Espectro De Absorción De La Clorofila

Espectro De Absorci´on on De La Clorofila. L´ opez opez Hern´andez andez Leonardo. Laboratorio de F´ısica Moderna, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Aut´ onoma onoma de M´ exico, exico, Ciudad Universitaria, Universitaria , 04510, D.F., M´exico. exico. Noviembre 20, 2013

Resumen Se estudia el espectro de absorci´ on on de la clorofila obtenida obtenida de una muestra muestra de 3 gr. aproximad aproximadamen amente te de espinacas espinacas,, el proceso se llev´ o a cab o en varias etapas, utilizando utilizan do ´eter eter de petr´ p etr´ oleo, oleo, alcohol met´ met´ılico, ´eter eter et´ et´ılico y agua a gua destilada. destilada . Se obtuvo o btuvo el espectro es pectro de absorci´ on de la clorofila utilizando un espectrofot´ on ometro y midiendo la transmitancia a varias longitudes de onda, quitando ometro la contribuci´ on on de la transmitancia debida al ´eter eter de petr´ oleo oleo y alcohol met´ met´ılico seg´ un un se ten´ ten´ıa clorofila α  o clorofila β . Se cencontr´o que la clorofila  α  tiene un m´ aximo aximo en (435 ±1)nmyotroen(670 ± 1)nm, mientrasquelac mientrasquelaclorofilaβ  lorofilaβ  tiene   tiene sus m´ aximos aximos en (455 ±1)nmy(660 ± 1)nm.

1.

2.

Objet bjetivos

La clorofila absorbe la energ´ıa ıa solar para iniciar el ciclo fotosint´etico, etico, la principal princi pal propiedad propied ad fisicoqu fisico qu´´ımica responresp onsable de esto es la elevada absorbancia que presenta la Obte Obtene nerr a part partir ir de una una muest uestra ra de hojas hojas de esespinacas clorofila α   y clorofila β , utilizando utili zando ´eter eter de clorofila en el intervalo de longitudes de onda entre 400 nm y 700 nm. La mol´ mo l´ecula ecula de d e clorofilaa clorofi laa puede pued e absorber absorb er un pretr´oleo, ol eo, alcoh al cohol ol met´ılic ıl ico o y ´eter et er et´ılic ıl ico. o. fot´ on on de ´estas estas longitudes de onda al excitar un electr´on on Obtener el espectro de absorci´on on de ambas clorofilas. de los que ocupan los orbitales moleculares que forman dobles enlaces conjugados C=C y C=N de la estructura central que rodea al ´atomo atomo de magnesio.

Intr Introdu oducc cci´ i´ on on

3.2. 3.2.

Un pigmento es cualquier sustancia capaz de absorber la luz luz o part partee de ella ella.. Como Como es bien bien sabi sabido do,, la luz luz blanca esta compuesta de varias longitudes de onda que caracterizan a los colores. La mayo mayorr´ıa de los pigmentos absorben ciertas longitudes de onda y reflejan otras, el espectro espec tro es caracter´ıstico ıstico de cada pigmento.

La presen presencia cia de un grupo grupo CH 3 o CH O   en uno de los anillo anilloss C 4 N    diferenc´ diferenc´ıa a la clorofila α y β , resrespectiv pectivame ament nte. e. La presen presencia cia de este este grupo grupo funcio funcional nal altera ligeramente l igeramente la estructura y energ´ energ´ıa de los l os dobles enlaces conjugados, dando lugar a espectros de absorci´on distintos para cada clorofila.

La clorofila, es el pigmento verde com´un u n a todas las c´elulas elulas fotosint´eticas, eticas, absorbe absorb e todas t odas las longitudes longit udes de onda del espectro visible, sin embargo, refleja la longitud de onda correspondiente al verde detectado por los ojos.

3. 3.1.

Diferen Diferencia cia Entre Entre Clorofil Clorofila a α y β 

La clorofila α  en disoluci´on on alcoh´olica olica presenta m´axiaximos de absorci´on on en 430 nm y 662 nm, mientras que la clorofila  β  los presenta en 453 nm y 642 nm. La posici´on on exacta de ´estos estos m´aximos aximos depende del disolvente que se utilice.

Marco Teorico o ´rico Clorofila Y Fotos Fotos´ ´ıntesis

La clorofila clorofila es una mol mol´´ecula ecula compleja, compleja, formada formada por cuatro cuatro anillos anillos pirr´ olicos, olicos, un atomo a´tomo de magnesio y una cadena de fitol larga ( C 20 ). 20 H 39 39 OH ). En las plantas p lantas y otros ot ros organismos organ ismos fotosint´ fo tosint´eticos eticos existen e xisten diferentes tipos de clorofilas. La clorofila α se encuentra en todos los organismos fotosint´ fotosint´eticos eticos (plantas, ciertos protistas, proclorobacterias y cianobacterias). Los pigmentos accesorios absorben energ´ energ´ıa que la l a clorofila es incapaz de absorber; ´estos estos incluyen a la clorofila β  y los carotenos. La clorofila  α  absorbe las longitudes de ondas correspondient dientee al violet violeta, a, azul, azul, anaran anaranjad jado-r o-rojizo ojizo,, rojo y pocas radiaciones de las longitudes de onda intermedias.

Figura 1: Espectro de absorci´on on de la clorofila  α  y  β . 1

3.3.

Transmitancia Y Absorbancia

El proceso de obtenci´on de la clorofila se hizo en los siguientes pasos:

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad I 0   incide perpendicularmente sobre una disoluci´on de un compuesto qu´ımico que absorbe luz, el compuesto absorber´a una parte de la radiaci´on incidente (I a ) y dejar´a pasar el resto ( I t ), de forma que se cumple: I 0  =  I a  + I t

1.- Se lavaron y quitaron las nervaduras de las hojas de espinacas hasta obtener 3 gr. aproximadamente de espinacas desnervadas. 2.- Se moli´o la espinaca en el mortero y se mezcl´o con 40 ml de acetona diluida al 80 %. Una vez que la acetona adquiri´ o un color verde oscuro se filtro la mezcla en un embudo de separaci´on. Obteniendo un extracto con los pigmentos de la espinaca.

(1)

La transmitancia (T) de una sustancia en soluci´on es la relaci´ on entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector, que a su vez ha atravesado la muestra, I t , y la cantidad de luz que incidi´o sobre ella,  I 0 :

T  =

I t I 0

3.- Al extracto con los pigmentos se le agregaron 50 ml de ´eter de petr´oleo y se mezcl´o rotando lentamente el embudo. Se le agregaron 70 ml de agua destilada procurando que resbalara por las paredes del embudo, mientras ´este u ´ ltimo se manten´ıa en rotaci´on hasta obtener una fase superior de un verde intenso. Una vez separadas las dos fases se desech´o la parte inferior.

(2)

La absorbancia (A) es un concepto m´as relacionado con la muestra, puesto que indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T:

A  =  Log 10 (

 1 I t ) =  Log10 ( ) I 0 T 

4.- La fase superior que conten´ıa ´eter de petr´oleo se limpi´ o a˜nadiendo 50 ml de agua destilada y rotando el embudo hasta que se obtuvieron dos fases. la parte inferior se desech´o. Este paso se repiti´o dos veces. 5.- Se mezclaron 46 ml de alcohol met´ılico con 4 ml de agua destilada, y se le agreg´o al embudo mezcl´andose por rotaci´on con la soluci´on de ´eter de petr´oleo, form´ andose dos fases.

(3)

Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (I 0 =I t ), la transmitancia es del 100 % e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y por tanto A=0.

4.

6.- Se separaron ambas fases en vasos de precipitado diferentes, la fase superior conten´ıa ´eter de petr´oleo, clorofila α  y carotenos, mientras que la fase inferior conten´ıa alcohol met´ılico, clorofila  β  y xantofila.

Desarrollo Experimental

7.- Se colocaron 50 ml de la soluci´ on de alcohol met´ılico en el embudo de separaci´on y se le agregaron 50 ml de ´eter et´ılico, mezclando por rotaci´on. Se a˜ nadieron 5 porciones de agua destilada, procurando que resbalara por las paredes del embudo, hasta que aparecieran dos fases bien definidas. La parte inferior se desech´o.

Para el proceso de la obtenci´on de las clorofilas y sus correspondientes espectros se utilizaron: Hojas de espinacas, aprox. 3 gr. Acetona Agua destilada

8.- Se colocaron en dos tubos de ensayo 30 ml de la soluci´ on de ´eter de petr´oleo y de alcohol met´ılico por searado. Se prepar´o una mezcla de 9 ml de alcohol met ilico y 21 mg de hidr´oxido de potasio. La mezcla se dividi´ o por la mitad y se le agreg´o a cada tubo de ensayo, se mezcl´o agitando un poco.

´ Eter de petr´oleo ´ Eter et´ılico Alcohol Met´ılico

9.- Se a˜nadieron 30 ml de agua destilada a cada tubo de ensayo y se mezcl´o hasta obtener dos fases en cada tubo.

Hidr´ oxido de potasio Embudo de separaci´on Vasos de precipitado

10.- Se Separaron y se colocaron en recipientes diferentes.

Mortero

El espectro de absorci´on de cada clorofila se obtuvo empleando un espectrofot´ometro Spectronic 21D, colocando parte de las muestras en los recipientes del dispositivo. Se introduc´ıa la muestra con solvente ocupado se tomaba la medic´ıon y se sustitu´ıa por la muestra de la clorofila correspondiente y se tomaba la medici´on. Esto se hizo

Tubos de ensayo Espectrofot´ometro SPectronic 21D L´ ampara de luz oscura 2

para ambas clorofilas. Las mediciones tomadas fueron hechas sobre la transmitancia de las muestras puesto que la absorbancia se saturaba r´apidamente.

cada una de las clorofilas utilizando la ecuaci´on (3), los datos de la absorbancia se presentan en el anexo. La gr´afica de cada uno de los espectros de absorci´o n se dan a continuaci´on:

Figura 5: Espectro de absrci´on para la clorofila  α .

Figura 2: Montaje experimental, el embudo de separaci´on se sujet´o a un soporte universal y unas pinzas de nueces.

Figura 6: Espectro de absrci´on para la clorofila  β . Puestas ambas gr´aficas en una sola se puede apreciar las diferencias mostradas en el espectro de absorci´on de ambas clorofilas: Figura 3: Muestra de clorofila  α  puesta a la exposici´on de la luz de una l´ampara de luz oscura, en ella se muestra el fen´ omeno de fluorescencia.

Figura 7: Comparaci´on de los espectros de absrci´on para la clorofila  α  y la . Figura 4: Muestra de clorofila  β  puesta a la exposici´on de la luz de una l´ampara de luz oscura, en ella se muestra el fen´ omeno de fluorescencia.

5.

6.

Discusi´ on

Los datos de la absorbancia fueron obtenidos utilizando la ecuaci´o n (3), en la pr´actica se obtuvieron los datos de la transmitancia para cada longitud de onda y para ambas muestras de clorofila, teniendo cuidado de restar el efecto de la transmitancia dada por el solvente

Resultados Y An´ alisis

Se tomaron las mediciones de la transmitancia, con estos datos se obtuvieron los datos para la absorbancia de 3

en cada caso; es decir, se le rest´o a la transmmitancia de Con esto se comprueba que las longitudes de onda que la clorofila α  la transmitancia debida al ´eter de petr´oleo son mejor aprovechadas por las plantas para realizar el y an´alogamente se hizo con la clorofila  β . proceso de fotos´ıntesis son aquellas en donde la absorc´on es m´axima, en ´esta regi´on todos los fotones fotosint´eticos Los picos obtenidos en las gr´aficas de la clorofila α se ser´an absorbidos y se tendr´a una mayor eficiencia durante encuentran en (435 ± 1) nm y en (670 ± 1) nm, mientras el proceso. que para la clorofila β   los m´aximos se encuentran en (455 ±  1) nm y (660 ±  1) nm. Los picos aceptados para ambos espectros se encuentran en: 430 nm y 470 nm Referencias para la clorofila α, mientras que para la clorofila β  se [1] D. Harris, Symmetry and Spectroscopy, Dover Puencuentran los m´aximos en 480 nm y 630 nm. blications, 1978. [2] Espectrofotometr´ıa Espectros de Absorci´on y Cuantificaci´ on colorim´ etrica de Biomol´eculas; Nieves Abril D´ıaz et alt; Depto. de Bioqu´ımica y Biolog´ıa molecular; Campus Universitario; Universidad de Rabanales.

El error porcentual de las mediciones es poco, para el primer y segundo pico de la clorofila α  se tienen 1.01 % y 0 %, respectivamente, mientras que para el primer y segundo pico de la clorofila β   se tienen 5.2% y 4.52% respectivamente.

[3] Manual de Laboratorio de F´ısica Contempor´ anea II.

7.

Conclusiones

[4] Intro. al an´ alisis gr´ afico de datos experimentales, Berta Oda Noda, Editorial Las Prensas De Ciencias.

Se logr´o obtener ambas clorofilas  α  y  β  de una muestra de 3 gr. aproximadamente de espinacas lavadas y desnervadas, esto se comprueba observando las figuras 3 y 4, en ellas se muestra que los dos tipos de clorofila exhiben fluorescencia, ´esto es caracter´ıstico de las clorofilas y otros pigmentos, es decir, ambas muestras emit´ıan una longitud de onda diferente a la cual estaban expuestas. Tambi´en se encontr´o el espectro de absorci´ on para cada una de las clorofilas, las discrepancias observadas al comparar la figura 1 con la figura 7 pueden deberse a que la concentraci´on del solvente utilizado no es la misma a la utilizada en esta pr´actica. Sin embargo, se observa el comportamiento debido, es decir ambas clorofilas tienen un pico de m´axima absorci´on en longitudes de onda no correspondientes al color verde, mientras que la m´ınima absorci´on se encuentra en el rango de las longitudes de onda correspondientes al verde, el m´ınimo de absorci´on indica un m´aximo en la transmitancia, es decir la longitud de onda incidente es reflejada, de aqu´ı que las plantas se vean de color verde pues la clorofila refleja dicha longitud de onda.

4