Factores Afectan Metodo Espectrofotometrico

Instituto Politécnico Nacional Escuela nacional de ciencias biológicas Departamento de bioquímica Laboratorio de métodos de análisis.

Estudio de algunos factores que afectan el establecimiento de un método espectrofotométrico.

Castillo Avila Fernando 5QM2 Profesora: Gabriela Edith Olguín Ruíz

Objetivos: 

Seleccionar tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el espectrofotómetro.



Manejar algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un método espectrofotométrico.



Establecer las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación del método.

Fundamento de la práctica :

El fundamento del equipo se basa en la cantidad de luz que es absorbida y en la cantidad de luz que es transmitida cuando se le incide un haz de luz monocromada a una muestra colorida, la resultante de la suma de la luz transmitida más la absorbida nos da igual a la intensidad de la luz que le hacemos incidir. La elección de tubos adecuados se fundamenta en escoger los que sean de paredes ópticamente equivalentes y diámetros regulares equivalentes. La reacción se fundamenta en la formación de un complejo colorido entre el ion férrico presente en algún tipo de muestra con el tiocianato, este complejo es de color rojo y puede cuantificarse a 480 nanómetros. Resultados: 1:- Selección de tubos para ser usados como celdas.

Se calibro el espectrofotómetro al aire a 0% de transmitancia a 400 nm, después se introdujo un tubo y se calibro el espectrofotómetro al 95% de transmitancia y posteriormente se introdujeron varios tubos buscando que tuvieran valores cercanos de más menos 2 unidades de transmitancia al 95%, esto para ver que tuvieran superficies ópticamente equivalentes, posteriormente para ver si eran de diámetro interno equivalente se les adiciono una solución de sulfato de níquel, la cual nos mostraría las pequeñas variaciones en el paso de luz, se usó un tubo con agua para calibrar a 100% de transmitancia y se buscaron tubos que no dieran más de dos unidades de diferencia, así llegamos a la conclusión de que 13 del total de tubos proporcionados cumplían con estas dos características y podían ser usados como celdas. El diámetro interno equivalente hace referencia a que los tubos deben de tener la misma medida de diámetro a lo largo del tubo para evitar variaciones en los resultados, y superficies ópticamente equivalentes se refiere a que en la superficie d el tubo debe de ser de tal manera que la luz pase de manera homogénea a través de el, y del resto de los tubos.

2.- Curva de calibración.

Ecuación de la recta: y = 0.015x Ejemplo de la corrección de absorbancia: Para el valor de 0.698, este valor corresponde a la concentración de ion férrico, por lo tanto corresponde al eje de las X, así que para calcular el nuevo valor de y o de absorbancia para esa concentración, simplemente se multiplica el valor por la pendiente quedando así: Y = 0.015 x 0.698 .: Y = 0.0104 que es el valor de absorbancia corregida.

   i

Figura 1.- Tabla que muestra los

Concentración del ion férrico

valores de absorbancias obtenidos a lo largo de la práctica de curva de

Figura 2.- Gráfico que muestra la curva de titulación junto con su

titulación, también se incluyen los

línea de tendencia, también se muestra e l valor de la r que nos

valores ajustados de Absorbancia.

muestra que los datos se comportan como una recta dándonos su

2

correspondiente ecuación. 2

Discusión: Que el valor de r  nos diera muy parecido a uno, nos indica que nuestros datos se comportan como una recta y el grafico nos dice que la ordenada se encuentra al origen, así que podemos decir que se trabajó bien, podemos usar la ecuación del grafico para interpolar datos de absorbancia que es la variable dependiente de la concentración, y así obtener la concentración de una muestra problema. Que nos diera como resultado una línea recta nos indica que se cumple con la ley de Bouger y Beer ya que se observa que la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la concentración de la muestra por medio de la ecuación. En la ecuación y corresponde a la absorbancia, x a la concentración y el valor de 0.015 es el coeficiente de absorción. Determinación del %Ep

El %Ep es igual al valor de absortancia. El valor de transmitancia se puede calcular despejando %T de la siguiente formula: A= 2 – log %T donde A: Absorbancia .: %T= 10

(2-A)

después calculamos la absortancia Abs = 100 - %T

Ejemplo: para la absorbancia de 0.01047; se calcula %T; %T = 10

(2-(0.01047))

Abs = 100 - %T .:

.: %T = 97.618% después calculamos la absortancia Abs = 100 – 97.618 .:

Abs = 2.38 y este es nuestro porciento de

error.

   i    c    t    r    s

Log [Fe

3+

]

Figuras 3.- y 4.- Muestran los valores calculados para el logaritmo de la concentración de iones férricos, el % de transmitancia y la absortancia, la gráfica muestra como la línea de tendencia tiene forma sigmoidea, en la parte recta de dicha curva es donde se observa que el error fotométrico es mínimo.

Como podemos observar en la gráfica, las determinaciones que se hicieron en los tubos 5, 6, 7, 8, 9 y 10, fueron en las cuales el error fotométrico fue mínimo, indicándonos que estos valores corresponden a la zona donde el error es muy bajo y por lo tanto es la zona que debemos utilizar. 3.- Efecto del tiempo en la estabilidad del color

Figuras 4.- y 5.- Tabla de resultados de la estabilidad del color con respecto al tiempo y su r espectivo gráfico.

Discusión: Se puede observar que a lo largo del tiempo la absorbancia va disminuyendo, esto nos indica que el color no es estable, la inestabilidad se puede deber a muchos factores, como la luz, radiaciones de más energía, la presencia de agentes contaminantes en el aire o el mismo oxígeno. El tiempo estable va de los 60 a los 120 minutos, porque es donde observamos que los datos forman una meseta, lo que nos indica que es estable el color al no variar. a) ¿es estable el color? No, no lo es, ya que se observan variaciones de lectura a lo largo del tiempo. b) ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas? Entre los 60 y 120 minutos, ya que en este intervalo es donde se observa menor variación entre los datos. 4.- Efecto de la concentración de cromógeno

Figuras 6.- y 7.- Tabla que indica los valores obtenidos en la práctica para este experimento y su respectivo grafico donde observamos el efecto de la conce rtación de tiocianato en la determinación de iones férricos.

Discusión: Se observa que a concentraciones muy altas, superiores a 29000 micro moles por mililitro hay una constancia en la absorbancia, es decir, el máximo de absorbancia se da a estas concentraciones muy altas, por eso en las demás experiencias se usa a concentraciones de saturación. ¿Qué concertación de tiocianato recomienda? Se recomienda una concentración saturada de tiocianato, porque se observó en la gráfica que a concentraciones muy altas se da la mayor absorbancia por parte del complejo colorido.

5.- Efecto del pH

Figuras 8.- y 9.- Tabla con valores de pH y su correspondiente absorbancia, la gráfica muestra el efecto del pH sobre la estabilidad del color.

Discusión: Se observa que a pHs ácidos la absorbancia es mayor, en cambio a pHs al calinos el color casi desaparece, esto se debe a que el hierro es más soluble a pHs ácidos además a pHs alcalinos puede que no se lleve a cabo la reacción de manera satisfactoria, o los iones hidroxilo compitan contra el tiocianato por estar con el hierro. a) ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido?

Influye evitando que se

lleve a cabo la reacción o separando los iones una vez formado el compuesto colorido.

b) ¿Cuál es el pH recomendado para que se efectué la reacción? El pH recomendado es de 1 a 3, ya que observamos los puntos más altos de absorbancia en estos valores de pH.

6. - Efecto de algunos iones sobre la absorbancia absoluta.

Figura 10.- Tabla de valores de absorbancia para cada ion, antes y después de agr egar el anión.

Discusión: Se observa que el hierro es más afín a los aniones fluoruro y oxalato que al tartrato y al fosfato, esto se aprecia por que en los dos primeros aniones, la absorbancia es mucho más baja que en los dos últimos, y esto se debe a la competencia que tiene el fluoruro y el oxalato contra el tiocianato para unirse al hierro. a) ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción? El efecto es una competencia entre algunos aniones, como el fluoruro o el oxalato por el hierro. b) ¿A qué se debe este efecto? Ya que el fluoruro al ser muy electronegativo se ve atraído por las cargas positivas del hierro, y el oxalato tiende a formar un nuevo complejo de tres moléculas de oxalato por un catión férrico. Determinación del límite de detección del analito.

El límite de detección del analito se puede definir como la concentración de analito que proporciona una señal igual a la señal del blanco más tres veces la desviación estándar del blanco. Esto nos sirve para calcular la concentración mínima de analito que puede detectar nuestro método espectrofotométrico. LDD= 3Sb/m Donde Sb es la desviación estándar del blanco y m es la pendiente. Si: y = 0.015X; y Sb= 0.5857073 LDD= 0.5857073/0.015 detectable de analito.

.: LDD = 39.0471 μg/mL, esta es la concentración minima

7.- Parámetros óptimos para el método del tiocianato de amonio para determinar iones

férricos.

Figura 11.- Tabla que nos indica los valores óptimos para cada determinación.

Conclusiones: Es posible usar tubos normales de ensaye como cubetas siempre y cuando cumplan con ciertas características. Los parámetros que pueden interferir en un método espectrofotométrico son: pH, tiempo, temperatura, concentración del cromógeno, etc. Las condiciones óptimas para llevar a cabo la reacción se dan a pH muy ácidos, de preferencia después de que pasara una hora, a concentraciones de cromógeno saturadas, y evitando la presencia de aniones que pudieran interferir con la medición, como los fluoruros o los oxalatos. Es posible usar la curva de calibración para interpolar absorbancias y así obtener datos de concentración.

Bibliografía:

D.A. Skoog, J.J. Leary, Analisis Instrumental, Ápendice 1, McGraw-Hill, 4ta. Edición, 1994. Análisis instrumental, Calibración y límite de detección en técnicas instrumentales, pdf,  pág. 9, sin autor, fecha de consulta: 19/08/2013.