Extracción de Saponina en Cucumis Dipsaceus Ehrenberg Ex Spach y Evaluar Su Actividad Cicatrizante

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD: CIENCIAS NATURALES Y MATEMATICA ESCUELA: QUIMICA CURSO: INVESTIGACION QUIMICA I PROFESOR: BARRETO YAYA, DANILO ARTURO

“Extracción de saponina en Cucumis dipsaceus Ehrenberg ex Spach y evaluación de su actividad cicatrizante” PROYECTO:

TRABAJO: OBJETIVOS, HIPOTESIS Y METODOLOGIA ALUMNO: MIGUEL OCTAVIO MORALES CENTENO

Investigación Química 0

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

1. 2. 3. 4. 5.

6.

7. 8.

9. 10. 11. 12.

RESUMEN INTRODUCCION OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GENERAL 3.2. OBJETIVO ESPECIFICO HIPOTESIS CLASIFICACION BOTANICA 5.1 UBICACION SISTEMATICA DE LA ESPECIE CUCUMIS DIPSACEUS 5.2 HABITAT 5.3. USOS POPULARES SAPONINAS 6.1. CONCEPTO 6.2. IMPORTANCIA DE LAS SAPONINAS 6.2.1 ACCIONES FARMACOLÓGICAS CICATRIZANTE PARTE EXPERIMENTAL 8.1. MATERIALES, APARATOS Y REACTIVOS 8.2. PREPARACION DE LA MUESTRA, CARACTERISTICAS Y VALORACION. 8.2.1. PREPARACION DE LA MUESTRA 8.2.1.1. RECOLECCION 8.2.1.2. ESTABILIZACION 8.2.1.3. MOLIENDA 8.3.2. EXTRACCION DE SAPONINAS 8.3.2.1. EXTRACCION ETANOLICA 8.3.2.2. DESENGRASADO Y DESPIGMENTACION 8.3.2.3. EXTRACCION BUTANOLICA 8.3.2.4. ENSAYO DE RECONOCIMIENTO 8.3.2.5. ANALISIS CROMATOGRAFICO RESULTADOS DISCUSIONES DE RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLOGRAFIA

Índice de figuras

Investigación Química 1

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Figura N°1………………………………………………………………………………………… ……………………13 Figura N°2………………………………………………………………………………………… ……………………16 Figura N°3………………………………………………………………………………………… ……………………24 Figura N°4………………………………………………………………………………………… ……………………25 Figura N°5………………………………………………………………………………………… …………………….26 Figura N°6………………………………………………………………………………………… …………………….27 Figura N°7………………………………………………………………………………………… …………………….27 Figura N°8………………………………………………………………………………………… ……………………..28 Figura N°9………………………………………………………………………………………… ……………………..29 Figura N°10………………………………………………………………………………………… ……………………30

Investigación Química 2

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Figura N°11………………………………………………………………………………………… ……………………31 Figura N°12………………………………………………………………………………………… ……………………31 Figura N°13………………………………………………………………………………………… ……………………32 Figura N°14………………………………………………………………………………………… ……………………33 Figura N°15………………………………………………………………………………………… ……………………33 Figura N°16………………………………………………………………………………………… ……………………34 Figura N°17………………………………………………………………………………………… …………………….35 Figura N°18………………………………………………………………………………………… …………………….38 Figura N°19………………………………………………………………………………………… …………………….33

Investigación Química 3

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL 1. RESUMEN

Se ha realizado el estudio del Cucumis dipsaceus, planta originario de la región del Merriteraneo y Oceanía; debido al uso común que brinda a los pobladores de la Costa, Sierra y Selva, quienes usan el fruto como detergente para el lavado de cabello, ropa; como también actividad farmacologica. Esta es materia de investigación el estudio farmacológico de la planta, obteniendo las saponinas a las que se debe el efecto cicatrizante y antiinflamatorio. El uso popular que se le dio al boliche al “Jaboncillo de campo”, vuelve a tomar relevancia en Cucumis dipsaceus, del que a través de la técnica de extracción etanolica, desengrasado y dispegmentada con éter de petróleo, de la extracción butanolica y de la deshidratación con sulfato de sodio anhidro, se obtuvo un sólido y mediante la técnica de coloración,

formación

de

espuma

se

demostró

la

presencia

de

saponinas, además con el reactivo de salkowski y el reactivo de Lieberman burchard he podido demostrar que tipo de saponinas triterpenicas o

de tipo esteroides se encuentra en muestra , luego

realice cromatografía de capa fina, capa preparativa columna (CC), lo cual va a purificar

la muestra y obtener el principio activo que nos

interesa como es la saponina para su posterior lectura por el

Investigación Química 4

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL espectrofotometro Infrarrojo y UV-visible para poder confirmar la presencia de saponina, presente en el fruto de Cucumis dipsaceus. 2. ANTECEDENTE

Las plantas medicinales constituyen unos de los principales recursos terapéuticos tanto en el medio rural como en el suburbano, siendo los tradicionales la única alternativa médica para la casi toda la población peruana. Esto es debido a que como bien se ha documentado, las plantas medicinales juegan un papel importante en la salud humana, principalmente en regiones donde todavía se conserva su práctica y su uso milenario. El conocimiento medico tradicional se trasmite y se conserva mediante tradición oral y son los etnobotanicos y médicos tradicionales los principales recopiladores de dicho conocimiento. Sin embargo es importante tener cuidado en la desaparición de diversas plantas, si como el conocimiento que solo lo manejan las personas mayores que resguardan el saber de las plantas medicinales (Osuna et al..2005). Las plantas han sido siempre una buena fuente de alimentos y la medicina y la relevancia de los productos a base de plantas ha ganado mucho interés debido a su nutracéutico propiedad con menos efectos

Investigación Química 5

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL secundarios. Los efectos de nutrientes son dosis - dependiente y la escasez se llaman deficiencias (Audrey, 1994) Las plantas medicinales se han utilizado para tratar una gran variedad de enfermedades como la diabetes, cáncer, artritis, enfermedades infecciosas, tumores, heridas entre otras. Debido al interés del presente a continuación describiremos investigaciones realizadas con plantas medicinales y su efecto cicatrizante. Uno de los cicatrizantes naturales más estudiados es el árbol conocido como Sangre de Grado,Croton lechleri L. (Euphorbiaceae) crecido en la jungla Peruviana. Diversos estudios In vivo e in vitro demuestran dicho efecto, siendo el alcaloide taspina identificado como el responsable de dicho evento. Algunos de los estudios que validan esto son el realizado por Vaisberg et al.(1989), donde evaluó al alcaloide en fibroblastos de piel

humana

a

diferentes

concentraciones

y

tiempos

sobre

su

proliferación y toxicidad.

En cuanto a la planta Peperomia galioides H.B.K. (Piperaceae), conocida como “congolona”, es una planta suculenta utilizada en forma de compresa, aplicada en cortadas y heridas para acelerar la cicatrización. Trabajos realizados por Hammond et al. (1997) demostraron que el extracto etanolico in vivo acelera el proceso de cicatrización.

Investigación Química 6

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL En tanto que Juana QUE? ,et al.(2004), elaboraron una crema hecha a base del extracto etanólico de cera de caña, que es un producto natural derivado de la industria azucarera compuesto por alcoholes superiores, ácidos grasos y fitoesteroles; la cual fue evaluada en diferentes concentraciones que van de 2.5 a 40% del extracto sobre heridas hechas en la región escapular de ratones, utilizando como control positivo a la crema de pantenol al 5%; las aplicaciones se realizaron diariamente de manera tópica durante un periodo de 21 días. Así mismo, el extracto acuoso de la hoja de Alcalypha langiana Muell. (Euphorbiaceae), es una hierba que crece en México y es conocida comúnmente como “arlomo”, fue evaluado mediante experimentos de cicatrización de heridas producidas quirúrgicamente (incisión) y por un rasguño profundo (excisión) en animales de experimentación (ratas Wistar). En tanto la planta Anredera diffusa (Bassellaceae), conocida como Lloto, es usada tradicionalmente para lavados de heridas externas en Perú. Un estudio preliminar del extracto etanolico de hojas frescas y tallos de dicha planta demostró tener una actividad cicatrizante del 37% en ratones con heridas de tipo incisión a una concentración de 25 mg/ml. Sin embargo, este extracto fue hidrolizado en una mezcla de ácido sulfúrico y tolueno para eliminar todos los glucósidos y fue aplicado en ratones a una dosis de 4 mg/ml y observándose que su actividad Investigación Química 7

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL cicatrizante no se perdió. Posteriormente, el extracto hidrolizado se pasó por una cromatografía con tolueno, en donde se obtuvo al ácido oleanólico (triterpeno pentacíclico), el cual fue probado de la manera antes mencionada, mostrando una actividad cicatrizante del 42.9%, en tanto que el control que fue el terpeno +-aminol a una concentración de 50 mg/ml fue del 17.6%. Estos datos sugieren que el ácido oleanólico obtenido de la planta A. difusa es el metabolito responsable de la actividad cicatrizante, por lo que fue comparado con ácido oleanólico comercial de Sigma-Aldrich, con el cual se observó que la mayor actividad cicatrizante (39.3%) se presentó con una concentración de 40 μg/Kg/peso de ratón (Moura-Letts et al., 2006) Así mismo, Buddleja globosa (Buddlejaceae), conocida comúnmente como “mático”, especie nativa de Chile, Perú y Argentina, presenta también propiedades cicatrizantes. Esto debido a que la infusión de sus hojas es usada en forma tópica para el tratamiento de heridas, quemaduras y úlceras externas e internas. La evaluación farmacológica de extractos seriados obtenidos a partir de sus hojas ha permitido demostrar las propiedades antiinflamatoria, analgésica, cicatrizante y antioxidante de los extractos hexánico, diclorometano y metanólico resultando más activos los dos últimos .Del extracto hexánico se ha aislado una mezcla de α y β amirinas como sus componentes mayoritarios. Del extracto bioactivo de diclorometano se ha aislado una Investigación Química 8

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL mezcla de esteroides siendo el glucósido de β-sitosterol el más abundante, junto con estigmasterol, estigmastenol, estigmastanol, campesterol y β-sitosterol. Los feniletanoides y flavonoides fueron los compuestos más abundantes del extracto metanólico, en especial verbascósido, 7-O-glucósido de luteolina, quercetina, 7-O-glucósido de apigenina siendo los dos primeros los mayoritarios (Backhouse et al., 2008)

En resumen la cicatrización que se ve favorecido con el empleo de algunas plantas con acción astringente (plantas con taninos), antiséptica (plantas con esencia) y antiinflamatoria (plantas con taninos, mucílago, azuleno) o bien con aquellas que contienen sustancias como la alantoína o el asiaticósido que favorecen la regeneración epitelial. Ya que por ejemplo, los taninos son de gran utilidad en la curación de heridas y cuidado de la piel al cicatrizar, en detener el sangrado e impedir el desarrollo de bacterias, etc., debido a su actividad astringente. En el tratamiento de quemaduras, los taninos hacen que las proteínas de los tejidos

expuestos

se

precipiten,

formando

una

capa

protectora

ligeramente antiséptica debajo de la cual se lleva a cabo la regeneración de tejido (D a ́ melio, 1999). En Brasil, la planta Chamomilla recutita L . Rauschert , pertenece a la familia Asteraceae y es una de las plantas más usadas en este país. Un Investigación Química 9

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL análisis comparativo entre esta planta y diferentes corticoesteroides: como el propionato de clobetasol y la acetonita de triamcinolona (uno de los

tratamientos

para

el

control

de

úlceras

y

enfermedades

inflamatorias), en la cicatrización demostró en un modelo de ratones que el proceso de cicatrización era más rápido en el grupo de ratones tratados con C. recutita (5 días) que con el corticoesteroide (14 días) (Domínguez et al., 2008).

3. OBJETIVOS  Objetivo general  Aislar e identificar cualitativamente saponina en la de la especie vegetal Cucumis dipsaceus Ehrenberg ex Spach.  Objetivo especifico

Investigación Química 10

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL  Determinar la factibilidad de la actividad cicatrizante del

extracto

del

fruto

del

Cucumis

dipsaceus

Ehrenberg ex Spach en la industria farmacéutica.  Evaluar la actividad cicatrizante en el extracto del fruto del Cucumis dipsaceus Ehrenberg ex Spach. 4. HIPOTESIS Las saponinas presentes en el fruto de Cucumis dipsaceus Ehrenberg ex Spach presentan efectos cicatrizantes.

5. CLASIFICACION BOTANICA 5.1 UBICACION SISTEMATICA DE LA ESPECIE CUCUMIS DIPSACEUS Reino

Plantae

División

Magnoliophyta

Clase

Equisetopsida

Orden

Cucurbitales

Familia

Cucurbitaceae

Género

Cucumis

Especie

dipsaceus

Nombre científico

Cucumis dipsaceus

Familia: Las cucurbitaceae son hierbas perennes, trepadoras, rastreras y el tallo usualmente anguloso, viven en todas las regiones sub Investigación Química 11

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL tropicales y tropicales del mundo, las hojas son alternas palmatipartidas o palmatilobadas, a veces ubicados en lado superior

de

la

base

del

peciclo,

inflorescencia

cimosa,

racemosa, axilar o terminal, raramente flores solitarias, la flor unisexual,

actinoforma,

caliz,

corola

acampanada

en

el

androceo, cinco estambre, que aparecen como si fueran tres por dos pares que se sueldan y uno se separa. Los filamentos y las anteras se unen total o parcialmente y so curvos o retorcidos, el gineceo, el ovario es ínfero, tricarpelar y casi siempre unilocular. Los óvulos son más o menos numerosos con placentación parietal, los frutos son bayas con envoltura o pericarpio blando o duro. Esta familia de plantas abarca unas 760 especies que habitan en países cálidos, algunas se cultivan con valores alimenticios. 5.2. HABITAT Estas plantas habitan en cumbreras, cunetas y baldíos. Florecen en los meses a partir de abril a octubre, aunque no es extraño encontrarlas en flor fuera de esta época. Su distribución es muy común en toda la Región Mediterránea y Oceania, aunque en la actualmente es cosmo polita, en el Perú se encuentra en el departamento de Amazonas, Ancash, Junín y Lima. 5.3. USOS POPULARES Esta planta es usada para las siguientes avtividades:  Ictiotoxicas(pesca)  Lavado de cabello Investigación Química 12

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL 

Lavado de ropa

6. SAPONINAS 6.1 CONCEPTO Las saponinas son una clase de compuestos estructurales diversos, que se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Se trata de glicosidos formados por una o más residuos oligosacáridos unidos covalente mente a una aglicona de carácter hidrofobico (Hostettmann, 1995). Según el tipo de aglicona, que es denominado el núcleo lipofilico, por el grupo que esta enlazado a un átomo de carbono anomerico, que es el átomo de carbono de carbono enlazado a dos oxígenos, o a un oxígeno y cualquier otro heteroatomo, como el nitrógeno (wade, 2004), la naturaleza química del aglicon se suele clasificar

en

dos

grupos,

como

saponina

esteroidal

o

triterpenoide. El nombre de saponina deriva del término en latín ¨sapo¨ qué significa jabón. Este se debe a que las saponinas son capaces de formar espuma al ser agitadas en soluciones acuosas. Investigación Química 13

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL De modo general, algunas de las características de este amplio

grupo

de

compuestos

son

sus

propiedades

emulsionantes, detergentes, deterrente, antiinflamatorio y hemolíticas. Historicamente se han definido a dichos compuestos en base a estas propiedades, pero en los últimos años se ha optado por una definición más precisa, en base a su estructura molecular, según su origen biosintetico.

Figura N°1.

Investigación Química 14

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Por hidrolisis se genera un aglucon (sapogenina) que puede ser tipo esteroide o triterpenoide. La industria aprovecha esta propiedad empleándola en detergentes y jabones. Estas actúan en la planta como sistema

de

defensa,

reguladoras

de

crecimiento

y

antifúngicas. (ANAYA LANG, 2003). Existen dos tipos de saponinas: 

Esteroides: son neutras. Se encuentran principalmente en las monocotiledóneas. Estas pueden ser utilizadas para la elaboración de hormonas sexuales y corticoides. (ANAYA LANG, 2003). Las geninas

esteroídicas

derivan

de

un

esqueleto

hexacíclico de 27 átomos de carbono, que es el núcleo espirostano. Algunas saponinas esteroidales son de gran interés e importancia por su relación con compuestos como

las

hormonas

sexuales,

cortisona,

esteroides

diuréticos, vitamina D y heterósidos cardíacos. Por este motivo, algunos son utilizados como material de partida para la síntesis de estos compuestos. En este sentido, destaca el uso de la diosgenina, saponina que se obtiene, principalmente a partir de las partes subterráneas de

Investigación Química 15

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL distintas especies de lianas herbáceas tropicales del género Dioscorea. Para que éstas posean interés industrial, su contenido en diosgenina debe ser superior al 3%. Además, hay otras plantas utilizadas como fuente de diosgenina, como la alholva (Trigonella foenum-graecum), que es bastante interesante por tener un ciclo de cultivo corto (las semillas se obtienen en 3-5 meses). También se utiliza mucho la hecogenina, que es un saponósido muy semejante a la diosgenina.

La

hecogenina

se

obtiene

de

distintas

especies de agaves o sisales.



Triterpénicas son ácidas. Se encuentran principalmente en las dicotiledóneas. (ANAYA LANG, 2003). Las saponinas triterpenoides

de

importancia

comercial,

aunque

la

mayoría de las sapogeninas triterpenoides se obtienen de las

saponinas

correspondientes

por

hidrólisis

ácida,

existen algunas en estado libre, como por ejemplo el ácido ursólico,

C30H48O3, los

ácidos

elemólicos

y el ácido

boswélico. (CYTED, 1993) Las saponinas triterpenoides se emplean en la fabricación de

ladrillo

acústico,

Investigación Química 16

placas,

películas

y

papeles

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL fotográficos, cerámica, extinguidores de incendios del tipo de espuma y pastas dentríficas; también sirve para producir espuma en bebidas (refrescos y cervezas), en champúes, jabones líquidos y preparados cosméticos y en emulsificación de aceites para pulverizar en árboles frutales. También se utilizan para la determinación del oxígeno en la sangre. Las sapogeninas de las saponinas triterpenoides no tienen aplicaciones comerciales. (Nohara, T.1989)

Investigación Química 17

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Figura N°2. Tipos de genina en las tres clases principales de saponinas (Hostettmann y Marston, 1995)

Por su capacidad espumante las saponinas se utilizan en la elaboración de cerveza, en la industria farmacéutica la elaboración sintética de hormonas, industria farmacéutica, industria cosmética en shampoos.(TAPIA, et al, 1979). Tanto los tritepenoides tetraciclicos como los pentaciclicos presentan un enlace glicosidico en el C3 y tiene un origen biogenético

común,

vía

ácido

mevalonico

y

unidades

en

mezclas

isoprenoides. 6.2 IMPORTANCIA DE LAS SAPONINAS En

general,

las

saponinas

son

solubles

hidroalcoholicas e insolubles en disolventes orgánicos de media y baja polaridad. Sin embargo, las geninas libres no son solubles en agua y si en disolventes apolares. Su principal propiedad física es que en solución acuosa son agentes

tensoactivos, es

decir,

son

capaces

de

formar

espumas (poder afrogeno) y formar emulsiones. Son difíciles de cristalizar. Investigación Química 18

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

6.2.1 ACCIONES FARMACOLOGICAS Desde el punto de vista farmacológico, las drogas con saponinas pueden tener diferentes acciones, las cuales se deben, sobre todo, a las saponinas triterpenicas. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, por vía oral y en dosis altas, las saponinas irritan la mucosa bucofaríngea y digestiva, causando dolor abdominal, vómitos y diarrea. A continuación, comentaremos las acciones farmacológicas más destacables de la drogas con saponinas. Acción expectorante Es una de las acciones más clásicas de las drogas con saponinas, la cual deriva de la estimulación de la secreción traqueobronquial por un reflejo autonómico con origen en la mucosa gástrica. Efecto diurético Las saponinas tienen la capacidad de aumentar la circulación sanguínea a nivel renal, con lo que la filtración glomerular se ve aumentada y, por tanto, se da un efecto diurético. Investigación Química 19

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Efecto antiedematoso y antiinflamatorio Algunas saponinas presentan este efecto (p. ej., la escina del castaño de Indias, sobre todo en cuanto a la insuficiencia venosa en las extremidades inferiores). Acción adaptógena Algunas saponinas pueden tener un efecto estimulante, tonificante y antiestrés. Efecto molusquicida

Muchas saponinas resultan tóxicas para los moluscos, motivo por el cual en los países tropicales se recurre a ellos como molusquicidas, ya que con ello se rompe la cadena de transmisión

de

las

esquistosomiasis.

Únicamente

son

molusquicidas las saponinas monodesmosídicas, pero por hidrólisis

las

bidesmosídicas

se

pueden

convertir

en

monodesmosídicas. Algunos beneficios más de la saponina:



Puede descomponer la grasa, acelerar la absorción de nutrientes y digestión

Investigación Química 20

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL 

Efectos Antioxidantes



Efectos anticancerígenos



Ayuda en función eréctil.



Revitaliza la actividad enzimática en las células apoyando el metabolismo.



Incrementa la energía, revigoriza, ayuda a recuperación de fatiga.



Ayuda en casos de letargo y falta de apetito.



Mejora la proteína de síntesis del suero.



Estimula la actividad enzimática involucrada en el proceso de reparación y construcción de hueso, e incrementa la deposición de calcio por las células de la médula ósea.



Mejora la flexibilidad de forma significativa y baja la presión arterial.



Ayuda en casos de depresión al incrementar los niveles de ciertos neurotransmisores como serotonina, dopamina y noradrenalina.

Investigación Química 21

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

En la actualidad se ha determinado que las saponinas tienen beneficiosas propiedades para la salud, entre las cuales se pueden mencionar diversos efectos biológicos: por su actividad antiviral, como analgésico, antiinflamatorio, antimicrobiano, antioxidante, y cito tóxico, tiene un importante efecto sobre la absorción

de

minerales

y

vitaminas,

produce

efecto

inmunoestimulador, aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal y tiene acción neuroprotectora. Además actúa como hipolipemiante (Güçlü-Üstündag and Mazza, 2007). Por lo anteriormente expuesto se puede afirmar que las saponinas tienen

importantes aplicaciones en el campo

industrial y farmacéutico.

7. CICATRIZANTE Es un proceso en el cual se regenera la piel, frente a una lesión provocada por cualquier tipo de mecanismo. (TROTT, 2007). Comienza el proceso de cicatrización normal de la herida cuando son agudas mientras, que las heridas crónicas no cicatrizan bien, Investigación Química 22

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL debido a que existe infección, tejido muerto o algún tipo de patología. (LEONG Y PHILLIPS, 2013) Son esteroides polihidroxilados, compuestos que actúan en la defensa

de

la

planta

y

también

presentan

propiedades

terapéuticas como anti- osteoporótico, ayudan en el proceso de curación de heridas. Además son considerados como compuestos bioactivos, ya que ayudan a reducir el estrés. El principal fitecdisteroide ecdiesterona este puede ayudar al tratamiento y la prevención de la diabetes, disminuyendo significativamente los niveles de glucosa en la sangre.Estos aceites pueden intervenir en diferentes procesos de agregación plaquetaria e inflamación actuando como mediadores celulares (CAÑIGERAL, 2003). 8. PARTE EXPERIMENTAL 8.1. MATERIALES, APARATOS Y REACTIVOS  Materiales Papel kraffs. Frasco de vidrio de color ambar con tapa rosca. Lamina portan objeto. Tubos de ensayo. Vasos precipitados. Peras de decantación. Espátulas. Probetas. Embudos. Mortero. Papel filtro. Erlermeyer

Investigación Química 23

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL 

Aparatos Sistema de destilación. Sistema soxhlet. Balanza. Estufa. Desecador. Cocinilla Eléctrica.



Reactivos n_Butanol. Eter de Petróleo. Etanol 70°. Ácido Sulfúrico. Ácido Clorhídrico. Sulfato de sodio Anhidro. Cloroformo Metanol

8.2. PREPARACION DE LA MUESTRA. 8.2.1. PREPARACION DE LA MUESTRA 8.2.1.1. RECOLECCION Para la presente investigación, las muestras del fruto de Cucumis

dipsaceus “jaboncillo” se recolectaron en el

mes de setiembre del 2015 en la Provincia de Barranca en el Departamento de Lima. Los frutos se lavaron manualmente para separar toda partícula de tierra que pudiera estar adherida al fruto ya que se desarrollan al ras del suelo.

Investigación Química 24

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Figura N°

3.

8.2.1.2. ESTABILIZACION Se efectuó el secado del fruto al medio ambiente (bajo techo), durante cinco días sobre papel kraffs, con la finalidad de deshidratarlo, luego se agregó vapores de etanol de 96° y aire caliente

para

inactivar

posibles

enzimas

que

pudieran

descomponer al fruto. Luego se prosiguió con el secado en estufa a una temperatura que oscilaba entre 40°C y 45°C, durante cinco días. La droga seca se guardó en frascos de vidrio de color ámbar con tapa rosca herméticamente cerrada.

Investigación Química 25

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Figura N°4.

8.2.1.3. MOLIENDA La molienda se realizó con un mortero, prosiguiéndose con el secado por 48 horas, obteniéndose polvo seco de la muestra, guardándose luego en frascos limpios y secos para utilización posterior.

Investigación Química 26

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Figura N°5.

8.3.2. EXTRACCION DE SAPONINAS 8.3.2.1. EXTRACCION ETANOLICA Teniendo en cuenta que las saponinas son solubles en agua, soluciones hidro-alcoholicas, etanol absoluto, entre otras, realizamos la extracción con etanol de 80°, para cuyo efecto se pesó 80 gramos de la muestra seca y pulverizada, que deposita en un beaker de 0.5 litros de capacidad y se agrega 0.25 litros de alcohol de 80°, dejamos en maceración por 72 horas con la finalidad de ablandar los tejidos celulares. Luego se decanta y el residuo se exprime obteniéndose un volumen de 0.21 litros, esta solución presenta un aspecto grasoso.

Figura N°6.

Investigación Química 27

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Figura N°7.

8.3.2.2. DESENGRASADO Y DESPIGMENTACION A los 0.21 litros de extracto etanolico, obteniéndose se le adiciona 0.1 litros de alcohol etílico al 40°, y se le trasvasa a una pera de decantación, agitándose la mezcla, se obtiene en dos fases al realizar la separación se obtienen 0.3 litros de una fase hidroalcoholica, la parte útil y una fracción lipídica, que se desecha. La solución hidroalcoholica es sometida a una extracción múltiple con bencina con la finalidad de eliminar pigmentos y residuos grasos, obteniéndose fracción etanolica útil.

Investigación Química 28

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Figura N°8.

8.3.2.3. EXTRACCION BUTANOLICA En el extracto etanolica previamente desengrasado se extraen las saponinas con n-Butanol aprovechado que dicho solvente posee mayor capacidad de disolución, esta operación se realizó en un embudo de separación. Al extracto butanolico se le adiciono SO4Na2 anhidro con la finalidad de secar la fase orgánica, luego se decantó. Este extracto butanolico se concentró por calentamiento hasta obtener un residuo sólido.

Figura N°9.

8.3.2.4. ENSAYO DE RECONOCIMIENTO Investigación Química 29

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL a. Ensayo de la Espuma Las saponinas son solubles en agua y pueden disminuir la tensión superficial del agua, formando abundante espuma. Se agregó en un tubo de ensayo 0.1 gramos de muestra y también se agrega agua destilada a una altura de un dedo, por último se agita por 30 segundos.

Figura N°10.

b. Ensayo de Salkowsky Una pequeña muestra se pone en un tubo de ensayo y se agrega un ml de ácido sulfúrico y anhídrido acético. Se va observar una coloración rojo o amarillo.

Investigación Química 30

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Figura N°11.

8.3.2.5. ANALISIS CROMATOGRAFICO Las técnicas cromatografías utilizadas en esta investigación para la separación y aislamiento son: Cromatografía de capa fina y cromatografía de capa preparativa.

Figura N°12.

A. Cromatografía de Capa Fina Preparamos una capa sobre una placa de 10cmx5cm, un absorbente de silica gel sobre la placa de vidrio. Luego buscamos un eluyente adecuado por ese motivo requerí probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas.

Investigación Química 31

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Figura N°13.

Figura N°14.

Figura N°15.

B. Cromatografía de Capa Preparativa. La cromatografía preparativa se llevó a cabo en placas de gel de sílice sobre un soporte de vidrio de 15x15cm. Hemos Investigación Química 32

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL utilizado esta técnica para la separación y aislamiento del componente interesado. Con una pipeta Pasteur trazamos una línea continua con la muestra disuelta y después se introduce la placa en posición vertical en la cubeta y se tapa, para evitar la evaporación del disolvente.

Figura N°16.

Después

que

la

fase

móvil llegue a la marca indicada, se le lleva a un equipo

de

uv

para

observar la fluorescencia que presenta la placa, lo que se pudo observar dos colores, el primer color en el uv es un rosado y el segundo un amarillo. Después de marca la zona donde están los dos colores, raspamos las manchas de colores y lo colocamos cada uno en un vaso precipitado, para después Investigación Química 33

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL disolverlo en etanol y lo filtramos la solución .Por último el filtrado

lo

guardamos

para

su

posterior

lectura

en

espectrómetro de UV- visible. Figura N°17.

9. RESULTADOS A. Ensayo de la Espuma Esta prueba salió positiva demostrando la presencia de saponina en el fruto de Cucumis dipsaceus

Investigación Química 34

el

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

B. Ensayo de Salkowsky

Esta

prueba

indicar

se

la

realizó

para

presencia

de

triterpenoides C.

dando

o

coloración

esteroides rojo

que

significa que hay presencia de triterpenoide

en

Cucumis dipsaceus Cromatografía de Capa Fina

a

Rf a=

4.5 =0.833 5.4

Rf b=

4.2 =0.778 5.4

b

Investigación Química 35

el

fruto

de

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

D. Espectrómetro de ultravioleta visible La solución enfriada se lleva para su posterior lectura en el espectrofotómetro con solvente etanol destilado. Luego la solución con etanol se coloca en la celda y se lleva al UV-VIS, el espectro aparece en esta imagen.

Compuesta a

Absorbancia 0.829

Figura N°18.

Investigación Química 36

Longitud de Onda 270.065

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Compuesta b

Absorbancia 0.729

Figura N°19.

10.

DISCUSIONES DE RESULTADOS

Investigación Química 37

Longitud de Onda 270.009

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL La prueba de la espuma se realizó con el fin de determinar si había o no presencia de saponinas aprovechando la propiedad de detergencia. Al agregar agua, las saponinas disminuyen la tensión superficial de esta, aumentando la capacidad de penetración del agua lom cual facilita la formación de pequeñas gotas, es por eso que al momento de sacudir o agitar la solución, se forme pequeñas gotas, es por eso que al momento de sacudir o agitar la solución, se forma una espuma abundante y relativamente estable formando un sistema coloidal. En la experiencia se observó que solo en una muestra (avena) no se formó espuma debido a que la avena da resultado positivo con agua caliente. La prueba con el reactivo de Salkowski se realizó con la finalidad de

indicar

la

presencia

de

saponinas

triterpenoidales

o

esteroidales dando como resultado coloración rojo sangre la cual se observó, no se pudo realizar la prueba de Liebermann- Burchard para determinar la presencia de saponinas esteroidales debió a que la planta también tiene cucurbitacina que es un esteroide.

11. 

CONCLUSIONES Ya que las saponinas

tienen

propiedades

detergentes,

comprobamos su presencia al generar espuma por agitación en diferentes tipos de muestras, de esta manera pudimos Investigación Química 38

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL observar la cantidad de saponinas en relación a la espuma producida en cada planta. 

Comprobamos la presencia de saponinas así como el tipo de saponinas para poder diferenciarlas: La reacción de Salkowski indica la presencia de saponinas que podrían ser triterpenicas o esteroidales a través de una coloración de



amarillo a rojo sangre. La Cromatografía preparativa se utiliza para purificar suficiente la cantidad de sustancia. Para su uso posterior mas que para un análisis, en este trabajo se purifico las saponinas.

12. BIBLOGRAFIA 1. Mendoza Nuñez, Carla (1998). Estudio de los fitoconstituyente del Cucumis

dipsaceusk

y

su

aplicación

en

cosmética. Pontificia Universidad Católica, Perú.

Investigación Química 39

la

formulaciones

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL 2. Nivedhini, Chemical dipsaceus

V.,

Chandran,

composition Ehrenb.

Ex

R.

and

and

Parimelazhagan,

antioxidant

Spach

fruit.

activity

T.(2014).

of

Department

Cucumis

of

Botany,

Bioprospecting laboratory, Bharathiar University, Coimbatore. India 3. Lata, S, Mittal, S K (2015). Pharmacognosy, Phytochemistry and Pharmacology of Cucumis dipsaceus Ehrenb. Department of Pharmaceutical

Chemistry,

ASBASJSM

COP,

Department

of

Pharmacognosy SD College of pharmacy, Barnala. India. 4. Sarkiyayi, S. and Agar, T. M. (2010). Comparitive analysis on the nutritional and anti-nutritional content of the sweet and bitter cassava

varieties.

Advance

Journal

of

Food

Science

and

Technology 2 (6): 328-334. 5. Villarreal Arévalo Andrea L. (2014). Evaluación de la actividad cicatrizante de geles Elaborados a partir de extractos lipídicos, etanólicos y saponinas de dos variedades de quinua (chenopodium quinoa

willd),

sobre

heridas

producidas

en

ratones

(mus

musculus).Ecuador. 6. Osuna, T. L., M.E. Tapia y A. Aguilar. 2005. Plantas medicinales de la

medicina

tradicional

gastrointestinales.

mexicana

Publicacions

i

para Edicions.

tratar

afecciones

Universidad

de

Barcelona. España.97 pp. 7. Vaisberg, AJ., M. Milla, MC. Planas, JL. Cordova, ER. Agusti, R. Ferreyra, MC. Mustiga, L. Carlin, and GB. Hammond. 1989. Taspine Investigación Química 40

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL is the cicatrizant principle in Sangre de Grado extracted from Croton lechleri. Planta Med. 55(2):140-143. 8. JuanaI., T. Capo, I. Castro M., V. Bueno P., C. Carrillo D. y M. Ortiz. 2004. Efecto cicatrizante de la crema de extracto etanólico de cera de caña. Rev Cubana Plant Med. 9(2). 9. Moura-Letts, G., LF. Villegas, A. Marçalo, AJ. Vaisberg and GB. Hammond. 2006. In vivo wound-healing activity of oleanolic acid derived

from

the

acid

hydrolysis

of

Anredera

diffusa.

JNatProd.69(6):978-979. 10. Backhouse, N., L. Rosales, C. Apablaza, L. Goïty, S. Erazo, R. Negrete, C. Theodoluz, J. Rodríguez and C. Delporte. 2008. Analgesic,

anti-inflammatory

and

antioxidant

properties

of

Buddleja globosa, B ddlejaceae J Ethnopharmacol 116 ( 2) 263269. 11. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED). 1993. Manual de Técnica de Investigación, Bogotá. Colombia. Proyecto X-1. s/p. 12. Nohara, T. 1989. Analysis of Sterols and other Biologically Significant Steroids. Academic Press INC. USA. pp. 119-131. 13. Hostettmann, K. y Marston, A. 1995. Saponinn Cambridge, 1er Ed. Cambridge University Press. 14. Güçlü-Üstündag, O. and Mazza, G. (2007).Saponins: Properties, applications and processing. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 47 ,231-258. 15. TROTT, A. Heridas y Cortes. 3ª ed., Madrid-España. Elsevier. 2007, pp. 14-31. 16. CAÑIGUERAL, S. La Fitoterapia ¿una terapéutica para el tercer milenio?. (Revista de Fitoterapia). Vol. 2. N°. 2. Septiembre de 2002,

Investigación Química 41

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL España,

pp.

101-121.

http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/RDF2_2_FITOTERAPIA.pdf 2014/05/23. 17. LEONG, M., & PHILLIPS, L. G. Cicatrización de las heridas. En: TOWNSEND, C., Sabiston Tratado de Cirugía. 19ª ed., Barcelona-España. Elsevier Saunders. 2013, pp. 151- 175 18.

Investigación Química 42