Estudio de Las Propiedades Cineticas de La Enzima

 

INDICE 1.

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... ......................................................................................................................................... .......... 2

2. 3.

RESUMEN........................................................... .............................................................................................................................. ........................................................................................ ..................... 3 DETALLES EXPERIMENTALES...................................................................................................................... ...................................................................................................................... 4 3.1.

Solución de enzima alfa-amilasa bacteriano: Bacillus subtilis. .......................................................... .......................................................... 4

3.2. Efecto de de la variación de pH sobre la la velocidad velocidad de reacción reacción de alfa-amilasa, en la hidrolisis del del almidón. ......................................................................................................................... ......................................................................................................................................................... ................................ 4 3.3. Efecto de la variación de la temperatura sobre la actividad enzimática de alfa-amilasa en hidrolisis del almidón. ................................................................................. ................................................................................................................................................... .................................................................. 5 4.

RESULTADOS .................................................................. ....................................................................................................................................... ............................................................................ ....... 6 4.1.

Efecto de la temperatura en la hidrolisis del almidón....................................................................... almidón....................................................................... 6

4.2.

Efecto del pH en la hidrolisis del almidón ......................................................... ......................................................................................... ................................ 7

5.

DISCUSION DE RESULTADOS .............................................................. ..................................................................................................................... ....................................................... 8

6.

CONCLUSIONES..................................................................................................................... CONCLUSIONES.......................................................................................................................................... ..................... 9

7.

RECOMENDACIONES ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 10

8.

BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... ..... 10

9.

CUESTIONARIO ................................................................................................................................... ........................................................................................................................................ ..... 11

1

 

1.  INTRODUCCIÓN Se dice que las enzimas son proteínas “especialistas” y controlan la mayoría de las reacciones químicas de nuestro cuerpo. Hay enzimas en todo lo que está vivo. También se dice que son catalizadores, porque cada reacción química necesita una enzima para que se realice, es decir, todo lo que se transforma se hace gracias a una enzima. La cinética enzimática es un principio que estudia la velocidad en las reacciones químicas en las que intervienen enzimas. El estudio de las propiedades como la velocidad y de la dinámica de la enzima, nos permite conocer a fondo el mecanismo de acción de dicha enzima, el rol que cumple en el metabolismo como su especificidad. especificidad. La velocidad de una rea reacción cción catalizada  por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya ya que en muchos casos no es necesario  purificar o aislar el enzima. Para medir la cinética enzimática es necesario condiciones optimas de temperatura, presencia de cofactores, pH, entre otros y se utiliza concentraciones saturadas de sustrato es decir que todos los sustratos en el medio presentan su enzima. En estas condiciones favorables la velocidad de la reacción observada será la velocidad máxima. La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto, su unidad es el katal(kat). La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml). Cada enzima actúa sobre una sustancia concreta, como una llave y una cerradura, esta es la razón por la cual en esta práctica N°5 analizaremos dos de los múltiples múlti ples factores que afectan en la velocidad de las reacciones enzimáticas enzimáticas que son el pH y la temperatura.

2

 

2.  RESUMEN La cinética enzimática permite estudiar propiedades como la velocidad y la dinámica de las enzimas permitiéndonos conocer conocer el mecanismo de acción de cada una de las enzimas. En esta  prueba, primeramente, estudiamos el efecto del pH del medio sobre la enzima Alfa- amilasa sobre una solución de almidón que, en este caso, usamos la solución de Buffer Fosfato- Citrato con diferentes valores de pH: 5,5; 6;6,5;7 y 8 y los rotulamos. Añadimos a cada uno 2mL de reactivo Benedict y se colocó a baño maría a 100 por 5 minutos donde a temperatura ambiente  presento una mayor presencia de almidón. Luego, estudiamos el efecto de la variación de la temperatura sobre la enzima Alfa- amilasa en la hidrolisis hi drolisis del almidón donde se colocó 25mL se solución de enzima en cada uno de los 3 tubo t ubo de ensayo, rotulados previamente, y se dispuso a diferentes temperaturas, posteriormente se procedió a adicionar 1mL de almidón para colocarlo en la incubadora. A continuación, le añadimos 2mL de reactivo Benedict colocándolo a baño maría a 100 por 5 minutos donde a mayor pH presento una mayor  presencia de azuca azucares res reductores reductores.. Es nec necesario esario utilizar una mayor mue muestra stra de la solución para que los cambios sean más significativos.

3

 

3.  DETALLES EXPERIMENTALES 3.1. Solución Solución de enzima alfa-amilasa bacteriano: B acillus subt subti lis li s. A partir del cultivo de la bacteria amilolítica  Bacillus subtilis de 48 horas de edad se obtuvo sobrenadante sobrenada nte libre de células (SLC) colocando el cultivo en centrifugación a 9000 rpm por 10 minutos. Separar el sobrenadante del pellet celular. El sobrenadante libre de células contiene la enzima alfa-amilasa que se utilizó en esta práctica.

3.2. Efecto Efecto de la variación de pH sobre la velocidad de reacción de alfaamilasa, en la hidrolisis del almidón. Se estudió el pH del medio sobre la enzima alfa-amilasa sobre una solución de almidón. Para esto disponemos de soluciones Buffer Fosfato  – Citrato, Citrato, con valores de pH: 5; 6; 6,5; 7; 8. En cinco tubos de ensayo, rotulados previamente, se completó en la siguiente forma:

Tubo N°

Tabla N°1 pH Sol. Buffer Vol. (gts) Sol.

Vol. (mL) Sol.

Vol. (gts)

Fosfato-Citrato Buffer Fosfato- Enzima

Sol sustrato

Citrato

almidón 1%

Alfa-amilasa

1

5

20

2.5

2

2

6

20

2.5

2

3

6.5

20

2.5

2

4

7

20

2.5

2

5

8

20

2.5

2

Incubar a 37°C por 25 minutos

Se añadió a cada uno de ellos 2 ml del reactivó de Benedict, luego se colocó en baño maría de agua a 100°C por 5 minutos.

4

 

3.3. Efecto Efecto de la variación de la temperatura sobre la actividad enzimática de alfa-amilasa en hidrolisis del almidón. En tres tubos que previamente fueron rotulados, se procedió según indica en el siguiente cuadro:

Tabla N°2 Tubo N° 1

Sol. Enzima (mL) 2.5

2

2.5

3

2.5

Acción de temperatura Hervir en baño de agua por 5 minutos No hervir (Temperatura ambiente) No hervir (Temperatura ambiente)

Después se prosiguió de las siguientes adiciones y efectos a los l os tubos respectivos, según indica la siguiente tabla:

Tabla N°3

1 2

Adición del sustrato (ml) de sol. almidón 2 2

3

2

Tubo N°

Temperatura de incubación

Tiempo de incubación

37°C 37°C Baño de agua helada

20 minutos 20 minutos 5 minutos

Luego, se añadió a cada tubo 2ml de reactivo de Benedict, después se colocó en baño maría de agua a 100°C por 10 minutos.

5

 

4.  RESULTADOS Luego de realizada la experimentación se obtuvieron los siguientes resultados:

4.1. Efecto Efecto de la temperatura en la hidrolisis del almidón Tabla N°4 Tubo

Enzima

Sustrato

Intensidad (Almidón)

Temperatura

1

Alfaamilasa

Almidón

Nivel 1(bajo)

Baño María

2

Alfaamilasa

Almidón

Nivel 3(alto)

Temperatura ambiente

3

Alfaamilasa

Almidón

 Nivel 2(intermedio)

Baño de agua fría

T vs Nivel de intensidad 3.5 3 2.5    D    A    D    I    S    N    E    T    N    I

2

1.5 1 0.5 0 Temperatura Baño Maria

Temperatura ambiente

Baño de agua helada

6

 

4.2. Efecto Efecto del pH en la hidrolisis del almidón Tabla N°5 Tubo

pH

1

5

Intensidad (Azucares reductores) Nivel 1(bajo)

2

6

Nivel 2(intermedia)

3

6.5

Nivel 2(intermedia)

4

7

Nivel 3(alto)

5

8

Nivel 3(alto)

pH vs Nivel de intensidad 3.5 3 2.5      D    A    D    I    S    N    E    T    N    I

2

1.5 1 0.5 0 PH 5

6

6.5

7

8

7

 

5.  DISCUSION DE RESULTADOS En este experimento se toma a la hidrolisis del almidón como reacción enzimática a observar y al reactivo de Lugol como indicador de almidón en las respectivas soluciones. Como sabemos la velocidad de una reacción enzimática varía al aumentar la temperatura, es decir, la velocidad de una reacción enzimática se incrementa al aumentar la temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un valor máximo a la denominada temperatura óptima. A valores que superan la actividad disminuye debido a que la enzima, sufre procesos de desnaturalización y, por lo tanto, de inactivación (Tena Aldave & Jorrin Novo).Esto se observó en la primera experimentación, en la que los l os tubos se diferenciaban por la intensidad de la coloración negruzca que poseían esto debido al reactivo Lugol agregado en la parte final. El tubo que presentaba mayor intensidad de coloración fue el expuesto a altas temperaturas, su coloración indicaba la presencia de una gran cantidad de almidón con pocos azucares reductores, esto debido a la acción de la temperatura la cual ralentiza la hidrolisis del almidón. Por otro lado, el tubo de menor intensidad indicaba mayor presencia de azucares reductores que de almidón lo que quiere decir que la hidrolisis ha casi culminado. La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y  pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos (Bionova).Esto se observó en la segunda experimentación, en la que la solución en un medio más acido  presentaba baja intensidad en la coloración rojo-ladrillo ,esto debido al reactivo de Benedict agregado en la parte final, lo cual indica poca presencia de azucares reductores eso quiere decir que la reacción fue ralentizada por acción del pH, situación que no ocurre cuando el pH es básico ,esto ocurrió en la solución con mayor intensidad de coloración.

8

 

6.  CONCLUSIONES Para el caso de pH:  Niveles según según el grado de inten intensidad sidad del color: 1)   No hay reacción reacción (no hay pre presencia sencia de ccolor). olor). 2)  Formación de color (no es intenso). 3)  Abundante formación de color (intenso).

4)  Tabla N°6 Tubo N°

pH

1

5

Resultados  No se observó observó ninguna reac reacción ción por lo tanto pertenece al nivel 1  Tiene una intensidad intermedia, por lo

2

tanto, pertenece al nivel 2. 

6

Tiene una intensidad intermedia con 3

6.5

 poca más intensidad, intensidad, pertenece pertenece al nivel

2.  4

7

5

8

La intensidad de color es más fuerte,  por lo tanto, pertenece pertenece al nivel 3.  La intensidad de color es más fuerte,  por lo tanto, pertenece pertenece al nivel 3 

Se puede llegar a la conclusión de que el rango óptimo de pH para la enzima alfa-amilasa es desde: 6.5; 7; 8, pH inferiores a ese rango no favorece la reacción, en el rango óptimo de pH la enzima alfa-amilasa puede hidrolizar al almidón. Variación de temperatura:  Niveles según según el grado de inten intensidad sidad del color: 1)   No hay reacción reacción (no hay pre presencia sencia de ccolor). olor). 2)  Formación de color (no es intenso). 3)  Abundante formación de color (intenso). 9

 

Tubo 1: sometido a baño maría a durante 5 minutos se observó una en alta intensidad de Lugol, esto se debe a que hay poca producción de azucares reductores, se concluye que la temperatura si afecta en las l as propiedades cinéticas de la enzima alfa-amilasa de Bacillus subtilis  al hidrolizar. Se le considera nivel 1 

Tubo 2: sometido a temperatura t emperatura ambiente se observó poca intensidad del Lugol, esto se debe a la alta presencia de cantidades de azucares reductores, se concluye que a temperatura ambiente es el óptimo para que la enzima pueda hidrolizar al almidón. Se le considera nivel

3.  Tubo 3: sometido a baño de agua helada durante 5 minutos, si hubo una reacción intermedia,  podemos concluir que a baño de agua helada no desnaturaliza las l as enzimas, por lo cual se considera un medio apto para la hidrolisis del almidón. Se le considera nivel 2.

7.  RECOMENDACIONES  

Agitar constante mente la solución de sustrato de almidón, para que se homogenice y no nos cause errores en la práctica.

 

Usar 2ml de la solución de almidón ya que 1 ml no se puede apreciar las reacciones.

 

Rotular cada tubo para evitar confusiones y errores en la práctica.

 

Evaluar los efectos del pH en las propiedades cinéticas en la actividad de la enzima alfa-amilasa.

 

Tener cuidado en el baño maría, mar ía, para evitar quemaduras.

 

Tener cuidado de contaminar los reactivos, para lo cual se recomienda usar una pipeta para cada reactivo.

8.  BIBLIOGRAFIA Beatriz, L. (8 de junio de 2019). LIFEDER. Obtenido de https://www-lifedercom.cdn.ampproject.org/v/s/www.lifeder.com/bacillussubtilis/amp_js_v=a2&_gsa= subtilis/amp_js_v=a 2&_gsa=1&usqp=mq3 1&usqp=mq331AQCKAE%3D#a 31AQCKAE%3D#aoh=157146830 oh=15714683033 33 576&referrer=https%3A%2F%2Fwww.go 576&referrer=https %3A%2F%2Fwww.google.com& ogle.com&_tf=De%20%251%24 _tf=De%20%251%24s&a s&a mpshare=https%3A%2F%2Fwww.lifed mpshare=h ttps%3A%2F%2Fwww.lifeder.com%2Fbacillus-su er.com%2Fbacillus-subtillis%2F btillis%2F  Bionova. (s.f.). Obtenido

de http://www.bionova.org.es/biocast/documentos/tema14. http://www.bionova.org.es/biocast/documentos/tema14.pdf pdf

Tena Aldave, M., & Jorrin Novo, J. (s.f.). Obtenido de https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CINETICA.pdf

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9.  CUESTIONARIO a.- Efectuar un breve estudio sobre las características más importantes de la enzima Alfa-amilasa. Las α-amilasas

que se encuentran en la naturaleza pueden tener rangos óptimos de pH muy

diferentes para su funcionamiento; por ejemplo, el óptimo para las α-amilasas animales y vegetales está entre 5.5 y 8.0 unidades de pH, pero algunas bacterias y hongos tienen enzimas más alcalinas y más otras acídicas. Las enzimas presentes en la saliva y el páncreas de mamíferos trabajan mejor a pH cercanos a 7 (neutros) además. Una característica compartida entre las enzimas del grupo de la α-amilasa es que estas, al igual

que otras amilasas, pueden ser inhibidas por iones metálicos pesados como el mercurio, el cobre, la plata y el plomo. las α-amilasa son empleadas para la producción de glucosa y

fructosa.

b.-Describir el tipo de enlace presente en el almidón que ha sido hidrolizado por la Alfaamilasa bacteriana (procedente de Bacillus subtilis). La -amilasa, también conocida como -1,4glucanohidrolasa; EC 3.2.1.1 es una glucanasa endoactiva que catalizan la hidrólisis al azar de los enlaces -(1,4) y/o - (1,6) glicosídicos de la región central de las cadenas de amilosa y amil amilopectina opectina excepto en las proximidades de los puntos de ramificación.

c.-Señale los tipos de productos agroindustriales que pueden ser tratados por hidrolisis con enzimas amilolíticos, a nivel industrial y que productos importantes se obtienen en cada caso. Los almidones representan un componente importante en un largo número de productos agroindustriales como el cereal (maíz, arroz, trigo) cuyo contenido de polisacáridos varía de 30 a 80%; legumbres (frijol, guisantes, haba) con 25 –  50%;   50%; tubérculos (papa, tapioca) con 60 – 90%, 90%, como también algunas frutas tropicales como el banano con 70-75%. Los hidrolizados de pescado han venido siendo una fuente con importante potencial para el mejoramiento de los productos y los procesos a nivel tecnológico. El hidrolizado de proteínas de hueva de atún ha sido utilizado para mejorar las propiedades emulsionantes de las salchichas de bagre, su adición por ejemplo, mejora las propiedades físico-mecánicas del 11

 

 producto, aumentando su firmeza, su cohesión y su resistencia, además genera glóbulos de grasa más finos, haciendo la emulsión más estable y sin ningún efecto sobre las propiedades propiedades organolépticas, ya que podría prevenir el desarrollo de rancidez debido a que también posee  propiedades antioxidantes. antioxidantes. En la producción de jarabes, que contienen oligosacáridos como maltosa y glucosa, donde la composición precisa de los productos finales puede ser controlados en los procesos fermentativos. La mayoría de los productos agroindustriales está integrada por la mezcla de la acción de enzimas diferentes.

d.- Describa las características morfológicas de la bacteria

B. subtilis,

así también, la

importancia del uso que tiene este microorganismo en las diferentes industrias. Mencione varios ejemplos. CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS: Las células de las  Bacillus subtilis subtilis tienen forma de barra con bordes redondeados, las cuales miden aproximadamente 1 micra de ancho por 2-3 micras de largo. Estas se encuentran individualmente formando cadenas. Con algunos cultivos forman colonias que tienen aspecto rugoso, liso o mucoide El tamaño promedio de las colonias es de 2-4 mm de diámetro Su pared celular es gruesa y contiene peptidoglucan peptidoglucano(mureína). o(mureína). Posee un cromosoma circular con 4100 genes aproximadamente los cuales codifican a ciertas  proteínas. Se movilizan con la ayuda de los flagelos que poseen. IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA La bacteria  Bacillus subtilis es importante en varios sectores industriales, esto debido a lo  beneficiosa que ha resultado, aun aunque que sus propiedades no han ssido ido determinadas determinadas por completo completo  por lo que siguen siguen en estudio. Algunas de las industrias en la que hay presencia de esta bacteria son: En la agricultura es utilizado como un mecanismo de control de plagas en los cultivos, esto debido a la propiedad antifúngica (ocasiona la lisis de las células de los hongos) que posee. 12

 

En la industria de artículos de limpieza esta bacteria es utilizada en la elaboración de detergente, ya que esta produce una enzima llamada proteasa (degrada sustancias proteicas), la cual es usada como aditivo en la elaboración causa por la que elimina manchas. En la industria farmacéutica es utilizada para producir sustancias antibióticas que degraden  bacterias patógenas, patógenas, así como la bacitricina la cu cual al es utilizado como ungüento. En la gastronomía es utilizado para llevar l levar a cabo el proceso de fermentación.

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