Estabilidad de Un Pool de Plasma Congelado

 

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANÁLISIS CÁTEDRA DE PASANTÍAS Y TRABAJO ESPECIAL DE INVESTIGACIÓN

ESTABILIDAD DE LOS FACTORES DE COAGULACIÓN MEDIDOS A TRAVÉS DEL TIEMPO DE PROTROMBINA (PT) EN POOL DE PLASMA CONGELADO A -36ºC

Tutor(a):

Autores:

Lcda. Yadira Rosales

Andris A. Vialva Guerrero

Coordinador de Pasantías Rurales: 

Mariem Sahi Rodríguez

Lcdo. Johann Palacios

Caracas, mayo de 2019

 

ÍNDICE INTRODUCCIÓN……………………………………………………………… ...…03 OBJETIVOS DEL ESTUDIO……………………………………………………….06  Objetivo general…………………………………………………… ...………06 Objetivos específicos……………………………………………………...…06 MARCO TEÓRICO O REFERENCIAL……………………………………………07  A.  Hemostasia………………………………………………………………...…07 B.  Factores de coagulación……………………………………………………...07  C.  Cascada de coagulación (in vitro)……………………………………………11 vitro)……………………………………………11  D.  Cascada de la coagulación in vivo (teoría celular)…………………………..14  E.  Determinación de laboratorio………………………………………………..19  F.  Control de calidad en coagulación…………………………………………...20  MARCO METODOLÓGICO……………………………………………………….22  RESULTADOS……………………………………………………………………...25  CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……………………………………..28  REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………29  ANEXO…………………………………………………… ANEXO………………………… …………………………………………………...32 ………………………...32 

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INTRODUCCIÓN En la práctica diaria en los diversos servicios de Bioanálisis es de vital importancia evaluar las condiciones bajo las que se trabaja, la calidad del servicio que ofrece, la relación coste/efectividad en los procedimientos, tanto en la fase la preanalítica, analítica y post-analítica. Uno de los objetivos principales en el laboratorio clínico es garantizar la validez del resultado analítico para una correcta interpretación clínica que contribuya con el diagnóstico preciso de la condición fisiológica, sea  patológica o no, del usurario (1,2). Para validar los resultados obtenidos, cada laboratorio debe tener un sistema de gestión de calidad establecido previamente. En la ejecución de los procedimientos, en condiciones ideales, se utilizan una serie de soluciones controles de origen comercial, que son materiales estables y homogéneos con concentraciones y actividades propias y similares a las distintas magnitudes y componentes de la muestra sometida a análisis, preparadas a base de muestras humanas, libres de interferentes (hemólisis, ictericia, li lipemia pemia y turbidez) , sin “riesgos  biológicos” y algunas veces con constituyentes artificiales (3); con la finalidad de

asegurar que la metodología empleada para la determinación esté funcionando  perfectamente, lo cu cual al se evalúa co comparando mparando los rresultados esultados obtenidos para el control con trol con valores de referencia asignados previamente por la casa comercial que diseño el mismo. Ahora bien, en Venezuela de forma gradual, ha habido un declive económico que ha afectado en distintos niveles, quedando vulnerable especialmente el sistema de salud, el cual incluye al laboratorio clínico; imposibilitando la adquisición de los 3

 

reactivos necesarios en forma continua y oportuna para el seguimiento y control de llaa calidad. En búsqueda de alternativas que permitan dar respuesta a la situación crítica existente, se ha recurrido a diseñar estrategias metodológicas confiables que puedan implementarse y mantenerse en el tiempo en las diferentes áreas que comprenden el laboratorio clínico. Si bien todas estas requieren un control de calidad funcional, el área establecida para llevar a cabo las pruebas de evaluación del sistema hemostático requiere especial atención porque las alteraciones trombóticas y/o hermorrágicas requieren acciones terapéuticas oportunas ya que representan las principales causas de muerte (3). Existen diversas opciones para el control de calidad en coagulación, la más utilizada consiste en la preparación de un pool de plasma fresco pobre en  plaquetas a partir de uunn mínimo de cuatro muestras de d e personas aparentemente sanas; el cual no cumple con los requerimientos o expectativas para un control de calidad, y como son preparados diariamente no existe una referencia con la cual compararlos. De allí parte la necesidad de crear un pool de plasma congelado que pueda ser estable, entendiéndose como estabilidad de una magnitud bioquímica el período en el que dicha magnitud mantiene su valor dentro de unos límites establecidos, conservando la muestra en la que se realiza la medición en unas condiciones específicas (1). Teniendo esto como finalidad poder emplearlo como sustitutivo de un control comercial para disminuir los costos, aumentar el beneficio y contribuir con el mejoramiento de la calidad. De acuerdo con un estudio multicéntrico realizado en 12 hospitales andaluces sobre la estabilidad de 24 magnitudes del suero; se analizaron muestras de suero de 5 4

 

 pacientes de cada hospital, las cuales fueron sometidas a 4 temperaturas (-20 C, +4 1C, +20 1C y +37 1C) en los siguientes medios: congelador, nevera, ambiente y estufa, durante períodos fijos entre 1 y 7 días, registrándose las temperaturas en cada medio. Los resultados obtenidos fueron que: la magnitud más estable es el ión cloruro y la magnitud menos estable es alanina aminotransferasa para las distintas temperaturas. Los autores recomiendan que cada laboratorio establezca un protocolo  para el estudio de la estabilidad de las magnitudes a analizar, especialmente para aquellas que son delicadas y que pueden degradarse rápidamente (4) Teniendo en cuenta lo antes expuesto el presente trabajo de investigación se enmarca en determinar el tiempo de estabilidad de los factores de coagulación medidos a través del tiempo de protrombina (PT) en un pool de plasma fresco congelado una temperatura de -36⁰C, para que pueda ser usado como alternativa para el control de calidad en el laboratorio del Instituto Oncológico “Dr. Luis Razetti”,

ubicado en la parroquia San José de Cotiza.

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OBJETIVOS DEL ESTUDIO Objetivo general Determinar el tiempo de estabilidad de los factores de coagulación medidos a través del tiempo de protrombina (PT) en un pool de plasma fresco congelado una temperatura de -36⁰C, para que pueda ser usado como alternativa para el control de calidad en el laboratorio del Instituto Oncológico “Dr. Luis Razetti”. 

Objetivos específicos 1)  Precisar el tiempo de protrombina (PT) en pool de plasma fresco.   2)  Precisar el tiempo de protrombina (PT) en pool de plasma congelado a -36ºC diariamente por un período de 8 días.   3)  Establecer estadísticamente la estabilidad en el tiempo de los factores de coagulación medidos mediante la prueba de PT.  

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MARCO TEÓRICO O REFERENCIAL A.  HEMOSTASIA El Dr. Oscar Iván Flores-Rivera define la hemostasia y describe sus componentes como(5): “El proceso que mantiene la integridad de un sistema circulatorio cerrado

y de alta presión después de un daño vascular. La hemostasia para su estudio se divide en primaria y secundaria. La hemostasia primaria se refiere a los procesos mediante los cuales se lleva a cabo el tapón  plaquetario a través de la adhesión, activación, secreción y agregación  plaquetaria. La hemostasia secundaria involucra la activación del sistema enzimático de coagulación, cuyo principal objetivo es la formación de trombina y fibrina para la estabilización del coágulo. Finalmente se encuentra el proceso de fibrinólisis, el cual se encarga de remover los restos del coágulo una vez reparado el daño tisular. Estos sistemas en condiciones fisiológicas mantienen un equilibrio perfecto, que al perderse da lugar a estados patológicos como sangrado o trombosis ”.  La coagulación de la sangre es un proceso dinámico y complejo en el que  participan numerosas proteínas plasmáticas conocidas como factores y cofactores c ofactores de la coagulación (6)

B.  CARACTERÍSTICAS DE LOS FACTORES DE COAGULACIÓN Los factores de coagulación son, en su mayoría, proteínas con función enzimática que circulan en el plasma en su forma inactiva, como zimógenos (o 7

 

 proenzimas), que son activadas por clivaje de residuos de serina, quedando al descubierto el sitio activo, y se convierten a su vez en enzimas tipo serinproteasas, estado que se designa por el sufijo  – a. Esta, sucesivamente, va a clivar residuos de serina de otra proenzima y a activar otro factor de la coagulación, en una cadena  progresiva de activaciones (7, 8).

Tabla 1. Características de los factores de coagulación

 Adaptado de: Martinuzzo, M (Laboratorio Central del Hospital Italiano de Buenos  Aires IU del HIUF. Sistema de coagulación. 2017;(1):31 – 42 42

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Para facilitar el entendimiento del sistema de la coagulación, clasificaremos a los factores de acuerdo con sus propiedades generales. F act actor ore es zi zim mógenos d de epe pendi ndiente entess de la vita vi tam mi na K K::   Algunos de los factores

de la coagulación requieren de vitamina K para su síntesis completa. Estas proteínas incluyen a los factores II, VII, IX y X, así como a las dos proteínas reguladoras  proteína C y proteína S. Todas tienen estru estructuras cturas similares en sus su s regiones region es con cierta homología y contienen de 10 a 12 residuos Glu, los cuales son carboxilados a ácidocarboxiglutámico y, en presencia de vitamina K, son importantes para la unión del Ca y necesarios para la interacción de estas proteínas vitamina K dependientes con membranas plaquetarias (fosfolípidos plaquetarios).  En ausencia de vitamina K o en el caso de tratamiento con anticoagulante con antagonistas de la vitamina K, los factores II, VII, IX y X son sintetizados pero están incompletos, carecen de la unión de calcio al ácido -carboxiglutámico y en el plasma se encuentran como factores no funcionales, incapaces de unirse adecuadamente a los iones Ca; estos factores son conocidos como PIVKA (por sus siglas en inglés):  proteínas inducidas por ausencia o antagonismo anta gonismo de la vitamina K (9). F act actor ore es zi zim mógenos no d de epe pendi ndiente entess de vvii ta tam mi na kk::   representados por los

factores XI, XII, PK y QAPM. Inicialmente se relacionaron con la activación del FXII o Factor Hageman, por contacto con superficies cargadas negativamente, como el colágeno subendotelial que se expone ante una lesión vascular. La deficiencia de alguno de estos componentes se manifiesta por un alargamiento del tiempo de tromboplastina parcial activado (PTTa), sin embargo, su deficiencia in vivo se ha 9

 

asociado con riesgo de trombosis, lo cual se explica por la participación de estos factores en la fibrinólisis, al activar al plasminógeno, bien sea de manera directa por acción del FXIIa o indirecta por activación de la prouroquinasa mediada por la calicreína (10)  Cofactores:   Se dividen en dos grupos:  Procofactores plasmáticos: Se

incluyen los factores V y  VIII y el CAPM. Los dos primeros tienen propiedades  bioquímicas y estructurales estructur ales similares,son sintetizados como una sola cadena con peso p eso molecular (PM) aproximadamente de 280,000,  tienen tres homologías; tres dominios A, un gran  dominio B y un par homólogo de dominio C. El FV circula en plasma como una proteína monomérica,  y el FVIII circula con el factor de von   Willebrand (FvW) y al activarse se disocian por   proteólisis de uniones peptídicas. Ambos son sintetizados  como procofactores y, al ser activados por la trombina, se convierten a cofactores formando parte de los complejos X-asa (FVIII) y II-asa (FV) sobre la superficie plaquetaria; otra posibilidad de activación del FV es por parte del FXa. Veinticinco por ciento del FV se encuentra en los α -gránulos de la plaqueta unido en complejo a una proteína multimérica, llamada multimerina, y es liberado en forma de  procofactor. El otro grupo lo constituyen los  Procofactores celulares: Factor tisular (FT) y trombomodulina(TM). El FT es una proteína específica presente sobre la membrana plasmática de células como los monocitos y células endoteliales y rico en carbohidratos; es el único factor de la coagulación que no se encuentra normalmente en la circulación o en contacto con éste. A diferencia de los otros cofactores, factor V y factor VIII, el factor tisular no requiere ningún proceso para su actividad y sólo se 10

 

necesita el contacto con el FVII. Uno de los hallazgos más importantes del factor tisular es que unido al FVII inician la coagulación coagulación plasmática; también se ha observado que la iniciación sola depende de la ruptura de la barrera física que normalmente separa al FVII del FT y, por lo tanto, para que la hemostasia ocurra, el daño por sí mismo puede ser suficiente para iniciar la coagulación. Se ha informado que los factores VII y VIIa se unen al FT con la misma constante de disociación, por lo que el FVII se distingue de otros zimógenos. La trombomodulina se expresa sobre células del endotelio vascular; de los cofactores es el único que participa como anticoagulante, activando a la proteína C (PC) (9).  

C.  CASCADA DE LA COAGULACIÓN (IN VITRO) El concepto de la cascada de coagulación fue propuesto por primera vez en el año 1964 por dos grupos separados de investigadores (11), al descubrirse que los factores participantes en la coagulación se activan unos a otros, en una secuencia lineal de eventos. Como se explicó en el apartado anterior, cada factor de coagulación se convertía de proenzima a enzimas activas, lo que proporciona la característica autocatalítica del proceso de manera restringida o limitada. Los modelos originales fueron modificados al pasar el tiempo al descubrirse que algunos factores son realmente cofactores que no poseen actividad enzimática. La cascada de coagulación esta descrita por dos vías diferentes: la vía intrínseca y la vía extrínseca. Ambas vías desembocan en la vía común por tener la capacidad de activar al factor X, que junto con el factor Va convierten a la protrombina en trombina (12) (Gráfico 1).

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Gráfico 1. Cascada de coagulación

 Fuente: Martínez-murillo C. Mecanismos de d e activación de la coagulación. Rev Med  Inst Mex Seguro Soc 2006; 44 (Supl 2): 51-58.

Vía intrínseca de la casada de la coagulación:  Llamada así por la aceptación

de que su inicio estaba relacionado con un factor activador presente en el plasma, ahora se correlaciona con la plaqueta activada. La vía intrínseca inicia la coagulación, con el daño vascular y la interacción de superficies cargadas negativamente con tres  proteínas plasmáticas: FXII, FXI I, PK y Ciinógeno de alto pero molecular (CA (CAMP) MP) (13). El FXII es activado por el CAMP, FXIIa actúa sobre el factor FXI y lo activa. El FXIa actúa sobre el FIX y lo activa, ese FIXa es vitamina K dependiente, para su correcto funcionamiento requiere del cofactor VIIIa, entonces FIXa se une a FVIIIa, y en  presencia de calcio se une al factor plaquetario 3 (FP3) formando un complejo

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enzimático (tenasa intrínseca) que va a actuar sobre el factor X para activar a la vía común (12, 13). Vía extrínseca de la cascada de la coagulación:   es llamada así porque

inicialmente se presumía que se activaba por un factor externo al plasma. Hoy día su inicio se relaciona con el FT, básicamente consiste de dos factores: el FVIIa y el FT (13). El FT se une al FVIIa en presencia de calcio y FP3 para formar un complejo enzimático (tenasa extrínseca) que actúa sobre el FX para iniciar la vía común. V í a co com mún de la casca cascada da de coa coaggulaci ulación: ón: ambas tenasas, intrínseca y

extrínseca, activan el FX para que se una a su cofactor FVa, en presencia de calcio y de FP3, lo que resulta en la formación de otro complejo enzimático, denominado  protrombinasa, que actúa sobre la protrombina para convertirla en trombina o FIIa. La trombina es la enzima clave en la formación del coagulo de fibrina insoluble. La fibrina se forma cuando la trombina actúa sobre el fibrinógeno, hicrolizando los fibrinopéptidos A y B del fribrinógeno, lo que conlleva a la formación de un monómero de fibrina. Este monómero de fibrina queda cargado electropositivamente en su parte central con respcto a los laterales haciendo que, por atracción de cargas, se formen dímeros de fibrina y luego, a su vez, polímeros de fibrina que son solubres, cuyas fuerzas de unión son débiles, establecidas por puentes de hidrógeno. Tras la formación del coágulo de fibrina soluble, el FXIIIa por la trombina cataliza la formación de enlaces covalentes de las fibras de fibrina, estabilizando las uniones intermonoméricas y evitando la lisis de la coagulación (14-16).

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D.  CASCADA DE COAGULACIÓN IN VIVO (TEORÍA CELULAR) Los sistemas intrínseco y extrínseco de la coagulación no pueden funcionar de manera independiente uno del otro, ya que todos los factores de coagulación se interrelacionan entre sí, por lo que no debería hablarse de cascada de coagulación, sino más bien de una serie de cambios bioquímicos y enzimáticos para la formación de trombina y subsecuentemente la formación de un coágulo de fibrina. Al pasar los años han surgido nuevos conceptos que se integraron al modelo de la cascada de la coagulación en la búsqueda de explicar con más exactitud el modelo real de la coagulación in vivo. El modelo aceptado en nuestros días consta de tres fases: iniciación, amplificación y propagación (17-19) (Gráfico 2).

Gráfico 2. Modelo celular del sistema de coagulación.

 Adaptado de: Hoffman M, Monroe D. A cell-based model of hemostasis. Thromb  Haemost. 2001; 85: 958-65

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F as ase e de i nici ni cia aci ón: El factor tisular (FT), antes llamado tromboplastina tisular

o factor III, es una glicoproteína transmembranal de 47KDa, normalmente ausente de la circulación y el endotelio sano, pero abundante en células perivasculares como fibroblastos, monocitos y el endotelio lesionado. Funciona como receptor de procesos de inflamación y apoptosis, pero también se considera el iniciador de la coagulación al ser expuesto al plasma por una lesión vascular (20) y viene a desempeñarse como cofactor de la acción del factor VIIa. De todos, el factor VII es el que tiene la vida media más corta y el único que en un porcentaje circula activo en el plasma (solo el 1 % como factor VIIa). De forma permanente patrulla la circulación en búsqueda de  pared vascular dañada, con factor tisular expuesto, que se une a este por medio de residuos de carboxi-glutamato, para provocar la activación del factor X, aunque también activa el IX y más factor VII circulante. En un complejo molecular adherido a la célula parietal, la iniciación produce una fugaz activación de la secuencia extrínseca y la común, que genera pequeñas cantidades de trombina (0,1-1 nM). El factor IX y la trombina generadas tienen la capacidad de difundir en el plasma y alcanzar la superficie plaquetaria para desencadenar la amplificación, como se describirá más adelante. Por otro lado, el factor VIII, que es una proteína inestable, circula en el plasma transportada por el vWF. La trombina cliva esta unión y deja libre el factor VIII, para adherirse a la membrana plaquetaria y actuar como cofactor del IX en la amplificación. También deja libre el vWF, que contribuye a la agregación plaquetaria al mediar la unión entre el receptor glicoprotéico GPIb de la membrana plaquetaria y la matriz de colágeno expuesta (5). 15

 

F ase de am amp plifi li fi ca caci  ci ón: Cuando las pequeñas cantidades de trombina

formadas en la iniciación superan cierto umbral, desencadenan la activación  plaquetaria, a través de proteínas específicas de membrana, llamadas receptores activados por proteasa (PAR1 y PAR4). Dicha activación sucede principalmente en la  población de plaquetas que ya se encuentran adheridas a la matriz de colágeno expuesta, ya sea directamente a través del receptor glicoproteico GPIa o a través del complejo vWF-GPIb, antes mencionado. Al ser activadas por estas dos vías, se les llama plaquetas activadas por colágeno y trombina (plaquetas COAT). La activación  plaquetaria genera un cambio rotacional en algunos lípidos de membrana, que al exterior expresan residuos de fosfatidilserina que, normalmente, se encuentran en el interior. Este cambio genera una superficie cargada negativamente que, por medio del calcio, adhiere y activa los factores de coagulación de la secuencia intrínseca y común, lo que facilita su cadena de reacciones y las estimula en cada uno de sus  pasos, a manera de múltiples asas de retroalimentación positiva; de modo que cada factor puede ser activado por su antecesor en la cadena de activación, pero también de manera alterna, por la superficie de la plaqueta activada. El principal de esos ciclos de retroalimentación positiva es activado por el factor IX y la trombina, liberados a la circulación durante la fase previa de iniciación. La trombina activa la superficie  plaquetaria, que adhiere y activa el factor IX y su cofactor, el VIII, previamente separado de su trasportador, el vWF, también por efecto de la trombina (21). Los anteriores, en conjunto, activan el factor X, y este último, ayudado de su cofactor, el factor V, que es liberado de los gránulos alfa de la plaqueta activada, genera más 16

 

trombina, que a su vez reiniciará el proceso anterior, activando más factor IX en la superficie plaquetaria. Este ciclo se repite de manera autosostenida, ya sin requerir nuevas secuencias de iniciación y genera nuevas moléculas de trombina en cada ciclo, hasta producirla en grandes cantidades. Dicha asa central de retroalimentación  positiva es esencial en la amplificación y alteraciones en los factores que participan en ella pues siempre generan manifestaciones clínicas importantes. La superficie  plaquetaria activada también adhiere y estimula los pasos iniciales de la secuencia intrínseca, que involucra la PK, el HMWZ, el factor XII y el XI. El valor de esas asas de retroalimentación adicionales es incierto, y sus alteraciones, aunque alteran el aPTT, dejan íntegra la mencionada asa central y generalmente cursan asintomáticas. Los factores de coagulación como actúan en una secuencia lineal de activaciones, en realidad, estos se agrupan en complejos moleculares sobre la superficie plaquetaria, lo que facilita su interacción y aumenta la velocidad de las reacciones. Uno de estos complejos moleculares es llamado tenaza intrínseca, que agrupa al IXa y su cofactor, el VIIIa, para activar el X (juego de palabras derivado de ten: diez y asa: enzima) y el otro llamado el complejo protrombínico, que agrupa al Xa y su co- factor, el Va, para formar trombina. (5) F as ase ed de ep prr opaga agaci ció ón ( fifib br i no nogg éne nesi siss y agr egación pla plaq que ueta tarr i a) :   Las grandes

cantidades de trombina generadas en la amplificación son responsables de la transformación final del fibrinógeno a fibrina. Inicialmente clivan cuatro enlaces arginina-glicina específicos de los extremos aminoterminales de las cadenas Aa y Bb del fibrinógeno, y así se liberan los fibrinopéptidos A y B y se producen cadenas que 17

 

se ensamblan espontáneamente por enlaces no covalentes. El factor XIII, liberado de los gránulos alfa de las plaquetas y activado por trombina, es responsable de convertir estos enlaces a covalentes, añadiendo estabilidad al coágulo de fibrina. Cada plaqueta activada por trombina expresa en su superficie hasta 12.000 copias del receptor glicoprotéico GPIIb/ IIIa, responsable de adherir los polímeros de fibrina a la superficie plaquetaria. La activación plaquetaria induce la síntesis y secreción de sustancias que estimulan la agregación de otras plaquetas circulantes; en este sentido, el tromboxano A2 (TXA2) y el adenosín-difosfato (ADP) actúan de manera sinérgica. El tromboxano A2 es sintetizado en una serie de reacciones que involucran la enzima ciclooxigenasa (COX) y liberado al plasma, donde tiene propiedades vasoconstrictoras; además, a través del receptor plaquetario asociado a la pro- teína G (Gq), estimula la disponibilidad del calcio citoplasmático. El ADP es liberado de los gránulos densos plaquetarios y actúa en el receptor P2Y12, que bloquea la síntesis de adenosín-mono- fosfato cíclico (AMPc) y sintetiza otros mediadores intracelulares que, junto con el calcio, producen un cambio conformacional en el receptor GP IIb/IIIa de las plaquetas circulantes, estimulando la unión de estas a los polímeros de fibrina y la agregación plaquetaria. Algunas sustancias presentes en el plasma  protegen el coágulo formado de su degradación (o ffibrinólisis), ibrinólisis), como los inhibidores de la activación del plasminógeno (PAI), entre los cuales podemos mencionar el inhibidor de la fibrinólisis activado por trombina (TAFI), que remueve de la fibrina los residuos carboxilo-terminal de lisina, cruciales en la posterior degradación (17).

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E.  DETERMINACIÓN EN EL LABORATORIO Actualmente existen técnicas para evaluar la integridad de la mayoría de los factores de coagulación, estas son: el tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTa) y el tiempo de protrombina (PT). Los factores involucrados en la vía intrínseca de la coagulación son evaluados por el PTTa, mientras que el PT evalúa a la vía extrínseca, ambos coinciden en los factores de la vía común  (22). Para su realización ambos requieren sangre anticoagulada con citrato de sodio 0,109M o 3,2%., recolectada en tubos al vacío con presión negativa que calibrados para extraer la cantidad exacta de sangre para mantener la proporción adecuada con el anticoagulante (una parte de anticoagulante por cada nueve de muestra) (3). El PT activa la coagulación cuando se le agrega factor tisular o tromboplastina y calcio; el resultado normal varía de 10 a 14 segundos con >60% de actividad. Dependiendo del tipo de tromboplastina que se agregue el resultado puede variar ampliamente, por lo que se ha desarrollado un método estandarizado para expresar estas variaciones: razón internacional normalizada (INR) (3). En cuanto al PTTa, activado evalúa la vía intrínseca de la coagulación y la vía común; esta última, junto con el tiempo de protrombina. Para esta reacción al plasma citratado se le agregan fosfolípidos, calcio y un iniciador de los factores de contacto como caolín osílica. El resultado normal va de 25 a 45 segundos; sin embargo, es importante conocer los valores de referencia de cada laboratorio (3).

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F.  CONTROL DE CALIDAD EN COAGULACIÓN El laboratorio debe diseñar sistemas de control de calidad internos que verifiquen que los resultados han alcanzado la calidad propuesta (23). Existen dos tipos de control de calidad: internos, responsabilidad de todo el personal, y externos, que comparan varios laboratorios para una misma determinación (Los internos  promueven la detección de errores y las medidas para evitarlos; los externos homogeneizan resultados entre laboratorios (3, 24). Uno de los primordiales  propósitos del control consiste en “…evaluar de forma real la capacidad funcional

habitual de un laboratorio con respecto a otros laboratorios ” (25). En el área de coagulación, el control de calidad interno se realiza mediante el uso de soluciones controles, estos pueden ser de origen comercial (soluciones o materiales primarios) o preparados en el laboratorio. La solución control empleada debe ser:   Similar a la muestra



  Estable por un tiempo prolongado



  Debe tener límite de variabilidad aceptables



  Accesibles para el laboratorio que las emplea



Existen varias alternativas del material control disponible para coagulación: el control comercial, el pool de plasma fresco pobre en plaquetas y el pool de plasma congelado pobre en plaquetas. Cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas que el

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 bioanalista debe evaluar antes de decidir cuál utilizar para establecer el control de calidad interno. 

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MARCO METODOLÓGICO 1.  Tipo de estudio Se diseñó un estudio experimental prospectivo, donde se manipuló las condiciones de temperatura de conservación de un pool de plasma pobre en plaquetas  para observar los efectos de la misma sobre las proteínas constituyentes de la vía extrínseca de la coagulación, estudiadas a través del PT, con la finalidad de conocer la durabilidad de los mismos a través del tiempo.

2.  Población La población estimada para el presente estudio estuvo constituida por los aquellos individuos que acudieron, con fines personales, al banco de sangre del Instituto Oncológico “Dr. Luis Razetti” ubicado en la parroquia San José de Cotiza. 

3.  Muestra Estuvo representada por 6 donantes en edades comprendidas de entre 18 a 45 años de edad, que pasaron el requisito establecido por el banco de sangre de la institución (anexo). Todos los sujetos fueron informados de la finalidad del estudio a través de un consentimiento transmitido de manera oral al momento de tomar la muestra de sangre total.

4.  Materiales y métodos Obtención de la muestra: Cada muestra fue obtenida a partir de punción venosa en el antebrazo utilizando el sistema de tubos al vacío e inyectadora. La muestra fue recolectada en tubos de material no contactable tapa azul con citrato de socio 0,109M (3,2%) y luego fueron centrifugadas a 3500 r.p.m por 15 minutos para 22

 

obtener plasma citratado pobre en plaquetas. En un beaker de plástico, se trasvasó 1,5ml del plasma obtenido de cada paciente, se mezcló vigorosamente por inversión y agitación para obtener un pool de plasma. Por último se realizaron 9 alícuotas 400µl del pool de plasma en recipientes tipo eppendorf de 2ml. Los materiales materiales utilizados finalmente fueron:   Vacutainer o sistema de aguja múltiple



  Camisa de Vacutainer



  Inyectadoras





  Torniquete plano

  Algodón

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  Alcohol y/o yodo

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  Equipo de coagulación (Coatron A4)

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  Pipetas automáticas

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  Beaker de plástico

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  Tubos eppendorf de 2ml

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  Reactivo para tiempo de protrombina: Prosper Diagnostic, lote



STY20201-3, con fecha de vencimiento para el 29/06/2019.

5.  Procesamiento del pool de plasma   Una vez realizo las alícuotas del pool de plasma fresco, se procedió a analizar una de las alícuotas inmediatamente y el valor obtenido en términos de razón se consideró como tiempo cero (T0). El resto de las alícuotas se conservaron congeladas 23

 

a una temperatura de -36ºC ± 1ºC por 8 días en total. Cada 24 horas durante 7 días se determinó el PT a una de las alícuotas de la siguiente manera: se descongelaba rápidamente a 37ºC, luego se dejaba reposar a temperatura ambiente por 30 minutos y finalmente se realizaba la prueba de PT. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. Los resultados obtenidos se almacenaron en una base de datos Microsoft Excel® 2010 para Windows.

6.  Análisis e interpretación de los datos  La estabilidad de los analitos se determinó calculando el promedio de los datos obtenidos por duplicado y comparando la media de los resultados de los 8 días (T1  a T8) con la media de los valores obtenidos el primer día (T 0). En el presente trabajo de investigación, los límites de aceptabilidad para considerar el periodo de estabilidad de los factores de coagulación derivaron del análisis de varianza ANOVA con un nivel de significación menor a 0,05 (p