Flavonoides en Los Alimentos

FLAVONOIDES EN LOS ALIMENTOS

Los flavonoides son compuestos fenólicos constituyentes de la parte no energética de la dieta humana. Se encuentran en vegetales, semillas, frutas y en bebidas como vino y cerveza. Se han identificado más de 5.000 flavonoides diferentes. Aunque los hábitos alimenticios son muy diversos en el mundo, el valor medio de ingesta de flavonoides se estima como 23 mg/día, siendo la quercitina el predominante con un valor medio de 16 mg/día. En un principio, fueron consideradas sustancias sin acción beneficiosa para la salud humana, pero más tarde se demostraron múltiples efectos positivos debido a su acción antioxidante y eliminadora de radicales libres.  Aunque diversos estudios indican que algunos flavonoides flavonoides poseen acciones acciones prooxidantes, éstas se producen sólo a dosis altas, constatándose en la mayor parte de las investigaciones la existencia de efectos antiinflamatorios, antivirales o antialérgicos, y su papel protector frente a enfermedades cardiovasculares, cáncer y diversas patología, muchas veces estos pigmentos dan una coloración amarilla, anaranjada o rojiza a los vegetales. El organismo humano no puede producir estas sustancias químicas protectoras, por lo que deben obtenerse mediante la alimentación o en forma de suplementos ampliamente distribuidos en plantas, frutas, verduras y en diversas bebidas y representan componentes sustanciales de la parte no energética de la dieta humana. Los flavonoides contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial en la protección frente a los fenómenos de daño oxidativo, y tienen efectos terapéuticos en un elevado número de patologías, incluyendo la cardiopatía isquémica, la aterosclerosis o el cáncer. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidación lipídica y se ha descrito su capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides (con respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregación plaquetaria (efectos antitrombóticos) y de proteger a las lipoproteínas de baja densidad de la oxidación (prevención de la placa de ateroma). Además de sus conocidos efectos antioxidantes, los flavonoides presentan otras propiedades que incluyen la estimulación de las comunicaciones a través de las uniones en hendidura, el impacto sobre la regulación del crecimiento celular y la inducción de

enzimas de destoxificación tales como las monooxigenasas dependientes de citocromo P-450, entre otras.

ESTRUCTURA QUÍMICA Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano (heterocíclico). Los átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2' al 6' (fig. 1). La actividad de los flavonoides como antioxidantes depende de las propiedades redox de sus grupos hidroxifenólicos y de la relación estructural entre las diferentes partes de la estructura química.

Fig. 1.—Flavonoides. Estructura básica y tipos . Esta estructura básica permite una multitud de patrones de sustitución y variaciones en el anillo C. En función de sus características estructurales se pueden clasificar en:

1. Flavanos: como la catequina, con un grupo -OH en posición 3 del anillo C. 2. Flavonoles: representados por la quercitina, que posee un grupo carbonilo en posición 4 y un grupo -OH en posición 3 del anillo C.

3. Flavonas: como la diosmetina, que poseen un grupo carbonilo en posición 4 del anillo C y carecen del grupo hidroxilo en posición C3.

4. Antocianinas: que tienen unido el grupo -OH en posición 3 pero además poseen un doble enlace entre los carbonos 3 y 4 del anillo C.

FUNCIONES Y BENEFICIOS. Los flavonoides presentan tres características estructurales importantes para su función:

a) La presencia en el anillo B de la estructura catecol u O-dihidroxilo. b) La presencia de un doble enlace en posición 2,3 c) La presencia de grupos hidroxilo en posición 3 y 5. La quercitina presenta las tres características, mientras que la catequina solo presenta la segunda y la diosmetina la primera (fig. 2).  A los flavonoles y las flavonas se unen azúcares, preferentemente a la posición C3 y con menor frecuencia al C7 del anillo A, de forma que estos compuestos se encuentran comúnmente como O-glicósidos, siendo la D-glucosa el residuo azúcar más frecuente. Cabe decir que; la parte sin azúcares de la molécula flavonoide se llama aglicona. y que además las repercusiones de la carga negativa son sumamente importantes en la evaluación del potencial antioxidante de los flavonoides. Asimismo estos no solo otorgan a los alimentos un pigmento, sino también una gran cantidad de propiedades medicinales. Por eso, tomar alimentos ricos en flavonoides de manera habitual proporciona diferentes beneficios muy importantes para la salud.  A continuación una lista con los más destacados: 

Mejoran la absorción de minerales: Los flavonoides ayudan al cuerpo a

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fijar minerales esenciales como el hierro o el cobre Antioxidantes: Los flavonoides tienen un poderoso efecto antioxidante, que protege y mejora el crecimiento y desarrollo de las células, y las protege de

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la degeneración causada por los radicales libres. Así pues, los flavonoides protegen el cuerpo del desgaste y el envejecimiento. Previenen el cáncer : Gracias a su acción antioxidante, los flavonoides también ayudan a prevenir el cáncer gracias a su protección de las células. Esto es porque la degeneración celular puede conllevar una mutación cancerígena en las células. Los flavonoides son especialmente beneficiosos para prevenir cánceres relacionados con el aparato digestivo, como el cáncer de estómago o el cáncer de colon. Desintoxicantes:  Los flavonoides protegen nuestro cuerpo de agentes contaminantes y perjudiciales para nuestro cuerpo, como la polución ambiental, los rayos ultravioleta del sol, o las sustancias químicas que puede haber en los alimentos. Así pues, estas propiedades los convierten en un gran desintoxicante natural. Antifúngicos y bactericidas:  Los flavonoides tienen propiedades antifúngicas y bactericidas, por lo que te ayudarán a combatir infecciones tanto de bacterias como de hongos. Reducen el colesterol malo: Los flavonoides ayudan a reducir los niveles de colesterol LDL. Este tipo de colesterol es perjudicial para nuestro organismo, ya que se acumula en las arterias taponándolas e impidiendo el flujo sanguíneo normal. Mejoran la circulación sanguínea: Gracias a esta reducción del colesterol LDL y a sus propiedades vasodilatadoras, los flavonoides también ayudan a mejorar la circulación sanguínea, reduciendo así la presión arterial y protegiendo órganos tan importantes como el corazón y los riñones. Ayudan al hígado y al estómago:   Gracias a sus propiedades antiinflamatorias y a su acción sobre la presión arterial, los flavonoides ayudan a mejorar la digestión y a proteger el estómago y el hígado.

TIPOS Y FUENTES DE FLAVONOIDES Los flavonoides se encuentran en frutas, verduras, semillas y flores, así como en cerveza, vino, té verde, té negro y soja, los cuales son consumidos en la dieta humana de forma habitual y también pueden utilizarse en forma de suplementos nutricionales, junto con ciertas vitaminas y minerales. Los flavonoides se encuentran también en extractos de plantas como arándano, gingko biloba, cardo, mariano o crataegus. Desempeñan un papel importante en la biología vegetal; así, responden a la luz y controlan los niveles de las auxinas reguladoras del crecimiento y diferenciación de las plantas.

Se han identificado más de 5.000 flavonoides20, entre los que se pueden destacar:

1. Citroflavonoides: Quercitina, hesperidina, rutina, naranjina y limoneno. La quercitina es un flavonoide amarillo-verdoso presente en cebollas, manzanas, brócoles, cerezas, uvas o repollo rojo. La hesperidina se encuentra en los hollejos de las naranjas y limones. La naranjina da el sabor amargo a frutas como la naranja, limón y toronja, y el limoneno se ha aislado del limón y la lima. 2. Flavonoides de la soja o isoflavonoides: Están presentes en los alimentos con soja tales como porotos, tofu, tempeh, leche, proteína vegetal texturizada, harina, miso. Los dos más conocidos son la genisteína y la daidzeina. 3. Proantocianidinas: Se localizan en las semillas de uva, vino tinto y extracto de corteza del pino marino. 4. Antocianidinas: Son pigmentos vegetales responsables de los colores rojo y rojo-azulado de las cerezas. 5. Ácido elágico: Es un flavonoide que se encuentra en frutas como la uva y en verduras. 6. Catequina: El té verde y negro son buenas fuentes. 7. Kaemferol: Aparece en puerros, brócoles, rábano, endibias y remolacha roja.

DISTRIBUCION DE FLAVONOIDES EN EL REINO VEGETAL  Aunque los flavonoides están muy presentes en la naturaleza, carecen de una distribución uniforme en el reino vegetal. En la Tabla 1 se presenta el contenido en flavonoides de algunos alimentos. En general estos datos muestran que una porción de frutas (manzanas, arándanos), de chocolate negro y de vino rojo tienen un contenido, de moderado a alto, en flavonoides y/o taninos. Sin embargo, una porción de brócoli o de zumo de naranja proporciona relativamente bajas concentraciones de estos fitonutrientes. El cacao parece ser efectivo al poseer varios favorables bioactivadores de las enfermedades cardiovasculares

Tabla 1.contenido de flavonoides en los alimentos .

EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO La extracción de los diferentes flavonoides se realiza a partir del material vegetal fresco o también se puede realizar con el material vegetal seco (30° C ó 40° C). Luego debe molerse finamente de esta forma facilitar la extracción de los compuestos flavonoicos; estos se pueden extraer indistintamente debido a la solubilidad que presenten en diferentes solventes orgánicos. La muestra se desengrasa inicialmente con éter de petróleo o n-hexano, y el marco se extrae con etanol puro o del 70%. El extracto obtenido se evapora con calentamiento no superior a los 50°C y se hacen particiones sucesivas con éter etílico, acetato de etilo los más polares en el n-butanol Cada una de estas tres fracciones se puede analizar por cromatografía de capa fina (CCP) y HPLC en fase reversa.

METODOS DE IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES Generalmente se puede realizar métodos de identificación cualitativos como: 

Ensayo de Shinoda: Los flavonoides con el núcleo benzopirona( p. ej. Flavonas, flavonoles, flavanonas, etc.) producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohólicas se les adiciona magnesio seguido de HCl concentrado.

Técnica:

1mL de extracto acuoso -1mL HCl concentrado -1 pedacito de cinta de Mg -1 mL de alcohol amílico (agitar y dejar reposar). 

Ensayo con Zn/HCl: Al reemplazar el Mg por el Zn en el ensayo de shinoda, solamente los dihidroflavonoides ( o flavononoles) se producen coloraciones rojo-violeta. Las flavanonas o flavanones no producen color o producen coloraciones rosadas débiles.

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Ensayo de Pacheco: Técnica: El sólido flavonoide se calienta sobre una llama con unos pocos cristales de AcONa y 0.1 ml de anhidro acético. Luego con 0.1 ml de HCL [ ]. Los dihidroflavonoles producen un color rojo característico, las flavonas, chalconas, auronas, flavonoles y flavononas dan una respuesta negativa.

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Ensayo del estroncio-amoniaco: Este ensayo de se utiliza para distinguir entre flavonas y flavonoles-3-O-sustitutos 5,6dihidroxilados y 5-dihiroxil-6metoxilados.

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Reconocimiento de antocianinas:  A pH ácido presentan coloraciones rojas, violetas y moradas; mientras a pH alcalino presentan coloraciones verdes y azules. Con esta prueba se pueden diferenciar entre las antocianinas y betacianinas (pigmentos nitrogenados de colores rojos y violeta).

TECNICAS CROMATOGRAFICAS: Las técnicas Cromatógraficas usadas para la separación de flavonoides o su detección en un extracto de planta son también muy variadas en cuanto a las técnicas mismas, así como las condiciones en las cuales ellas pueden realizarse; no se pretende en este punto abarcar todas ellas sino dar pautas generales, las que deben ser ampliadas con la literatura especializada.

Cromatografía de papel La cromatografía de papel es la técnica más antigua, aún usada desde su introducción en 1948 por Base Smith, se utilizan sistemas de solventes como BAW (n-buOH:HOAc:H2O,4:1:5,fase superior). Una generalidad puede asumirse al utilizarse sistemas con solventes alcohólicos para las agliconas flavonoides, que para una misma clase el valor de Rf es más bajo cuanto mayor es el número de grupos hidroxilo, y son en la mayoría de los casos más altos que los correspondientes glicósidos. La detección de los flavonoides en ambas cromatografías, de papel y de capa delgada, puede hacerse por el color que desarrollan en el Vis o en el UV, apareciendo como manchas fluorescentes azules, rosadas, naranjas, púrpuras y otras, las cuales se intensifican o cambian de color luego de su exposición a vapores de amoniaco. Geissman y Markham reportan la relación que existe entre los colores y la posible estructura del flavonoide.

TECNICAS ESPECTROMÉTRICAS: El método más usual para un análisis preliminar de la estructura de un flavonoide es quizás la absorción UV-Vis; esta técnica es usada tanto para identificar el tipo de flavonoide como el modelo de oxigenación. Este último puede además ser el mejor definido por el uso de reactivos de desplazamientos los cuales, como su nombre lo indica, provocan el desplazamiento de bandas de absorción. Los espectros de los flavonoides son determinados usualmente en solución metanólica. Los espectros UV de los flavonoides en metanol presentan bandas características debidas a los sistemas conjugados de los anillos aromáticos Las flavonas y flavonoles muestran dos bandas definidas: La banda I, de mayor longitud de onda en el rango 300-390 nm asociada con la funcionalidad cinamoílo,

y la banda II, entre 250-280 nm debida al anillo aromático A (funci onalidad benzoílo), aunque a veces se observan otras bandas de absorción. La posición de la banda depende del tipo de flavonoide: las flavonas la muestran en 310-350 nm, los flavonoles3-O-sustituidos en 330-360 nm, y los flavonoles en 350-385 nm. La presencia de hidroxilos fenólicos en diferentes posiciones de la molécula puede establecerse estudiando el comportamiento del espectro UV metanólico al añadirle los denominados reactivos de desplazamiento: metóxido de sodio (NaOMe), acetato de sodio (NaOAc), cloruro de aluminio (AlCl3) con y sin HCl, y ácido bórico (H3BO3). El NaOMe es una base fuerte que ioniza los hidroxilos fenólicos presentes en la molécula y particularmente permite reconocer la existencia de grupos hidroxilo en 3 y4'. Las flavonas 4'-hidroxiladas y los flavonoles 3-O-sustituidos presentan desplazamiento batocrómico de 45-65 nm para la banda I al añadir NaOMe, y la intensidad de la banda no decrece. Los flavonoles (ó 3-hidroxiflavonas) sin hidroxilo en4', también presentan el mismo desplazamiento batocrómico de 45-65 nm, pero la intensidad de la banda se ve disminuida. En los flavonoles 3,4'-dihidroxilados, orto-dihidroxilados y diorto-trihidroxilados, el espectro se descompone en pocos minutos luego de añadir el NaOMe. La aparición de una banda alrededor de 330 nm (banda III) es característica de flavonas 7hidroxiladas

Prueba cualitativa de flavonoides. Para el aislamiento de flavonoides se recurre a la extracción con solventes de polaridad creciente o directamente con hidróxido de sodio (NaOH). El color amarillo intenso característico de los flavonoides, flavonas y flavonoles.

Preparación de reactivos.  Acetato de plomo Pb (C2H3O2)2 al 10%. Pesar 5 g y disolver en 15 mL de agua destilada, posteriormente aforar a 100 mL. Caducidad de 6 meses. Hidróxido de sodio (NaOH) al 20%. Pesar 10 g y disolver en 25 mL de agua destilada. Agitar después de enfriar y aforar a 100 mL Caducidad de 6 meses.

Procedimiento. a) Pesar 200 mg de los propóleos en bruto o EEP y añadir 5 mL de alcohol etílico y mezclar perfectamente.

b)  Añadir 1 mL de la solución preparada a dos tubos de ensaye marcados como a) y b).

c) Tubo a): añadir una gota de NaOH al 20% y observar un cambio de coloración que va del amarillo a naranja de acuerdo a la cantidad de flavonoides presentes.

d) Tubo b): añadir 500 µL (0.5 mL) de Pb (C2H3O2)2 al 10%, y observar un cambio de coloración que va de un amarillo y la presencia de un precipitado, lo que indica la presencia flavonoides.

Cuantificación de flavonoides. El principio básico del método colorimétrico de cloruro aluminio es que éste forma complejos estables de ácidos con el grupo cetona en C-4 o bien el grupo hidroxilo en C-3 o C-5 de flavonas y flavonoles. Además, también forma complejos lábiles ácidos con los grupos dihidroxilo en el anillo A o B de los flavonoides.

Preparación de reactivos. Solución stock de quercetina (1 mg/mL). Pesar 10 mg de quercetina dihidratada y aforar a 10 mL de metanol grado reactivo. Conservar protegido de la luz y en refrigeración. Tricloruro de aluminio, AlCl3 (2%): Disolver 2 g de cloruro de aluminio en agua destilada y aforar a 100 mL con agua destilada con mucho cuidado ya que el producto es muy corrosivo e higroscópico.

Preparación de la muestra. Pesar 500 mg del EPP y disolverlo en 10 mL de metanol grado reactivo.

Procedimiento Preparación de la curva de calibración.  A partir de la solución estándar de quercetina de1mg/mL, tomar alícuotas correspondientes para obtener concentraciones seriadas de 1 a 90 µg/mL (ppm).

Preparación del blanco de muestra. Tomar 3 mL de la solución del EEP (500 mg EEP/10 mL de metanol) y agregar 3 mL de metanol HPLC.  Al tener todos los sistemas anteriores preparados, se procede de la siguiente manera:

a)  Adicionar a cada tubo 3 mL de la solución de AlCl3, esperar 10 minutos a que se lleve a cabo la reacción y determinar la absorbancia a 415 nm por espectrofotometría de absorción UV-VIS.

b) Graficar la concentración contra la absorbancia para obtener la curva patrón de quercetina.

c) El contenido total de flavonoides se expresa como mg de equivalentes de quercetina (QE)/g de extracto o en porcentaje (%)

Actividad antioxidante: Método del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•). La reducción del DPPH• se monitorea por la disminución en la absorbancia a una longitud de onda característica. En su forma de radical libre, el DPPH• éste absorbe a 515 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante , esta absorción desaparece. En consecuencia, la desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la capacidad del EEP de prueba para atrapar radicales.

Preparación de reactivos. Solución stock de quercetina (1 mg/mL). Pesar 10 mg de quercetina y aforar a 10 mL con metanol grado HPLC. Conservar protegido de la luz y en refrigeración. Solución de DPPH• (100 μM). Pesar 1.9716 mg, disolver y aforar a 50 mL con metanol grado HPLC. Conservar protegido de la luz y en refrigeración.

Preparación de la muestra. Pesar 10 mg del EEP y disolver en metanol grado reactivo, aforar a 10 mL. Las concentraciones a preparar y a evaluar son en un rango de 1 a 40 µg/mL.  Al tener los sistemas anteriores preparados se procede de la siguiente manera:

a) Colocar en tubos de ensaye, 250 µL de la muestra y 750 µL de solución de DPPH•.

b) Proteger de la luz y dejar reposar 30 minutos. c) Determinar la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro de absorción UV-VIS.

d) Como control negativo se utiliza metanol y control positivo se utiliza quercetina a las mismas condiciones que el compuesto problema.

e)  Los resultados se reportan obteniendo el porcentaje de reducción y se calcula con la siguiente fórmula: % de reducción= Absorbancia del DPPH• - Absorbancia de la mezcla (DPPH• + compuesto problema)*100

Elucidación estructural del flavonoide aislado de Alchornea coelophylla Se utilizaron las técnicas de espectroscopía infrarroja de absorción (IR) y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN).  Para tal fin, los espectros infrarrojos del compuesto asilado fueron tomados en estado sólido con ayuda de un Espectrómetro Infrarrojo de Transformada de Fourier (FTIR) Agilent Cary 630, cuya información ayuda con la identificación de los grupos funcionales presentes básicos, además de ser otra herramienta a la hora de realizar búsquedas bibliográficas en bases de datos. Así, la toma de espectros de RMN a la muestra aislada se realizó en el Departamento de Química de la Universidade Federal de Minas Gerais (Belo Horizonte, Brasil) en un Espectrómetro Bruker AVANCE DRX

400, para lo cual se realizaron los siguientes experimentos utilizando como solvente hexadeuterodimetilsulfóxido (DMSO-d6) con algunas gotas de D2O.  1H-RMN  13C-RMN  HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)  HSQC-TOCSY (Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy  – Total

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Correlation Spectroscopy)  COSY (Correlation Spectroscopy). 

Finalmente, con la información recopilada en los anteriores espectros, es posible realizar la determinación estructural a través de las correlaciones existentes entre átomos vecinos.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE: Determinación de la capacidad captadora de radicales libres por el ensayo de ABTS. + La generación del radical catión debe ser considerada en los momentos previos a la realización de cada ensayo, dado que este no es suficientemente estable como para ser guardado por periodos de almacenamiento superiores a dos días. De esta manera, luego de la preparación de la cantidad necesaria de radical, se debe realizar una dilución del mismo para ajustar la absorbancia del mismo a 0.7 ± (0,02) a una longitud de onda de 732 nm. 63 El protocolo seguido para la preparación de la solución del radical catión ABTS•+, conjuntamente, se descr ibe el método por el cual fueron evaluadas el extracto metanólico, las fracciones cromatográficas y el compuesto aislado. Para la evaluación de la actividad antioxidante del extracto crudo metanólico se preparó una solución a 1000 mg/L, posteriormente, dado que la masa con que se contaba para la determinación de las actividades de las fracciones era menor, se prepararon soluciones a 500 mg/L en metanol y para el compuesto aislado se realizó la determinación de la concentración máxima de la media inhibitoria (IC50), concentración a la cual se observa una inhibición del 50% de la carga radicalaria inicial, a concentraciones de 500, 250, 100 y 50 ppm con ayuda de regresiones gráficas en el programa estadístico GraphPadm Prism. Todas las determinaciones para este ensayo, fueron realizados por triplicado en dos repeticiones

BIBLIOGRAFIA https://misremedios.com/vida-sana/beneficios-flavonoides-que-son/ http://spars.es/wp-content/uploads/2017/02/vol34-n3-2.pdf   http://www.dof.gob.mx/normasOficiales/6130/sagarpa11_C/sagarpa11_C.ht ml http://www.scielo.org.mx/pdf/agro/v42n4/v42n4a5.pdf https://es.slideshare.net/irenashh/flavonoides-10307542 http://revistas.lamolina.edu.pe/index.php/xiu/article/viewFile/599/582 Olga L. “INVESTIGACION FITOQUIMICA” Fondo Editorial PUCP. Lima. 1994. Olga L. “COLORANTES NATURALES” Fondo Editorial PUCP. Lima. 1997

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