos son consideradas según la metodología Zucol (1996, 2001; en Martínez, 2004), en clases de frecuencias distribuidas en una escala que abarca desde la ausencia de los fitolitos de una determinada clase morfológica, a su presencia en forma rara, escasa, frecuente o muy frecuente. Los límites de dichas clases se obtienen teniendo en cuenta que:

1.

La ausencia estará representada por el 0% de frecuencia relativa.

2.

El valor máximo de la escala (D) es igual al valor de la clase morfológica que posee la mayor frecuencia relativa de la asociación.

3.

Raros serán considerados a los fitolitos cuyas clases morfológicas poseen valores de frecuencias relativas superiores al 0% y que no superan el limite A, siendo A= 0.1 * D.

385

4.

Escasos serán considerados a los fitolitos cuyas clases morfológicas poseen valores de frecuencias relativas iguales o superiores a A y que no superan el limite B, siendo B = 0.3 * D.

5.

Frecuentes serán considerados a los fitolitos cuyas clases morfológicas poseen valores de frecuencia relativas iguales o superiores a B y que no superan el límite C, siendo C = 0.6 * D.

6.

Muy frecuentes serán considerados a los fitolitos cuyas clases morfológicas poseen valores de frecuencias relativas entre C y D.

386

ANÁLISIS DE GRANOS DE ALMIDON PREPARACIÓN DE GRANOS DE ALMIDÓN ACTUALES

Materiales y equipos Mortero Tubos de centrifuga Lugol Agua destilada Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 x 22 mm Agitador plástico Guantes de látex libres de talco

Metodología: Granos de almidón actuales Los granos de almidón actuales se aíslan con el objetivo de obtener material de referencia para la identificación taxonómica de los gránulos recuperados de contextos arqueológicos. 1.

En un mortero con agua destilada, triturar finamente 5 gramos de la parte de la planta seleccionada para extraer los almidones, ésta puede ser raíz o el mesocarpio de las frutas.

2.

Echa el material triturado en un tubo de centrífuga de 15 ml y terminar de llenarlo con agua destilada. Agitar con varilla de plástico.

3.

Centrifugar a 3000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

4.

Lavar otras dos veces con agua destilada, agitar y centrifugar cada vez a 3000 r.p.m durante 5 minutos, descartando el sobrenadante.

5.

Echar 10 ml de agua destilada al tubo de centrífuga con el precipitado y colorear con dos gotas de solución acuosa de lugol al 10% para colorear ligeramente los gránulos.

6.

Extraer una gota del residuo final, depositarla en un portaobjetos y sellar con gelatina glicerinada, siguiendo la técnica de acetólisis. 387

Descripción morfológica de los granos de almidón actuales Después del montaje en los portaobjetos, para la descripción de los granos de almidón, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X o 100X (inmersión), según el tamaño de los granos de almidón que se desee describir y se procede a la búsqueda de los granos de almidón en las preparaciones. Para esto, en cada portaobjetos se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. Se observan y describen los granos de almidón encontrados en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con las observaciones y descripciones de los granos de almidón encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita describir varias veces un mismo grano de almidón.

Análisis de granos de almidón presentes en muestras arqueológicas Seleccionar los artefactos que se van a someter a la extracción de granos de almidón. Los dos principales criterios de selección son el contexto de procedencia y el tipo de instrumento. El primer criterio es el más importante, dado que se debe tener absoluta seguridad de la procedencia estratigráfica y contextual de los objetos, para que los resultados se puedan correlacionar con el resto del registro arqueológico y aporten información cultural significativa. El segundo criterio depende de la materia prima y el tipo de técnicas aplicadas. En el caso de los artefactos líticos es preferible utilizar artefactos de grano grueso, que permiten una mejor intrusión de los granos de almidón en la estructura interna de la roca. Obviamente, los mejores artefactos son los que por su morfología muy probablemente han sido utilizados en el procesamiento de plantas, como son las manos y las placas de molienda, también llamadas molinos. Las rocas de grano muy fino como el chert o el cuarzo y los instrumentos con bordes pulidos dificultan la impregnación de los granos de almidón en los bordes de uso, debido a los obstáculos para que éstos permanezcan en las superficies de trabajo. En el caso 388

de la cerámica sucede lo mismo, los recipientes con paredes internas intensamente bruñidas dificultan la conservación de los granos de almidón.

Todos los utensilios se deben limpiar cuidadosamente con cloróx, para asegurar máxima limpieza y evitar la contaminación de las muestras.

Materiales y equipos Mortero Tubos de centrifuga Lugol Agua destilada Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 x 22 mm Agitador plástico Guantes de látex libres de talco Recipiente contenedor Tubos de laboratorio o frascos de muestras de análisis Guantes de látex libres de talco Hipoclorito de sodio comercial 5,25% (Clorox o lejía)

Metodología: Granos de almidón presentes en muestras arqueológicas 1.

Usando guantes de látex, recolectar sin lavar, los artefactos arqueológicos y guardarlos en bolsas de plástico con su correspondiente etiqueta, con el fin de evitar la destrucción de los gránulos de almidón. El uso de los guantes de látex evita la contaminación de las muestras.

2.

En el laboratorio impregnar con agua destilada el sector de los artefactos que va a ser procesada.

3.

Con un punzón, previamente esterilizado con clórox, raspar la parte o el borde del artefacto con el fin de extraer las partículas conservadas en la parte más superficial de los artefactos. El raspado puede durar varios segundos, por lo cual se recomienda lavar continua y levemente el material 389

con agua destilada para que los almidones lleguen hasta al recipiente recibidor. Si se van a extraer granos de almidón de piezas dentales, por su reducido tamaño, éstas se sumergen en agua destilada y se procede a raspar la pieza dental con un instrumento de odontología; posteriormente se deposita el agua destilada en un tubo de laboratorio. 4.

Echar el agua destilada con los almidones y otras particulares minerales en tubos o frascos de plásticos. Estos se deben sellar muy bien y etiquetar inmediatamente para no perder la procedencia de las muestras. La etiqueta de los tubos de laboratorio debe contener la misma información que la etiqueta de los artefactos; por lo general, debe tener el yacimiento, el corte de excavación, el estrato, el nivel y el número consecutivo correspondiente al artefacto.

5.

Echar 5 gramos del material obtenido en un tubo de centrífuga y agregarle 10 ml de agua destilada y agitar con varilla de plástico.

6.

Centrifugar a 3000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

7.

Lavar otras dos veces con agua destilada, agitar y centrifugar cada vez a 3000 r.p.m durante 5 minutos, descartando el sobrenadante.

8.

Extraer una gota del residuo final, depositarla en un portaobjetos y sellar con gelatina glicerinada, siguiendo la técnica de acetólisis.

Análisis de muestras extraídas de artefactos líticos y cerámicos

Materiales y equipos Guantes de látex libres de talco Agua destilada Hexametafosfato de sodio 5% Acido acético glacial Tubos de centrífuga Goteros Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 x 22 mm 390

Beakers Solución de Lugol Agitador plástico

Metodología: Muestras extraídas de artefactos líticos y cerámicos 1.

Echar 5 gramos de la muestra arqueológica en un tubo de centrífuga.

2.

Añadir 10 ml de hexametafosfato de sodio al 5%, (NaPO4)6, homogenizar con varilla de vidrio. El hexametafosfato actua como agente dispersador para separar los granos de almidón, mediante flotación del resto de partículas como arcillas y materiales coloidales, debido a que los granos de almidón tienen una gravedad promedio de 1.5 (Pagan et al. 2005).

3.

Dejar

en

hexametafosfato

duante

30

minutos

para

que

actúe

eficientemente. 4.

Centrifuga a 3000 r.p.m durante 12 minutos. Decantar el sobrenadante en un beaker por si es necesario recuperarlo posteriormente.

5.

Lavar dos veces con 10 ml de agua destilada cada vez, agitando con varilla de plástico y centrifugando a 3000 rpm durante 5 minutos. Echar el sobrenadante en el beaker del paso anterior.

6.

Lavar con 10 ml de ácido acético glacial para eliminar el carbonato de calcio.

7.

Agregar al tubo 10 ml de agua destilada y colorear con 4 gotas de lugol, los granos de almidón adquieren un color ligeramente azul o rosado pálido, lo cual facilita su identificación en las placas. Dejar actuar el lugol por 3 minutos, si se deja más tiempo en lugol los granos adquieren un color muy oscuro que impiden ver el hilum o las capas concéntricas.

8.

Lavar nuevamente con agua destilada.

9.

Montar las placas y sellar siguiendo las técnicas de acetólisis.

391

Análisis de los micropreparados con granos de almidón presentes en muestras arqueológicas Después del montaje en los portaobjetos, para el conteo e identificación de los granos de almidón, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X y

se procede a la búsqueda de los granos de almidón. Para el

análisis cuantitativo la frecuencia de los tipos de granos de almidón encontrados en la muestra, se calcula contando por lo menos 500 granos, al menos en tres placas por muestra. Para esto en cada placa se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. El conteo se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con el conteo de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces un mismo grano.

Se deben contar todos los granos de la placa, en caso de completar los 500 granos de almidón antes de finalizar los 11 recorridos, se continuará contando, así que muchas veces serán contados más de 500 granos por muestra. Cuando sean muy escasos los granos de almidón, son necesarias más de tres placas para contar el mínimo de 500 estructuras, teniéndose presente que se debe completar el conteo hasta terminar la placa en la cual se complete el número indicado. Si se utiliza más de tres portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes.

Preparación del hexametafosfato 5% Disolver 50 g de (NaPO4)6 en 500 ml de agua destilada en un recipiente de 1 litro. Agitar hasta disolver completamente. Posteriormente, se añade agua destilada hasta completar un litro, se agita nuevamente y se deja reposar unas 10 horas antes de su uso. La mezcla debe permanecer a una temperatura aproximadamente

de

20°C

(http://mct.dgf.uchile.cl/AREAS/sed_mod2.htm). 392

ANÁLISIS DE POLEN FÓSIL (Método clásico)

Materiales y equipos Muestras de sedimento Microscopio compuesto Mortero y pistilo de maceración Centrífuga Campana de extracción de gases Baño maría Cernidor con mallas de 100-200 μm Plancha de secado Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Beakers plásticos de 100 ml Varillas de plástico Rótulos autoadherentes Tubos plásticos de centrífuga, graduados, de 15 ml HCl puro HCl 10% HCl 50% HF 40% KOH 10% Parafina o sellador seleccionado para el montaje de las placas Gelatina glicerinada Agua destilada

Metodología 1.

Tomar 5 g de muestra de sedimento.

393

2.

Echar la muestra en un beaker con agua y pasarla luego por un cernidor con mallas de 100 a 200 μm según el estudio deseado. Con esto se limpia la muestra de contaminantes como tierra, lodo, residuos de material orgánico o inorgánico, etc.

3.

Lavar el cernidor con agua corriente recibiendo el líquido en el beaker.

4.

Pasar la suspensión a tubos plásticos de centrífuga.

5.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

6.

Agregar a cada tubo HCl puro o HCl 10% en frío para eliminar los carbonatos de calcio. Agregar el HCl poco a poco hasta completar la reacción, lo cual está indicado por finalización de la efervescencia. Este paso debe ser realizado en cabina extractora de gases.

7.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

8.

Lavar dos veces con agua destilada.

9.

Agregar HF 40% por 10 minutos para eliminar la sílice (SiO2). Debe usar recipiente plástico en baño frío dentro de una campana de extracción de gases. El volumen de HF debe ser dos o tres veces mayor que el de la muestra. El HF debe manejarse con sumo cuidado pues causa ulceraciones al contacto con la piel. Igualmente, debe evitarse ponerlo en contacto con vidrio, ya que lo disuelve. Este paso debe ser realizado en cabina extractora de gases.

10.

Agitar frecuentemente con varilla de plástico.

11.

Centrifugar en tubos plásticos y decantar el sobrenadante.

12.

Lavar dos o tres veces con agua destilada, cada vez centrifugando a 3.000 r.p.m. y decantando el sobrenadante.

13.

Agregar HCl 50% y poner la mezcla en baño maría hasta hervir. Con este tratamiento se elimina la sílice coloidal. Este paso debe ser realizado en cabina extractora de gases.

14.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante. Repetir este paso tres o cuatro veces, sin lavar con agua entre cada repetición. 394

15.

Lavar tres veces con agua destilada caliente, centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar.

16.

Agregar 5 ml de KOH 10% y dejar en esta solución durante 10 minutos como mínimo. Este paso debe ser realizado en cabina extractora de gases.

17.

Lavar varias veces con agua destilada.

18.

Montar las placas como se indicó.

OBSERVACIÓN. Para aclarar el polen se puede realizar acetólisis del material antes del montaje de las placas.

Análisis de los micropreparados con polen fósil Después del montaje en los portaobjetos, para el conteo e identificación de los granos de polen fósiles, se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X y

se procede a la búsqueda de los granos de polen. Para el

análisis cuantitativo la frecuencia de los tipos de polínicos encontrados en la muestra, se calcula contando por lo menos 500 granos, al menos en tres placas por muestra. Para esto en cada placa se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. El conteo se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con el conteo de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces un mismo grano. Se deben contar todos los granos de la placa, en caso de completar los 500 granos de polen antes de finalizar los 11 recorridos, se continuará contando, así que muchas veces serán contados más de 500 granos de polen por muestra. Cuando sean muy escasos los granos de polen, son necesarias más de tres placas para contar el mínimo de 500 estructuras, teniéndose presente que se debe completar el conteo hasta terminar la placa en la cual se complete el número

395

indicado. Si se utiliza más de tres portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes. El número de placas a examinar para cada muestra se define a través de una curva de estabilización de especies, la cual se hace graficando el número de especies encontradas contra el número de placas examinadas. Para el análisis cualitativo la lista total de especies crece con cada una de las placas estudiadas en forma sucesiva. Al principio el número de especies crece con rapidez, pero luego el crecimiento se hace cada vez más lento. Cuando la curva asciende tiende a estabilizarse y se detiene el conteo. Así se garantiza que la posibilidad de encontrar un nuevo taxón sea muy pequeña (Lozano, 2000). La identificación de los granos de polen fósiles se hace utilizando catálogos de referencia o literatura especializada como van der Hammen (1954), Herrera & Urrego (1996), Roubick & Moreno (1991), Hooghiemstra (1984), Salomons (1989), trabajos locales publicados en varios medios, entre otros. En caso de no contar con trabajos para identificación polínica deben hacerse placas de referencia con la flora local o de estudio, mediante el muestreo de material fresco o especímenes de herbario de la región.

Con estos datos se elaboran los diagramas polínicos así: del total de palinomorfos contados e identificados en cada período de muestreo, se obtiene la densidad relativa de cada tipo polínico, taxón o agrupamiento respecto al total de granos contados por muestra. Posteriormente, con la ayuda del programa Tilia Graph (u otro que se disponga) se grafica el comportamiento de la densidad relativa de cada uno. Para el análisis de agrupamiento y ordenación de los grupos, se utiliza, el programa Coniss, el cual viene con el programa Tilia y utiliza como método la distancia cuadrada euclidiana (o su equivalente para otros programas) para su análisis. Para hacer estos diagramas polínicos, existen otros programas, algunos se pueden bajar gratuitamente de internet, cada uno con su metodología apropiada y con las ventajas y desventajas propias. 396

ANÁLISIS DE POLEN FÓSIL (Método para muestras de turba o sedimentos con poco material mineral)

Materiales y equipos Muestras de sedimento Microscopio compuesto Centrífuga Campana de extracción de gases Baño maría Cernidor con mallas de 100-200 μm Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Beakers plásticos de 100 ml Varillas de plástico Tubos plásticos de centrífuga, graduados, de 15 ml KOH 10% Reactivos para acetólisis de Erdtman Gelatina glicerinada Agua destilada

Metodología 1.

Antes del muestreo limpiar la zona elegida.

2.

Tomar 5 g de muestra de sedimento, teniendo la precaución de que todo el material y equipo esté completamente limpio.

3.

Si la muestra está húmeda y no se procesará el mismo día, agregarle unas gotas de alcohol etílico para evitar el crecimiento de microorganismos que ataquen el polen.

4.

Rotular las muestras con marcador permanente o preferiblemente con lápiz, con información del lugar de muestreo, profundidad, fecha, recolector y

397

cualquier tipo de observaciones adicionales. Se recomienda hacer un registro fotográfico del lugar. 5.

En el laboratorio, echar la muestra en un beaker con agua y pasarla luego por un cernidor con mallas de 100 a 200 μm según el estudio deseado y con el fin de eliminar la mayor cantidad posible de impurezas (raíces, piedras, suelo, etc.)

6.

Lavar el cernidor con agua corriente recibiendo el líquido en el beaker.

7.

Pasar la suspensión a tubos plásticos de centrífuga.

8.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

9.

Agregar a cada tubo 10 ml de KOH 10%. Con la ayuda de un agitador homogenice la mezcla.

10. Tapar cada tubo con papel aluminio y llevarlo a baño de maría, a 70ºC, durante 10 minutos. 11. Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante. 12. Lavar dos veces con agua destilada para retirar el KOH. 13. Lavar cada tubo con 10 ml de alcohol absoluto, agitando con la varilla de plástico. 14. Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante. 15. Lavar cada tubo con 10 ml de ácido acético glacial para retirar el agua y el alcohol restantes. 16. Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante. 17. Adicionar al tubo de centrífuga, 5 ml de solución de acetólisis (anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado en proporción de 9:1) y continuar con la acetólisis de Erdtman hasta montar las placas ((ver 4. Acetólisis de Erdtman).

398

ANÁLISIS DE POLEN FÓSIL (Método para muestras de turba o sedimentos con bastante material mineral)

Materiales y equipos Muestras de sedimento Microscopio compuesto Centrífuga Campana de extracción de gases Baño maría Cernidor con mallas de 100-200 μm Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Beakers plásticos de 100 ml Varillas de plástico Tubos plásticos de centrífuga, graduados, de 15 ml KOH 10% Reactivos para acetólisis de Erdtman Gelatina glicerinada Agua destilada

Metodología 1.

Tomar 5 g de muestra de sedimento.

2.

Echar la muestra en un beaker con agua y pasarla luego por un cernidor con mallas de 100 a 200 μm según el estudio deseado.

3.

Lavar el cernidor con agua corriente recibiendo el líquido en el beaker.

4.

Pasar la suspensión a tubos plásticos de centrífuga.

5.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

6.

Agregar a cada tubo 10 ml de KOH 10%. Con la ayuda de un agitador homogenice la mezcla.

7.

Tapar cada tubo con papel aluminio y llevarlo a baño de maría, a 70ºC, durante 10 minutos. 399

8.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

9.

Lavar dos veces con agua destilada para retirar el KOH.

10.

Lavar cada tubo con 10 ml de alcohol absoluto, agitando con la varilla de plástico.

11.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

12.

Lavar cada tubo con 10 ml de ácido acético glacial para retirar el agua y el alcohol restantes.

13.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

14.

Adicionar al tubo de centrífuga, 5 ml de solución de acetólisis (anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado en proporción de 9:1) y continuar con la acetólisis de Erdtman.

15.

Centrifugar la mezcla, todavía caliente, durante 3 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte de la solución sobrenadante. La decantación debe hacerse dentro de la campana de extracción de gases, en recipientes totalmente secos, y cuidadosamente, por los peligros que ofrece su mal manejo.

16.

Lavar el precipitado (polen con parte del tejido vegetal particulado) con 10 ml de agua destilada más 3 gotas de alcohol etílico, con agitación del material por 2 minutos. El alcohol hace disminuir la tensión superficial del agua permitiendo el hundimiento de los granos de polen eventualmente flotantes. Este lavado debe hacerse con el tubo dirigido en sentido opuesto al cuerpo de quien está trabajando, pues la reacción puede ser explosiva y causarle quemaduras.

17.

Centrifugar esta mezcla por 5 minutos a 2.000 r.p.m., con posterior descarte del sobrenadante.

18.

Lavar dos veces con 10 ml de agua destilada pura, agitando el material durante 2 minutos. En este paso, si el material no está muy limpio, es conveniente tamizarlo para retirar el exceso de material no degradado.

19.

Centrifugar después de cada lavado, durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante. 400

20.

Agregar a cada tubo 5 ml de Bromoformo densidad 2; o Cloruro de zinc densidad 2. Con esto se separan por gradiente los microfósiles (incluidos granos de polen y esporas).

21.

Agitar con varilla plástica y agregar otros 5 ml de Bromoformo densidad2; o de Cloruro de zinc

22.

Centrifugar durante 20 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

23.

Lavar dos veces con 10 ml de alcohol absoluto agitando con la varilla.

24.

Centrifugar después de cada lavado, durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

25.

Agregar a cada tubo 10 ml de solución acuosa de gicerina 50% y montar las placas de la forma ya indicada (ver 4. Acetólisis de Erdtman).

401

ANÁLISIS DE SEDIMENTOS MARINOS (Primera técnica)

Materiales y equipos Muestras de sedimento Microscopio compuesto Centrífuga Campana de extracción de gases Baño maría Cernidor con mallas de 100-200 μm Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Beakers plásticos de 100 ml Varillas (agitadores) de plástico Tubos plásticos de centrífuga, graduados, de 15 ml Lápices o portaminas de grfito de 2 mm de diámetro Rótulos autoadherentes adhesivos KOH 10% Reactivos para acetólisis de Erdtman Gelatina glicerinada Agua destilada

Metodología 1.

Tomar 5 g de muestra de sedimento.

2.

Echar la muestra en un beaker plástico con agua, triturarla y pasarla luego por un cernidor con mallas de 100 a 200 μm según el estudio deseado. Algunos investigadores proponen la separación de los microfósiles, según el tamaño, utilizando cernidores con mallas número 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 y 200.

402

3.

Lavar el cernidor con agua corriente recibiendo el líquido en el beaker plástico.

4.

Dejar decantar la muestra y adicionar HCl puro lentamente hasta que cese la efervescencia.

5.

Agitar con varilla de plástico y pasar la suspensión a tubos plásticos de centrífuga.

6.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

7.

Lavar dos veces con agua destilada, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

8.

Lavar tres veces con HCl puro, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

9.

Lavar dos veces con agua destilada, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

10.

Agregar a cada tubo 10 ml de ácido fluorhídrico puro (HF). Con la ayuda de un agitador plástico homogenice la mezcla cada vez. Recuerde el cuidado al agregar el HF, pues puede ser una reacción explosiva.

11.

Dejar enfriar, agitar y tapar cada tubo con papel aluminio y llevarlo a la cámara extractora de gases durante 2 a 3 días, agitando de vez en cuando.

12.

Después de este período centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

13.

Lavar dos veces con agua destilada, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

14.

Lavar una vez cada tubo con 10 ml de ácido acético glacial.

15.

Adicionar al tubo de centrífuga, 5 ml de solución de acetólisis (anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado en proporción de 9:1).

16.

Centrifugar la mezcla, todavía caliente, durante 3 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte de la solución sobrenadante. La decantación debe hacerse dentro de la campana de extracción de gases, en recipientes totalmente secos, y cuidadosamente, por los peligros que ofrece su mal manejo. 403

17.

Lavar el precipitado con 10 ml de agua destilada más 3 gotas de alcohol etílico, con agitación del material por 2 minutos. El alcohol hace disminuir la tensión superficial del agua permitiendo el hundimiento de los granos de polen eventualmente flotantes.

18.

Centrifugar esta mezcla por 5 minutos a 2.000 r.p.m., con posterior descarte del sobrenadante.

19.

Lavar dos veces con 10 ml de agua destilada pura, agitando el material durante 2 minutos. En este paso, si el material no está muy limpio, es conveniente tamizarlo para retirar el exceso de material no degradado.

20.

Mantener el residuo en suspensión acuosa dentro de un generador de ultrasonido durante 5 a 10 minutos, dependiendo de la existencia de grumos y de la resistencia de los granos de polen.

21.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

22.

Lavar tres veces con 10 ml de alcohol absoluto.

23.

Centrifugar cada vez durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

24.

Dejar los tubos en un desecador de vidrio (o en espacio limpio de contaminantes aéreos) hasta que el alcohol se evapore completamente.

25.

Agregar a cada tubo 5 ml de glicerina bidestilada pura.

26.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante. Sin enderezar el tubo, ponerlo boca abajo sobre un beacker pequeño (20 o 50 ml) al cual previamente se le puso en el fondo papel absorbente, papel higiénico o toallas de papel. De esta forma el material queda en condiciones de montaje.

27.

Montar las placas permanentes de la forma indicada (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

404

ANÁLISIS DE SEDIMENTOS MARINOS (Segunda técnica)

Materiales y equipos Muestras de sedimento Microscopio compuesto Centrífuga Campana de extracción de gases Baño maría Cernidor con mallas de 100-200 μm Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Beakers plásticos de 100 ml Varillas de plástico Tubos plásticos de centrífuga, graduados, de 15 ml KOH 10% Reactivos para acetólisis de Erdtman Gelatina glicerinada Agua destilada

Metodología 1.

Tomar 5 g de muestra de sedimento.

2.

Echar la muestra en un beaker de vidrio de 100 ml.

3.

Agregar 40 ml de pirofosfato de sodio (Na4P207) 10% ó 40 ml de ácido clorhídrico (HCl) 20% para muestras calcáreas.

4.

Tapar con papel aluminio y dejar reposar la muestra durante 12 a 48 horas.

5.

Agitar y pasar la suspensión a tubos de centrífuga plásticos (si no se cuenta con centrífuga y tubos para el volumen total de la muestra).

405

6.

Lavar varias veces el beaker y echar el contenido a los tubos de centrífuga, hasta estar seguro de verter todo el contenido de sedimento a los tubos de centrífuga.

7.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

8.

Lavar dos veces con agua destilada, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

9.

Agregar 10 ml de pirofosfato de sodio 10% y llevar los tubos a baño de maría por 20 minutos.

10.

Centrifugar vez durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. con posterior descarte del sobrenadante.

11.

Lavar con 10 ml de pirofosfato de sodio 10%.

12.

Lavar varias veces con agua destilada, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

13.

Lavar dos veces con alcohol absoluto puro, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

14.

Adicionar una mezcla de alcohol-bromoformo densidad 2,0 – 2,1 y llevar a ultrasonido si es necesario.

15.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar la fracción orgánica en tubos de vidrio de centrífuga a los que previamente se les adiciona 10 ml de alcohol absoluto puro.

16.

Lavar dos veces con alcohol absoluto puro, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

17.

Agregar a cada tubo 3ml de solución de safranina 0,1% durante 5 minutos.

18.

Lavar dos veces con agua destilada, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

19.

Lavar dos veces con alcohol absoluto puro, centrifugando y descartando el sobrenadante cada vez.

20.

Dejar los tubos en un desecador de vidrio (o en espacio limpio de contaminantes aéreos) hasta que el alcohol se evapore completamente. 406

21.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante. Sin enderezar el tubo, ponerlo boca abajo sobre un beacker pequeño (20 o 50 ml) al cual previamente se le puso en el fondo papel absorbente, papel higiénico o toallas de papel.

22.

Montar las placas permanentes de la forma indicada (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

OBSERVACIÓN El pirofosfato de sodio debe mantenerse caliente para evitar que se cristalice.

407

1.4.2. PREPARACION DE MUESTRAS FORAMINIFEROS

1.

Manejo de las muestras, Recepción, Listados. Empaque, Etiquetado etc.

2.

Lavado de las muestras (H2O) para eliminar contaminantes.

3.

Secado de muestras en tazas metálicas.

4.

Cubrir la muestra con Detergente industrial no enzimático. Separar constituyentes de la muestra.

5.

Lavado sobre tamiz malla 200.

6.

Secado de la muestra

7.

“Picking”, separación manual de los microfósiles por tamaños utilizando tamices número 20,40,60,80, 100, 120, 140 y fondo.

8.

Preparación de placa de estudio.

9.

Análisis bajo la lupa binocular.

10. Material Utilizado para preparaciones micropaleontológicas.

Equipos y materiales Ultrasonido Recipientes resistentes al calor Tamices malla standar de 8inch Estufa gas tipo cocina Lupa binocular con zoom hasta 400 aumentos Juego de tamices malla standar de 3 ¼ pulgadas con apertura de10 micrones hasta 200 micrones Bandejas standar para Picking Cámara digital de 12.5 pixels Mortero y pistilo para desagregar Peroxido Jabón no enzimático Cuaterna Soda cáustica Azul de metileno 408

Nafta (kerosene o varsol) Xileno de inmersión Goma tragacante al formaldehído Brochas de cerda Pinceles de marta Placas portaforaminíferos Bolsas plásticas Rótulos autoadherentes Marcadores

Las preparaciones Palinológicas (placas) se analizan utilizando un fotomicroscopio de luz transmitida, el cual debe contar con oculares de 15x y objetivos de 100x, 40x, 20x, 10x y 4x.

Las placas de foraminíferos son analizadas con la ayuda de un microscopio binocular de luz directa, el cual debe contar con oculares de 10x, 20x y 30 x y un zoom que vaya de 0.67 a 8.5.

409

ANÁLISIS DE LA LLUVIA POLÍNICA

La técnica de análisis palinológico de la lluvia polínica es muy parecida a la técnica de análisis palinológico de los sedimentos. Encierra dos pasos principales: la toma de la muestra en el campo y el trabajo en el laboratorio. En la toma de las muestras se debe tener mucha precaución para evitar contaminación, el material recogido debe manipularse con pinzas y espátulas limpias, indicar el lugar de recolección, condiciones y la forma de muestreo. El lugar de toma de las muestras debe escogerse de tal manera que se obtenga una representación significativa de los elementos vegetales de la zona y se evite hasta el máximo el polen proveniente de otras regiones. Los muestreos deben hacerse al menos durante un año, cada semana o, preferiblemente, cada mes y tomar muestras de las especies en florecimiento para obtener material polínico de comparación.

El muestreo, arbitrariamente, debe hacerse por lo menos en tres sitios diferente, a 10 metros de separación entre cada uno. La forma de muestreo puede ser hojarasca, superficies de briófitos, turberas o hacer la colecta en envases de vidrio (frascos, beakers o erlenmeyer) de un litro de capacidad y un diámetro igual o superior a 8 cm (los envases deben ser iguales para cada una de las tres estaciones de muestreo), en cada envase de vidrio se echan 25 ml de glicerina bidestilada para evitar el desecamiento del material depositado y se deben cubrir con gasa para prevenir la entrada de insectos y hojarasca.

Una vez seleccionados los sitios de muestreo, se recolectan 10 gramos del sustrato (partes superiores de los briófitos que no estén en estado de reproducción), hojarasca, turbera, o se limpia la superficie del suelo con un cuchillo y se corta un pedazo de suelo superficial o se ponen los envases de vidrio a una altura de 1,5 m arriba del suelo, la hojarasca que se deposita en la gasa debe ser lavada con agua destilada la cual se recibe en el envase.

410

Para tomas de muestras mensuales deben usarse frascos con glicerina pura. En el laboratorio se centrifuga y descarta la glicerina. Se agrega ácido acético al residuo y luego se hace acetólisis.

NOTA. En aeropalinología se debe trabajar en estrecha asociación con factores climáticos y geográficos, elaborando pronósticos para cada región en particular.

Materiales y equipos Frascos de vidrio de 1000 ml de capacidad y al menos 8 cm de diámetro 10 gramos de muestras del sustrato o 10 ml del contenido de los envases colectores Microscopio compuesto Centrífuga Campana de extracción de gases Baño maría Cernidor con mallas de 100-200 μm Gasa Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 × 22 mm Beakers de 500 ml Varillas de vidrio o plástico (agitadores) Tubos de vidrio o plásticos de centrífuga, graduados, de 15 ml Ácido acético glacial HCl puro HCl 10% HCl 50% HF 40% KOH 10% Glicerina bidestilada Gelatina glicerinada Agua destilada 411

Solución de acetólisis

Metodología para muestras tomadas de hojarasca, turberas o suelo 1.

Tomar 10 g de muestra de cada uno de los sitios de colección y juntarlos. Revolver para homogenizar las muestras.

2.

Echar la mezcla de las muestras en un beaker con agua 100 ml de agua destilada y pasarla luego por un cernidor con mallas de 100 a 200 μm. Repetir dos veces más, cada vez con agua destilada limpia.

3.

Lavar el cernidor con 100 ml de agua destilada recibiendo el líquido en el beaker.

4.

Pasar la suspensión a tubos plásticos de centrífuga.

5.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante, repetir y juntar el precipitado hasta que la mezcla original quede en un solo tubo de centrífuga.

6.

Agregar al tubo 10 ml de ácido acético glacial.

7.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

8.

Agregar a cada tubo 10 ml de HCl puro o HCl 10% en frío para eliminar los carbonatos de calcio. Agregar el HCl poco a poco hasta completar la reacción, lo cual está indicado por finalización de la efervescencia.

9.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

10.

Lavar dos veces con agua destilada.

11.

Agregar HF 40% por 10 minutos para eliminar la sílice (SiO2). Debe usar recipiente plástico en baño frío dentro de una campana de extracción de gases. El volumen de HF debe ser dos o tres veces mayor que el de la muestra. El HF debe manejarse con sumo cuidado pues causa ulceraciones al contacto con la piel. Igualmente, debe evitarse ponerlo en contacto con vidrio, ya que lo disuelve.

12.

Agitar frecuentemente con varilla de plástico.

13.

Centrifugar en tubos plásticos y decantar el sobrenadante. 412

14.

Lavar dos o tres veces con agua destilada, cada vez centrifugando a 3.000 r.p.m. y decantando el sobrenadante.

15.

Agregar HCl 50% y poner la mezcla en baño maría hasta hervir. Con este tratamiento se elimina la sílice coloidal.

16.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

17.

Lave tres veces con agua destilada caliente, centrifugar a 3.000 r.p.m. y decantar.

18.

Agregar 5 ml de KOH 10% y dejar en esta solución durante 10 minutos como mínimo.

19.

Lavar varias veces con agua destilada.

20.

Montar las placas como se indicó en la acetólisis (ver 4.3.2. Montaje de las placas).

NOTAS: 1.

Si también se quiere tener en cuenta la lluvia de fitolitos se debe eliminar el tratamiento con HF, pues este ácido los disuelve.

2.

Para aclarar el polen se puede realizar acetólisis del material antes del montaje de las placas.

Metodología para muestras tomadas encima de briófito, o con envases de vidrio

1.

Tomar 10 ml de muestra de cada uno de los sitios de colección y juntarlos. Agitar para homogenizar las muestras.

2.

Echar la mezcla de las muestras en un beaker con 100 ml de agua destilada y pasarla luego por un cernidor con mallas de 100 a 200 μm. Repetir dos veces más, cada vez con 100 ml de agua destilada limpia.

3.

Lavar el cernidor con 100 ml de agua destilada recibiendo el líquido en el beaker.

4.

Pasar la suspensión a tubos de centrífuga. 413

5.

Centrifugar a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante, y juntar el precipitado hasta que la mezcla original quede en un solo tubo de centrífuga.

6.

Agregar al tubo 10 ml de ácido acético glacial.

7.

Hacer acetólisis de Erdtman (ver 4. Acetólisis de Erdtman).

Análisis de los micropreparados de lluvia polínica Después del montaje de las placas, para el conteo e identificación de los granos de polen sedimentados en la lluvia polínica se observan los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X y se procede a la búsqueda de los granos de polen.

Para el análisis cuantitativo la frecuencia de los tipos de polínicos

encontrados en la muestra, se calcula contando por lo menos 500 granos, al menos en tres placas por muestra. Para esto en cada placa se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. El conteo se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con el conteo de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces un mismo grano. Se deben contar todos los granos de la placa, en caso de completar los 500 granos de polen antes de finalizar los 11 recorridos, se continuará contando, así que muchas veces serán contados más de 500 granos de polen por muestra. Cuando sean muy escasos los granos de polen, son necesarias más de tres placas para contar el mínimo de 500 estructuras, teniéndose presente que se debe completar el conteo hasta terminar la placa en la cual se complete el número indicado. Si se utiliza más de tres portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes. El número de placas a examinar para cada muestra se define a través de una curva de estabilización de especies, la cual se hace graficando el número de especies encontradas contra el número de placas examinadas. La lista total de especies crece con cada una de las placas estudiadas en forma sucesiva. Al 414

principio el número de especies crece con rapidez, pero luego el crecimiento se hace cada vez más lento. Cuando la curva asciende tiende a estabilizarse y se detiene el conteo. Así se garantiza que la posibilidad de encontrar un nuevo taxón sea muy pequeña (Lozano, 2000). La identificación de los granos de polen se hace utilizando catálogos de referencia o literatura especializada como van der Hammen (1954), Herrera & Urrego (1996), Roubick & Moreno (1991), Hooghiemstra (1984), Salomons (1989), trabajos locales publicados en varios medios, entre otros. En caso de no contar con trabajos para identificación polínica deben hacerse placas de referencia con la flora local. Con estos datos se elaboran los diagramas polínicos así: del total de palinomorfos contados e identificados en cada período de muestreo, se obtiene la densidad relativa de cada tipo polínico, taxón o agrupamiento respecto al total de granos contados por muestra. Posteriormente, con la ayuda del programa Tilia Graph (u otro que se disponga) se grafica el comportamiento de la densidad relativa de cada uno. Para el análisis de agrupamiento y ordenación de los grupos, se utiliza, el programa Coniss, el cual viene con el programa Tilia y utiliza como método la distancia cuadrada euclidiana (o su equivalente para otros programas) para su análisis. Para hacer estos diagramas polínicos, existen otros programas, algunos se pueden bajar gratuitamente de internet, cada uno con su metodología apropiada y con las ventajas y desventajas propias.

Además de los diagramas polínicos es importante comparar la lluvia polínica en períodos de sequía y lluvia, para lo cual es necesario obtener, a través de las estaciones meteorológicas más cercanas a la zona de estudio, datos sobre la precipitación pluviométrica durante los períodos de muestreo (ver Figura 1.56).

415

ANÁLISIS

DE

SEDIMENTACIÓN

POLÍNICA

PARA

ESTUDIOS

DE

AEROPALINOLOGÍA

Materiales y equipos Microscopio compuesto Captador de Durham Captador de Hirst Centrífuga Bisturí Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (laminillas) de 22 x 22 mm Tubos de centrífuga graduados, de 15 ml Éter o acetona Vaselina o gelatina glicerinada coloreada Reactivos para acetólisis de Erdtman

Metodología utilizando captadores de Durham 1.

Cubrir la superficie de un portaobejetos con vaselina o con gelatina glicerinada coloreada con fucsina básica. La vaselina o la gelatina actúan como adherentes del material polínico. Si se usa gelatina glicerinada es necesario calentar la placa para extender la gelatina con la ayuda de un estilete.

2.

Poner el portaobjetos en posición horizontal en el captador y dejarlo expuesto al aire a una altura aproximada de 5 m durante 24 horas como mínimo o una semana como máximo.

3.

Retirar el portaobjetos, después del período deseado, y llevarlo al laboratorio.

4.

Raspar, con la ayuda de un bisturí limpio, la superficie del portaobjetos y echar dentro de un tubo de centrífuga, la vaselina o la gelatina glicerinada con el material atrapado. 416

5.

Agregar al tubo 3 ml de disolvente orgánico (éter o acetona) o agua destilada caliente, y llevar a baño de maría para completar la dilución del material adherente.

6.

Centrifugar y descartar el disolvente.

7.

Preparar y montar el material polínico según la técnica de acetólisis de Erdtman (ver 4. Acetólisis de Erdtman).

NOTA. Para para facilitar la identificación de los granos de polen de la muestra, pueden ser teñidos con un colorante especial denominado “rojo calberla”, el cual sólo tiñe a los granos de polen dejando el resto del material (esporas de hongos, partículas de polvo, entre otros) sin colorear.

Figura

2.11.

Forma

de

demarcar en

el

portaobjetos un cuadrado de 22x22 mm

Metodología utilizando captadores de Hirst 1.

Seleccionar la estacion aerobiológica según la dirección de las corrientes de aire

2.

Montar el captador Lanzoni evitando pantallas (obstáculos) que puedan bloquear la llegada de masas de aire

3.

En el laboratorio preparar el tambor de muestreo adhiriéndole la cinta melinex, a la cual se le aplica silicona liquida, con el fin de que los granos de polen y las esporas queden atrapados en la cinta

4.

Introducir el tambor preparado al recipiente metálico circular hermético, suministrado con el equipo, con el fin de evitar posibles contaminaciones con granos o esporas aerovagantes al momento del traslado a la estación aerobiólogica donde se localizó el captador

417

5.

En el sitio de muestreo poner el tambor dentro del captador extrayendo el cabezal sobre el que se asienta el tambor

6.

Dar cuerda al mecanismo de relojería del tambor, verificar el volumen de entrada de aire que debe corresponder a 10 litros/min, introducir nuevamente el cabezal a la bomba de vacío

7.

Semanalmente tomar las muestras realizando el cambio de tambor, de la manera indicada, en el día y hora en el cual el captador termina su ciclo, sustituyéndolo por uno preparado previamente en el laboratorio

8.

Montaje de las muestras:

9.

En el laboratorio montar, desprender y cortar la cinta melinex en los accesorios del captador

10.

Una vez obtenidos los fragmentos diarios, montarlos sobre portaobjetos previamente impregnados de gelatina glicerinada

11.

Cubrir la preparación en cada portaobjetos con un cubreobjetos también impregnado con gelatina glicerina teñida con fucsina, para facilitar la fijación y tinción de las partículas capturadas y su posterior reconocimiento

12.

Leer los micropreparados

418

ANÁLISIS PALINOLÓGICO DE LA MIEL DE ABEJAS Materiales y equipos Muestras de miel, mínimo 300 ml por muestra Microscopio compuesto Centrífuga Placa de calentamiento Baño maría Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (Laminillas) de 22 × 22 mm Tubos de centrífuga de extremo cónico, de 10 y de 50 ml Varilla de vidrio Gotero o pipeta Pasteur Ácido acético glacial Ácido sulfúrico concentrado (puro) Anhídrido acético Glicerina 50% Agua destilada Gelatina glicerinada Parafina

Metodología. Existen varios métodos para aislar y analizar los granos de polen presentes en la miel de abejas. Estos métodos comprenden tanto análisis del material al natural, como acetolisado.

Análisis al natural 1.

Homogenizar, con la ayuda de una varilla de vidrio, la muestra de miel de abejas

2.

Disolver 10 g de miel homogenizada en 20 ml de agua destilada a 40ºC.

3.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

419

4.

Lavar el precipitado agregando 10 ml de agua destilada y agitando con varilla de vidrio.

5.

Centrifugar por 5 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

6.

Agitar el sedimento con una varilla de vidrio. Con una pipeta Pasteur tomar una gota y extenderla sobre un portaobjetos limpio en un área de 22 × 22 mm.

7.

Secar el frotis en una placa de calentamiento a 35ºC.

8.

Agregar una gota de gelatina glicerinada, cubrir con la laminilla y sellar con parafina o esmalte transparente para uñas. Si se desea puede utilizarse gelatina glicerinada coloreada.

El polen preparado con esta técnica conserva la intina y demás caracteres del polen fresco, por lo tanto su identificación debe ser realizada con preparaciones de polen al natural procedente de la misma región donde se tomó la muestra de miel.

Acetólisis de Erdtman modificada para melisopalinología 1.

Homogenizar, con la ayuda de una varilla de vidrio, la muestra de miel de abejas

2.

Disolver 10 ml de miel de abejas homogenizada en 20 ml de agua destilada a 40ºC. Agitar con varilla de vidrio para homogenizar la mezcla.

3.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

4.

Lavar el precipitado agregando 20 ml de agua destilada y agitando con una varilla de vidrio.

5.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

6.

Agregar 20 ml de ácido acético glacial y agitar con varilla de vidrio. Dejar en reposo por un período no menor de 15 minutos para permitir el inicio de la degradación del protoplasma.

7.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m., y descartar el sobrenadante. 420

8.

Continuar con la técnica de acetólisis de Erdtman hasta solución de glicerina 50% en agua, durante 15 minutos a 24 horas.

9.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante. Sin enderezar el tubo de centrífuga, dejarlo invertido durante 5 minutos en un beaker con papel absorbente en el fondo.

10. Agregar 1 ml de gelatina glicerinada derretida, tomando la precaución de que no descienda por las paredes internas del tubo. Agitar en baño maría con una varilla de vidrio para homogenizar la muestra. 11. Hacer el montaje de las placas según la siguiente Metodología: 12.

Calentar una pipeta Pasteur de 1 ml o un gotero largo limpio y usarlo para poner una gota del material sobre un portaobjetos también caliente.

13.

Poner sobre la gota, un cubreobjetos de 22 mm de lado, calentar suavemente para asegurar la distribución del material por toda el área del cubreobjetos, sin dejar espacios libres en los lados.

14.

Sellar con parafina o esmalte transparente para uñas. Preparar un mínimo de 4 placas por muestra.

Análisis estadístico El número aproximado de granos de polen en 10 ml de muestra de miel de abejas se calcula según la fórmula: N = And / f. a X 10 N = número total de granos de polen por 10 ml de muestra. A = área total del cubreobjetos utilizado. n = número de granos de polen contados por muestra. d = número de gotas contenidas en 1 ml de gelatina glicerinada derretida. Debe utilizarse la misma pipeta o el mismo gotero empleado para montar la placa. f = área de un campo visual del microscopio. a = número de campos examinados.

421

10 = con la fórmula N = And / f. a se obtiene el número de granos presentes en 1 ml de gelatina glicerinada derretida. Como se utilizan 10 ml de miel de abejas, debe multiplicarse por este factor.

OBSERVACIÓN. Si se utiliza más de un portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes.

422

ANÁLISIS DE VIABILIDAD DE LOS GRANOS DE POLEN El material polinífero colectado “en fresco” debe procesarse dentro de un período de tiempo no superior a 24 horas. El material obtenido de ejemplares de herbario se debe tratar con ácido acético glacial durante un período mínimo y máximo de una hora antes de ser preparado.

Generalmente se utiliza la técnica de acetocarmín de Marks 1954 (en Dickison & Bell, 1974). Esta técnica se basa en la coloración del citoplasma del polen: los granos viables absorben el aceto carmín y el protoplasma presenta una coloración púrpura, mientras que los granos de polen no viables, que carecen de protoplasma o este se encuentra en cantidades muy pequeñas, no absorben el colorante y quedan casi transparentes, como si estuviesen acetolisados, o toman un color púrpura muy claro.

Con fines de comparación de las técnicas usadas para determinar la viabilidad de los granos de polen, estos también pueden ser coloreados con una solución de azul de algodón en lactofenol (Dicción & Bell, 1974). Con esta solución los granos de polen viables toman un color azul oscuro y los no viables generalmente no se colorean o toman un color azul muy claro. Con cualquiera de las dos técnicas se obtienen los mismos resultados, independientemente de si se utilizan granos de polen frescos o de ejemplares de herbario.

Otros colorantes utilizados para estudios de viabilidad son: Las anteras se sumergen en una solución con un colorante como el azul de anilina en lactofenol, azul de metileno, rojo neutro.

Materiales y equipos Microscopio compuesto Estiletes o agujas de disección Placa de calentamiento o lámpara de alcohol 423

Portaobjetos (placas) de aproximadamente 76 x 26 mm (3 x 1 inch) Cubreobjetos (Laminillas) de 22 × 22 mm Varilla de vidrio Gotero o pipeta Pasteur Papel de filtro Agua destilada Gelatina glicerinada Fenol Glicerina bidestilada Ácido láctico Ácido acético glacial Acetato férrico Anhídrido acético Glicerina 50% Parafina Colorante carmín en polvo Colorante azul de algodón o anilina azul

ESTUDIO DE VIABILIDAD MEDIANTE GERMINACIÓN DEL GRANO DE POLEN 1. Prepare una solución de germinación del grano de polen con: •

Lactosa o sucrosa 10% (10 g del azúcar + 90 ml de agua destilada)

•

100 ppm de ácido bórico

•

100 ppm de nitrato de calcio

2. En un portaobjetos limpio y desengasado, monte varios granos de polen de Impatiens balsamina o de Lilium spp. 3. Agregue dos gotas de la solución de germinación 4. Tape con un cubreobjetos y observe inmediatamente la preparción con objetivo de 40x 424

5. Observe cada cinco minutos la preparación durante 30 minutos. Si es necesario agregue por los lados del cubreobjetos más solución de germinación. 6. Después de este tiempo cuente los granos de polen que formaron tubo políco (granos viables) y los que no formaron tubo polínico (granos inviables).

ESTUDIO DE VIABILIDAD MEDIANTE COLORACIÓN DEL CITOPLASMA DEL GRANO DE POLEN

Primera metodología 1.

Poner sobre un portaobjetos limpio y desengrasado una gota de acetocarmín 1,2% y disecar sobre ella una o dos anteras (dependiendo del tamaño, algunas veces se requieren más anteras.

2.

Dejar el material en esta solución durante 5 minutos, flameando el portaobjetos en lámpara de alcohol, controlando la temperatura con el dorso de la mano, sin dejar hervir ni secar la gota de aceto carmín.

3.

Después de los cinco minutos retirar el exceso de material de las anteras trituradas.

4.

Cubrir la preparación con un cubreobjetos y hacer un poco de presión con un papel de filtro para retirar el exceso de colorante.

La solución de aceto carmín tiene muy baja viscosidad por lo cual los granos de polen se mueven hacia los bordes del cubreobjetos y no hay una buena distribución de los granos viables y de los no viables en la preparación, originando errores en el conteo. Para evitar esto, se puede usar un medio viscoso para el montaje, tal como el acetocarmín en gelatina glicerinada. Este medio presenta la ventaja de permitir la preparación de láminas permanentes. 425

Segunda metodología 1.

En un portaobjetos limpio y desengrasado poner una gota de gelatina con acetocarmín, o con azul de algodón, (previamente derretida) y disecar sobre ella una antera.

2.

Con la ayuda de un estilete o aguja de disección, retirar los residuos de tejidos de la antera y esparcir suave y uniformemente los granos de polen teniendo la precaución de no dejar formar burbujas en la preparación.

3.

Poner un cubreobjetos y sellar con parafina o con esmalte transparente para uñas.

4.

Después de tres horas contar los granos viables y los no viables, expresando los resultados en porcentajes (%).

Tercera metodología: cloruro de tetrazolio (cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio) Con el propósito de establecer rápidamente el estado fisiológico (determinar la viabilidad) de los palinomorfos frescos, se usa como colorante el cloruro de tetrazolio (cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio): 1.

Retirar las anteras de las flores frescas y echarlas a un tubo de ensayo con 15 ml de cloruro de tetrazolio 0.5%.

2.

Agitar fuertemente los tubos con el propósito de liberar los granos de polen de las anteras.

3.

Dejar incubar durante una noche (máximo 24 horas) en la oscuridad.

4.

Después de este tiempo homogenizar la muestra y colocar una gota sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, cubrir con laminilla y observar inmediatamente al microscopio compuesto.

Esta prueba permite visualizar en los palinomorfos coloraciones que desde desde el rojo púrpura, rosado hasta blanco. Cuando se presentan coloraciones rojas se presume que el material es viable fisiológicamente. La coloración rosada corresponde al inicio de pérdida de viabilidad y la coloración blanca, total o parcial, significa que hay pérdida de viabilidad. 426

Análisis de los micropreparados para estudios de viabilidad Observar los micropreparados bajo el microscopio con objetivo de 40X para buscar los granos de polen viables y los no viables. Para el análisis cuantitativo la frecuencia de viabilidad, se calcula contando por lo menos 500 granos, al menos en tres placas por muestra diferenciando los granos viables y los no viables. Para esto en cada placa se demarcan 11 recorridos horizontales separados 2 mm uno del otro. El conteo se hace en el primer campo visual y en los siguientes campos visuales obtenidos por recorridos horizontales en la preparación. Al finalizar el primer recorrido, se desciende un campo visual y se continúa con el conteo de los granos encontrados en los campos localizados horizontalmente en sentido contrario al primer recorrido, y así sucesivamente. De esta forma se evita contar varias veces un mismo grano.

Se deben contar todos los granos de la placa, en caso de completar los 500 granos de polen antes de finalizar los 11 recorridos, se continuará contando, así que muchas veces serán contados más de 500 granos de polen por muestra. Cuando sean muy escasos los granos de polen, son necesarias más de tres placas para contar el mínimo de 500 estructuras, teniéndose presente que se debe completar el conteo hasta terminar la placa en la cual se complete el número indicado. Si se utiliza más de tres portaobjetos para contar los 500 granos de polen, se deben hacer los ajustes correspondientes.

Preparación del aceto carmín 1,2% 1.

Disolver 50 ml de ácido acético glacial en 100 ml de agua destilada.

2.

Disolver en frío 1,2 g de carmín en 100 ml de la anterior solución de ácido acético.

3.

Hervir la mezcla por un período de 2 a 3 horas en un tubo de reflujo.

4.

Dejar enfriar y filtrar para eliminar el colorante no diluido.

427

Preparación del aceto carmín en gelatina glicerinada 1.

Diluir gelatina glicerinada (preparada para acetólisis) y echar 50 ml en un beaker de vidrio.

2.

Agregar 0,25 g de carmín en polvo y agitar en caliente hasta homogenizar la solución.

3.

Continuar con la preparación o envasar en recipiente de vidrio o plástico oscuro y guardar tapado herméticamente hasta su uso.

4.

Diluir 45 ml de ácido acético glacial en 100 ml de agua destilada y agregar 40 ml de esta solución a 20 ml de la gelatina glicerinada preparada con carmín (si la gelatina fue guardada, debe derretirse para hacer esta mezcla), agitar hasta homogenizar la solución.

5.

Adicionar 4 ml de una solución saturada de acetato férrico en ácido acético 45%. Con esto la solución debe adquirir una coloración vinotinto.

Preparación del azul de algodón en lactofenol 1.

Tomar 20 ml de fenol, previamente derretido en baño de maría, y agregarle 40 ml de glicerina bidestilada, 20 ml de ácido láctico y 20 ml de agua destilada.

2.

Agregarle a esta mezcla 1 a 5 ml de una solución acuosa de azul de algodón 1% (o anilina azul), dependiente de la intensidad de color deseada.

3.

Continuar la preparación como la del aceto carmín

Preparación de cloruro deTetrazolio 0,5% 1.

Para obtener un rango de pH adecuado, hacer una solución buffer a partir de las siguientes soluciones:

2.

Solución 1: Disolver 9,078 g KH2PO4 en 1000 ml de agua.

3.

Solución 2: Disolver 9,472 g Na2HPO4 en 1000 ml de agua.

4.

Mezclar dos partes de la solución 1 con tres partes de solución 2.

5.

Medir el pH, que debe estar entre 6.5 y 7.5. 428

6.

Disolver 0,5 g de cloruro de tetrazolio en 99,5 ml de la mezcla anterior.

429

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

El uso del microscopio electrónico de transmisión (MET) para palinología tiene gran importancia, gracias a que este aparato tiene un alto poder de resolución que permite analizar detalladamente la ultraestructura del polen y esporas, principalmente en lo referente a la génesis, forma y tamaño de las capas que conforman la pared.

El rendimiento que se pueda obtener del microscopio electrónico de transmisión, presenta dos factores limitantes: el poder de resolución y el contraste. El poder de resolución de un instrumento óptico es la distancia más pequeña entre dos puntos del objeto que se pueda diferenciar con la ayuda de dicho instrumento. (Tabla 2.2). Es una característica inherente al aparato usado y es independiente de la muestra. Mientras que el contraste depende de la técnica de preparación de la muestra, la cual debe ser lo suficientemente fina y estar sombreada o coloreada con sustancias que le suministren el contraste adecuado.

Tabla 2.2. Poder de resolución. INSTRUMENTO

DE

PODER DE RESOLUCIÓN

OBSERVACIÓN Ojo humano

100 μm

Microscopio de luz

0,2 μm (200 nm)

MET

0,1 nm = 1 Å

MEB

1 nm = 10 Å

Materiales y equipos Material polinífero Microscopio electrónico de transmisión (MET o TEM) Ultramicrótomo 430

Centrífuga Rejillas de cobre para MET Tubos de centrífuga Pipetas Pasteur Cuchillas de vidrio o diamante Glutaraldehido 2.5 % Amortiguador fosfato 0.1M, pH 7.1 Tetraóxido de osmio Acetato de uranilo Citrato de plomo Ácido acético Acetona Alcohol etílico Colodión o formvar Agua destilada Agar 1% Goma arábiga Resina plástica

Metodología 1.

Fijar en glutaraldehido 2.5% en amortiguador fosfato 0.1M, pH 7.1 a 4ºC por dos horas. Iniciar la fijación en un desecador o campana de vacío hasta conseguir la extracción de gases del material vegetal.

2.

Poner el material polinífero al natural o acetolisado, en una cápsula de gelatina y agregar una gota de agar 1% para facilitar su manejo. Dejar solidificar el agar, retirarlo de la cápsula y dividirlo en cubos de aproximadamente 1.2 mm de lado.

3.

Lavar dos veces, durante 5 minutos cada una, en buffer fosfato 0.1M, pH 7.1.

431

4.

Fijar durante una hora en tetraóxido de osmio 1%, 0.1M en amortiguador fosfato pH

5.

7.1. Manipular este reactivo en campana de extracción de gases.

6.

Lavar dos veces, durante 5 minutos cada una, en buffer fosfato 0.1M, pH 7.1.

7.

Deshidratar a través de un gradiente creciente de alcohol etílico a 30, 50, 70, 90% durante 15 minutos en cada paso y continuar la deshidratación poniendo dos veces en alcohol etílico 100% durante 30 minutos cada vez.

8.

Lavar en óxido de propileno durante una hora.

9.

Incluir el material poniéndolo en pequeñas cápsulas de gelatina con una mezcla de resina plástica, como araldita, epon 312 o resina spurr.

10. Poner las cápsulas con el material en una estufa a 60ºC hasta su polimerización. 11. Retirar el material de la cápsula de gelatina y pulir el bloque en forma de pirámide truncada. 12. Con el ultramicrótomo, utilizando preferiblemente cuchilla de diamante, realizar cortes de aproximadamente 600 Å de espesor. Los cortes óptimos se pueden apreciar a simple vista por el color de reflexión de la luz que debe ser de un tono plateado o blanco amarillento. Desechar los cortes de otra coloración, pues son demasiado gruesos o demasiado finos para su observación al MET. 13. Recoja los cortes en rejillas de cobre para MET, en una de cuyas caras previamente se ha extendido una fina película de colodión o formvar disuelto en cloroformo o dicloroetano. 14. Teñir la rejilla con acetato de uranilo y luego con citrato de plomo para darle contraste a las estructuras. 15. Lavar y dejar secar. 16. Observar al MET.

432

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

El microscopio electrónico de barrido (MEB), también llamado microscopio electrónico de rastreo (MER), es un instrumento fundamental en el estudio topográfico de superficies. Permite observar tridimensionalmente a los granos de polen y esporas, facilita determinar la forma de las aberturas y apreciar detalles de la superficie que pasan desapercibidos con microscopía de luz. Ya que el microscopio electrónico de barrido solamente permite observar detalles de la superficie, es decir la escultura u ornamentación de la esporodermis, si se desean observar detalles de la estructura de la pared, es necesario cortar o fracturar los granos con un crimicrótomo (Skvarla et al., 1988) o congelarlos en un dial pequeño (frasco pequeño) y fracturarlos sometiéndolos a ultasonido, con esta segunda técnica los cortes resultan muy irregulares por lo cual no se recomienda.

La observación de los granos de polen al MEB puede hacerse al natural o en granos de polen acetolisados. La observación al natural tiene la ventaja de permitir observar estructuras que pueden ser destruidas por acción de la acetólisis, requiere que el material polinífero esté bien purificado y presenta la desventaja de no mostrar detalles de la pared, ocultos por las sustancias propias del polen. La observación de material acetolisado, permite trabajar con muestras tratadas uniformemente para observación tanto en microscopio de luz como al MEB.

Materiales y equipos Material polinífero Microscopio Electrónico de Barrido o “Scanning” (MEB o SEM) Cobertor iónico Centrífuga Aparato de ultrasonido Tubos de centrífuga Pipetas Pasteur 433

Cinta adhesiva de doble faz Glutaraldehido 2,5% Buffer fosfato 0,1M, pH 7,1 Tetraóxido de osmio Ácido acético Alcohol etílico Agua destilada Esmalte (brillo) incoloro para uñas

Metodología: Granos de polen al natural 1.

Usando estereomicroscopio, pinzas de punta fina y estiletes limpios, retirar los granos de polen de las anteras sobre un portaobjetos desengrasado.

2.

Fijar el material polínico en la base portamuestras del MEB. Pueden utilizarse varios tipos de adhesivos, tales como: una capa fina de esmalte transparente (o brillo) para uñas o cinta adhesiva de doble faz rodeada de pintura de plata coloidal. Si se utiliza brillo para uñas, debe tenerse la precaución de que la capa esté casi seca para evitar que los granos de polen se sumerjan en el esmalte, pero no se puede dejar secar completamente, pues los granos de polen no se adhieren al esmalte seco.

3.

Invertir la base portamuestras y golpearla suavemente para eliminar residuos de anteras y granos no adheridos a la preparación.

4.

Fijar la exina, exponiéndola durante una noche a vapores de tetraóxido de osmio en cámara cerrada y en campana de extracción de gases.

5.

Si se utiliza material fresco, dejar secar durante 24 horas a 40ºC o en un desecador con sílica gel activa.

6.

Metalizar con oro, oro-paladio o platino a alto vacío, usando una capa de 120 Å de grosor.

7.

Observar al MEB.

434

Para mejorar el fondo de observación de los granos de polen se aconseja montarlos sobre un pedazo de cubreobjetos: con una pipeta Pasteur, tomar una gota de los granos de polen en alcohol y extenderla sobre un pedazo de cubreobjetos o sobre un cubreobjetos de un diámetro menor a la base portamuestras del MEB, previamente adherido a ella con pintura de plata coloidal. Los granos de polen se adhieren por energía electrostática a la base.

Metodología: Granos de polen acetolisados 1.

Lavar el material polinífero acetolisado en 5 ml de ácido acético glacial, agitando durante 2 minutos con una varilla de vidrio.

2.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

3.

Lavar dos veces en 10 ml de agua destilada tibia, agitando durante 2 minutos con una varilla de vidrio.

4.

Centrifugar cada vez durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y decantar el sobrenadante.

5.

Deshidratar durante 10 minutos en cada paso de un gradiente creciente de alcohol etílico 50, 70, 90, y dos veces en alcohol absoluto, agitando en cada paso con varilla de vidrio.

6.

Centrifugar durante 5 minutos en cada paso y decantar el sobrenadante.

7.

Agregar 10 ml de alcohol absoluto y agitar para homogenizar la mezcla.

8.

Con una pipeta Pasteur, tomar una gota de los granos de polen en alcohol y extenderla sobre un pedazo de cubreobjetos o sobre un cubreobjetos de un diámetro menor al de la base portamuestras del MEB, previamente adherido a ella con pintura de plata coloidal. Los granos de polen se adhieren por energía electrostática a la base. También pueden ser montados extendiendo directamente la gota sobre la base portamuestra como se indicó en los granos al natural, pero en el fondo se observan las rayas que presenta la base porta muestras del MEB.

435

9.

Fijar la preparación exponiéndola durante una noche a vapores de tetraóxido de osmio en cámara cerrada y bajo campana de extracción de gases.

10.

Metalizar por evaporación de oro, oro-paladio o platino en alto vacío, recubriendo con una capa de 120 Å de grosor.

11.

Observar al MEB.

OBSERVACIONES 1.

Como los ejemplares biológicos no tienen alta reflectividad ni conductividad electrónica, las superficies deben ser recubiertas con un metal evaporado (oro, oro-paladio, platino) de 50 o 120 Å de grosor. La fijación con tetraóxido de osmio permite darle mayor conductividad al polen para obtener un mejor contraste al MEB.

2.

Una vez metalizado el material, debe ser observado el mismo día o máximo, el día siguiente, pues puede hidratarse y causar problemas en las aberturas de la columna del microscopio. Si se requiere observar el material al otro día de preparado, deberá conservarse en cajas de petri pequeñas dentro de un desecador con algún deshidratante como sílica gel activado.

Metodología: Fractura de la esporodermis 1.

La estratificación de la pared del polen no se aprecia al MEB si no se fractura. Uno de los métodos de fractura de los granos de polen, es sometiéndolos a la acción de ultrasonido según el siguiente Metodología:

2.

Poner las esporas o los granos de polen en tubos de ensayo plásticos.

3.

Agregar a cada tubo 3 ml de ácido acético glacial.

4.

Llevar la mezcla a la acción de ultrasonido con una frecuencia aproximadamente de 40 Kh/s, durante un tiempo variable según la resistencia de la pared.

5.

Centrifugar durante 5 minutos a 2.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.

436

6.

Lavar dos veces, agregando 10 ml de alcohol absoluto cada vez y agitando con varilla de vidrio por dos minutos, centrifugar y decantar el alcohol.

7.

Agregar 10 ml de alcohol absoluto.

8.

Con una pipeta Pasteur, tomar una gota del alcohol con polen y extenderla sobre un cubreobjetos de diámetro menor que la base del portamuestras del MEB, previamente adherido a ella con pintura de plata coloidal. También puede extenderse la muestra directamente sobre la base portamuestras.

9.

Fijar la preparación, exponiéndola durante una noche a vapores de tetraóxido de osmio en cámara cerrada y bajo una campana de extracción de gases.

10.

Metalizar por evaporación de oro, oro-paladio o platino en alto vacío, recubriendo con una capa de 120 Å de grosor.

11.

Observar al MEB.

437

MICROSCOPIA DE LUZ DE ALTA RESOLUCIÓN

Para observar con más detalles la estratificación de la exina, se realizan cortes o roturas del polen, tanto al natural como acetolisados. Las roturas se efectúan sometiendo los granos a ultrasonido como para microscopia de rastreo o barrido (MER o BAR) y los cortes se hacen preparando el material como para microscopía electrónica de transmisión. Los fragmentos o los cortes se montan en portaobjetos limpios y desengrasados, se montan en algunos de los medios indicados y se sellan para ser observados bajo un buen microscopio de luz.

La resina plástica puede ser reemplazada por alcohol polivinílico o por goma arábiga para proporcionar la dureza necesaria de tal forma que no se rompan al hacer los cortes con el micrótomo para microscopia electrónica. Una fórmula para la goma arábiga es: Agua… 12 ml Glicerina… 4,5 ml Goma arábiga...11 g Cristales de fenol… 4 g

Para facilitar la pérdida de gas, el agua debe ser evaporada hasta que se reduzca a la mitad, poniendo la mezcla a fuego lento y con agitación continua. Esta solución puede ser guardada por algunos meses en lugares oscuros, frescos y secos. Las esporas o los granos de polen se incluyen en esta goma de la misma forma que en resina, se deja secar durante dos o tres semanas en un cristalizador hasta su endurecimiento o hasta cuando la preparación se pueda rayar con la uña.

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La ciencia camina en dos pies: teoría y experimentación... Algunas veces es un pié el que da el paso hacia delante, algunas veces es el otro, pero el progreso continuo, es hecho sólo con el uso de ambos pies.

R. Millikan (Butposts of Sciencie)

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