Espectroscopia de Luminiscencia Molecular

 

INTRODUCCIÓN El presente trabajo vamos a diferenciar los dos tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados: fluorescencia y fosforescencia mol molecular. En todos ellos, las mol moléculas del analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo. Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes luminiscent es moleculares.

 

FUNDAMENTO Para que una sustancia origine or igine emisión foto-luminiscente es necesario que previamente ten tenga ga lugar la absorción de radiación electromagnética, mayormente tienen lugar entre los orbitales π enlazantes y antienlaza antienlazantes ntes (π—>π*)

que son las de mayor interés en los procesos luminiscentes.

 

En la luminiscencia se consideran 3 tipos de métodos ópticos relacionados entre sí:

*FLUORESCENCIA *FOSFORESCENCIA MOLECULAR *QUIMIOLUMINISCENCIA

En todos ellos, las moléculas de analito se excitan para dar una especia cuyo espectro de emisión suministra información para un análisis cuantitativo y cualitativo.

A estos métodos se le conoce colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares.

 

LUMINISCENCI •

Es todo proceso de emisión de luz cuyo origen no radica excl clu usi sivvam amen entte en la lass al alttas tempe emperratur uras as,, es una for orma ma de "l "lu uz fría" ría" en la que la emisión de radiación lumínica es provocada en cond co ndic icio ione ness de tem empe perrat atur uraa am ambi bien entte o ba baja ja..

 

TIPOS DE LUMINISCENCIA •

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Fluorescencia Que caracteriza caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferent diferente. e. Fosforescencia Fenómeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energía y almacenarla, para emitirla en forma de radiación. A los elementos que ofrecen fosfor fosforescencia escencia se les conoce como foto-r foto-reactivos. eactivos. DIFERENCIA: *Fluorescencia: Las transiciones electrónicas responsables no conllevan un cambio en el espín del electrón; presenta una vida corta .

*Fosforescencia: *Fosf orescencia: Hay un cambio en el espín del electrón.

 

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Estados excitados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia fosforescencia Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere una revisión revisión de dell spín del ele electr ctrón ón y de los est estados ados ex excit citados ados singulete singulete / triplete.

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Espín del electrón Establece que en un átomo no puede haber dos electrones con los cuatro

números iguales.tener No debe de haber deopuestos. dos electrones en un orbitalcuánticos y los dos deben los estados demás espín E spines Espines están apareados. • Estados excitados singulete/triplete singulete/triplete Un estado electrónico electr molecular en elsingulete cual todos los espines de los se electrones estánónico apare apareados ados se llama y cuando la molécula expone a un campo magnético no se produce un desdoblamiento de niveles de energía.

 

TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA La fluo fluorresc escenc encia tien tienee lu luggar en sis sistem emas as gaseo aseoso sos, s, lílíqu quid idos os y sóli sólido dos, s, tant anto

senc co co Ese l ncil tipillos olosmcomo ásmo secomp ncmple illo lejo djos. e s.fluorescencia es el que presentan los vapores atóm at ómic icos os dilu diluid idos os.. Por ej ejem empl plo: o: Los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3 p median iante la absor orcción de radiación ión de longit itu udes de onda de 5 896 a 5 890 Å. Desp De spué uéss de   10−8  10−5 s, lo loss electrones vu vueelven al estado fund undamental emitiendo radiación de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones. Estte tipo Es tipo de fluo fluorres esce cen ncia, cia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin cambio de frecuencia, se   conoce conoce como como radiac radiación ión de resona resonanci ncia a o  fluorescencia de resonancia.

 

PRINCIPIO DE EXCLUSIÓN DE PAULI •

  No pueden haber cuánticos; 2 electrones con los mismos números porcon lo tanto solo 2 electrones en un mismo orbital con espines opuestos. •   Electrones

apareados apareados o no apareado apareados. s.

 

•   Las

moléculas con espines apareados no presentan un campo magnético: son diamagnéticas (no se alteran en un campo

magnético). •   Las

moléculas con electrones

desapareados (radicales presentan gnéticas un campo magnético: sonlibres)  parama (se alteran en un campo magnético).

 

•  Singulete:

estado electrónico molecular con todos los espines apareados.

•  Doblete:

estado electrónico molecular donde el electrón impar puede tomar dos orientaciones.

 

PROPIEDADES •   Una

molécula es paramagnética en estado triplete y diamagnética en estado singulete.

•   Es

más probable transición singuletesingulete que unauna singulete-triplete. singulete-triplete . •   Tiempo de vida de un estado triplet triplete e ex excitado citado desde10-4 a varios segundos. •   Tiempo de vida de un estado es 10-8 a 10-5 segundos.

singulete excitado

 

Rendimiento cuántico o eficiencia cuántica de fluorescencia o de fosforescencia

Es la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto al número total de moléculas excitadas.

Moléculas altamente eficacia cuántica sefluorescentes aproxima a la(fluoresceína) unidad; en las poco fluorescentes se aproxima a cero.

 

FLUORESCENCIA Y ESTRUCTURA La fluorescencia más intensa y la más útiles la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones 

* de baja energía. Los compuestos que

contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados también pueden presentar fluorescencia, pero el número de estos compuestos es pequeño comparado con el número de sistemas aromáticos. La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su grado de condensación. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol.

 

no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con éstas normalmente sí la presentan. En los heterociclos con nitrógeno, se cree que la transición electrónica de más baja energía implica a un sistema n   * que rápidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia. Sin Si n em emba barrgo, go, la con onde dens nsaaci ción ón de ani nill llo os benc bencén énic ico os par para dar núcl núcleo eoss heterocíclicos, da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorción. En estas estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es más cort co rto, o, as así, í, se ob obse serv rvaa fluo fluore resc scen enci ciaa en co comp mpue uest stos os como como la quin quinol olin ina, a, la isoquinolina y el indol.

 

PRESENTAN FLUORESCENCIA

NO PRESENTAN FLUORESCENCIA

 

EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y DEL DISOLVENTE

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La fluorescencia de una molécula se reduce en presencia del disolvente Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia a los disolventes compuestos que contienen átomos pesados

Dism Di smin inuy uye e en la mayo mayorí ríaa de mo molé lécu cula lass al aume aument ntar ar la tem empe perratur aturaa  

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN EN LA INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA. Ley de Beer

Serie de Maclaurin

Po=potencia del haz incidente P=potencia del haz transmitido ε=absortividad b=espesor de la cubeta (camino óptico) C=concentración

 

INSTRUMENTACIÓN Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros ultr ul trav avio iole leta ta/v /vis isib ible le.. La si sigu guie ient ntee gr gráf áfic icaa mues muestr traa una una configuración característica de estos componentes en los   fluorómetros  y los  espectrofluorímetros . Casi todos loss in lo inst stru rume ment ntos os de fluo fluore resc scen enci ciaa ut util iliz izan an ópti óptica cass de dobl do blee ha hazz ta tall co como mo se mu mues estr tra, a, par para co com mpe pen nsa sarr la lass fluctuaciones en la potencia de la fuente.

 

COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFLUORÍMETROS

Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren sólo en detalles de los que componen los fotómetros y los espectrofotómetros; sólo es necesario considerar estas diferencias. FUENTES

En la mayoría de las aplicaciones se necesitan fuentes más intensa que las lámparas de wolframio o hidrógeno utilizadas en las medidas de absorción. De hecho, la magnitud de la señal de salida y, por tanto, la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente  P o

 

LÁMPARAS.

La lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de arco de mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice fundida. Esta fuente emite líneas útiles para producir la excitación previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las líneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia o absorción adecuados. Ya que, en la mayoría de los compuestos fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes de onda, al menos una de las líneas del mercurio suele resultar adecuada.

 

LÁSERES. Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que utilizan, como sistema de bombeo, un láser de nitrógeno pulsante o un láser de Nd:YAG. La may mayorí oríaa de los espectr espectrofl ofluor uoríme ímetro tross comerc comercial iales es utiliz utilizan an lám lámpar paras as (ya des descri critas) tas) com como o fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de láser  ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo,  (1)  cuando las muestras son muy pequeñas como en cromatografía con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad cantid ad de muestra muestra es de un microl microlitro itro o meno menor; r;   (2)  en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de radicales hidroxilo en la atmósfera de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza colimada de los haces de láseres vital: o  (3)  cuando se requiere unaa ra un radi diaci ación ón de exc excit itaci ación ón al altam tamen ente te mono monocr crom omát ática ica pa para ra mini minimi mizar zar los los efe efect cto o de las las interferencias fluorescentes.

 

FILTROS Y MONOCROMADORES

Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utnidliazaddoelenhalozs fdle uoreóxm óinacdióenla fllo o cietatrcoiósnpayra dlae selalecrcaid un ogreitsucdendtee resultante, mayorí ríaa de los espectrofluorí rím metros están equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red. DETECTORES La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de

trige onger ersac pión arna de mej melo josradet r la rteor laes ció ciópar n rse señ al al/r /ru urar ido idola . Trael m bión iénn se señal/ utl/ru ilruid izaido. , o. a veces, la rfoef efri ació los de tec ect ores pa a ñmejo me jor elac ació seña

 

CUBET CUBETAS AS Y COMPARTIMENTOS PARA LAS CUBET CUBETAS AS Para Pa ra me medi dida dass de fluo fluore resc scen enci ciaa se ut util iliza izan n tant tanto o cube cubeta tass ci cilín líndr dric icas as co como mo rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el diseño del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiación disp di sper ersa sada da qu quee ll lleg egaa ha hast staa el de dete tect ctor or.. Co Con n es este te pr prop opós ósit ito, o, a me menu nudo do se introducen deflectores en el compartimento incluso más importante que en las medidas de absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas y, a que la grasa de la piel con frecuencia fluórese.

 

APLICACIONES Determinación de: •Especies inorgánicas (cationes que forman quelatos fluorescentes). •Especies orgánicas y

bioquímicas (ácidos

nucleicos, aminoácidos, enzimas, hidrocarburos, etc.). •Cromatografía. •Análisis de gases (métodos quimioluminiscentes). •Detección de sangre en ciencias forenses (luminol, hemasceína, etc.)

 

•

Determinación de

sustancias inorgán inorgánicas icas • Cationes que forman quelatos fluorescent fluorescentes es •

Otras Aplicaciones

Descenso de fluorescencia Determinación de sustancias orgánicas • Fármacos y drogas. • En Química Agroalimentaria Agroalimentaria • Contaminación ambiental •

 

LAS VENT VENTAJAS AJAS PRINCIP PRINCIPALES ALES DE DE ESTE MÉTODO a) Su sensibilidad, uno o dos órdenes de magnitud mayor quee la es qu espe pect ctro rosc scop opia ia de abso absorc rció ión. n. b) Llaoespe es s ipect ntectro rvrosc ascop losopia liia nede aleab abso s, sorc losrció ción. un. ales son más grandes que en c) Se pueden detectar concentraciones muy pequeñas de moléculas moléc ulas org orgánica ánicas. s. d) El agua es transparente a radiación UV y VIS. Se pueden ana nalilizzar las las mo molé lécu cula lass biol bioló ógic gicas en so solu luci cio one ness acu cuo osa sass si sin n interf int erfer erenc encia ia del sol solven vente. te.

 

D ESVENTAJAS LAS DESVENT AJAS PRINCIP PRINCIPALES ALES DE ESTE MÉTODO 

  Gene Generralme alment nte e no se obti obtien ene e una una info inform rmac ació ión n detallada detal lada de la estructur estructura a de la molécula. molécula.



 La fl fluo uorresc es cenci encia a es mde uymacromoléculas, sens sensib ible le par para anal an aliz izar ar cambios estructurales pero su intensidad es afectada por la temperatura. No sirve para estudiar cambios dependientes de temperatura. 

  Debido a la sensibilidad de la espectroscopía de abso ab sorrción ción UV y VIS, VIS, la mues muestr tra a debe debe tener ener una una pureza pure za muy muy alta. alta.

 

CONCLUSIONES • •

La espectroscopia de luminiscencia molecular no va permitir la determinación de sustancias orgánicas e inorgánicas La diferencia entre la fluorescencia y fosforescencia es, en la fluorescencia las transiciones electrónicas responsables no conllevan un cambio en el espín del electrón y presenta una vida corta, mientras en la fosforescencia fosforescencia hay un cambio en el espín del electrón.

 

 I LIOGR FÍ Principio de Análisis Instrumental. Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMAN Quinta Edición. Mc Graw Hill. •

Análisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. F. RUBINSON Prentice Hall. Madrid 2001. •