Extraccion de Pigmentos (1)

EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS QUÍMICOS MEDIANTE DISOLVENTES QUÍMICOS Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS DE HOJAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) Paja camayo Fabián Eduardo, Salamanca Alejandro Programa de Química. Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educación. Universidad del Cauca Fecha de la práctica: 22/09/2016; Fecha de entrega: 06/10/2016

ABSTRACT Se realizó la separación de los pigmentos fotosintéticos de hojas de Batavia fresca mediante el método de extracción liquido-líquido. El método de separación se realizó por etapas mediante la utilización de solventes orgánicos, hasta obtener finalmente las fracciones por separado de cada uno de los pigmentos. Para comenzar con el proceso de extracción se adiciono acetona, para separar todas las especies solubles en ella, posteriormente se realizaron varios cambios de solvente con polaridades diferentes hasta obtener las clorofilas y carotenoides y posteriormente llevo a cabo la extracción de los diferentes pigmentos fotosintéticos presentes en la Batavia , para dicho propósito se emplea la técnica de cromatografía de capa fina, a fin de identificar cada una de las 4 sustancias a separar (carotenoides, xantofilas, clorofila a y clorofila b). Para la determinación de la mejor mezcla de disolventes se realizó un ensayo en cromatografía en papel, para comparar la eficiencia de la extracción. Nuestra matriz fue la Batavia la cual contiene un gran porcentaje de dichos pigmentos. Se calculó los factores de retención los cuales se alejan significativamente de los valores reportados en la literatura. 1. SECCIÓN EXPERIMENTAL 2.1. Reactivos Acetona, éter de petróleo, etanol al 96%, éter etílico, metanol acuoso, carbonato de calcio, agua destilada, hexano, cloroformo, sulfato de sodio anhídrido y benceno. 2.2. Equipos Balanza analítica, Centrifuga, bortex, equipo de filtración al vacío y cámara de cromatografía, equipo de luz ultravioleta. 2. DATOS Y RESULTADOS Tabla 1.Resultados experimentales de la práctica. Pigmento Clorofila a Clorofila b Xantofilas Carotenos

Disolvente Solución acuosa Solución acuosa Éter etílico Éter de petróleo

Color Verde Verde de baja tonalidad Amarillo Naranja 1

Figura 1. Resultados obtenidos en la práctica.

Figura 2. Resultados obtenidos en la práctica. Tabla 2. Clasificación de los pigmentos según el orden empleado en la placa cromatografíca Indicación M a b x c

Pigmento Muestra completa Clorofila a Clorofila b Xantofilas Carotenos 2

Para iniciar con la cromatografía en capa fina, se realizó un ensayo con diferentes mezclas de disolventes y como soporte se utilizan tiras de papel filtro. Tabla 3. Separación obtenida con diferentes mezclas de disolventes en la cromatografía en papel. Mezcla

Relación

Resultado

A B C D

Para la cromatografía en capa fina se emplearon 3 placas y como medio de separación las mezclas de solventes B, C y D. A continuación se describe tanto la ubicación como la coloración de los pigmentos en la figura 1 y los desplazamientos en la tabla 3.

3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los cloroplastos posen un mezcla de pigmentos de diferentes colores, por ejemplo, la clorofila-a posee una coloración verde intenso, la clorofila-b poseen una coloración verde, y las xantofilas posen coloración amarillo o anaranjadas en diferentes proporciones. Estos pigmentos fotosintéticos tienen un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separación. Los compuestos fotosintéticos extraídos se tomaron de la Batavia, donde para dicho procedimiento se utilizaron 15 g, asegurando que la muestra tomada estuviese libre de venas, la trituración se realizó mediante un proceso mecánico que garantizó un troceado uniforme. Posteriormente la adición de acetona permitió la separación de una porción de los pigmentos del resto del vegetal. Se han descrito innumerables procedimientos para la extracción de los pigmentos, en donde el solvente utilizado en dichos procedimientos es la acetona; debido a su baja polaridad, y amplio margen de solubilización [1] es utilizada para dicho fin. La adición de Carbonato de Calcio (CaCO3) en pequeñas pociones protege electrostáticamente a las moléculas de las clorofilas y al mismo tiempo absorbe agua presente en las hojas, impidiendo la formación de las feofitinas (a y b para cada una de las clorofilas correspondientes) que se pueden generar durante la extracción ya sea por hidrólisis ácida, por aumento de la temperatura, por exposición directa a los rayos solares, o por acción enzimática de la misma planta, las feofitinas son compuestos derivados de la clorofila que se generan por la sustitución del Mg por dos átomos de hidrogeno (ver figura 1), una característica física para poder evidenciar este tipo de compuesto es su coloración pardo oliva.

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Figura 3.Reac ción de

producción de las feofitinas por hidrólisis acida, estas al ser libre de magnesio poseen una menor polaridad. Con lo que respecta a los carotenoides es sabido que son bastantes estables, por lo que solo se han registrado oxidaciones e isomerizaciones posteriores al desarrollo de la separación. Debido a estos fenómenos químicos presentes se debe garantizar un ambiente fresco, con luz tenue, y una extracción rápida [2]. A continuación la centrifugación de la solución resultante permitió la separación de los restos celulares de la solución de acetona que contenía los pigmentos de estudio y sustancias solubles en acetona. Cada uno de los pigmentos fotosintéticos se separaron mediante solventes, la extracción liquido-liquido simple aprovecha la propiedad de las diferentes solubilidades de los pigmentos anteriormente mencionada, con el empleo de solventes inmiscibles es posible dicha separación. Las moléculas de clorofilas (a y b) poseen un átomo central de Mg 2+ contenido en un anillo de porfirina junto a un alcohol insaturado llamado fitol, ambas estructuras únicamente difieren en el sustituyente del carbono 3, mientras la clorofila-a posee un grupo metilo, la clorofila-b posee un grupo aldehído (-CHO), esta diferencia estructural no tan solo confiere una diferencia en la coloración sino que también en su polaridad por lo que la clorofila-b es más polar que la clorofila-a [3,4]. Los carotenos son compuestos formados únicamente por carbono e hidrogeno por lo que se clasifica como hidrocarburos [5], consecuentemente es un compuesto muy apolar, los carotenos se clasifica en α y β carotenos (por ser los más abundantes), sus coloraciones van desde el amarillo hasta el anaranjado, también dentro de los pigmentos extraídos se encuentran las Xantofilas, que son derivados oxigenados de los carotenos. Las Xantofilas poseen coloraciones por lo general amarillas, siendo la Leutina y la Violaxantina las más abundantes. Las características estructurales de los pigmentos estudiados nos permitieron clasificar la polaridad de cada uno por lo que se generó un gradiente de polaridad desde el más apolar al menos apolar, la figura 2 muestra dicho gradiente de polaridad, Carotenos < Clorofila-α < Xantofilas < Clorofila-β Figura 4.Gradiente de polaridad desde el más apolar al menos apolar (polar). El cambio de disolvente permitió eliminar compuestos solubles en acetona diferentes a los pigmentos fotosintéticos, se adiciono éter de petróleo a la solución de acetona realizando 4

lavados con agua en un embudo de separación con el fin de eliminar la acetona que pueda estar presente en la nueva matriz que contiene los pigmento de estudio. Posteriormente se procedió a separar los pigmentos en parejas, la adición de metanol permite la separación de las Xantofilas y Clorofila-b de los Carotenos y Clorofila-α}a, el metanol posee una alta polaridad por lo que es a fin con los compuestos polares, (ver figura 2). Hasta ahora se han separado los compuestos polares de los apolares, gracias a la adición de metanol y de éter de petróleo, ahora el tratamiento de lo solución de metanol con lleva un cambio de matriz, se adicionó éter etílico con lavados de agua destilada, por lo que las Xantofilas y Clorofila-b pasan al éter etílico, este procedimiento permitió pasar de un medio muy polar a uno menos polar, pero con la suficiente polaridad que permita la retención de los pigmentos, el metanol posee un valor de índice de polaridad de 5,1 mientras que el éter etílico posee un valor de 4,1 [5]. Finalmente la hidrólisis de las clorofilas permite la separación de su pigmento acompañante, el fitol presente encada una de las clorofilas es hidrolizado mediante el ataque nuclefilico del KOH, generando fitolato de potasio y las repetitivas clorofilidas, la adición de agua (índice de polaridad 10,2 [5]) permite la separación de las clorofilas de su respetivo pigmento acompañante (ver tabla 1).

4. CONCLUSIONES La extracción liquido-liquido realizada permitió la separación de cada uno de los pigmentos fotosintéticos, aprovechando las diferencias de solubilidad de estos en solventes orgánicos, de igual manera el cambio de solvente o de matriz de los analítos se debe realizar garantizado que la mayor parte de la concentración de los analítos se reparta en la nueva matriz, lo cual se lleva a cabo mediante la adición de un solvente de mayor polaridad. Para finalizar La producción de feofitinas se puede generar fácilmente debido a que en la lisis celular se puede liberar enzimas presentes en la planta lo que hace que el método sea inadecuado, aunque en nuestro experimento se tuvo las precauciones debidas anteriormente mencionadas en el análisis. 5. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Cuál es la función de la acetona durante el proceso de extracción? Se utiliza acetona debido a su baja polaridad, y amplio margen de solubilización. 6. REFERENCIAS [1]M. C. Rodríguez Dodero, I. Moreno Garrido. Optimización de variables para la mejora de la separación y la sensibilidad en un análisis por cromatografía en capa fina: aplicación al estudio del perfil pigmentario de algas marinas Anales de la Real Sociedad Española de Química. 2002, 3, 34-39

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[2] H. Quach, R. Steeper, W. Griffin. J Chem. Un método mejorado para la extracción y cromatografía en capa fina de clorofila a y b de la espinaca, J. Chem. Educ. 2004 81(3), 385-387. [3] H. Curtis, S. Barner, Biología, Medica panamericana, Buenos aires –Argentina 2005. [4] S.J Schawartz, T. V. Lorenzo, Food Sci, Nutr. 1900, 29 (1), 1-17. [5] Torissi, F, D. Una experiencia sencilla con fundamentos complejos: la separación de pigmentos fotosintéticos mediante cromatografía sobre el papel, Aula y laboratorio de Química, Anales de la Real Sociedad Española de Química. 2007, 103 (4), 45-51.

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