Extraccion de Nematodas

Nombre: Mayerlin Rojas Perez Código: 114555 Materia: Nematodos Fitoparasitos Profesor: Eyder Daniel Gomez Lopez Extracción de nematodos Introducción

Una vez obtenidas las muestras de suelos o raíces, el manejo y cuidado entre la recolección y la extracción de nematodos es de suma importancia para obtener optamos op tamos resultados, la etapa de almacenamiento debe ser en lo posible corta y en caso de no ser posible, se deben tener en cuenta dos aspectos muy importantes, la temperatura y la humedad. Para evitar la pérdida de humedad, humed ad, es recomendable guardar las muestras en e n bolsas selladas y no exponerlas directamente al solo cerca ce rca de fuentes de calor que puedan secar nuestra muestra, se debe tener en cuenta que un manejo inadecuado en el transporte, almacenamiento o extracción puede causar un índice alto de mortalidad y esto puede datos erróneos al momento de realizar un conteo o solucionar un problema. Palabras clave: Nematodo, Extracción, Temperatura, Mortalidad, Conteo, Humedad, Muestra.

Aspectos generales en la recolección de muestras.

Se debe recorrer el campo y trazar un recorrido para la extracción de muestras, después extraer un numero acordado de muestras, si el área es muy pequeña, es recomendable tomar las muestras en zigzag cada 15 metros muestreando en áreas de interés, se debe d ebe tener muy en cuenta que las submuestras se toman en los primeros 0.3m de profundidad del suelo, y que se debe evitar tomar muestras cerca de plantas muertas. Cuando se trata de cultivos nuevos, o invernaderos, lo mejor es tomar una cantidad de submuestras en función del área controlada. La muestra compuesta es una muestra representativa del suelo de todo el terreno. Tambien existen muestreos de raíces, los cuales ayudan a tener información de los nematodos endoparásitos (dentro de la raíz) y en las muestras de suelo se pueden obtener larvas o huevos endo y ectoparásitos.

Muestreo de raíces y suelos.

Para tomar la muestra se deben seguir los siguientes pasos:

1. Con el croquis de la finca se deben identificar los lotes que tengan plantas con síntomas de poco desarrollo y amarillamiento. También se deben identificar las plantas con aparente saneamiento o que visiblemente se noten sanas. 2. Una vez identificados los lotes a muestrear, se deben tomar en cuenta dos tipos de  plantas:  Plantas aparentemente sanas: con buen desarrollo y sin amarillamiento.  Plantas aparentemente enfermas: se deben tomar muestras de plantas con amarillamiento, decaimiento o poco desarrollo; sin embargo, deben evitarse muestras de plantas que estén muertas o muy deterioradas, ya que los niveles  poblacionales de estas plantas tienden a ser erróneos. 3. Para obtener un resultado confiable en muestreos de raíz, es necesario que la muestra final esté compuesta de varias sub-muestras. La cantidad de submuestras depende del área. Se recomienda de 50 a 80 submuestras por hectárea. En el caso de plantaciones establecidas o perennes, se debe tomar la muestra de la zona entre el goteo y la mitad de la rama a una profundidad de 30 centímetros obviando los primeros 10 cm.

Muestreo para cultivos de ciclos cortos o anuales.  Recorrer toda la parcela en forma de zig-zag y tomar submuestras cada 20 pasos,       

 para un total de 50 submuestras por hectárea aproximadamente. Quitar la capa superior del suelo (5 a 10 cm aproximadamente). Tomar muestras cerca de la época de cosecha. Muestrear la zona de las raíces (a 20 o 30 cm de profundidad dependiendo del cultivo) para lo cual se usa un barretón o pala. Sacar raíces con suelo adherido. Tener una hielera o recipiente que guarde la humedad y no altere la condición de la muestra. La muestra se deposita en una bolsa plástica. La muestra total debe ser de 1000 g aproximadamente. Identificar la muestra registrando datos de la zona como: agricultor, cultivo anterior, fecha y otros datos que se consideren importantes.

¿Porque se toma la muestra en la zona de goteo?

Metodos de extracción

Hay varios métodos de extracción de nematodos empleados en laboratorios de nematologia, el usar un método u otro depende de algunos factores de estudio entre los cuales tenemos equipo disponible, condición de las muestras y tipo de nematodo a estudiar. Algo a destacar es que ningún tipo de extracción conocido hasta la fecha es capaz de extraer el 100% de los nematodos presentes en una muestra y que el resultado final obtenido depende también del método de extracción utilizado.

Los nematodos fitoparasitos son removimos principalmente de muestras de material vegetal y suelos y existen dos procesos básicos utilizados para su extracción de los cuales uno depende de la capacidad móvil de los nematodos, y el otro se ocupa de extraer nematodos inactivos e inmóviles, algunos métodos para la extracción d e nematodos son los siguientes embudo de Baerman, técnica de cribado y centrifugación en solución azucarada, método de cribado y decantación de Cobb, elutriador de Oostenbrink y aparato de Fenwick para extracción de quistes entre otros. Embudos Baerman: Este método es usado para extraer nematodos móviles, este método consiste en colocar embudo en un soporte universal, llenarlo con agua potable y  posteriormente cantidades de suelo entre los (50 a 100 cc) de material vegetal o suelo, son colocadas dentro de una bolsa de tela porosa o papel, la cual se sumerge suavemente en el agua del embudo. Una de las variantes que se puede implementar consiste en colocar a  pocos milímetros del borde superior del embudo, un cedazo o malla de alambre cuya función es soportar la muestra, la que es vertida so bre tela o papel, cuya consistencia, textura y porosidad puede variar. Técnica de centrifugación-flotación: El principio de esta técnica es recuperar a los nematodos de una muestra mediante flotación mediante soluciones de gravedad especifica superior a los fluidos del nematodo algunas de estas soluciones son soluciones de azúcar de caña, soluciones de sulfato de magnesio y sulfato de zinc, si el suelo es arcilloso se aconseja usar un poco de detergente que ayude a la dispersión de partículas de arcilla y favorezca la extracción de nematodos.

Cuando se utiliza este técnico se debe considerar el estrés osmótico que generan estas soluciones a los nematodos por lo que es prioridad lavarlos para ayudar a la recuperación de estos de lo contrario pueden distorsionarse o morir, esta es una de las técnicas más utilizadas debido a que sirve para extraer nematodos inactivos, inmóviles, huevos y nematodos muertos. Para llevar a cabo este método se debe:  Preparar una alícuota de muestra 100 gramos de suelo homogenizado, sin ningún     

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otro tipo de material en el presente. Colocar la muestra en una cubeta y lavarla directamente bajo un chorro a presión, la cantidad de agua agregada no debe superar la mitad de la cubeta. La suspensión resultante se agita bien y se deja reposar durante 30 segundos. Después se procede a dejar la solución sobre un grupo de tamices súper puesto de 100 y 400 mallas. Con ayuda de una pizeta los residuos en el tamiz de 400 mallas se transfieren a tubos de centrifuga. Se centrifuga de 4 a 5 minutos a 3000rpm, se decanta cuidadosamente el sobrenadante y se agrega una solución de azúcar (480 gramos de azúcar de caña por litro de agua). Se resuspende el suelo en los tubos y se procede a agitar a la misma velocidad de 1.5 a 3 minutos.

 El sobre nadante el cual contiene a los nematodos es vertido sobre una criba de 400

mallas y el azúcar en los nematodos es removido con agua, por último, se transfieren los nematodos a un plato para su debido uso.   Nota: por medio de esta técnica se pueden recuperar casi todos los tipos de nematodos.

Extracción de nematodos del material vegetal

Examen directo en estereoscopio a baja magnificación: este método ocupa una pequeña cantidad del material vegetal, consiste en lavar el suelo de las raíces teniendo extremo cuidado, después las raíces son transferidas a cajas Petri, suracuzas o vidrio reloj y a los que anteriormente se les ha agregado una pequeña cantidad de agua, con ayudas de aguas de disección se rasga levemente el material vegetal para liberar a los nematodos los cuales al estar en el agua flotan y pueden ser recolectados por una micro aguja o micro pipeta y al igual que con el suelo, el material vegetal debe mantenerse a una temperatura y humedad adecuada. Mazerado de tejidos vegetal con licuadora: se toman 10 gramos de raíces y se cortan en trozos de 2 a 3 cm de longitud, se agrega agua dependiendo de la dureza del material y se licua a máxima velocidad de 20 a 30 segundos, la solución resultante se filtra en tamices de 100 y 400 micras respectivamente y el resultante se traslada a un embudo baermann donde se da la separación final, una vez extraido el material macerado de la licuadora también se  puede emplear el método de centrifigacion-floculacion.

Bibliografía

Coyne, J;Nicol B; Claudius, C. 2009. Nematología Práctica: Una guía de campo y laboratorio. Benín. IITA. p.1-2. Crozzoli R. La Nematología Agrícola en Venezuela. Ediciones de la Facultad de Agronomía. Universidad Central de Venezuela. ISBN: 978-980-00-2797-4. 2014. 447pp. FHIA (Fundación Hondureña de Investigación Agrícola, HN). 2014. Cómo tomar muestras de raíces y suelo para análisis de nematodos.

Rizosfera Es la zona donde ocurre la interacción bioquímica entre el suelo y las raíces de las plantas, es una zona de interacción única y dinámica entre las plantas el suelo y los microorganismos del suelo, esta zona se caracteriza por gran cantidad de biomasa y gran actividad biológica en comparación a otras zonas del edafológicas. La rizosfera es una capa muy delgada y su profundidad varia según el lugar del planeta donde se encuentre, y en esta se dan a cabo procesos ecológicos indispensables, entre los cuales la fijación del nitrógeno tiene un lugar destacado. Rizovaina región de la rizosfera caracterizada