Extracción de RNA de Plantas
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Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato
Laboratorio de Biotecnología Molecular Grupo 5BV1 Práctica # 4 y 5 “Extracción de RNA de plantas: Especie Capsicum annuum L.” “Cuantificación de RNA por espectrofotometría y visualización en gel de agarosa” Equipo 1: López Castañeda Mariana López Chacón Emma Karen Pérez Pérez Karina Daniela Docentes: Dr. Juan Francisco Sánchez López Dr. Karla Lizbeth Macías Sánchez Miryam Jhazmin Torres Gómez M en C. Silvia díaz Sandoval
Semestre EneroJunio 2015 Silao, Guanajuato. 19 de Febrero del 2015.
I.
RESULTADOS
De acuerdo al protocolo establecido, se llevó a cabo la extracción y purificación de RNA de la especie Capsicum annuum, comúnmente conocido como chile serrano, del cuál se obtuvieron 2 muestras a partir de aproximadamente 1g de pericarpio, descartando la placenta y, asegurándose de remover el exocarpio, es decir, la capa externa de color verde intenso que recubre al chile, para prevenir contaminaciones ya que las RNAsas son liberadas a partir de las células y están presentes en la piel.
Espectrofotometría mediante equipo NanoDrop. Terminado el proceso de extracción y purificación se llevó a cabo la cuantificación y visualización de RNA de Capsicum annuum a través de la espectrofotometría, empleando un NanoDrop, el cual lee absorbancias a distintas longitudes de onda para cuantificar distintos parámetros como la concentración de RNA o la presencia de otros agentes contaminantes tales como solventes orgánicos o sales de guanidina. Los datos obtenidos a partir del Nanodrop se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1. Parámetros de cuantificación de RNA y relaciones de las absorbancias registradas en el Nanodrop de la especie Capsicum annum .
De acuerdo a la Tabla 1 se puede observar que de acuerdo a la absorbancia medida a 260 nm de la primera muestra de Capsicum annuum es de 2.571 nm la cual indica una concentración de RNA de 102.9ng/ μ L, mientras que para la segunda muestra se obtuvo una concentración de 80 ng/ μ L, a la que le corresponde una longitud de onda de 1.999, pero mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1% se puede comprobar la integridad del RNA.
En la Figura 1 se observa la gráfica de la absorbancia contra la longitud de onda registrada en el Nanodrop para la primera muestra, en la cuál se aprecia un máximo entre la absorbancia 260 a 275. Figura 1. Gráfico de la Absorbancia Vs. Longitud de onda registrada en el NanoDrop para la muestra 1 de Capsicum annuum.
Y por último en la figura 2 se observa la gráfica de la absorbancia contra la longitud de onda registrada en el Nanodrop para la segunda muestra de Capsicum annuum .
Figura 2. Gráfico de la Absorbancia Vs. Longitud de onda registrada en el NanoDrop para la muestra 2 de Capsicum annuum.
Visualización en gel de agarosa Posteriormente empleando la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1%, (p/v) se visualizan las muestras Capsicum annuum, para poder comprobar si la concentración que se obtuvo mediante el equipo NanoDrop es la correspondiente a RNA. En la Figura 3, se observan 10 carriles, encontrándose en el primer y último carril el marcador de peso molecular HyperLadderTM 1kb con sus 14 bandas, debido a que al momento de colocar la muestra del marcador hubo deficiencias en la técnica, por lo que se creyó conveniente añadir otra muestra del mismo. En el segundo y tercer carril se encuentra la muestra de interés. Mientras que en el carril 4, 5 y 6 las muestras correspondientes al equipo 2 y por último en el carril 7,8 y 9 se encuentran las muestras correspondientes al equipo 3.
Figura 3 . Visualización de RNA de Capsicum annuum corrido en gel de agarosa al 1% con los respectivos carriles. Carril 1 y 10 : marcador de peso molecular HyperLadder 1kb, 100 Lanes, Lot No. Hi211k; Carril 2 y 3: muestra de equipo 1; Carril 4, 5 y 6 : muestra de equipo 2; Carril 7, 8 y 9: muestra de equipo 3.
II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS A pesar de que el DNA es el ácido nucléico que contiene la información que determina la estructura de las proteínas, no puede actuar solo, por eso en los organismos celulares el RNA es la molécula que complemente al DNA ya que se encarga de dirigir la síntesis de proteínas para el desarrollo y actividades de la célula. (Patiño, 2006) Por esa razón la extracción de RNA libre de contaminación con DNA o proteínas es empleada para distintos procedimientos tales como Northern blot, Dot blot, transcripción reversa, ensayos de protección de RNAsas, PCR y clonaje molecular.
Según Jiménez (2002), la absorbancia de los ácidos nucleicos es máxima a una longitud de 260 nm. Por tal motivo para determinar la calidad del RNA, uno de los parámetros que se emplean es la relación 260/280 nm, la cual debe presentar un valor de 2 para ser considerado de buena calidad (Martínez 2000), ya que frecuentemente el RNA viene mezclado con proteínas, carbohidratos y diversas sales. Al observar este parámetro en la Tabla 1 para las muestras 1 y 2, se puede observar que no cumplen este requisito, ya que quedan por debajo del valor establecido para ser considerado de calidad presentando valores de 1.6 y 1.55 respectivamente. También se observa una mayor concentración de RNA en la muestra 1 que en la 2, sin embargo, al observar las absorbancias leídas a 230 nm de ambas muestras, se demuestra una clara contaminación por agentes orgánicos como el isopropanol, ya que superan al valor registrado de la absorbancia leída a 260 nm, siendom la contaminación en la muestra 1. A pesar de que las lecturas registradas en el NanoDrop, demuestran la presencia de RNA, el método no puede decir si el RNA se encuentra fragmentado o impuro. Por lo anterior, se emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1%, para poder visualizar el RNA y observar la condición en la que se encuentra. Dicha visualización se muestra en la Figura 1, en la que los carriles de interés son el 2 y 3 con la muestra 1 y 2 respectivamente. El método de electroforesis, nos permite separar las partículas de acuerdo a su tamaño en función de su carga neta al someterlas a un campo eléctrico. La fuerza que se encarga del movimiento de las partículas es el potencial eléctrico (E), por lo que la movilidad electroforética (μ) de una molécula está dada por la razón de la velocidad de la partícula (V) al potencial eléctrico, por lo que al aumentar el voltaje, aumenta la carga del compuesto a estudiar, en este caso el RNA. (Garrido et al., 2006) Sin embargo lo que se pretende no es que sea rápido el proceso de visualización en gel de electroforesis, sino conservar la integridad estructural durante la corrida, razón por la cuál se corrió el gel a un voltaje de 70V, sin embargo el tiempo de exposición al campo electroforético se considera que para una mejor visualización tuvo que haber sido mayor, ya que como se observa en la Figura 3 las muestras se encuentran muy pegadas a la parte superior del gel y el marcador de peso molecular se encuentra con las 14 bandas muy poco espaciadas entre sí. Por esta razón para la electroforesis en gel de agarosa para la separación de ARN por tamaños Hernández (1994) propone el uso de formaldehído, un desnaturalizante que favorece la separación del ARN por tamaños, pero en su trabajo a pesar de la presencia de ese componente
desnaturalizante sugiere el empleo de voltajes bajos para cuidar la integridad de los resultados. El Trizol Reagent es una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina que solubiliza simultáneamente el material biológico y desnaturaliza la proteína. Después de la solubilización, la adición de cloroformo provoca la separación de fases, donde la proteína se extrajo a la fase orgánica, el ADN se resuelve en la interfaz, y el ARN permanece en la fase acuosa. (Hannon, 2010) Este reactivo listo para usar está diseñado para aislar el ARN total de alta calidad,así como ADN y proteínas, a partir de muestras de células y tejidos de origen humano, animal, vegetal, levadura, o de origen bacteriano. Este reactivo se emplea para mantener la integridad del RNA, ya que durante la homogenización y lisis de la muestra inactiva a las RNAsas, al tiempo que rompe las células y disuelve los componentes celulares (McNamara, 2006) Para la visualización de RNA por el método de electroforesis en gel de agarosa al 1% se empleó el marcador HyperLadder 1kb, dicho marcador de peso molecular genera un patrón de 14 bandas con un rango de 200 pb 10,037bp como se muestra en la Figura 4 (HyperLadder, 2015) Además como se observa en la imagen la banda de 100 bp y la banda de 10,037 bp tienen la mayor intensidad para su fácil identificación y orientación en la cuantificación de RNA. El marcador de peso molecular también nos ayuda a darnos cuenta si el gel fue preparado adecuadamente, ya que si este no se encontrara bien hecho el marcador no emigraría por el gel.
TM Figura 4. Patrón de bandas del marcador HyperLadder 1kb corrido en gel de agarosa al 1% visualizado con bromuro de etidio. Debido a que el RNA ribosomal es el más abundante en las células, forma parte de hasta el 80% del RNA celular según Peña (2004). El ARN ribosomal eucariótico está formado por una subunidad 40s, conformado por una molécula de ARNr 18s y 32 moléculas de proteínas y la subunidad 60s, la cual tiene tres tipos de ARNr 5s, 5.8s y 28s, con 46 proteínas (Koolman, 2004) El ácido ribonucleico aproximadamente de un 40% a un 50% del ribosoma. (Barioglio, 2001) mientras que el tamaño del ARNr 28s es de 4.6 a 5.2kb su subunidad pequeña mientras que el de 18s va de 1.7 a 1.9kb (Farrell, 2005). Es por eso que la visualización del RNA de la figura en el gel de agarosa no fue la esperada, de acuerdo a Martínez, 2000, se debe observar un doblete de bandas característico del RNA, 28S y 18S como se muestra en la Figura 5. Figura 5. Visualización de extracción de RNA en gel de agarosa con el doblete de bandas característico 28S y 18S presente en todos los carriles, a partir de la corteza de cidra. Dichas bandas no se presentan en el carriles 2 de la figura 3, debido a que el RNA se encuentra degradado. La degradación del RNA puede ocurrir por diversos factores, ya que se degrada con mucha facilidad, sobre todo con la contaminación de RNAsas. Ya
que la molécula de RNA es sumamente lábil, la clave en la extracción es evitar su degradación por acción de ribonucleasas propias de la célula. Los protocolos existentes se basan en una rápida inactivación de RNAsas endógenas, muy estables y que no requieren de cofactores para funcionar. Es muy importante tomar precauciones para evitar la contaminación con RNAsas exógenas, por ejemplo, tratar el agua y soluciones salinas con inhibidores de RNAsas, si es posible se recomienda el empleo de pipetas, puntillas y soluciones exclusivas, puntillas y soluciones exclusivas para trabajar con RNA. El material de vidrio debe esterilizarse por calor seco por 4 horas a 150°C, mientras que el material plástico debe ser nuevo y estéril, o bien debe enjuagarse con cloroformo, ya que la esterilización por autoclave no inactiva por completo las ARNsas. (Armendariz, 2011) Así mismo, deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso e intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación del RNA durante la manipulación. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida (Sandoval, 2010). Durante la experimentación, se trabajó todo el tiempo con guantes para evitar la contaminación por las RNAsas de la piel, por lo que se descarta esta forma de contaminación, así como el hecho de que se trabajó con una muestra fresca de Capsicum annuum . Sin embargo, la degradación del RNA se le puede atribuir al proceso de maceración, ya que no se realizó de forma rápida, este proceso se realiza con la finalidad de que las células del tejido vegetal estén más expuestas a los reactivos y así asegurar la obtención de RNA de forma rápida, por lo que al no realizar este paso de forma rápida permitió que las RNAsas endógenas liberadas se encontraran con el RNA y lo degradara. En caso del tercer carril, de la figura 3, no se observan bandas ya sean borrosas o extendidas, lo cual se debe a una colocación deficiente en el pocillo del gel de agarosa o en dado caso se debe a la pérdida de material genético en alguna de las etapas de extracción durante la decantación de la fase acuosa, ya que a partir de la fase de separación, después de la primera centrifugación se observó pérdida de la pastilla, sin embargo se continuó con el procedimiento hasta el final obteniendo una lectura de concentración de RNA de 80 ng/ μ L, sin embargo se presentaron datos de contaminación por solventes orgánicos y sales de guanidina por lo que se descarta la posibilidad de haber obtenido RNA de la segunda muestra.
III. CONCLUSIONES
A través de la experimentación no se logró el proceso de extracción y purificación del RNA de la especie Capsicum annuum , comúnmente conocido como chile serrano. A pesar de que se registraron concentraciones de RNA de 102.9 ng/μL y 80 ng/μL para la muestra 1 y 2 respectivamente, se detectó mediante la relación 230/260 que el RNA se encuentra contaminado por agentes orgánicos; así como la relación 260/280 no alcanzó el valor esperado de 2, para poder calificar el RNA como libre de sales o agentes orgánicos, por lo que demuestra un mal proceso de purificación. La visualización de RNA en gel de agarosa al 1% demostró que el RNA se encuentra fragmentado, por lo que fue imposible observar el doblete de bandas característico del RNA, siendo una causa posible la primera parte del proceso de extracción, ya que no se maceró de forma adecuada, logrando así la fragmentación. IV. CUESTIONARIO
1. Sobre el DEPC, en el protocolo de extracción de RNA, investigue: a. Nombre IUPAC del compuesto Dietil policarbonato, con fórmula molecular lineal O(COOC H ) 2 5 2 b. Estructura química
c. Mecanismo de acción Es un potente químico que Inactiva las RNAsas por unión covalente en su sitio activo inhibiendo su actividad catalítica, a través de la modificación de residuos de histidina y tiroxina. (Farrell, 2005) 2. Explique cuál es la función de la formamida en el buffer de carga. La función que cumple la formamida es debilitar las uniones de hidrógeno de los duplex ADNADN y ADNARN, permitiendo de esta manera que se pueda bajar la temperatura de anillamiento al incrementar el nivel de astringencia . 3. Explique la función de la RNAsa out. Es un inhibidor no competitivo de ribonucleasas pancreáticas, tales como la RNAsa A, el cuál es utilizado para evitar la degradación del RNA. 4. A partir del siguiente problema, responda los incisos a, b y c:
Las siguientes imágenes muestran los productos de RNAm de tejido de flor de plantas de chile (carril 2, 3 y 4) por un método basado en perlas magnéticas (Dynabeads mRNA Purification Kit Dynal Biotech, Brown Deer, WI), a partir de RNAt (carril 8). El panel A corresponde a una corrida después de 2 minutos de iniciada la electroforesis a 100 V y el panel B a la misma corrida después de 30 minutos.
a) Analice la integridad de las muestras 2, 3 y 4. Para el caso de las muestras 2 y 3 se observa la presencia de ARN al estar más alejada de los pocillos iniciales, ya que el ARN es menos pesado que el ADN, también se puede observar que la muestra no esta 100% pura ya que presenta trazas borrosas que implican la contaminación, con lo cual se podrían hacer más procesos de purificación para la obtención de ARN únicamente. En el caso de la muestra 4 no se observan ni bandas de ARN o degradación del mismo ya que no se ve nada el carril 4 lo cual se podría deber a una inserción de muestra en el pocillo o una pérdida de ácidos nucleicos en alguna etapa de la extracción. b) Estime de modo visual la concentración que tendría la banda inferior de la muestra del carril 3. Suponiendo que el marcador es Hyperladder, la concentración es de 750 pb, considerando que la banda superior del marcador es de 800 pb y la inferior de 600 pb. c) ¿Por qué fue necesario tomar dos imágenes en diferentes tiempos de corrida para la estimación visual de la concentración de RNAm en gel de agarosa? Porque en la primera corrida debido al corto tiempo de contacto de voltaje en el gel impidió la migración de las bandas a una distancia adecuada para ver la presencia de ARN.
V. BIBLIOGRAFÍA [1] Armendariz Borunda, Jan Socorro. (2011) Biología Molecular. 2°Edicion. Mexico. Mc Graw HILL
[2] Brarioglio, C. (2001) “Diccionario de producción animal” Editorial Brujas, Espña. P,42. [3]Farrell, R. (2005) “RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization” 3er Edición. Elsevier Academic Press. USA. P, 218 [4] Garrido, A., et al. (2006) Fundamentos de bioquímica estructural. 2º Edición. Madrid. Páginas 444. [5] Hannon, G. J, Nielsen T. W., Ares M. (2010) Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). PubMed. [6] Hernández Medina (1994) Revista comparativa el estrés salino entre Capsicum annuum var. glabriusculum y Capsicum annuum var annuum: Análisis molecular, fisiológico y morfométrico.Centro de Investigaciones Biológicas del Noreste. TM [7] HypperLadder 1kb, Bioline a Meridian Life Science Company, 1 página. Rceuperado el 7/02/15 http://www.bioline.com/sg/downloads/dl/file/id/2672/pi50092_hyperladder_1kb_v2.pdf [8]Jiménez, Horacio Merchant Larios. 2002. Biología Celular y Molecular. Primera edición. Editorial Pearson Educación. Naucalpan de Juárez. Edo de México. Pág: 2732 [9] Koolman, J. KlausHeinrich, R. (2004) “Bioquímica: texto y atlas” Editorial Médica Panamericana. Alemania. P, 250. [10] Martínez JuanPablo, Alvarado Omar. (2000) Comparación de Métodos de Extracción de RNA para la Detección del Viroide Exocortis de los Cítricos por Electroforesis Secuencial. Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. Revista Mexicana de Fitopatología, vol. 18, núm. 1, enerojunio, pp. 42 49. [11] McNamara, P. A. (2006). “Trends in RNA research”. New York, EUA: Nova Science Publishers. [12] Patiño Restrepo J.F. 2006. Metabolismo, Nutrición y Shock. Cuarta edición. Editorial médica panamericana. Colombia. [13] Peña, A. (2004). “Bioquímica”. Editorial Limusa. México. P, 166167. [14] Sandoval A. 2010. Protocolos de Extracción de Ácidos Nucleicos. Laboratorio de Biotecnología Molecular. Universidad de La Frontera. Facultad De Ciencias Agropecuarias y Forestales.
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