Exclusión Molecular

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIÓQUÍMICA LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

P ráctic ráctica a: S epa eparación de grupos g rupos us ando cromat cromatog rafía rafía por por exclusión.

Profra. Rosa Martha Cabrera Martínez.

 A lumno.  Lacunza Guzmán Juan Diego.

Grupo: 4IM2 

 30 de oc octubre tubre de 2017

S ección II

I ng enierí eni erí a bioquí bi oquímic mica. a.

OBJETIVOS. El alumno: o o

Determinará algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico. Efectuara la desalación de la albúmina, utilizando de cromatografía por exclusión

FUNDAMENTO. La cromatografía de exclusión molecular es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Biogel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado. (1) Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y, por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio, aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.

Imagen 1. Mecanismo de la cromatografía por exclusión molecular.

DATOS E XPE R IMENTALES . Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna. Volumen de elución (mL) A 615 3 0 6 0.009 9 0 12 0.003 15 0.022 18 0.931 21 0.831 24 0.031 27 0.009 30 0.001 33 0.005 36 0 39 0.001 42 0.001 45 0 48 0

Perfil de elución de la Dextrana azul 2000 1 0.8    a    i    c    n    a0.6     b    r    o    s     b    A0.4 0.2 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Volumen de elución (mL)

Gráfica 1. Perfil de elución de la dextrana azul 2000, para determinar el volumen vacío de la columna. a) ¿Cuál fue el volumen total de la columna (V T)?  Altura del lecho cromatográfico: 20.5 cm Diametro: 2cm Radio: 1 cm VT = (Altura del lecho cromatográfico) (área de la columna) VT = (20.5 cm) (π (1 cm) 2) = 64.4 cm 3 = 64.4 mL

b) ¿Cuál fue el volumen vacío (Vo) de la columna? ¿Qué importancia tiene determinarlo? Vo= 18 mL Es el volumen que se necesita para eluir un soluto que no queda retenido en la columna, lo que es equivalente al tiempo que permanece, el mismo, en la fase móvil. c) Determiné el volumen que ocupa en la columna el líquido que se encuentra en el interior de la estructura del gel (V i) y el volumen del gel solo (Vg). Del SEPHADEX G-25, se sabe: Intervalo de fraccionamiento para proteínas (daltones): 1000  – 5000  Agua retenida (mL /g gel seco): 2.5 ± 0.2 Volumen del lecho (mL /g gel seco): 4  – 6 Gramos que se tienen con el volumen del lecho cromatográfico 5 mL – 1 g 64.4 mL – X = 12.88 g Mililitros internos se tienen por gel seco. 1 g gel seco  – 2.5 mL 12.88 g – X = 32.2 mL Vi = 32.2 mL Vg = VT – (Vi + Vo) Vg = 64.4 mL – (32.2 mL + 18 mL) = 14.2 mL Tabla 2. Separación del sulfato de amonio y la albúmina. Solo se tomaron los pesos de los tubos que presentaron precipitado. Volumen de  A280 Masa del tubo Masa del tubo con (NH4)2SO4 elución (mL) seco (g) precipitado seco (g) (mg) 3 0.001 6 0.002 9 0.001 12 0.003 15 0.021 18 0.334 21 0.294 24 0.216 27 0.127 6.6778 30 0.04 0.000 0.000 7.7930 33 0.001 0.000 0.000 6.1778 36 0.002 0.000 0.000 5.9998 6.0171 39 17.3 0.000 8.4841 8.5179 42 33.8 0.000 6.6176 6.6613 45 43.7 0.000 8.5432 8.5775 48 34.3 0.000

51 54 57 60 63 66 69 72 75

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

5.2568 7.5043 7.9096 7.5090 5.1201 8.1479 -

5.2803 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 -

23.5 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0 0 0

Perfil de elución 0.4

50

    ) 45    g    m     ( 40    o    i    n 35    o    m 30    a    e     d 25    o    t    a 20     f     l    u    s 15     l    e     d 10    a    s    a 5    M 0

0.35     )    m 0.3    n    0    8 0.25    2     (    a    i 0.2    c    n    a     b    r 0.15    o    s     b 0.1    A

0.05 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Volumen de elución (mL) Albúmina

Sulfato de amonio

Gráfica 2. Perfil de elución de la albumina y sulfato de amonio. a) ¿Qué sustancia eluyó primero y cual después? Explique porqué. Eluyó primero la albúmina, luego el sulfato de amonio; el gel Sephadex G-25 permite el paso de molecular de tamaño de 1000D a 5000D a su interior, por lo que la albúmina al ser una proteína de 66380D es excluida, y recorre un camino más rápido con ayuda de la fase móvil en comparación con el sulfato de amonio que pasa por el interior del gel, saliendo después de las moléculas que son excluidas. b) ¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es cromatográficamente útil? “Un gel es un retículo tridimensional cuya estructura se dispone, por lo general al azar…Constan de polímeros entrecruzados, por lo general, inertes, que no se

unen ni reaccionan con el material analizado y que no presenta carga eléctrica.”(2). “El grado de entrecruzamiento se controla de manera cuidadosa para obtener una serie de geles con diferentes tamaños de poro y rangos de fraccionamiento.” (3)

c) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a la usada en la práctica, que puede tener esta técnica. 1. “En la titulación de enzimas o en la determinación de requerimientos de cofactores, la preparación de enzimas contiene a veces inhibidores de pequeño tamaño molecular o los mismos cofactores. También en los estudios físicos de algunas moléculas (p. e., en la espectroscopia de fluorescencia) pueden estar presentes sustancias de interferencia. Estas moléculas pequeñas pueden eliminarse con facilidad utilizando geles de dextrano o poliacrilamida.” (2) 2. Para la separación de DNA de otras biomoléculas como proteínas, para la realización de algunos análisis físicos. (2) 3. También es un instrumento analítico valioso, para la determinación de pesos moleculares. (2). d) Escriba las estructuras químicas del Sephadex ® , Bio  –  Gel A ®  y Bio  – Gel P ® , indicando dónde y de qué forma se da el entrecruzamiento en cada casi y el tipo de enlace que se presenta. Sephadex ®   Bio  – Gel A ®  

Bio  – Gel P ® 

Enlaces alfa, 1-6.

DISCUSION DE R E S ULTADOS . Se determinaron primero los parámetros que caracterizan a la columna; el volumen total, volumen vacío, volumen del gel y volumen interno. Para ello se uso como fase estacionaria Sephadex G-25, el cual tiene un límite de exclusión entre 1000 D – 5000 D, es decir, para moléculas menores a 1000 D y mayores a 5000 D de tamaño, el volumen de elución será el mismo para cada situación y como fase móvil regulador Tris  – EDTA. Para obtener el volumen vacío, se realizó un perfil de elución empleando dextrana azul 2000, una molécula de tamaño mayor a 5000 daltones, por lo tanto, no cuenta con las dimensiones necesarias para entrar en los poros del gel y eluye de una manera rápida. Se obtuvo la mayor absorbancia en el tubo seis, siendo en este punto el volumen vacío. Para calcular el volumen total que ocupa nuestro gel, se mide la altura del lecho cromatográfico, como la columna es un cilindro, se multiplica por el área para obtener el volumen. El dato calculado es de 64.4 mL de gel, dato que coincide con el otorgado por el profesor a cargo, ya a cada equipo se le repitió aproximadamente 60 mL de Sephadex G  – 25, se dice aproximadamente porque se midió en un vaso de precipitados, en el cual puede variar la medida. El obtener un volumen total similar al otorgado, quiere decir que el empaquetamiento fue óptimo puesto que no existieron burbujas de aire que aumentaran la altura del lecho cromatográfico, aunque esto es algo que se determinara adecuadamente obteniendo nuestro perfil de elución de la separación de mezcla al valorar el número de picos, la resolución y eficiencia. El volumen interno se calcula con las propiedades del Sephadex G  – 25. Teniendo el volumen total, el volumen vacío y el volumen interno, se determina el volumen del gel. Todos estos parámetros son importantes en una cromatografía; se pudieran ocupar para determinar el PM de la proteína empleada, claro que para esto necesitaríamos un gel con poros más grandes para tener un intervalo mayor de tamaño y entren proteínas más grandes, soluciones estándar de proteínas y volúmenes de elución para cada una. Se llevo a cabo la separación de una mezcla de albúmina con sulfato de amonio, empleándose las mismas condiciones que para la dextrana azul 2000. La albúmina es una proteína de 60,000 daltones de tamaño aproximadamente y el sulfato de amonio una molécula pequeña, por lo tanto, la proteína eluyó primero gracias a que el sulfato de amonio se quedó retenido en los poros del gel, algo muy importante que se debe destacar, es que la albúmina al igual que la dextrana azul 2000, miden más de 5000 daltones; como ya se mencionó anteriormente las moléculas con mayor tamaño al del poro, eluyen con de la misma forma y por ende el mismo volumen de elución, entonces el volumen vacío que equivale al volumen de elución de la dextrana azul 2000, debe de ser el mismo que el de la

albúmina. Se obtuvo la mayor absorbancia de albumina en el tubo seis, de igual manera que sucedió con la dextrana. El sulfato de amonio es una molécula que no absorbe luz, por eso se empleó otro método para identificar la separación, se precipito con cloruro de bario los tubos seleccionados (a partir del tubo 13). Para ello anteriormente se pesaron los tubos vacíos y posteriormente los tubos donde se presentó precipitado, por diferencia de pesos se obtuvo la masa sulfato de bario formado, lo que equivale al peso del sulfato de amonio. Entonces para el perfil de elución se empleó en el caso del sulfato de amonio su peso y no absorbancia.  Al final se graficó el perfil de elución con la absorbancia a 280 nm de la proteína, con la masa del sulfato de amonio en función del volumen de elución, debemos recordar que para un perfil de elución no es necesario un valor de absorbancia, sino que se necesita una señal que indique la presencia del compuesto, por ello se usa la masa de la sal. Como se observa en la gráfica 2, se aprecia que hubo separación por la resolución, ya que existen dos tubos en los cuales no hay medición de absorbancia, ni masa de precipitado, es decir, no hay proteína ni sulfato de amonio, por lo tanto, se deduce que salió primero completamente la albúmina y posteriormente la sal. Por la anchura de los picos, se puede decir que hay una buena eficiencia para una cromatografía tradicional, solo nos basamos en la campana que se forma por la proteína, ya que lo que nos interesa separar, el sulfato de amonio se puede considerar una impureza. En general, se produjo una buena separación producto de un buen trabajo en el laboratorio, ya que se controló adecuadamente la velocidad de elución, el volumen del lecho cromatográfico, cuestiones que nos revela el perfil de elución al aparecer únicamente dos campanas con buena resolución y eficiencia, para poder hablar de esto más a profundidad, se tendrían que determinar los parámetros matemáticamente, puesto que ya se tiene el tiempo de retención (volumen de elución), el volumen vacío, solo falta el ancho de la campana.

CONCLUSIONES. 



Se determinaron correctamente los parámetros que caracterizan un lecho cromatográfico; volumen vacío, volumen interno, volumen del gel y volumen total. Se separó correctamente la mezcla de la albúmina con sulfato de amonio (desalación de la proteína), comprobándose con un perfil de elución, el cual también nos ayudó a saber la eficiencia y resolución del método junto con el buen trabajo en laboratorio.

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