Exposicion de Tecnicas de Fijacion y Tincion de Protozoarios

Laboratorio de Microbiología General II Técnicas de colecta y tinción de parásitos Blanco Blanco Ivón Galicia López Susana Verónica Laguna Morales Juan Carlos Mogollan Marín Luis Jonatan

 Aprender

colectar material parasitario de animales de experimentación y domésticos.

 Conocer

a

utilizar las diferentes técnicas de tinción, utilizadas en Parasitología.

 Es

la manipulación sobre un ser vivo, o bien sobre parte de él, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible.



Los fijadores se dividen en 2: 

Físicos:   



Calor Frío Criodesecación (liofilización)

Químicos      

Líquido de Bouin Solución Fijadora de PVA Solución de Schaudinn Gelatina-Glicerol Formalina AFA

 Se

hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulación rápida de las proteínas y por tanto su estabilización.

 Fijador

de Protozoarios y Helmintos.

 Ácido

pícrico, saturado con agua.  Formaldehído  Ácido Acético Glacial

 Cloruro

de mercurio, saturado con agua

 Alcohol

95%



etílico,

A esta solución se le agrega ácido acético glacial en proporciones de 1 parte de Ác, acético glacial por 19 partes de la preparación, antes de usarla.

 Fijador

de quistes, trofozoitos, huevos, larvas.

 Fijador

de trofozoitos y quistes (combinación Schaudinn más resina).

 PVA  Ácido

acético glacial  Glicerina  Solución de Schaudinn

 Sirve

en preparaciones permanentes de nematodos  Componentes:    

Gelatina Agua destilada Glicerina Fenol (cristales)

 Sirve

para preservar quistes, helmintos y protozoarios  Componentes:  

Formaldehido 0.5% Solución salina (NaCl 0.85%) Se recomienda calentar a 60-63 oC

 Se

utiliza para preservar trematodos y cestodos  Componentes: Etanol(96%)  Formaldehido  Agua destilada  Acido acético La mezcla de etanol, formaldehido y agua destilada durar varios meses. Cuando se agrega el acido acético dura un mes. 

 Es

un método en el cual se utilizan colorantes especiales para pintar o teñir a una célula que ha sido procesada, esto con la finalidad de poder observarla al microscopio.

 Para

obtener buenos resultados en una tinción esta se realiza lo más rápido posible después de la fijación.

 Las

tinciones se clasifican en:



Simples: Utilizan solo un colorante.



Diferencial: Ocupa más de un colorante.

Y



se pueden realizar de dos formas: Progresivas: Son aquellas en las que el material se coloca en colorante diluido durante el tiempo necesario para colocar la tinción hasta la intensidad deseada.

•

Regresiva: Son las tinciones en las que el material o preparaciones se colocan en colorante concentrado hasta lograr una sobre tinción y posteriormente decolorar hasta lograr la intensidad deseada.

Parásitos

Ectoparásitos

Endoparásitos

Hemoparásitos

 Coloración

de Giemsa  Tinción Wright  Tinción Indica  Eosina 5%  Tinción de Gram  Tinciones permanentes de protozoarios







Tiñe protozoarios, hemáticos e intestinales. Para protozoarios se lava con buffer fosfatos pH 6.8. Flagelos, cilios y núcleos (rojo), citoplasma y esporozoitos (azul)



Reactivos: 

Giemsa II-Eosina (Azul de Metileno-Eosina)



Giemsa II (Azul de Metileno)



Giemsa B (Azur B, formado por la oxidación del Azul de Metileno)Eosina (colorantes)



Glicerina (humectante)



Metanol absoluto (fijador)

Leishmania infantum

Toxoplasma gondii



Tinción de tipo Romanowsky, debido a que se produce una separación de colores: 

Tiñe de púrpura núcleos y gránulos neutrofilicos.



De rosa a los Eritrocitos.



De azul a proteínas ácidos nucleicos y citoplasma.



Reactivos: 

Tinción de Wright   

Eosina Y Eosina B Azul de Metileno



Glicerina



Alcohol metílico absoluto

Melanoma perro

maligno

del

 Útil

para evidenciar segmentos grávidos entre Taenia solium y Taenia saginata.

 Reactivos:

   

Tinta india (colorante) Etanol al 50% o 70% (deshidratante) Xilol (aclarante) Se monta en bálsamo de Canadá

 Observación

de parásitos en heces ya que, estos y sus quistes se resisten a su coloración y la materia fecal se tiñe rosa. (protozoarios es fondo blanco al igual que sus quiste)  Reactivos: 

Eosina 5%

 Ésta

es una tinción diferencial usada para demostrar las propiedades tintoriales de bacterias de todos los tipos.  Las bacterias grampositivas retienen el colorante de cristal violeta después de la decoloración se ven azul oscuro.  Las bacterias gramnegativas no son capaces de retener el colorante violeta cristal después de la decoloración y se contratiñen de color rojo con el colorante de safranina.

 Las

características tintoriales pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes, viejos, muertos o en degeneración.  Tinción de formas quísticas de Pneumocystis carinii

Tinciones I. II.

permanentes:

Tinción de Heidenhain con hematoxilina férrica. Tinción de Wheatley, tricrómica.

 Utilizada

para la detección e identificación de protozoos fecales.

 Preparación I.

II. III.

de hematoxilina Hematoxilina Alcohol etílico de 95° Agua destilada

 La

hematoxilina primero debe ser oxidado para dar hemateína.  Algunos agentes químicos oxidantes que se pueden usar son: yodato de sodio, permanganato de potasio, peróxido de hidrógeno y oxido de mercurio.

 La

fase de la coloración (solución de alumbre de hierro y amonio al 2% ) es de mucha importancia. El propósito es disolver gradualmente algo del color negro de la preparación y se continúa hasta que la estructura nuclear de las amebas y flagelados sea perfectamente visible.

 Es

una alternativa a la hematoxilina férrica para la tinción de protozoos.

 Permite

visualizar las características de los organismos.

I.

II. III.

10mL de ácido acético glacial a 6 g de cromotropo 2 R, 3g de verde brillante y 7g de ácido fosfotúngstico. Mover y dejar la mezcla por 30 min. Agregar 1000mL de agua destilada y mezclar.

 Los

protozoos tienen citoplasmas de color entre verde azulado y violeta

 Núcleos

y cuerpos de inclusión de color entre rojo y rojo purpúreo

 El

fondo de la muestra es verde.

 Las

tenias adulto están formadas por una serie de segmentos rectangulares planos denominados proglótidos  Cada proglótide maduro contiene ambos órganos reproductores

Los proglótidos se lavan con formol

Se escoge uno de los proglotidos terminales del gusano y se coloca entre dos portaobjetos

Con un hilo en cada extremo se presionan los portaobjetos, se deja uno de los hilos mas largos

Se abren los portaobjetos, se toma el proglótido y se coloca en un portaobjetos limpio fijándose con resina

Sujetando el hilo largo se sumerge en lactofenol, se extrae hasta que se aclare

 Las

filarias son nematodos que se localizan en tejido subcutáneo, sangre, ojo y cavidades de animales y humanos; su forma larvaria es conocida como Microfilaria, la cual es ingerida por mosquitos hematófagos, en estos evolucionan hasta larva III (infectante) para ser inoculados por picadura a otros animales.

1.Alumbre de amonio Agua destilada 2.Hematoxilina Alcohol 95% Mezclar y agregar la solución 1. 3.Glicerina Alcohol metílico Agregar la solución anterior

Loa loa

 Reactivos:

Azul de cresilo al 75% en solución salina Azul de metileno al 1% es solución salina  Se usa para teñir microfilarias vivas, tiñe el núcleo y provee un contraste entre el portaobjetos y el m.o.

Tipos de muestra

Cuidados de la muestra

Técnicas

Parásitos

Sangre

Heparina Azida de sodio Recién extraída

Gota gruesa Gota fina

Hemoparásitos,in tra/extra eritrocitarios

Ectoparásito

Vivo

Sacrificado Fraccionado

Garrapata

Materia Fecal

Frasco boca Varios procesos ancha, limpio y seco, ausencia de orina y rotulado

Sólidas

Cerradas( evitar desecación) y refrigeradas 2° C

Cps Flotación Concentración

Huevos y/o quistes nemátodos

Líquidas

37° C recién obtenidas

Observación en fresco

Trofozoitos y quistes

Tejidos

frascos con fijador •formalina

Varios procesos

T. Solium

Parásitos intestinales

 Impregnación

que se produce al ejercer presión con un porta objetos sobre el tejido que va a ser examinado.

 Se

fijan y se tiñen como un frotis sanguíneo.



Técnica de Gota Gruesa

 Frotis

o extensión fina de sangre

 En

la molleja o proventrículo suele atacar el Tetrameres americana.  En el intestino delgado la Ascaridia galli y la capillaria obstinta.  También pueden detectarse: o Davainea proglotina o Amoebotonea o Hymenolepis carioca

 En

el ciego (parte del intestino) suele alojarse el Heteraquis gallinae, Capillaria anulata.  En la tráquea se aloja el Syngamus laringeus

Parásito

Localización

Trypanosoma sp. Sangre Trypanoplasma sp. Hexamita sp.

sangre

Trichodina sp.

Branquias

Tracto digestivo

NORMAS OFICIALES MEXICANAS

 NOM-062-ZOO-1999  NOM-033-ZOO-1995

 NOM-051-ZOO-1995  NOM-059-ECOL-1994

 Microscopio  Estereoscopio 1

Pliego de papel absorbente  Un estuche de disección  Animales: sapo, gallina, pez carpa

Localice y obtenga los ectoparásitos de los animales asignados

Sacrifique los ectoparásitos

Observe con ayuda del microscopio y estereoscopio las muestras

Haga observaciones de diferentes porciones del artrópodo

Realice diversas preparaciones en solución salina utilizando lugol

Coloque en el portaobjetos limpio una gota de sangre extendiéndola a 1.5 cm

Se hace un lacado o lisado de eritrocitos en agua destilada, seca y teñir con el método de Giemsa

Mueva rápido el portaobjetos de manera suave para no lisar los eritrocitos y teñir con el método de Wright

Observar en 10x, 40x y 100x en el microscopio

Deposite una gota de sangre en uno de los extremos y realizar una extensión de la sangre

El frotis de sangre se cubre con unas gotas de la tinción de Wright; se deja durante 1 minuto.

Se agrega unas gotas de agua amortiguada (pH 6.8 a 7.2); se debe soplar sobre el portaobjetos para mezclar el agua con el colorante.

Este método solo sirve para frotis delgados

Se tiñe durante 3-5 minutos o hasta por 15 minutos

El exceso de colorante se quita con agua amortiguada, se escurre con rapidez y se deja secar al aire.

Fijar los preparados en metanol absoluto durante unos 30 segundos por inmersión o por goteo del alcohol sobre el frotis colocado en un ángulo de 30° a 45°.

Dejar que sequen.

Secar los frotis en posición vertical.

Teñirlos unos 20 minutos en una disolución de Giemsa 1:20 o 45 minutos en una disolución 1:50.

Lavarlos brevemente en agua amortiguada neutra o bajo corriente.

Sacrificar mediante incisión todo lo largo de la línea media ventral

Se limpiara de moco y resto de tejido a los helmintos

Conservar los helmintos limpios en AFA y fijar posteriormente

Buscar en la superficie de los órganos internos y las membranas serosas la presencia de quistes

Realizar impronta con una pequeña y delgada porción de algunos órganos del animal

Extraer órgano por órgano, los que se colocan en placas con solución salina

Abrir los órganos huecos con una tijera y los esponjosos se desmenuzaran en busca de helmintos. Y en el intestino en busca de helmintos y protozoarios

 Lawrence

Ash. Atlas de Parasitología Humana. Editorial Panamericana. 5ta. Edición. México 2010. Pág. 455  Markell Edward K. Parasitología, Diagnóstico, Prevención y Tratamiento. Editorial el Manual Moderno. 5ta. Ed. México 1984. Pág. 411

Tinción de giemsa

 1.

Secar los frotis durante varias horas o hasta el día siguiente. No fijarlos.

 2.

Teñirlos durante 45 minutos con una disolución 1:50 del colorante de Giemsa.

 3.

Lavarlos en agua amortiguada neutra o bajo agua corriente por 3-5 minutos.

 4.

Secar los frotis en posición vertical



1. Fijar solo los frotis delgados en metanol absoluto aproximadamente durante 30 segundos por inmersión o por goteo del alcohol sobre el frotis colocado en un ángulo de 30° o 45°.



2. Dejar que se sequen



3. Teñir ambos frotis simúltaneamente durante 45 minutos con una dilución Giemsa 1:50.



4. Enjuagar brevemente los frotis delgados por inmersión en agua amortiguada neutra. Lavar el frotis grueso durante 3-5 minutos adicionales por inmersión en agua amortiguada sin dejar que el frotis delgado se ponga en contacto con el agua de lavado.



5. Secar los frotis en posición vertical con el frotis delgado hacia abajo.



1. Fijar los frotis de sangre en alcohol metílico absoluto durante 1 minuto.



2. Dejar secar los portaobjetos.



3. Sumergir los portaobjetos en una solución de Giemsa en proporción de una parte de ésta con 30-50 partes de agua amortiguada (pH 6.8 a 7.2). Teñir durante un lapso de 30 minutos a 1 hora.



4. Mojar brevemente los portaobjetos con agua amortiguada, después se escurren con rápidez y se dejan secar al aire.