Final Informe de Practicas 2013 - Wilma

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE AGRONOMÍA Departamento Académico de Ciencias Agrarias

INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES CRECIMIENTO MICELIAL DE BEAUVERIA BASSIANA Y METARHIZIUM ANISOPLIAE EN SEIS MEDIOS DE CULTIVO Y SU PRODUCCIÓN EN CINCO TIPOS DE SUSTRATOS.

EJECUTOR

:

WILMA GONZALES TOSCANO

ASESOR

:

Ing. Msc. GIANNFRANCO EGOAVIL JUMP

LUGAR

:

LABORATORIO DE ENTOMOPATÓGENOS – UNAS.

DURACIÓN

:

3 MESES

INICIO

:

20 DE AGOSTO DEL 2012

TERMINO

:

20 DE NOVIEMBRE DEL 2012 TINGO MARÍA – PERÚ

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ÍNDICE I.

INTRODUCCIÓN .................................................................................... 3

II.

REVISIÓN LITERARIA ........................................................................... 4 A.

BEAUVERIA BASSIANA ............................................................................... 4

B.

METARHIZIUM ANISOPLIAE.......................................................................... 8

C.

MEDIOS DE CULTIVOS .............................................................................. 11

D.

PRODUCCIÓN DE BEAUVERIA BASSIANA Y METARHIZIUM ANISOPLIAE .......... 20

E.

VALOR NUTRICIONAL DE ALGUNOS POSIBLES SUSTRATOS PARA LA PRODUCCIÓN DE BEAUVERIA BASSIANA Y METARHIZIUM ANISOPLIAE

III.

.......... 24

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................ 30 A.

LUGAR DE EJECUCIÓN. ............................................................................ 30

B.

F ASES

IV.

DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICAS PREPROFESIONALES ........ 30

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................. 48 A.

CRECIMIENTO MICELIAL DE B. BASSIANA EN SEIS MEDIOS DE CULTIVOS ....... 48

B.

CRECIMIENTO MICELIAL DE M. ANISOPLIAE EN SEIS MEDIOS DE CULTIVOS .... 54

C.

CONTEO DE CONIDIAS DE B. BASSIANA EN SEIS MEDIOS DE CULTIVOS .......... 61

D.

CONTEO DE CONIDIAS DE M. ANISOPLIAE EN SEIS MEDIOS DE CULTIVOS ....... 68

E.

CONTEO DE CONIDIAS DE B. BASSIANA Y M. ANISOPLIAE EN CINCO SUSTRATOS DIFERENTES ............................................................................................ 76

V.

CONCLUSIÓN ...................................................................................... 84

VI.

RECOMENDACIÓN .............................................................................. 85

VII.

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................... 86

VIII.

ANEXO ................................................................................................. 90

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I.

INTRODUCCIÓN

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae son hongos que crece de forma natural en los suelos de todo el mundo.La aplicación de métodos biológicos para el control de insectos con el hongo Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae constituye en uno de los enemigos naturales más importantes de las plagas, especialmente del orden coleóptera.

Su poder entomopatógeno le hace capaz de parasitar a insectos de diferentes especies, respectivamente,

en

especial

actualmente

es

del

orden

utilizado

coleóptera

como insecticida

y

homóptera biológico

o

biopesticida controlando un gran número de plagas como la broca del café, el gorgojo negro del plátano, etc. Por ello es que se ha planteado en el presente trabajo realizar el estudio sobre el crecimiento micelial de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae en diferentes medios de cultivo y su producción en diferentes sustratos.

Objetivos:  Determinar el crecimiento micelial de 2 cepas de Beauveria bassiana y 2 cepas de Metarhizium anisopliae en seis medios de cultivo.  Producción Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en cinco tipos de sustratos

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II.

A.

REVISIÓN LITERARIA

Beauveria bassiana Los primeros datos sobre B. bassiana fueron emitidos por Agostino Bassi en

1834 cuando demostró que este hongo era el agente causal de una enfermedad en el gusano de seda Bombix mori, conocida como la muscardina blanca. B. bassiana se conoce muy bien por su amplio rango de hospederos y distribución geográfica, ha sido probada por su patogenicidad contra más insectos plagas que cualquiera otra especie de hongo (CARBALLO et al., 2004). Se encuentra distribuido por todo el mundo, de forma saprofítica y parasítica atacando mayormente insectos del orden coleóptero y lepidóptero (COMMONWEELTH MICOLOGICAL INSTITUTE, 1979).

1. Taxonomía y origen Según BARNET y HUNTER (1999), clasifica taxonómicamente a Beauveria bassiana de la siguiente manera: División

: Deuteromycota.

Clase forma

: Deuteromycete.

Orden forma

: Moniliales

Familia

: Moniliaceae.

Género

: Beauveria

Especie

: Bassiana

Según WAINWRIGHT (1995), citado por ESTRADA et al. (1997), señala que B. bassiana es uno de los entomopatógenos más estudiados. COMMONWEELTH MICOLOGICAL INSTITUTE (1979), indica que el hongo B. bassiana, se encuentra distribuido por todo el mundo, en forma saprofítica y parasítica atacando mayormente insectos de orden coleóptero y lepidóptero. ROSSKAMP (1997) y GUARAY (1997), mencionan que constituye en uno de los enemigos naturales más importantes de la broca. Además, Deacon (1983), citado por VELEZ et al. Indica que existe un control biológico, bastante significativo realizado por hongos entomopatógenos ocurre en forma primaria a través de la cutícula.

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2. Distribución en el Perú La distribución de este hongo en el Perú se reportó por primera vez en Huancayo en el que se encontraba gorgojos en estado de larva, pupa y adultos de la especie Premnotrypes suturicallus (Kuschell), infectados con el hongo Beauveria bassiana de en condiciones naturales. para comprobar la patogenicidad del hongo del genero Beauveria

se realizaron trabajos en

laboratorio en invernadero utilizando insectos de la especie Premnotrypes suturicallus (Kuschell) y Epitryx sp. Se reportó en Huatata – Chinchero (Urubamba) se encontró larvas, pupas y adultos del gorgojo de los andes Premnotrypes latithorax Piercei, infectados en forma natural por el hongo Beauveria sp (PLANTAS Y ENTOMOPATOGENOS, 2009).

En el Perú actualmente se encuentran reportadas dos especies del género Beauveria los cuales están ampliamente distribuidos tanto en costa sierra y selva; la especie Beauveria brongniartii (Saccardo) Petch se encuentra en la sierra en los departamentos de Puno, Huancayo, Cajamarca y Cuzco, otra especie del mismo género: Beauveria bassiana (Bals) Vuillemin se encuentra distribuida en la selva alta (San Ramón – Junín) y en la costa (PLANTAS Y ENTOMOPATOGENOS, 2009).

3. Ciclo biológico de Beauveria bassiana El ciclo de vida de B. bassiana (Figura 1) comprende dos fases una patogénica y la otra saprofítica. La fase patogénica involucra cuatro pasos principales: adhesión, germinación diferenciación y penetración. El proceso de infección se inicia con la unión de las conidias del hongo a la cutícula del insecto. Existen sitios preferenciales del tegumento del insecto hospedante donde los conidios se adhieren, germinan y penetran. Estos lugares corresponden a las regiones intersegmentales diferente al resto del tegumento (CARBALLO et al., 1988).

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Las conidias óptimas para él la germinación son: temperatura de 23 25ºC y humedad del 92%. El conidio germina originando un tubo germinativo en cuyo extremo de diferencia un apresorio cuya función podría ser debilitar la cutícula en los puntos de contacto o simplemente es una transición hacia la formación del pico o estaquilla de penetración (CARBALLO et al., 1988). B. bassiana penetra la cutícula principalmente por las partes frágiles de los insectos originando dos procesos: uno físico debido a la presión de las hifas que rompen áreas membranosas y poco esclerotizadas; y otro químico, por la elaboración de enzimas producidas durante la germinación y penetración como son quitinasas, proteasa y lipasas que degradan la cutícula. La muerte del insecto ocurre por acción de mico toxinas, el rompimiento de tejidos bloqueo mecánico del aparato digestivo y otros daños físicos por desarrollo del micelio (CARBALLO et al., 2004).

Figura 1. Ciclo de vida de Beauveria bassiana (CARBALLO et al., 2004)

Previo a la penetración del hongo, hay una actividad metabólica a nivel de apresorio que ayuda a degradar la capa cerosa de epicutícula probablemente con enzimas proteasas, amilopeptinas y esterasas que facilitan el proceso de penetración, primero sobre la porción cerosa de la epicutícula y luego sobre la matriz de proteína y quitina. Otra vía de entrada es a través del tracto digestivo pero generalmente los

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conidios no pueden germinar en el intestino. Además la multiplicación del hongo en el interior del hospedero conduce a la producción de hifas y blastosporas y la producción de toxinas que en conjunto van a provocar la enfermedad y la muerte del insecto esta ocurre con la acción física del micelio mismo invadiendo los órganos y tejidos comenzando por el tejido graso y también por la caída o desbalance de nutrientes y por la acción insecticida de los metabolitos tóxicos emitidos por el hongo, principalmente la beauvericine. Los cadáveres de insectos infectados por B. bassiana, presentan una cubierta blanca muy densa formada por el micelio y esporulación del hongo. Generalmente, los cadáveres de insecto atacados se momifican quedando adheridas en la planta principalmente en el envés de la hoja (CARBALLO et al., 1988).

4. Características morfológica Este hongo presenta unas estructuras que son visibles al microscopio llamadas fialidas o células conidiógenas que tienen una base globosa o sea en forma de botella y se extienden apicalmente en grupos densos. Estas fialidas presentan un raquis que es denticulado en zig-zag y se extiende apicalmente con un conidio denticulado (CARBALLO et al., 1988).

El conidióforo mide de 1-2 µ de diámetro donde nacen células conidiógenas en grupos grandes (CAÑEDO y AMES, 2004). La conidia es aceptado, globoso y menor a 3.5 mm para B. bassiana (CARBALLO et al., 1988). Además CAÑEDO y AMES (2004), indican que estas conidias son hialinas, globosas a subglobosas, de 2 a 3 x 2 a 2.3 µ que se insertan sucesivamente en el raquis en forma opuesta.

Las Células conidiógenas (c.cs.), están agrupadas formando grupos compactos grandes y a veces solitarias, en forma de botellitas de 3 a 6 x 3 a 5 µ. En ciertos casos, las c.cs. Se ramifican formando c.cs secundarias. Al final de las c.cs se forma un raquis que sostiene las conidias. El raquis mide: hasta de 20µ de longitud y 1µ de diámetro, denticulado, que sostiene una conidia en cada dentícula (CAÑEDO y AMES, 2004).

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El micelio es de color blanco y los conidios presentan una coloración blanca a crema (CARBALLO et al., 1988). En medio Agar Papa Dextrosa, la colonia a los 14 días es algodonosa a polvorienta, blanca. A medida que va pasando el tiempo se vuelve amarillento, cremoso. El revés es de color rojizo al centro y amarillento alrededor (CAÑEDO y AMES, 2004). 5. Importancia a. Agricultura B. bassiana. se encuentra afectando a una serie de insectos. Este hongo desarrollado en medio de cultivo bajo condiciones de laboratorio, siendo factible de multiplicarlo en forma masiva utilizando como sustrato una de serie de granos, como arroz, cebada, trigo, maíz partido, etc (GOMEZ et al., 2002). Las colonias que desarrollan en medios de cultivos, presentan un aspecto aterciopelado o pulverulento, de color blanco, tomándose amarrillo pálido a medida que la colonia envejece, lo cual se observa en el reverso de la placa de cultivo. La fructificación está constituida por células conidiogenas que forman conidias sucesivas en un raquis que se desarrolla en forma de zig-zag. Esta fructificación ocurre como synema o conjunto de células conidiogenes unidas (B.bassiana) (GOMEZ et al., 2002). B.

Metarhizium anisopliae 1. Taxonomía Según BARNETT & HUNTER (1999), clasifican a M. anisopliae de la

siguiente forma: División

: Deuteromycota.

Clase

: Deuteromycete.

Orden

: Moniliales

Familia

: Moniliaceae

Género

: Metarhizium

Especie

: anisopliae

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2. Origen y distribución Metarhizium anisopliae es el agente causal de la muscardina verde y es un patógeno de más de 300 especies de siete órdenes de insectos. Los Coleópteros son los hospederos más comunes (CARBALLO et al., 2004).

3. Ciclo biológico de Metarhizium anisopliae El ciclo de vida de M. anisopliae comprende una fase patogénica que se inicia con la unión de los conidios del hongo a las partes frágiles de la cutícula del insecto. Si las condiciones de humedad son adecuadas, ocurre la germinación de los conidios originando un tubo germinativo y luego se forma la estaquilla de penetración para penetrar la cutícula. Antes de que ocurra la muerte del insecto proliferan cuerpos hifales. La muerte del insecto marca el fi n de la fase patogénica y el micelio empieza a crecer saprofíticamente dentro del hemocele invadiendo todos los tejidos. La muerte del hospedante ocurre tanto por el efecto mecánico del hongo como por el efecto de los metabolitos tóxicos producidos. Después de la muerte, ocurre una fase de crecimiento micelial hacia el exterior que concluye con la producción de nuevas unidades reproductivas (conidios) sobre la superficie y rodeando el cadáver del insecto (CARBALLO et al., 2004).

4. Modo de acción Después de germinar, el hongo penetra al insecto por las regiones frágiles de la cutícula mediante la acción física propia del hongo a través de las estructuras formadas después de la germinación como son los apresorios y la estaquilla de penetración y también mediante la acción química gracias a la participación de enzimas como proteasas, lipasas y quitinasas que degradan la cutícula (CARBALLO et al., 2004).

Además de la acción física del micelio producido por la multiplicación del hongo en el interior del cuerpo del insecto que invade los órganos y tejidos, es muy importante la participación de las destruxinas que tienen una acción insecticida propia. El hospedero produce reacciones de defensa celular por

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ejemplo granulomas que son tejidos formados para rodear el micelio. Las toxinas producidas por el hongo erosionan estos granulomas y permiten a las blastosporas invadir el hemocele. Las toxinas también matan al hospedero al provocar una degradación progresiva de sus tejidos debido a la pérdida de integridad estructural de las membranas y la consecuente deshidratación de las células por pérdida de fluidos (CARBALLO et al., 2004).

M. anisopliae produce varias toxinas entre ellas los ciclodepsipeptideos como las dextruxinas A, B, C, D y la desmetildextruxina B y otras como la A1, A2, B1, C2, D1, D2, y E1. Son compuestos tóxicos para los insectos por inyección intrahemocélica y su efecto tóxico varía con la especie de insecto. Otros compuestos son las cytochalasinas que pueden contribuir al desarrollo de la enfermedad en insectos afectados por Metarhizium (CARBALLO et al., 2004).

Los insectos enfermos presentan cambios de conducta, entre ellos cese de la alimentación, perdida de coordinación, movilización a partes altas de la planta en que se encuentran o movilización hacia la superficie del suelo en caso de insectos del suelo y síntomas como cambio de coloración del tegumento o manchas en la piel. Después de morir, permanecen como cadáveres presentando los signos característicos como son crecimiento del hongo en las zonas inter segmentales del insecto y una coloración verde por efecto de las esporulación (CARBALLO et al., 2004).

5. Características morfológica Visto al microscopio, M. anisopliae presenta células conidiógenas (fiálidas) de forma cilíndrica, con ápices redondeados o cónicos y están arreglados

en

densos

himenios.

Los

conidióforos

son

ramificados

repetidamente formando una estructura semejante a un candelabro. Los conidios son septados, cilíndricos u ovoides, formando cadenas usualmente arregladas en columnas prismáticas “o cilíndricas o en masas sólidas de

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cadenas paralelas. Su color varía entre el verde pálido o brillante a verde amarillo u oliváceo. M. anisopliae var. anisopliae presenta conidios cortos de 3.5 a 9 μm mientras que M. anisopliae var. Mejorada presenta conidios de 9 a 18 μm. Los cadáveres de los insectos afectados, se observan completamente cubiertos con micelio del hongo de color blanco. Cuando el hongo esporula sobre el cadáver, adquiere una coloración verdosa (CARBALLO et al., 2004).

6. Importancia a. Agricultura Es el segundo hongo entomopatógeno más ampliamente usado en el control microbial y es el hongo más utilizado en Latinoamérica para el control de diferentes especies de Cercópidos que son plagas en la caña de azúcar (CARBALLO et al., 2004).

C.

Medios de cultivos Las sustancias nutritivas preparadas en el laboratorio para el crecimiento de

microorganismos se conocen como medio de cultivo. Algunoshongos y bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras necesitan medios especiales y aún hay algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios inertes desarrollados hasta ahora. Los microbios que crecen y se multiplican dentro o sobre un medio de cultivo constituyen lo que se denomina cultivo microbiana (TORTEZA et al., 1993).

Hay una gran variedad de medios disponibles para el cultivo en laboratorio de los microorganismos. La mayoría de ellos, que están disponibles comercialmente, tienen sus componentes previamente mezclados y necesitan sólo la adición de agua y la esterilización. Para los medios utilizados en el aislamiento e identificación de las bacterias que son de interés para los investigadores en áreas como alimentación, aguas y microbiología clínica, hay constantes revisiones de las antiguas fórmulas e introducción de otras nuevas (TORTEZA et al., 1993).

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1. Tipos demedios de cultivo Según TUITE (1969), clasifica a los medios de cultivos de la siguiente manera:

a. Según su consistencia i.

Liquido.- No se adiciona ningún elemento solidificante. Se utiliza

principalmente en el incremento de bacterias, en las determinaciones de sus propiedades fisiológicas, para el incremento masivo de bacterias y hongos con fines experimentales (generalmente bajo agitación) y para el estudio de crecimiento de microorganismos. Ejemplo: Caldo nutritivo (Bacterias), caldo papa (Hongos), melaza de caña de azúcar (Trichoderma spp.), etc.

ii. Sólido: Lleva compuestos solidificantes que endurecen el medio de cultivo como el agar gelatina, gelatina inorgánica. El uso principal es para el aislamiento de hongos y bacterias Ejemplo: Agar nutritivo (Bacterias), Agar Papa Dextrosa (para cualquier fitopatógeno). Malta Agar (Basidiomycetos) Oat Meal Agar(Phytophthora palmivora), etc.

b. Por sus propiedades nutritivas i. Carentes de nutrición 

Agua: Se utiliza agua desionizada estéril, usado para la

conservación de bacterias en el estado latente e inmutable o estado de conservación de Fusarium spp. (clamidosporas). 

Agar agua: Para el estudio de determinado compuestos y ver el

efecto de ciertos compuestos (nutricionales). 

Nitrógeno líquido: Mantiene en estado congelado al hongo o

bacterias a temperaturas de 190ºC.

ii. Medio nutritivo 

Natural: Consiste únicamente de material vegetal. Ejemplo:

Tejido vegetal aséptico (hojas y pétalos de clavel), tejido vegetal esterilizado (granos de cereales), tejido vegetal macerado (pastas y jugo de papaya).

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

Semisinteticos o complejos: Contiene sustancias naturales y

sintéticas o definidas. Ejemplo: Extracto de carne (Medio Extracto de Carne, Gelatina), extracto vegetales (Medio Caldo Papa, Gelatina), preparados vegetales como los medio: Oat Meal Agar (OMA), Corn Meal Agar (CMA), V8, Agar Extracto de Malta (MEA), Agar Papa Dextrosa (PDA), etc. 

Sintéticos o definidos: Todo su contenido es químicamente

definible, aunque generalmente son aceptables algunas impurezas. Ejemplo: Medio Czapecks, Solución Richard, etc. 

Selectivos o diferenciales: Se denomina diferenciales a los

medios que contienen sustancias (no necesariamente nutritivas) con un papel especial para identificar, seleccionar, o caracterizar

microorganismos.

Ejemplo: Medio Tetrazolio (TZC) usado para Pseudomonas spp.,etc.

2. Medios de cultivo y posibles insumos para preparar medios de cultivos artesanales a. Agar Papa Dextrosa Para la preparación de medio de cultivo según CAÑEDOet al. (2004), menciona las siguientes cantidades e insumos: 200 g papa sin pelar, 10 g dextrosa, 18 g agar y enrazar a 1 L agua destilada. Además CAÑEDO et al. (2004) indica el siguiente procedimiento de preparación: Lavar las papas, cortarlas y hacerlas hervir en un litro de agua destilada por 20 minutos, colar y disolver en el líquido la dextrosa y el agar. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión.

Es un medio muy usado que sirve para aislar todo tipo de hongos. Beauveria, Paecilomyces, Lecanicillium (Verticillium)y Metarhizium, los más importantes hongos parásitos de insectos, al igual que los parásitos de plantas y los hongos saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio. Cuando se aíslan hongos a partir de insectos colectados del suelo, es recomendable acidificar el medio con ácido láctico al 25%. Se agregan 3 ó 4 gotas sobre el agar solidificado de la placa con el objeto de evitar el desarrollo de bacterias. Con los

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mismos ingredientes, excluyendo el agar, se obtiene el medio líquido de Papa Dextrosa (PD), muy utilizado para la preparación del inoculó en forma masiva (CAÑEDOet al., 2004).

b. Agar granulado El agar agar es un polygalactosa soluble en agua que se obtiene de las algas marinas del Gelenium sesquipedal. El agar agar se mantiene solidificado en las temperaturas de crecimiento para muchos microorganismos y es generalmente resistente al daño ocasionado por las enzimas bacterianas. El agar es un gel en la temperatura ambiente, debilitando su firmeza hasta la temperatura de 65° C derritiéndose aproximadamente 85° C, una temperatura diferente para que el agar solidifique es de 32-40° C. El agar-agar se utiliza en una concentración final de 1-1.5% (1.0-1.5 g/100 ml) para los medios de cultivo de sólidos. Cantidades más pequeñas son utilizados en los medios para estudios de la movilidad (0.5% o 0.05 g/100 ml) y para el crecimiento de los anaerobios (0.1% o 0.01 g/100 ml) y de los microaerophiles. Si el medio de cultivo tiene un pH