Errores en La PCR - Ejercicios - 2021 - 2

Errores en la PCR: CASO I MP

Sin banda

Banda tenue

Sin banda ó banda tenue

Tiempos de los ciclos y temperaturas TIEMPO

Componentes de la PCR MASTER-MIX

-> [dNTPs] muy alta (Mg2+) o baja (200 μM, c/u) -> Pocos ciclos (20-35) -> Extensión muy corta (1min/kb) -> Anillamiento muy corto (>30s) -> Denaturación muy larga o muy corta (Inicial 3 min, durante el ciclo 30 s) TEMPERATURA -> Anillaje muy alta (Tm más baja – 5°C, < 72°C) *Gradiente de temperatura -> Denaturación muy baja

¡¡¡NO SE AGREGO ALGÚN COMPONENTE DE LA REACCIÓN!!!

-> [Primers] muy alta (dímeros) o baja (anillamiento ineficiente) (0.2 - 1 μM) -> [Taq polimerasa] baja (replicación incompleta)

-> [ Mg2+] insuficiente (1.5 mM) -> Contaminantes

CARACTERÍSTICAS DEL PRODUCTO(P) O DEL TEMPLETE (T) -> P: alto contenido CG (>65%) (↑Temperatura de anillaje) -> P: demasiado largo ->T: dañado, degradado o contiene inhibidores (Diluir/ ADN fresco ↑#Ciclos)

-> T: insuficiente

Errores en la PCR: CASO II

Banda no específica Banda específica

Banda no específica

Bandas no específicas ó dímeros de primers

Tiempos de los ciclos y temperaturas TIEMPO -> Demasiados ciclos (↑Amplificación inespecífica)

-> Extensión muy larga (↑Amplificación inespecífica) -> Anillamiento muy largo ( spurious priming) -> La velocidad de rampa del termociclador es muy baja ( spurious annealing) TEMPERATURA -> Anillaje muy baja *Gradiente de temperatura -> Cálculo incorrecto de la Tm del primer

Componentes de la PCR MASTER-MIX -> [Primers] muy alta (dímeros) o baja (anillamiento ineficiente) -> Diseño incorrecto de los primers (BLAST) -> [ Mg2+] muy alta (unión inespecífica) -> Contaminantes dNTPs

Errores en la PCR: CASO III

“Barrido” de bajo peso molecular

“Barrido” de alto peso molecular Banda no específica

“Barridos”

Componentes de la PCR

Tiempos de los ciclos y temperaturas TIEMPO

CARACTERÍSTICAS DEL TEMPLETE (T)

-> Demasiados ciclos (↑Amplificación inespecífica)

-> Extensión muy larga (↑Amplificación inespecífica) -> Anillamiento muy largo ( spurious priming) -> La velocidad de rampa del termociclador es muy baja ( spurious annealing)

->T: Demasiado (inhibidores/denaturación ineficiente) ->T: Degradado o con presencia de exonucleasas (ADN fresco)

TEMPERATURA -> Anillaje muy baja *Gradiente de temperatura -> Cálculo incorrecto de la Tm del primer

Revisen el siguiente video de Gold Biotecnology.Inc: https://www.youtube.com/watch?v=GHQDEm7WLcU

MP MP

MP

[]stock del reactivo

Reactivos

Volumen a agregar

[] Master Mix

[ ]i

[ ]F

Volumen a agregar(μl)

Buffer PCR

10X

1X

?

dNTPs

20 mM

?

0.5 μl

?

2.5 mM

5 μl

Primers forward y reverse

10μM

0.1μM

?

10 U/μl

?

Volumen a agregar

Vamos a suponer que en este ejercicio, que el volumen final de la reacción es de 50 μl

𝐶𝑖 ∙ 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 ∙ 𝑉𝑓

MgCl2

Taq polimerasa

La cantidad de soluto se mantiene constante

?

5 0 μl

[] Master Mix []stock

Utilizamos una regla de 3. Por cada 25 μl de reacción necesito 2.5 U de Taq polimerasa

Despejando las variables de la ecuación Volumen a agregar

stock ([ ]i)

𝐶𝑓 ∙ 𝑉𝑓 𝐶𝑖 = 𝑉𝑖

𝐶𝑓 ∙ 𝑉𝑓 𝑉𝑖 = 𝐶𝑖

TIPs Asegúrate que ambos volúmenes (𝑉𝑖 , 𝑉𝑓 ) y ambas concentraciones (𝐶𝑖 , 𝐶𝑓 ) estén en las mismas unidades.

Para la Taq polimerasa Master Mix ([ ] f)

𝐶𝑖 ∙ 𝑉𝑖 𝐶𝑓 = 𝑉𝑓

Cómo son 50 μl de reacción requerimos 5 U de Taq (𝟐. 𝟓 × 𝟐).

10 U

1 μl

5U

X

10𝑈 ∙ 𝑋 = 1μ𝑙 ∙ 5𝑈 1μ𝑙 ∙ 5𝑈 𝑋= = 0.5 μ𝑙 10𝑈

Reemplaza los valores según corresponda en cada caso ¡Recuerda!, para este ejercicio 𝑉𝑓 = 50 μl

[]stock del reactivo

Volumen a agregar

[] Master Mix

Volumen a agregar(μl)

Reactivos

[ ]i

[ ]F

Buffer PCR

10X

1X

dNTPs

20 mM

0.2 mM

0.5 μl

MgCl2

25 mM

2.5 mM

5 μl

Primers forward y reverse

10μM

0.1 μM

0.5 μl

Taq polimerasa

10 U/μl

5U

0.5 μl

5 μl

Recuerda que este volumen lo debes multiplicar por el número de reacciones que se van a realizar. Controles (+), (-), y muestras que se van a amplificar.

+

-

m1

m2

MP (pb) 5000 3000 2000 1500 1000 800 500 300

Mediciones (cm) Promedio 1.44 3.25 4.90 6.08 7.97 8.79 10.54 12.04

BANDA

8.05

LOG10 (MP) Distancia (cm)

𝑦 = −0.1112 ∙ 8.05 + 3.8562 𝑦 = 2.95 102.95 = 901.5

El peso molecular de la banda es de 902 pb

3.70

1.44

3.48

3.25

3.30

4.90

3.18

6.08

3.00

7.97

2.90

8.79

2.70

10.54

2.48

12.04

902 pb