Espectros de absorción y cuantificación espectrofotométrica de hierbabuena

Espectrofotometría: Espectros de absorción y cuantificación espectrofotométrica de biomoléculas David Santiago Tovar Romero

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, Manuel Camilo Mendoza Salazar  2

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA, UNIVERSIDAD DE LA SABANA. 08 de agosto del 2017 OBJETIVOS  Aplicar la ley de Lambert-Beer Lambert-Beer y realizar una una recta de calibrado calibrado para ácido ácido gálico Calcular gráficamente el valor de coeficiente de extinción molar para el ácido gálico Determinación cuantitativa de polifenoles en una muestra problema

RESUMEN

ABSTRACT

En estu estudi dios os de Bioq Bioquí uími mica ca,, las las molé molécu cula las s debe deben n ser ser anal analiz izad adas as para para su cara caract cter eriz izac ació ión n cual cualit itat ativ iva a y cuantitativa; un método que permite llevar a cabo cabo dich dicha a cara caract cter eriz izac ació ión n es la espectro espectroscop scopía ía UV-Vis la cual está basada en el proceso de absorción de la radiación ultravioleta-visible (radiación con longitud de onda comprendida entre los 160 y 780 nm) por una molécula. En este proceso la cantidad de luz que absorben las moléculas depende de forma lineal de la conc conce entra ntraci ció ón. En la espe spectro ctrosc scop opiia se empl mplea un espectrofotómetro, en el que se puede sele selecc ccio ion nar la lon longitu gitud d de onda de la luz que pasa asa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.En esta práctica de labo labora rato tori rio o se real realiz izó ó una una espe espect ctro rosc scop opia ia UV-V UV-VIS IS para clorofila en cápsula con la finalidad de dete determ rmin inar ar su λmax (Longitud de onda de mayor  absorbancia),s absorbancia),seguido de la elaboración de una curv curva a de cali calibr brac ació ión n para para esta esta.C .Com omo o un proc proces eso o adic adicio iona nall fue fue medi medida da la abso absorb rban anci cia a en mues muestr tras as problema en este caso la hierbabuena, y por   último se determinó el porcentaje de humedad dichas muestras.  Absorbancia,  Absorbancia, Palabras clave: espectrofotometría, curvas de calibración, solución patrón, clorofila, muestras vegetales.

In studies of Biochemistry , molecules must be analyzed for qualitative and quantitative characterization ; a method to perform such cha hara rac cte teri riza zati tio on is th the e UV UV-V -Vis is spec ectr tros osco cop py whi hich ch is base ba sed d on th the e ab abso sorp rpti tion on pr proc oces ess s of ul ultr trav avio iole lett - vi visi sibl ble e radiation ( with wavelength of from 160 to 780 nm ) by a molecule.In this process the amount of light absorbing molecules depends linearly on the concentration . spectrophotometer is used in a Spec Sp ectr tros osco copy py pr proc oced edur ure e , which can select the wavelength of light passing through a solution and measuring the amount of light absorbed by the same is used. In this lab UV - VIS spectroscopy it was performed to chlorophyll capsule in order to determine their  λmax( wavelength greater absorbance) , followed by the development developme nt of a calibration curve for this .  As an additional process was was meas measur ured ed abso absorb rban ance ce in test test sampl sample e peppe peppermi rmint nt,, and fi fina nallly the the mois moistu ture re thes these e samples was determined . Absorbance, spectrophotometry, spectrophotometry, Keywords: Absorbance, calibration curves, standard solution, chlorophyll, plant samples, solvent, transmittance.

INTRODUCCIÓN En el siguiente informe trabajaremos la espectrofotometría identificando los espectros de absorción y cuantificación de biomoléculas; un método que permite la determinación e identificación cuantitativa y cualitativa de una biomolécula es la espectroscopia. La espectroscopia es el estudio y medición de la cantidad de energía radiante que absorbe una solución en función de la longitud de onda, en otras palabras es la medición de la absorción y emisión de la radiación electromagnética por la materia, la radiación electromagnética tiene carácter ondulatorio y está formada por fotones; el instrumento que permite la cuantificación de energía absorbida o transmitida por una solución. (Anzola Velasco & López Rico, 2005, págs. 129-132) La espectrofotometría o espectrometría ultravioleta-visible implica la espectroscopia de fotones en la región de radiación UV-Vis, en otras palabras estudia la absorción de la radiación ultravioleta-visible por una molécula, al incidir la radiación de energía las moléculas pasan de un estado fundamental (basal) a un estado de mayor  energía (excitado). El paso de un haz de radiación a través de un medio transparente va a acompañado de la absorción parcial de aquélla, y que también la absorción de radiación electromagnética es equivalente a una absorción de energía, entonces cuando una molécula absorbe un fotón la energía que recibe da como resultado una alteración de su estado, se dice que la especie en cuestión está excitada y dicha excitación puede consistir en la transición de un electrón a un nivel energético, o en el cambio en el modo de vibración de la molécula, o en la alteración en su modo de rotación. (Skoog & West, 2002, pág. 502) La ley de Lambert-Beer dice que cuando un haz de radiación monocromática atraviesa una solución que contiene una especie absorbente, la energía radiante del haz se reduce progresivamente como consecuencia de la absorción de parte de la energía por las partículas de dicha especie química. La disminución de la energía depende de la concentración de la substancia responsable de la absorción así como de la longitud del recorrido del haz a través de

la solución lo que expresa la ley de Lambert-Beer es cuantitativamente dicha relación. Una manera mejor  de expresar la ley de Beer-Lambert es establecer que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de la solución. Por  tanto, la espectrometría UV/VIS puede usarse para determinar la concentración de una solución. Es necesario saber con qué rapidez cambia la absorbancia con la concentración. Esto puede ser  obtenido a partir de referencias (las tablas de coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud, determinando a partir de una curva de calibración. La expresión matemática de la ley de Lambert-Beer es:

 A=Absorbancia de la muestra C=concentración del cromóforo L=Longitud del paso óptico que contiene la muestra En la ecuación de absorbancia  representa la constante de extinción molar. El logaritmo decimal de la razón de la intensidad incidente a la transmitida recibe el nombre de absorbancia de la solución y se simboliza por la letra A, la absorbancia de la sustancia absorbente y con longitud del camino atravesado por el haz. La Transmitancia es la fracción de la radiación incidente transmitida por la solución; en general se expresa como tanto por ciento (%), la transmitancia está relacionada directamente con la absorbancia por la siguiente expresión:

La existencia de una relación lineal entre la absorbancia y el espesor de la capa de solución atravesada, a concentración constante, es una ley general de la cual no se han encontrado excepciones, pero se encuentran frecuentemente desviaciones de la proporcionalidad directa entre la absorbancia y la concentración, a espesor de capa constante, algunas de estas desviaciones son de naturaleza fundamentas o desviaciones instrumentales representando una limitación de la ley de Lambert-Beer. (Skoog & West, 2002).

MATERIALES Y REACTIVOS

absorbancia y realizamos su curva de calibración.

Se usará un vidrio de reloj previamente pesado y una estufa a 60°C donde se introducirá el vidrio RESULTADOS Y DISCUSIÓN de reloj, este se sacará con pinzas de crisol y se  Al realizar la curva de calibración para la muestra dejará enfriar en un desecador. patrón, diluida en agua y restando el blanco, con Se usa una balanza para pesar la muestra, luego ayuda del espectrofotómetro se obtiene los siguientes una tabla para cortar finamente la muestra, luego resultados: se utilizara un tubo Falcon de 50 mL protegido de la luz con papel aluminio, se agita la solución en Concentración Absorbancia un Vortex. Se usa filtración con algodón y un ( μ g /mL ) matraz para recoger lo sobrante. También, se utilizara una baño de ultrasonido. 5 0,978 Usar tubos de eppendorf para preparar las soluciones y finalmente utilizar gráfica de 10 0,895 absorbancia vs concentración. Determinar la absorbancia usando lector de microplacas. 20 0,934

METODOLOGÍA Teniendo en cuenta los objetivos dichos anteriormente, se presenta a continuación la metodología que fue seguida en la práctica de laboratorio:

40

0,936

80

0,937

160

0,939

Tabla N°1: Datos de concentración y absorbancia

Determinaciòn de humedad

para una muestra diluida en etanol. Pesar 2 g de muestra problema, seguidamente  Al graficar los valores de absorbancia en función de dejarlo en la estufa por 24 horas, luego enfriar en la concentración, se obtiene la siguiente gráfica: el desecador y calcular el porcentaje de humedad

Extracción de problema - Vortex

polifenoles

en

muestra

En un tubo falcon de 50 mL adicionar 5 g de hojas de hierbabuena cortadas protegido con papel aluminio seguidamente agregar 20 mL de etanol. Agitar 5 veces en vortex durante 20 min, finalmente recoger el sobrenadante en un matraz aforado de 25 mL y llevar a volumen con etanol.

-

Ultrasonido

Repetir el proceso anterior hasta los 20 mL de etanol y adicionalmente meterlo en el baño de ultrasonido 4 veces durante 10 segundos.

Curva de calibración de la hierbabuena Con el patrón que se realizó en la primera parte, se realizaron diluciones de 1 mg/mL de 5, 10, 20, 40, 80, 160 µg/mL en etanol; determinamos su

Gráfica N°1: Absorbancia vs concentración muestra problema diluida en etanol. De esta gráfica se obtiene la siguiente ecuación Y  = 0, 00003 x + 0, 9341 ,mediante una regresión lineal; teóricamente se sabe que el coeficiente de extinción molar es la pendiente obtenida al graficar la absorbancia en función de la concentración; ya que son directamente proporcionales. Nota: Los valores de absorbancia a la concentración de 5, 10  µg/mL estaban desfasados por esto, no fueron tomados en cuenta en la gráfica.

Se cumple la ley Lambert- Beer para soluciones diluidas; para valores de concentración altos, ε varía con la concentración ya estas dos son inversamente proporcionales, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc. por tanto se obtiene que el coeficiente extinción molar experimental del ácido gálico es : ε = 0, 00003 Se utiliza la ecuación de la recta para determinar las concentración del polifenol presente en la en la muestra problema, (diluida en etanol). Despejamos x para determinar la concentración de ácido gálico que posee la hierbabuena, asumiendo a Y como un promedio de los valores de absorbancia utilizados en la Gráfica 1. Despejando x:  x = Y −b m y≈0,9365

crisol su peso inicial fue 2,0007 g y el peso final 0,2907 g. Primer crisol % de humedad  =

(2,0185−0,2934) g   x100 2,0185  g 

= 85, 46%

(2,0007−0,2907)  g   x100 2,0007  g 

= 85, 47%

Segundo crisol % de humedad  =

Dado los resultados la hierbabuena tiene una gran cantidad de humedad, se debe a que es vegetal y los vegetales presentan en la mayoría gran cantidad de humedad, analizando los resultados, vemos que la humedad es inversamente proporcional a la concentración de polifenoles presentes en la muestra problema, entonces la humedad es un factor que afecta directamente la concentración y también el coeficiente de extinción experimental obtenido. Por ende vemos el porque la cantidad tan Concentración promedio de polifenoles en relativamente poca de polifenoles presentes la muestra problema en la muestra problema (hierbabuena). 0,9365−0,9341  x = = 8 0 μ  g  / mL La cantidad de polifenoles promedio que se 0,00003 Los resultados para hierbabuena son presentó fue de 80 μ g /mL y el un porcentaje similares a lo informado por Guzmán et al. de humedad alto (80%). (2005), quienes reportan valores de 70 y 250 Respecto al coeficiente de extinción del ácido µg eq. AG/mL, respectivamente. gálico sabemos que a concentraciones altas la La variación en el contenido de fenoles entre linealidad se pierde y los resultados se la hierbabuena se puede atribuir a variabilidad encontraron dos desfases muy grandes y por  genética de las plantas, la composición del ende esto afecta en gran parte al coeficiente suelo, el clima, el método de cosecha, de extinción del ácido gálico, además la almacenamiento poscosecha, así como al cantidad de polifenol presente en la muestra muestreo y las prácticas de elaboración problema. (Friedman et al., 2009). Para tener más claro cuál es el verdadero Porcentaje de humedad coeficiente de extinción experimental se debe El contenido de humedad de los alimentos emplear la fórmula de Lambert-Beer A= ε *c*l varía enormemente. El agua es un porque el obtenido por la pendiente dela recta constituyente principal en la mayoría de los da ε = 0, 00003 y este es un valor muy productos alimenticios. pequeño, los posibles errores fueron Para calcular el porcentaje de humedad sistemáticos o experimentales al realizar mal presente en la hierbabuena se utilizará la la concentración de la muestra problema siguiente ecuación: (hierbabuena). ( peso inicial − peso f inal )  porcentaje de humedad = x100 Nota: A = A bsorbancia de la muestra ,  peso inicial  En el primer crisol el peso inicial fue de 2,0185 c = c oncentración del cromó f oro, ,I = Longitud g y el peso final de 0,2934 g; en el segundo del paso óptico que contiene la muestra.

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

Se concluye que la humedad es inversamente proporcional a la concentración de polifenoles en la muestra; ya que la humedad se encuentra entre los factores que alteran la concentración de polifenoles.

- Anzola Velasco, C., & López Rico , E. (2005). Guía de laboratorio de bioquímica. Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia, Unilibros.

El uso del espectrofotómetro permite determinar la longitud de onda óptima de las soluciones. Para la extracción de polifenoles es óptimo utilizar un disolvente polar prótico como el etanol , por su afinidad al ácido gálico. La ley de Lambert- Beer se cumple para solución diluidas; para valores de concentración altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz. Se observó experimentalmente que la ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra.

Christian Gary, D. (2009). Química analítica. McGraw-Hill. Obtenido de Tomado de http://www.ebooks7-24.com. Harris, D. (2001).  Análisis Químico Cuantitativo. Barcelona, España: Reverté. Skoog, D., & West , D. (2002). Introducción a la Química Analítica. Barcelona, España: Reverté, S.A. Bárcena Ruiz Antonio, N. A. (2009). Espectrofotometría: Espectros de absorción y  cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Menéndez Pidal - Córdoba: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Guzmán, M. S. H.; Torres, P. I,;A.; Acosta, G. J. A.; Miranda, L. R. y Guevara, L. R. 2005.Potencial de plantas de uso común en México como fuente de compuestos fenólicos, hierro y vitamina C. Agric. Téc. Méx. 31(2):115-123. Friedman,M.;Levin, C. E.; Lee, S. U. and Kozukue, N. 2009. Stability of green tea catechins in commercial tea leaves during storage for 6 months. J. Food Sci. 74(2):47-51.