Esterilizacion de Biorreactores
October 20, 2020 | Author: Anonymous | Category: N/A
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4. Métodos de esterilización
4.1. Introducción
En las fermentaciones industriales se requiere de un alto grado de limpieza y asepsia No existe un método cuantitativo seguro y confiable para medir el número o la concentración de contaminantes en el sistema
Posibles elementos de contaminación en un proceso fermentativo:
El medio El inóculo y el proceso de inoculación El suministro de aire La adición de nutrientes, antiespumantes, etc. durante el proceso El fermentador en sí
4.2. Esterilización de medios de cultivo A. Eliminación física a) b) c) d) e) f)
Filtración Centrifugación Flotación Atracción electrostática Intercambio iónico Adsorción por carbón de virus
4.2. Esterilización de medios de cultivo B. Destrucción a) b) c) d) e)
Calor húmedo Calor seco Radiación electromagnética Radiación sónica Agentes químicos
4.2. Esterilización de medios de cultivo
La técnica de mayor aplicación a nivel industrial es el tratamiento térmico que se puede llevar a cabo en procesos intermitentes y
continuos
El vapor es el recurso utilizado universalmente para la esterilización del medio de fermentación
Cinética de esterilización
La destrucción de microorganismos por vapor (calor húmedo) puede ser descrita como una reacción química de primer orden:
Donde: N q K
- dN = KN dq
(1)
No. de m.o. viables presentes Tiempo del tratamiento de esterilización Constante de reacción
Constantes de velocidad de reacción (K) y tiempos de reducción decimal de diferentes esporas bacterianas suspendidas en buffer a 121°C Especie
Ka 121°C (min-1)
Da 121°C (min)
3.8-2.6
0.6-0.9
Bacillus stearothermophilus FS 1518
0.77
3.0
Bacillus stearothermophilus FS617
2.9
0.8
Clostridium sporogenes PA 3679
1.8
1.3
Bacillus subtilis FS 5230
Cinética de esterilización
Integrando la ecuación (1):
Donde: Nq N0
Nq = e-Kq N0
(2)
No. de m.o. viables al tiempo q No. de m.o. Viables presentes al inicio del tratamiento de esterilización
Cinética de esterilización
Otra forma de expresar la ecuación (2):
Donde: Nq N0
ln Nq = -Kq N0
(3)
No. de m.o. viables al tiempo q No. de m.o. viables presentes al inicio del tratamiento de esterilización
Representación gráfica de la ecuación (2)
Nq/N0
q
Representación gráfica de la ecuación (3)
ln (Nq/N0)
q
Cinética de esterilización
La esterilización total nunca puede alcanzarse Valores de Nq < 1 se deben considerar en términos de la probabilidad de que un microorganismo sobreviva al tratamiento Las gráficas representadas anteriormente sólo se observan cuando se lleva a cabo la esterilización de un cultivo puro bajo condiciones ideales de esterilización
Cinética de esterilización
El valor de K no sólo depende de las especies, sino también depende de la forma fisiológica de la célula Ejemplo: las endoesporas del género Bacillus son más resistentes que las células vegetativas Richards generó una serie de gráficas ilustrando las desviaciones que en la práctica se presentan de la teoría
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas a)
ln (Nq/N0)
q
La activación de esporas es significativamente mayor que su destrucción durante los primeros estados del proceso
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas b)
ln (Nq/N0)
q
La activación de esporas es balanceada por su muerte durante los primeros estados del proceso
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas c)
ln (Nq/N0)
q
La activación de esporas es menor que su muerte durante los primeros estados del proceso
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezclados d)
ln (Nq)
Mezcla constituida principalmente por el microorganismo menos resistente térmicamente Microorganismo sensitivo Microorganismo resistente
q
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezclados e)
ln (Nq)
Mezcla constituida principalmente por el microorganismo más resistente térmicamente Microorganismo sensitivo Microorganismo resistente
q
Relación entre la temperatura y la constante de reacción: tipo Arrhenius d ln K = Ea dT RT2 Donde: Ea R T
Energía de activación Constante de los gases Temperatura absoluta
(4)
Relación entre la temperatura y la constante de reacción: tipo Arrhenius
Integrando la ecuación (4): ln K = ln A - Ea RT
(5)
Ecuación para la esterilización térmica de un cultivo puro:
Combinando las ecuaciones (3) y (5): ln N0 = A q e-E/RT Nq
(6)
Factor DEL o Factor NABLA (V) ˉ
Definido por Deinoerfer y Humprey (1959) como un criterio de diseño para la esterilización:
De donde:
V ˉ = ln N0 Nq
(7)
ˉ = A q e-EA/RT V
(8)
ˉ Factor DEL o Factor NABLA (V)
Rearreglando la ecuación (8): ln q =
E + ln ˉ V RT A
(9)
Este factor es una medida de la reducción fraccional de organismos viables producido por un cierto régimen de tiempo y temperatura
Efecto del tiempo de esterilización y de la temperatura sobre el factor DEL alcanzado en el proceso ln q
69
23
Factores DEL
4.6 2.3
1/T
Diseño de proceso de esterilización ˉ de medios de fermentación
El mismo grado de esterilización se puede obtener a partir de un gran número de combinaciones de tiempo y temperatura De acuerdo a Deindoerfer y Humprey (1959), Richards (1968) y Banks (1979) un factor de riesgo de que un batch de mil esté contaminado se utiliza frecuentemente en la industria de las fermentaciones
Diseño de proceso de esterilización ˉ de medios de fermentación
Se supone presentes
que los únicos contaminantes son esporas de Bacillus stearothermophilus, que es de los microorganismos más termorresistentes, cuyas características son: Ea = 67.7 Kcal/mol A= 1 x 10 36.2 seg-1 Una serie de reacciones deteriorativas pueden presentarse en el medio durante su esterilización, resultando en una pérdida de la calidad nutritiva
% de la máxima productividad
Efecto deteriorativo del incremento del tiempo de tratamiento sobre la productividad del proceso de fermentación
Duración de la esterilización (min)
Pérdida de calidad nutritiva del medio durante la esterilización
Dos tipos de reacciones básicas contribuyen a la pérdida de calidad nutritiva durante la esterilización: i. Interacciones entre nutrientes constituyentes del medio, Ejem: reacción de Maillard ii. Degradación de componentes termolábiles como vitaminas y aminoácidos Para evitar reacciones deteriorativas se recomiendan sistemas de esterilización continuos de alta temperatura y corto tiempo (HTST)
4.2.1. Esterilización intermitente
Existen diferentes tipos de equipo utilizado para la esterilización del medio de cultivo, dependiendo del método empleado para el calentamiento
1. Inyección de vapor
VVVV
VVVV
2. Calentamiento eléctrico
3. Calentamiento con vapor Fuente isotérmica de calor
4. Enfriamiento con refrigerante Refrigerante no isotérmico
Perfiles de temperatura en esterilización batch Tipo
1
Ecuación de perfil
at 1 + gt Hiperbólico
T = T0 1 +
a, b, g
a = hs g = S/M MCpT0
2
T = T0 (1 + at) Lineal
a=
3
T = TH (1 + be-at) Exponencial
a = UA b = T0 – TH MCp TH
4
T = TCo (1 + be-at) Exponencial
a = WCp’ 1 – exp -UA MCp WCp’ b = (T0 –TCo)/TCo
q MCpT0
Terminología A Cp Cp’ h M q S T0 TH TCo U
área de transferencia de calor (m2) calor específico del medio (Kcal/Kg °C) calor específico del refrigerante (Kcal/Kg °C) contenido entálpico del vapor (Kcal/Kg) masa inicial del medio velocidad de transferencia de calor (Kcal/seg) flujo másico de vapor (Kg/seg, Kg/min, Kg/hr) temperatura inicial del medio (°K) temperatura de la fuente de calor (°K) temperatura inicial del refrigerante (°K) coeficiente global de transferencia (Kcal/m2 hr °C)
Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch
D
D
=
0
calent
∫
Kdt = a’ e-E/RT dt 0
+
reten +
D
D
total
∫
t
D
total = ln N0 = N
t
enfr
D
Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch
D
∫
calent = ln N0 = N1
0
D
reten = ln N1 = N2
∫
= ln N2 = N
∫
D D
enfr
t1
∫
t2
Kdt = a’ e-Ea/RT dt
t3
0
Kdt = a’ e-Ea/RT dt 0
t2
0
∫
t1
0
∫
t3
Kdt = a’ e-Ea/RT dt 0
Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch D
Donde:
N N0
N1 N2
t = t 1 + t2 + t 3
nivel de esterilidad (No. de m.o. después de la esterilización) nivel de contaminación (No. de m.o. antes de la esterilización) No. de m.o. contaminantes después del período de calentamiento, t1 No. de m.o. contaminantes después del período de retención, t2
4.2.2. Esterilización continua
Menos utilizados en la industria que los intermitentes Equipo más utilizado para la esterilización continua del medio de fermentación:
Esterilizador tipo inyección Intercambiador de placas
Esterilización continua por inyección
Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaña.
Perfil de temperatura – tiempo en esterilizadores continuos por inyección de vapor
Esterilización continua con intercambiadores de calor
Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaña.
Perfil de temperatura – tiempo en esterilizadores continuos de intercambiador de platos
Ventajas de la esterilización CONTINUA sobre la BATCH
Mantenimiento superior de la calidad del medio Fácil escalamiento Fácil control automático Reducción del tiempo de esterilización Reducción de corrosión en el fermentador
Ventajas de la esterilización BATCH sobre la CONTINUA
Control manual simple Fácil de aplicarse a un medio que contenga una alta proporción de material sólido
4.3. Esterilización del aire
En los procesos de fermentación se necesita aire estéril, por lo que es común el uso de un sistema de filtración y uno de esterilización El tamaño de los microorganismos varía desde unas milimicras hasta cientos de micras Los microorganismos más pequeños suelen ser absorbidos en el polvo del aire, lo que facilita su eliminación durante la filtración
4.3. Esterilización del aire
Durante el proceso de esterilización del aire se eliminan las partículas de tamaño entre 0.5 y 1.0 micra Para poder diseñar un sistema de esterilización es necesario conocer el tamaño de las partículas y el número de microorganismos presentes en el aire, así como la cantidad de otras partículas. En Inglaterra se han reportado valores promedio de 3 a 9 x 103 partículas/m3 y en Japón 12 x 103 El proceso de esterilización del aire más utilizado es el de FILTRACIÓN
Requisitos de un sistema de filtración 1. El sistema debe ser de diseño sencillo 2. Su operación debe ser barata 3. Debe ser estable y resistente a varias esterilizaciones con vapor 4. Debe acondicionar el aire, ajustando temperatura y humedad
Tipos de filtros
Tipos de filtros
Escala pequeña:
Filtros millipore, de asbesto o porcelana Filtros fibrosos de lana de vidrio o materiales similares
Escala mayor:
Filtros granulados, partículas de carbón Filtros fibrosos
4.3.1. Análisis fundamental
El comportamiento de un filtro para aire se define de la siguiente manera:
h- = N – N0 x 100 (%)
(10)
N0
Siendo h la eficiencia total de retención del filtro
Mecanismos de retención de partículas finas por filtros de aire a) Impacto b) Intercepción
c) Difusión d) Sedimentación e) Atracción electromagnética
Líneas de corriente de aire producidas por el flujo alrededor de una fibra cilíndrica
b
q
Df
Impacto inercial (h1)
La retención por este método se expresa como: h1 = b/Df (11)
b = Df + 2Dp Donde: b Df Dp
ancho específico de la corriente (m, cm) diámetro de la fibra (m, cm) diámetro de la partícula (m, cm)
(12)
Impacto inercial (h1) Masa de partícula muy pequeña o Velocidad de aire muy baja
Fuerza inercial insuficiente para que la partícula choque con la fibra
Velocidad crítica, Vc, en la que los efectos inerciales se vuelven mínimos
Velocidad Crítica (Vc)
Donde: Vc ma rp C
Vc = 1.125 ma Df C r p D p2
(13)
velocidad superficial crítica del aire viscosidad del aire densidad de la partícula factor de correlación basado en la Ley de Stokes
Velocidad Crítica (Vc)
Para bacterias de 1 micra de diámetro: Vc = 0.066 Df Vc en ft/seg Df en micras
(14)
Intercepción (h2)
Para partículas esféricas: h2 = 1 [(1+Re)ln(1+Re)2 – (1+Re) + 1/(Re+1)] 2(2-lnRe) (15)
Donde:
Re = Df v r m v
velocidad del aire
(16)
Difusión (h3)
-
La difusividad de las partículas finas, D, puede expresarse como una función de Dp y considerando como Do el diámetro efectivo de desplazamiento de la partícula por difusión se tiene: h3 =
1 [2(K)lnK – K + 1/K] 2(2-lnRe)
(17)
Difusión (h3)
Donde:
K = 1 + 2 Do/Df
-
Do/Df = 2.24 (2 – lnRe) D VDf
(18) 1/3
-
K T
D= CKT 3pmDp
constante de Boltzman (1.38x10-16 erg/°K) temperatura absoluta
(19)
(20)
- y Relación entre la eficiencia total (h) las eficiencias de una sola fibra (h0)
h0 = h1 + h2 + h3
Para un filtro real, la eficiencia se define:
ha = p (1 – a) Df ln 1 4aL 1 - hh0 -
h
(21)
(22)
Eficiencia de colección de una sola fibra cuya fracción volumétrica es a Eficiencia total de recolección de un filtro
- y Relación entre la eficiencia total (h) las eficiencias de una sola fibra (h0)
Experimentalmente se ha encontrado: ha = (1 – 4.5 a) h0
Para:
0 < a < 0.1
(23)
4.3.2. Diseño de filtros
La penetración de microorganismos en un filtro es de naturaleza logarítmica: dN = – K’ N dL
(24)
ln N = -K’ L N0
(25)
4.3.2. Diseño de filtros
Donde: N0 N
L K’
Número de microorganismos que entran al filtro Número de microorganismos que salen del filtro Longitud del filtro Constante de filtración
4.3.2. Diseño de filtros K’ es función de: La velocidad del aire Densidad del filtro Tamaño de las fibras Tamaño y densidad del microorganismo eliminado K’ se puede expresar en términos de la profundidad del filtro, como la longitud para eliminar el 90% de N0, L90.
4.3.2. Diseño de filtros ln N0 = 2.3 (L) N L90 ln N0 = 1.23 h0 (1 + 4.5a) L N (1 – a) Df
Criterio de diseño: N = 10-3
(26)
(27)
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